CN103146661A - MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法 - Google Patents
MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103146661A CN103146661A CN2013100720243A CN201310072024A CN103146661A CN 103146661 A CN103146661 A CN 103146661A CN 2013100720243 A CN2013100720243 A CN 2013100720243A CN 201310072024 A CN201310072024 A CN 201310072024A CN 103146661 A CN103146661 A CN 103146661A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- streptomyces
- transglutaminase
- mgcl
- fermentation
- output
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 title abstract description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 title abstract description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 39
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 39
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 14
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 8
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 claims 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 abstract description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102100030944 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000653235 Homo sapiens Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710123874 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 241001495137 Streptomyces mobaraensis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940105784 coagulation factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002407 tissue scaffold Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，涉及链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶技术领域。本发明采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，通过在发酵培养基中添加MgCl2，最终实现了提高谷氨酰胺转氨酶产量的目标，并添加保护剂制成低温喷雾干燥或冷冻干燥干粉。本发明所用的MgCl2价格低廉，能显著提高了谷氨酰胺转氨酶的产量，在其它培养条件相同的情况下，本发明比不添加MgCl2的对照例产量提高约100%，并且缩短了发酵周期。
Description
技术领域
本发明涉及链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶技术领域，具体涉及一种添加MgCl2提高发酵法制备谷氨酰胺转氨酶的方法。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，简称TGase，EC 2.3.2.13，R-glutaminyl- peptide：amnie-γ-glutamyl-transferase）又名转谷氨酰胺酶，它通过催化蛋白质中的谷氨酸残基上的甲酰胺与赖氨酸残基上的ε-氨基进行酰基转移反应，使蛋白质在分子内或分子间形成交联。
在二十世纪八十年代，Ikura等人报道了谷氨酰胺转氨酶对食物蛋白质的交联作用。他们用哺乳动物源谷氨酰胺转氨酶交联几种食物蛋白质，如酪蛋白、大豆蛋白等。这些蛋白的交联，提高了其产品的功能性，如凝胶性、溶解性和乳化性等。然而，由于其高昂的价格和低效的利用率限制了它在食品工业上的应用。从链霉菌中成功分离到微生物源谷氨酰胺转氨酶是促进其在食品工业上应用的一个里程碑。它使得这种酶可以大规模地生产，并且被商业利用。由于链霉菌谷氨酰胺转氨酶底物的催化特性，以及它在食品、纺织和医药行业中的广阔应用前景，受到了国内外学者的广泛关注，在亚洲的日本、台湾，欧洲的丹麦、荷兰、法国、德国、爱尔兰以及巴西等国家均投入了大量的人力、物力、财力进行研究，并取得了突飞猛进的进展。
谷氨酰胺转氨酶的来源主要有3种：一是从动物的组织或体液中提取，例如牛、猪或鱼等，由于动物组织种类有限、来源稀少、含量低、组织特异性又极高，而且分离精制过程复杂，价格十分昂贵；在欧洲，商业化的凝血因子XIII（谷氨酰胺转氨酶的一种）主要通过宰杀牛或猪等动物来获得，但由于血液中的谷氨酰胺转氨酶通常需要凝血酶激活才具有活性，故很少应用于食品工业中。二是以大肠杆菌、棒状杆菌和链霉菌等为宿主，用基因工程手段来生产此酶。基因工程菌表达效果较差，远不能达到原有水平；虽然有些报道产量较高，但某些国家对基因工程产品限制比较严格。三是直接筛选产谷氨酰胺转氨酶的微生物，通过发酵法来生产。由于此方法技术可行、成本较低、生产不受出发材料和季节限制，最有可能进行大规模生产和广泛应用。但是目前食品级谷氨酰胺转氨酶来源单一、产量较低、价格昂贵，限制了其在食品工业上的应用。
国内外提高微生物谷氨酰胺转氨酶产量的报导大多集中在优化发酵条件，改善培养基组成等方面。虽然这些研究都取得了一些成果，但是此酶的产量仍然较低。目前商业化的产品主要由日本味之素等公司生产。国内用微生物发酵法生产谷氨酰胺转氨酶尚处于起步阶段，产量较低。
发明内容
针对现有谷氨酰胺转氨酶的制备方法存在的问题，本发明提供一种MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法。
本发明的发明目的是通过如下技术方案实现的：
采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，通过在发酵培养基中添加MgCl2，发酵96 h，最终实现了提高谷氨酰胺转氨酶产量的目标。
具体技术方案如下：
1、菌种及培养基：
（1）菌种 ：
茂原链霉菌（Streptomyces mobaraense）DSM40587：购于日本NBRC。
（2）斜面培养基（g/L）：高氏一号培养基。
（3）种子培养基（g/L）：聚蛋白胨20，可溶性淀粉20，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，酵母粉2，无水硫酸镁2，pH 7.0。
