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CN103119062A - 修饰的单结构域抗原结合分子及其应用 - Google Patents

修饰的单结构域抗原结合分子及其应用 Download PDF

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CN103119062A
CN103119062A CN2011800448671A CN201180044867A CN103119062A CN 103119062 A CN103119062 A CN 103119062A CN 2011800448671 A CN2011800448671 A CN 2011800448671A CN 201180044867 A CN201180044867 A CN 201180044867A CN 103119062 A CN103119062 A CN 103119062A
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CN
China
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sdab
molecule
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single domain
peg
Prior art date
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CN2011800448671A
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马丁·黑根
斯特凡娜·于贝尔·奥兰德
尤利娅·武格迈施特
徐鑫
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Ablynx NV
Original Assignee
Ablynx NV
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Abstract

本发明涉及修饰的单结构域抗原结合分子，例如，SDAB分子，特别是结合TNFa的SDAB分子。本发明还公开了制备本发明所述的修饰的单结构域抗原结合分子的方法和使用本发明所述的修饰的单结构域抗原结合分子治疗例如TNFa-相关病症的方法。

Description

修饰的单结构域抗原结合分子及其应用
本申请要求于2010年7月16日提交的美国临时申请号61/365,307的优先权，该优先权申请的内容通过引用结合于此。
背景
肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的分泌的和膜结合的促炎性细胞因子。TNFa的合成在各种慢性自身免疫炎性疾病中被上调，所述慢性自身免疫炎性疾病如类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、局限性肠炎(Crohn′s Disease)及其他。TNFα表达为三聚体跨膜蛋白，其可以被TNFα转化酶(TACE)蛋白水解切割，从而释放其可溶形式。两种形式的TNFα均与TNF受体(TNFR)1和TNFR2相互作用。
概述
本发明涉及修饰的单结构域抗原结合分子(single domain antigenbinding molecules，在本文中还称为“SDAB分子”)。所述修饰的SDAB分子可以包含一个或多个与一种或多种靶标相互作用(例如，与之结合)的单抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子的一个或多个单抗原结合结构域与肿瘤坏死因子α(TNFα)结合。所述SDAB分子可以被修饰，从而增加其体内生物特性。例如，所述SDAB分子可以被修饰，从而与未修饰的SDAB分子相比改善下述中的一种或多种：增加的半衰期；减少的免疫原性；或改善至少一种药动学/药效学(PK/PD)参数。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子包含一种或多种聚合物分子，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。所述修饰的SDAB分子是有用的，例如，用于施用给受试者，例如人。本发明还公开了制备所述修饰的SDAB分子的方法，和使用所述修饰的SDAB分子治疗或预防例如TNFα-相关病症的方法。
因此，在一个方面中，本发明描述一种修饰的SDAB分子，所述分子包括：(i)与一种或多种靶标(例如，TNFα)相互作用(例如，与之结合)的一个或多个单抗原结合结构域；(ii)连接体(例如，非肽连接体和/或肽连接体)；和(iii)一个或多个聚合物分子，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。在一个实施方案中，所述SDAB分子的连接体是非肽连接体。在某些实施方案中，可以通过与第二结构部分(例如，聚合物分子)缔合，例如，共价或非共价缔合，而修饰所述SDAB分子。例如，所述SDAB分子可以共价连接适当的药用聚合物，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。
在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子包括一个或多个单结合结构域。例如，所述SDAB分子可以包括这样的多肽(例如，单链多肽)或由这样的多肽(例如，单链多肽)组成，所述多肽包含至少一个免疫球蛋白可变结构域(包括一个、两个或三个互补决定区(CDRs))。SDAB分子的实例包括天然缺乏轻链的分子(例如，VHH、纳米抗体或骆驼科动物来源的抗体)。所述SDAB分子可以来源于骆驼科动物或从骆驼科动物获得，所述骆驼科动物诸如骆驼(camel)、美洲驼(llama)、单峰骆驼(dromedary)、羊驼(alpaca)和栗色羊驼(guanaco)。在其他实施方案中，所述SDAB分子可以包括一种或多种单结构域分子，其包括但不限于，其他天然存在的单结构域分子(例如，鲨鱼单结构域多肽(IgNAR))和单结构域构架(例如，纤连蛋白构架)。
