CN103146740B

CN103146740B - 一株生产1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN103146740B
Application number: CN201310071754.1A
Authority: CN
Inventors: 周胜; 秦启伟; 魏京广; 李莉莉; 付静
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2033-03-06
Also published as: CN103146740A

Abstract

本发明公开了一株生产1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法。本发明利用同源重组、基因插入失活的方法使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的磷酸转乙酰酶基因沉默，从而得到乙酸代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，乙酸生产大幅度降低，使得副产物乙酸对细胞的毒害作用大大减少，单位生物量生产速率增强，另外，由于副产物种类减少，也简化了后提取工艺，降低了生产成本。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵28小时，1,3-丙二醇浓度可达55g/L以上。本发明将在微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。

Description

一株生产1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株生产1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法。

背景技术：

1,3-丙二醇（PDO）是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂，应用于耐压高润滑剂、染料、油墨、防冻剂等行业。PDO可用来合成杂环、药物中间体、聚酯和聚氨酯，尤其是可作为聚酯PTT的单体。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性恢复性；在全范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性；抗内应力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可循还利用性等。由于PTT的具有以上优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。

生产PTT纤维的关键在于单体原料PDO的来源。PTT占领市场的关键在于价格，而PTT的价格主要取决于PDO的价格。由于不能廉价制得PDO，制约了PTT的研制和市场开拓。直到90年代中期PDO实现了工业化生产，使得PDO价格大大降低，PTT才开始工业化生产和应用。

Dupont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。化学合成法生产PDO的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。

目前1,3-丙二醇的生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源（如甘油、玉米、淀粉）为原料；2、生产条件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。

微生物发酵法生产1,3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的1,3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强度，具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。

目前被用来生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分离自土壤环境中。克雷伯氏菌只能利用甘油（不能利用糖类等廉价碳源）产生1,3-丙二醇。在产生1,3-丙二醇的过程中，甘油发生岐化反应，氧化途径中的产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1,3-丙二醇。氧化途径中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，甲酸往往又会分解为CO₂和H₂。乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的ATP，而在经乙醛形成乙醇的反应中要消耗2摩尔还原力；丙酮酸也可能转化为2,3-丁二醇,乳酸和琥珀酸，生成乳酸的过程要消耗1摩尔还原力。而生成琥珀酸的过程要消耗2摩尔还原力。还原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B₁₂的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步，由1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成1,3-丙二醇，此过程消耗1摩尔还原力。

在克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇的过程中，细胞的生长受到底物甘油和多种产物的抑制作用。在副产物中，以乳酸的产量最多，野生型克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇的过程中乳酸产量可达40g/L以上；副产物乙酸对发酵的抑制作用最强烈，6g/L的乙酸即能显著抑制细菌生长与发酵，研究报道7.6g/L乙酸能减少50%细菌生长，培养基中15g/L乙酸可完全抑制细菌生长。大量副产物的生成不但对细胞生长不利，还会造成底物甘油的浪费。例如，由于产生乳酸的途径会争夺还原力，乳酸的产生导致1,3-丙二醇产量降低。由于乙酸的产生，使底物甘油更多地进入糖酵解途径，导致底物转化率降低。另外，副产物的生成，使产品提取工艺复杂，能耗成本增加。因此，减少副产物的生成，对提高生产水平，降低微生物发酵生产1,3-丙二醇成本，具有重要的意义。对于副产物乳酸，研究报道敲除乳酸代谢途径关键编码基因乳酸脱氢酶基因，可以使乳酸合成大幅度减少，1,3-丙二醇生产能力得到增强。但目前还没有失活乙酸代谢途径关键编码基因的报道，乙酸代谢途径失活对克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的影响未知。

发明内容：

本发明的目的是提供一种生产1,3-丙二醇的工程菌—敲除乙酸代谢途径基因的工程菌及其构建方法和应用。

本发明的敲除乙酸代谢途径基因的工程菌，是通过以下方法构建的，将产1，3-丙二醇的野生型菌株的磷酸转乙酰酶基因敲除后获得的工程菌。

所述的1，3-丙二醇的野生型菌株优选为克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌，进一步优选为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

所述的将克雷伯氏菌的磷酸转乙酰酶基因敲除，优选通过以下方法敲除：

a、PCR扩增克雷伯氏菌的磷酸转乙酰酶基因的部分同源序列，将其与自杀载体相连，然后再导入杂交供体菌株中；

b、将步骤a获得的携带有磷酸转乙酰酶基因的部分同源序列与自杀载体的供体菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组、基因插入失活，经筛选后获得磷酸转乙酰酶基因被沉默的敲除乙酸代谢途径基因的克雷伯氏菌。