（4）初始发酵培养基（g/L）：聚蛋白胨30，可溶性淀粉10，果糖10，磷酸氢二钾2，酵母粉2，无水硫酸镁1，pH 7.0。
2、谷氨酰胺转氨酶酶活的测定方法：
采用分光光度法37 ℃下测定。吸取50μL发酵液，加入0.5mL试剂A，37 ℃水浴保温10min，加入0.5mL试剂B，终止反应，500nm比色。
试剂A：100mg的N-CBZ-Gln-Gly溶解于2mL、0.2mol/L的NaOH，依次加入0.2mol/L、pH 6.0的Tris-HCl缓冲液4mL，0.1mol/L的羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。
试剂B：3mol/L盐酸、12%三氯乙酸、5%FeCl3·6H2O（溶解于0.1mol/L的盐酸）按1:1:1的比例混合。
1单位谷氨酰胺转氨酶活性(U)定义为：37℃，pH 6.0的条件下反应，每分钟产生浓度为1μmol的单羟肟酸所需的酶量。
3、培养方法：
用5mL无菌生理盐水将培养7 d的斜面孢子洗下，接种于100 mL种子培养基中，30 ℃、200 r/min培养48 h后，按10%的接种量添加到发酵培养基中，30 ℃、200 r/min条件下采取提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养方式培养。将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22μm滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液，添加载体保护剂充分混溶，或这些保护剂与无细胞酶液充分混合再经0.22μm滤膜的微过滤装置过滤除菌。采用低温喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。或通过超滤、凝胶层析、离子交换层析、透析后再经冻干制成医药级酶制剂。
4、上述提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养措施：
所涉及的提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养方式为在初始发酵培养基中添加0.1-0.2 mol/LMgCl2，发酵96 h发酵液中谷氨酰胺转氨酶活力达4.3 U/mL。而未为添加MgCl2在发酵120 h时酶活力达最大(2.1U/mL)。MgCl2不但促进了酶的产量，而且发酵周期缩短24h。
5、医药级酶制剂制备方法：
（1）超滤
将上述的无细胞酶液进行超滤，超滤条件为采用截流分子量为30kDa的超滤膜，将无细胞的酶液浓缩为初始体积的1/5。
（2）凝胶层析
将浓缩液加入到预先用50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）平衡的Sephadex G75柱中，并用相同缓冲液进行洗脱，流速为0.25 mL/min，检测波长为了280nm，收集有活性的部分；
（3）离子交换层析：
将收集到的全部活性部分加入到预先用50 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液平衡的SP sepharose High Performance (HP) (1.6×10 cm)层析柱中，用含0-0.25mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为3 mL/min，检测波长为了280nm，收集活性部分。
6、载体保护剂添加：
上述所涉及的保护剂以无细胞的酶液计蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%。载体保护剂经100℃、1小时烘干，无菌条件下混料机充分混溶；或这些保护剂与无细胞酶液充分混溶再经0.22 μm滤膜的微过滤装置过滤除菌。
7、低温喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉：
将载体添加保护剂后，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80℃，出风温度55-60℃。或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为-60℃，真空度为0.05MPa。
本发明采用MgCl2胁迫促进茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶，本法得到的酶经纯化后热稳定性和pH稳定性均高于吸水链霉菌合成的谷氨酰胺转氨酶，它在食品加工、纺织行业和组织支架制备行业中具有很大的潜力。所用的MgCl2价格低廉，操作简单，易于实施，显著提高了谷氨酰胺转氨酶的产量，在其它培养条件相同的情况下，本发明比不添加MgCl2的对照例产量提高约100%，并且缩短了发酵周期，达到发酵法制备谷氨酰胺转氨酶的先进水平。
具体实施方式
具体实施方式一：在发酵起始时，向培养瓶中添加MgCl2使其终浓度为0.20 mol/L。30℃、200 r/min条件下培养96 h，发酵液中酶活力由0.6U/mL上升到3.8U/mL。将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22μm滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液。载体保护剂蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%经100℃、1小时烘干，无菌条件下与无菌酶液充分混溶；或无细胞酶液与载体保护剂蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再经0.22μm滤膜的微过滤装置过滤除菌，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80℃，出风温度55-60℃，或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为-60℃，真空度为0.05MPa。
具体实施方式二：在初始发酵液中添加0.15 mol/LMgCl2，发酵96h的酶活达4.2U/mL，将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22μm滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液。载体保护剂蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%经100℃、1小时烘干，无菌条件下与无菌酶液充分混溶；或无细胞酶液与载体保护剂蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再经0.22μm滤膜的微过滤装置过滤除菌，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80℃，出风温度55-60℃，或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为-60℃，真空度为0.05MPa。