在另一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子是包含一个或多个单抗原结合结构域的单链多肽。所述SDAB分子可以例如，在相同或不同的表位结合相同的靶标，或结合不同的靶标。SDAB分子的单抗原结合结构域可以具有相同或不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，SDAB分子是单价的或多价的(例如，二价、三价或四价)。在其他实施方案中，SDAB分子是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性、三特异性或四特异性)。所述SDAB分子可以包含一个或多个单抗原结合结构域，所述结构域可以是重组的、CDR-嫁接的、人源化的、骆驼源化的、去免疫的(de-immunized)和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)。例如，SDAB分子可以是单链融合多肽，包含与一种或多种靶抗原结合的一个、两个、三个、四个或更多个单抗原结合结构域。典型地，靶抗原是哺乳动物蛋白，例如，人蛋白。在一个实施方案中，靶抗原是TNFα，例如，人TNFα。
在一个示例性的实施方案中，所述修饰的SDAB分子是一种二价分子，其包含与靶抗原(例如，TNFα)结合的两种单抗原结合结构域(例如，两个骆驼科动物可变区)的单链多肽融合体(fusion)。所述修饰的SDAB分子的单抗原结合结构域从N端到C端可以按下述顺序排列：结合TNFα的单抗原结合结构域-(任选地连接基团，例如，肽连接体)-结合TNFα的单抗原结合结构域-一个或多个聚合物分子。在一个实施方案中，所述单抗原结合结构域与靶抗原上相同的表位结合(例如，使用相同或不同的单抗原结合结构域)。在其他实施方案中，SDAB分子的单抗原结合结构域结合相同或不同靶标上的不同的表位。应该理解，本发明包括两个、三个、四个或更多个针对一种或多种靶标的单抗原结合结构域的任意顺序或组合。
在其他实施方案中，所述修饰的SDAB分子的两个、三个、四个或更多个单结构域分子用或不用连接基团缔合(例如，融合)为遗传或多肽融合体。所述连接基团可以是本领域技术人员知晓的任意连接基团。例如，所述连接基团可以是长度为1至100个原子的生物相容的聚合物。所述连接基团可以是肽或非肽连接体。在一个实施方案中，所述连接基团是肽连接体，例如，其包括下述或由下述组成：聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酰胺、聚异亮氨酸或聚精氨酸残基、或它们的组合。例如，聚甘氨酸或聚丝氨酸连接基团可以包括至少五个、七个、八个、九个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、三十五个和四十个甘氨酸和丝氨酸残基。可以使用的示例性的连接基团包括Gly-Ser重复，例如，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个重复的(Gly)3-Ser(SEQ ID NO：7)或(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：8)重复。在一些实施方案中，连接基团具有下述序列：(Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser(SEQ ID NO：9)或((Gly)4-Ser)n(SEQ ID NO：10)，其中n为4，5或6。在一个实施方案中，连接基团包括下述序列：((Gly)4-Ser)n(SEQ ID NO：10)，其中n＝6。所述修饰的SDAB分子可以另外在单抗原结合结构域的C端包括连接基团(例如，在本文中称为“C端连接基团”)以促使SDAB与另一个结构部分(例如，载体分子、非肽连接体或结构部分)的连接。本文所述的任意连接基团可以用作C端连接基团。在一个实施方案中，使用一个或多个Gly-Ser重复；例如，使用(Gly)3-Ser或(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：8)的一个或多个重复。
在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子(在本文中称为″SDAB-01″)包含下述或由下述组成：图1所示的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)，或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，相对于图1所示的氨基酸序列，与其至少85％、90％、95％以上相同的氨基酸序列，或具有至多20，15，10，5，4，3，2，1个氨基酸变化(例如，缺失、插入或取代(例如，保守取代))的氨基酸序列)。编码SEQ ID NO：1的两个单抗原结合结构域的核苷酸序列提供为SEQ ID NO：6(见表12)。在其他实施方案中，所述修饰的SDAB包含由SEQ ID NO：6或与其基本上相同的核苷酸序列(例如，相对于SEQ ID NO：6的氨基酸序列，与其至少85％、90％、95％以上相同的核苷酸序列，或具有至多60，45，30，15，12，9，6，3个核苷酸变化的核苷酸序列)编码的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
另外的单结构域分子的实例包括，但不限于，WO2006/122786(通过引用结合于此)的表19中公开的氨基酸序列，并且其也在下表11中公开。