所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的磷酸转乙酰酶基因的部分同源序列是磷酸转乙酰酶基因的哪一部分序列并不重要，只要是同源序列即可。当所述的1，3-丙二醇的野生型菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)时，所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的磷酸转乙酰酶基因的部分同源序列优选为是以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以上游引物PTA-F：TACCCGGGTACCAGCGTAGGTCTGACCAGCGTC与下游引物PAT-R：GACCCGGGTTACTTCTGCTGCTGAGCCGATTG组成的引物进行PCR扩增后的序列。

所述的自杀载体可为自杀载体pGPCm，可从试剂公司购买。

所述的将携带有磷酸转乙酰酶基因部分同源序列的自杀载体导入杂交供体菌株中，可以通过热激法、电转化法、接合转化法等常规方法转化杂交供体菌。

所述的杂交供体菌可以为大肠杆菌SM10(λpir)。通过双亲本杂交，使磷酸转乙酰酶基因的部分序列与产l,3-丙二醇的目的菌株发生同源重组，从而使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的磷酸转乙酰酶基因插入失活，从而获得敲除乙酸代谢途径基因的工程菌。

本发明还提供了敲除乙酸代谢途径基因的工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用。

本发明利用同源重组、基因插入失活的方法使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的磷酸转乙酰酶基因沉默，从而得到乙酸代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，乙酸生产大幅度降低，使得副产物乙酸对细胞的毒害作用大大减少，单位生物量生产速率增强，另外，由于副产物种类减少，也简化了后提取工艺，降低了生产成本。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵28小时，1,3-丙二醇浓度可达55g/L以上。本发明将在微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。

附图说明：

图l是回收并纯化PCR扩增的PTA目的片段图

图2是SmaI酶切质粒pT-PTA图

图3是载体pGPCm的物理图谱

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：乙酸代谢途径关键基因—磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的构建。

(l)、磷酸转乙酰酶基因PTA部分序列的克隆

根据磷酸转乙酰酶基因PTA完整的DNA序列（GenBank号：YP_002920553.1）设计引物，PCR扩增其部分同源序列，引物序列如下：上游引物PTA-F：TACCCGGGTACCAGCGTAGGTCTGACCAGCGTC与下游引物PAT-R：GACCCGGGTTACTTCTGCTGCTGAGCCGATTG。以野生型肺炎克雷伯氏菌（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2011075）基因组DNA为模板，在引物PTA-F和PAT-R的引导下，PCR扩增磷酸转乙酰酶基因PTA的部分序列，PCR扩增条件为：先95℃3min;然后94℃1min，55℃1min，72℃2min，共33个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约2000bp的目的片段（图1），将其克隆入载体pGEM-T easy（TaKaRa公司）中，将重组产物转化大肠杆菌Dh5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶SmaI进行酶切鉴定，经酶切获得了2000bp的酶切片段（图2），表明获得了插入序列正确的重组载体，命名为pT-PTA质粒。

(2)、磷酸转乙酰酶基因PTA自杀载体pGP-PTA的构建

用限制性内切酶SmaI酶切pT-PTA质粒，回收并纯化步骤（1）扩增的长度为2000bp的PTA部分DNA片段，再将其与经SmaI酶切的载体pGPCm（其物理图谱如图3所示）用DNA连接酶进行连接，将连接产物转入大肠杆菌SM10(λpir)感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，得到携带含有磷酸转乙酰酶基因PTA的自杀载体的大肠杆菌SM10(λpir)，提取质粒，得到的质粒命名为pGP-PTA，其是将磷酸转乙酰酶基因PTA的部分同源序列与自杀载体pGPCm相连。

(3)、磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的构建

将步骤（2）的携带有载体pGP-PTA的大肠杆菌SM10(λpir)（供体菌）和野生型肺炎克雷伯氏菌（CCTCC M 2011075）（受体菌）进行双亲本杂交，具体方法为：在含有氯霉素的LB液体培养基中过夜培养供体菌和受体菌；供体菌和受体菌按数量比3:1比例混合于10mM的MgSO₄溶液中，过滤，将滤膜置于LB平板上，37℃培养8-12小时；用l0mM的MgSO₄溶液洗下长在滤膜上的菌苔，梯度稀释后涂布于氯霉素抗性平板上，37℃培养进行筛选。最终得到具有氯霉素(Cm)抗性的重组菌株，即为乙酸代谢途径关键基因—磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株。