具体实施方式三：在初始发酵液中添加0.1 mol/L MgCl2，发酵120h酶活力达最大(4.3U/mL)，将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22μm滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液。载体保护剂蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%经100℃、1小时烘干，无菌条件下与无菌酶液充分混溶；或无细胞酶液与载体保护剂蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再经0.22μm滤膜的微过滤装置过滤除菌，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80℃，出风温度55-60℃，或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为-60℃，真空度为0.05MPa。
具体实施方法四：本实施方式与具体实施方式一、二、三不同的是，通过超滤、凝胶层析、离子交换层析、透析后再经冻干制成医药级酶制剂，具体步骤如下：
(1）超滤
将上述的无细胞酶液进行超滤，超滤条件为采用截流分子量为30kDa的超滤膜，将无细胞的酶液浓缩为初始体积的1/5。
(2）凝胶层析
将浓缩液加入到预先用50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）平衡的Sephadex G75柱中，并用相同缓冲液进行洗脱，流速为0.25 mL/min，检测波长为了280nm，收集有活性的部分；
(3）离子交换层析
将收集到的全部活性部分加入到预先用50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）平衡的SP sepharose High Performance (HP) (1.6×10 cm)层析柱中，用含0-0.25mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为3 mL/min，检测波长为了280nm，收集活性部分。即为所制备的电泳纯谷氨酰胺转胺酶。TGASE的回收率可以达到77.5%，TGASE的比酶活可以达到17.33U/mg。
Claims (10)
1.一种MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，其特征在于：在发酵培养基中添加MgCl2 ，发酵96 h提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶的产量。
2.根据权利要求1所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述发酵培养基中添加0.1-0.2 mol/L的MgCl2。
3.根据权利要求1所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的具体步骤如下：
用5mL无菌生理盐水将培养7d的斜面孢子洗下，接种于100mL种子培养基中，30℃、200r/min培养48h后，按10%的接种量添加到发酵培养基中，在初始发酵培养基中添加0.1-0.2 mol/L MgCl2，30℃、200r/min条件下采取提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养方式培养，将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22 μm滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液，添加经烘干灭菌的载体保护剂充分混溶，制成干粉或医药级酶制剂。
4.根据权利要求3所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述载体保护剂为以无细胞的酶液计蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%。
5.根据权利要求3或4所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述载体保护剂经100℃、1小时烘干灭菌，无菌条件下与无细胞的酶液充分混溶。
6.根据权利要求3或4所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述保护剂与无细胞酶液充分混溶，再经0.22 μm滤膜的微过滤装置过滤除菌。
7.根据权利要求3所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于采用低温喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。
8.根据权利要求7所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述低温喷雾干燥的条件为进风温度80℃，出风温度55- 60℃；冷冻干燥采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为-60℃，真空度为0.05MPa。
9.根据权利要求3所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于通过超滤、凝胶层析、离子交换层析、透析后再经冻干制成医药级酶制剂。
10.根据权利要求9所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述制备医药级酶制剂的具体要求如下：
（1）超滤：
将上述的无细胞酶液进行超滤，超滤条件为采用截流分子量为30kDa的超滤膜，将无细胞的酶液浓缩为初始体积的1/5；
（2）凝胶层析：
将浓缩液加入到预先用50 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex G75层析柱中，并用相同缓冲液进行洗脱，流速为0.25 mL/min，检测波长为了280nm，收集有活性的部分；
（3）离子交换层析：
将收集到的全部活性部分加入到预先用50 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液平衡的SP sepharose High Performance层析柱中，用含0-0.25mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为3 mL/min，检测波长为了280nm，收集活性部分。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013100720243A CN103146661A (zh) | 2013-03-07 | 2013-03-07 | MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013100720243A CN103146661A (zh) | 2013-03-07 | 2013-03-07 | MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103146661A true CN103146661A (zh) | 2013-06-12 |
Family
ID=48544982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013100720243A Pending CN103146661A (zh) | 2013-03-07 | 2013-03-07 | MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103146661A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107384820A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-11-24 | 华东理工大学 | 一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100497632C (zh) * | 1999-09-30 | 2009-06-10 | 味之素株式会社 | 转谷氨酰胺酶的制备方法 |