在某些实施方案中，与TNFα结合的修饰的SDAB分子的至少一个单抗原结合结构域包含一个、两个或三个具有下述氨基酸序列的CDRs：DYWMY(SFQ ID NO：2)(CDRl)，EINTNGLITKYPDSVKG(SEQ ID NO：3)(CDR2)和/或SPSGFN(SEQ ID NO：4)(CDR3)，或具有由于少于3、2或1个氨基酸取代(例如，保守取代)而与所述CDRs中之一不同的CDR。在其他实施方案中，所述单抗原结合结构域包含具有图1的约1-115位氨基酸的氨基酸序列、或基本上与其相同的氨基酸序列(例如，相对于图1所示的氨基酸序列，至少85％、90％、95％以上相同的氨基酸序列，或具有至多20，15，10，5，4，3，2，1个氨基酸变化(例如，缺失、插入或取代(例如，保守取代))的氨基酸序列)的可变区。在一些实施方案中，结合TNFα的SDAB分子具有图1所示的结合TNFα的单结构域抗体分子的一种或多种生物活性。例如，结合TNFα的SDAB分子结合与图1所示的结合TNFα的单结构域分子所识别的表位相同的表位或相似的表位(例如，结合以其三聚体形式存在的TNFα；结合与TNF受体接触的TNFα位点；结合TNFα三聚体中的表位，所述表位包含在第一TNF单体(单体A)上位置88的Gln，在位置90的Lys，在第二TNF单体(单体B)上的位置146的Glu，或如WO06/122786中公开的表位)。在其他实施方案中，结合TNFα的SDAB分子结合TNFa的N端。在其他实施方案中，结合TNFα的SDAB分子具有与WO06/122786中公开的结合TNFα的单结构域分子相似的活性(例如，结合亲和力、解离常数、结合特异性、TNFα抑制活性)。
其他实施方案中，所述结合TNFα的SDAB分子包括表11中公开的一种或多种SDAB分子，其也公开在WO2006/122786中(其通过引用结合于此)。例如，所述结合TNFα的SDAB分子可以是WO2006/122786的表9中公开的单价的、二价的或三价的结合TNFα的SDAB分子。示例性的结合TNFα的SDAB分子包括，但不限于，TNF1，TNF2，TNF3，及其人源化的形式(例如，TNF29，TNF30，TNF31，TNF32，TNF33)。单价结合TNFα的SDAB分子的另外的实例公开在WO2006/122786的表8中。示例性的二价的结合TNFα的SDAB分子包括，但不限于，TNF55和TNF56，其包含通过肽连接体连接的两个TNF30SDAB分子，从而形成单融合多肽(在WO2006/122786中公开)。二价的结合TNFα的SDAB分子的另外的实例公开在本文的表11中，或在WO2006/122786的表19中公开为TNF4，TNF5，TNF6，TNF7，TNF8)。
在某些实施方案中，所述SDAB分子被修饰，从而包含一个或多个聚合物分子，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。所述PEG分子(例如，PEG单体、其聚合物或衍生物)可以是直链的或支链的。在一个实施方案中，所述SDAB通过连接体结构部分(例如，非肽连接体)连接至一个或多个PEG分子。
在一些实施方案中，所述连接体是非肽连接体。在一个实施方案中，所述连接体由式(I)所示：
Figure BDA00002930903500051
其中
W1和W2各自独立地选自键或NR1；
Y是键，被0-2个存在的Ra取代的C1-4亚烷基，或吡咯烷-2，5-二酮；
X是O，键或不存在；
Z不存在，是O，NR3，S或键；
R1和R3各自独立地是氢或C1-6烷基；
R2不存在或是一个或多个聚合物结构部分；
Ra选自羟基、C1-4烷基或C1-4烷氧基；
m是0或1；
n是0，1，2或3；且
p是0，1，2，3或4。
在一些实施方案中，所述SDAB分子的一个或多个聚合物结构部分(例如，式(I)中的R2)包含聚(乙二醇)(PEG)分子(例如，PEG单体、其聚合物或衍生物)。在一些实施方案中，所述PEG分子是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)单体、其聚合物或衍生物。
在一些实施方案中，所述PEG分子是支链的。在一些实施方案中，所述PEG分子选自式(a)-(h)的结构部分：
Figure BDA00002930903500061
其中每个PEG分子独立地为PEG单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG分子是mPEG单体、其聚合物或衍生物。
在一些实施方案中，Y是键。在一些实施方案中，Y是吡咯烷-2，5-二酮。在一些实施方案中，Y是被0-2个存在的Ra取代的C1-4亚烷基。在一些实施方案中，Y是被1个存在的Ra取代的C1-4亚烷基。在一些实施方案中，Y是被1个存在的Ra取代的亚甲基。在一些实施方案中，Ra是羟基。
在一些实施方案中，X是键。在一些实施方案中，X是氧(O)。在一些实施方案中，X不存在。
在一些实施方案中，R2是(a)。
在一些实施方案中，R2是(g)。
在一些实施方案中，W1是键。在一些实施方案中，W1是NR1。
在一些实施方案中，W2是键。在一些实施方案中，W2是NR1。
在一些实施方案中，R1是氢。
在一些实施方案中，Z是O，S或键；
在一些实施方案中，Z是O。
在一些实施方案中，R3是氢。
在一些实施方案中，m是0。在一些实施方案中，m是1。
在一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。
在一些实施方案中，p是0。在一些实施方案中，p是3。