实施例2：磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的活性检测。

对实施例1的磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株进行磷酸转乙酰酶的活性检测，以野生型肺炎克雷伯氏菌为对照，具体方法包括以下步骤：

(l)将磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株接种于100mL培养基（每升水中含有甘油10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5g，pH7.0，120℃灭菌20min）中，在37℃下振荡培养6-12小时，每2小时取样离心收集菌体；

(2)用100mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮洗涤菌体2次；

(3)用2.5mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮菌体；

(4)超声波破碎菌体；

(5)3000g离心30min，取上清测定酶活，测定方法为用紫外分光光度计测定反应体系在OD_233nm处1min内的变化值，即△A_233nm/min。反应条件为：温度25℃，pH7.6，时间5min，波长233nm，酶浓度0.002-0.003u/ml，底物浓度，乙酰磷酸盐8mmol/L，辅酶A0.2mmol/L。酶活定义为：在pH7.6,25℃环境下,用乙酰磷酸盐作底物，每1min催化1.0umol辅酶A转化成乙酰辅酶A所需的酶量定为磷酸转乙酰酶的一个单位(u)。

结果显示，实施例l构建的磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的磷酸转乙酰酶活性为野生型菌株的3.7%-4.9%，表明实施例l构建的磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的磷酸转乙酰酶失活。

实施例3：磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株发酵生产1,3-丙二醇

(1)培养基

LB培养基（g·L^-1）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，琼脂10，调节至pH7.0，用于克雷伯氏菌菌种的短期保藏及活化。种子及发酵培养基组成见表1：

表1：培养基组成

(2)培养方式

(i)种子活化：从甘油管保藏的实施例1中的磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株接种至LB培养基斜面活化，温度37℃下培养12小时活化种子。

(ii)种子培养：250mL三角瓶9层纱布封口，装液量100mL种子培养基，接入斜面菌苔（步骤i的活化种子）一环，摇床中进行好氧种子培养，温度30℃，转速150r·min^-1。

(iii)发酵培养：为了考察所构建的失活磷酸转乙酰酶PTA基因对磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株发酵甘油产1,3-丙二醇的影响，以实施例1中的磷酸转乙酰酶基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株为实验组，以出发野生菌肺炎克雷伯氏菌为对照组，进行补料批式发酵，采用岛津LC-20A HPLC分析发酵液中物质组成。

在5L搅拌发酵罐中进行时，装液量4L，接种量1%，通入0.5vvm空气进行微氧发酵培养，搅拌转速为250rpm。发酵温度恒定在37℃；NaOH调节pH至6.8，发酵过程中体系pH通过流加40%的NaOH溶液调控。待菌株进入对数生长期后进行甘油补料，甘油浓度控制在1-50g/L。

(iv)发酵结果

发酵进行28小时，1,3-丙二醇及副产物生产情况结果见表2。

表2：失活磷酸转乙酰酶PTA基因对肺炎克雷伯氏菌发酵甘油产1,3-丙二醇的影响

从发酵结果可以得知，失活磷酸转乙酰酶PTA基因使菌种生物量降低，但乙酸合成代谢途径被切断，乙酸合成量大幅度降低66.04%，单位菌体生物量合成1,3-丙二醇增加9.4%，单位菌体生物量1,3-丙二醇的生产强度增加9.4%，单位菌体生物量发酵生产1,3-丙二醇得率也增加8.47%。

Claims

1.一种敲除乙酸代谢途径基因的工程菌的构建方法，其特征在于，是将克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌的磷酸转乙酰酶基因敲除后获得的工程菌。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的克雷伯氏菌属的细菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的将克雷伯氏菌的磷酸转乙酰酶基因敲除，具体通过以下方法敲除：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，当所述的克雷伯氏菌属的细菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)时，所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的磷酸转乙酰酶基因的部分同源序列是以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以上游引物PTA-F：TACCCGGGTACCAGCGTAGGTCTGACCAGCGTC与下游引物PAT-R：GACCCGGGTTACTTCTGCTGCTGAGCCGATTG组成的引物进行PCR扩增后的序列。

5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述的自杀载体为自杀载体pGPCm，所述的杂交供体菌为大肠杆菌SM10(λpir)。

6.一种按照权利要求1、2、3或4所述的构建方法构建得到的敲除乙酸代谢途径基因的工程菌。

7.权利要求6所述的敲除乙酸代谢途径基因的工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用。

8.一种按照权利要求5所述的构建方法构建得到的敲除乙酸代谢途径基因的工程菌。

9.权利要求8所述的敲除乙酸代谢途径基因的工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用。