| CN100569943C (zh) * | 2007-10-31 | 2009-12-16 | 天津大学 | β-甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法 |
-
2013
- 2013-03-07 CN CN2013100720243A patent/CN103146661A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100497632C (zh) * | 1999-09-30 | 2009-06-10 | 味之素株式会社 | 转谷氨酰胺酶的制备方法 |
| CN100569943C (zh) * | 2007-10-31 | 2009-12-16 | 天津大学 | β-甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| LILI ZHANG ET AL.: "Enhancement of transglutaminase production in Streptomyces mobaraensis as achieved by treatment with excessive MgCl2", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 * |
| LILI ZHANG ET AL.: "Enhancement of transglutaminase production in Streptomyces mobaraensis DSM 40587 by non-nutritional stress conditions: Effects of heat shock, alcohols, and salt treatments", 《KOREAN J. CHEM. ENG.》 * |
| 宋林等编著: "《生物技术学导论》", 31 December 2006, 北京市：中国人民大学出版社 * |
| 张莉丽: "MgCl2胁迫调控茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶合成及酶应用特性研究", 《万方数据知识服务平台》 * |
| 日本发酵工程学会编: "《微生物工程的基础和应用》", 30 September 1988, 轻工业出版社 * |
| 葛绍荣等: "《发酵工程原理与实践》", 31 August 2011, 华东理工大学出版社 * |
| 韩洛川编: "《生物技术学导论》", 31 December 2006, article "酶的分离纯化", pages: 110-113 * |
| 颜真，张英起主编: "《蛋白质研究技术》", 31 December 2007, 第四军医大学出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107384820A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-11-24 | 华东理工大学 | 一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株及其应用 |
| CN107384820B (zh) * | 2017-07-25 | 2020-04-07 | 华东理工大学 | 一株谷氨酰胺转氨酶高产诱变菌株及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106701719B (zh) | 利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素k2和纳豆激酶的方法 | |
| CN103695341B (zh) | 一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法 | |
| CN101955960B (zh) | 一种利用类弹性蛋白标签纯化重组乳糖酶的方法 | |
| CN103602651A (zh) | 一种纳豆激酶生产方法 | |
| CN112961845B (zh) | 敲除cslA基因以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法 | |
| CN112813085A (zh) | 焦磷酸酶基因的用途 | |
| CN106148296A (zh) | 一种重组谷氨酰胺转氨酶的生产方法 | |
| CN102719411A (zh) | 一种微生物谷氨酰胺转胺酶及其应用 | |
| CN105734092B (zh) | 一种酶法制备d-塔格糖的方法 | |
| CN102618601B (zh) | 利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法 | |
| CN108841882A (zh) | 一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法 | |
| CN108998437A (zh) | 一种纳豆激酶液态发酵方法 | |
| CN103146660A (zh) | 应激条件提高茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶产量的方法 | |
| CN102604899B (zh) | 一种包含l-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用 | |
| CN103993022B (zh) | 低分子量透明质酸的制备方法及工程菌 | |
| CN103146661A (zh) | MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法 | |
| CN103103205B (zh) | 编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用 | |
| CN102382771B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化制备京尼平的方法 | |
| CN108949728B (zh) | 一种纳豆激酶干燥保护剂 | |
| CN103305495B (zh) | 一种制备谷氨酸脱羧酶的方法 | |
| CN106754829A (zh) | 一种利用芽孢杆菌hs17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用 | |
| CN103275918B (zh) | 高产dl-丙氨酸的生产菌株及其应用 | |
| CN107236772B (zh) | 一种制备褐藻寡糖的方法 | |
| CN103725724A (zh) | 一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法 | |
| CN108503859A (zh) | 一种利用干酪乳杆菌发酵大豆蛋白-葡萄糖混合液制备大豆蛋白凝胶的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130612 |