在一些实施方案中，每个PEG分子独立地为PEG单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG分子是甲氧基PEG衍生物(mPEG)单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有1KDa至100KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有10KDa至50KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有40KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有15KDa至35KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有30KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有20KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有17.5KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有12.5KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有10KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有7.5KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立地具有5KDa的分子量。
在一些实施方案中，所述修饰的SDAB分子包含与PEG分子连接的式(I)的连接体，并且具有选自下述的结构：
在一些实施方案中，所述修饰的SDAB分子包含与PEG分子连接的式(I)的连接体，并且具有选自下述的结构：
或
Figure BDA00002930903500091
其中每个PEG分子独立地为PEG单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG分子是mPEG单体、其聚合物或衍生物。
在一些实施方案中，式(I)的连接体与PEG分子连接，由下式所示：
Figure BDA00002930903500092
在一些实施方案中，式(I)的连接体与PEG分子连接，由下式所示：
Figure BDA00002930903500093
在一些实施方案中，式(I)的连接体与PEG分子连接，由下式所示：
Figure BDA00002930903500094
连接体-PEG分子可以与SDAB分子缔合(例如，偶联)，由此形成修饰的SDAB分子。所述SDAB分子的单结构域分子从N端到C端可以按下述顺序排列：结合TNFα的单结构域分子-结合TNFα的单结构域分子-PEG分子(例如，支链的PEG分子)。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子由下式所示：
Figure BDA00002930903500101
在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子由下式所示：
Figure BDA00002930903500102
在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子由下式所示：
所述修饰的SDAB分子的一个示例性的实施方案由下式所示：
Figure BDA00002930903500104
SDAB分子的反应基团通常通过连接到所述SDAB分子上的亲核结构部分连接。在一些实施方案中，亲核结构部分是硫(例如，来自半胱氨酸残基的硫)。在其他实施方案中，所述亲核结构部分是氮(例如，来自末端α-氨基基团或含氮氨基酸侧链(例如，来自赖氨酸链的ε-氨基基团))。在其他实施方案中，所述亲核结构部分是C端基团。SDAB分子的反应基团通常通过连接到连接体的亲电性结构部分连接。在一些实施方案中，所述亲电性结构部分是羰基基团(例如，活化的酯或醛)。在一些实施方案中，所述亲电性结构部分是马来酰亚胺基团。
在另一个方面中，本发明描述一种制备本发明所述的修饰的SDAB的方法。所述方法包括：提供SDAB分子(例如，从细胞培养物(例如，重组细胞培养物)获得SDAB分子)；并且使所述SDAB分子(例如，单抗原结合结构域，或连接体(例如，与其连接的肽连接体))在形成至少一个化学键的条件下与式(I)的连接体接触，其中Y，X，W1，W2，Z，R1，R2，R3，m，n和p如上文公开。
在一些实施方案中，Y是键。在一些实施方案中，Y是吡咯烷-2，5-二酮。在一些实施方案中，Y是被存在的0-2个Ra取代的C1-4亚烷基。在一些实施方案中，Y是被存在的1个Ra取代的C1-4亚烷基。在一些实施方案中，Y是被存在的1个Ra取代的亚甲基。。在一些实施方案中，Ra是羟基。
在一些实施方案中，X是键。在一些实施方案中，X是氧(O)。在一些实施方案中，X不存在。
在一些实施方案中，R2是(a)。
在一些实施方案中，R2是(g)。
在一些实施方案中，W1是键。在一些实施方案中，W1是NR1。
在一些实施方案中，W2是键。在一些实施方案中，W2是NR1。
在一些实施方案中，R1是氢。
在一些实施方案中，Z是O，S或键；
在一些实施方案中，Z是O。
在一些实施方案中，R3是氢。
在一些实施方案中，m是0。在一些实施方案中，m是1。
在一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。
在一些实施方案中，p是0。在一些实施方案中，p是3。
在一些实施方案中，所述SDAB分子通过半胱氨酸残基连接。
在一些实施方案中，所述SDAB分子在用式(I)的连接体结构部分处理之前被还原。在一些实施方案中，所述SDAB分子被还原以消除在半胱氨酸残基之间形成的二硫键。
在一些实施方案中，式(I)的连接体与PEG分子连接，由下式所示：
Figure BDA00002930903500121
在一些实施方案中，所述修饰的SDAB分子由下式所示：
Figure BDA00002930903500122
在另一个方面中，本发明描述一种组合物，例如，一种药物组合物，其包含本发明所述的修饰的SDAB分子和药用载体。所述组合物还可以包含第二试剂，例如，可用于治疗TNFα相关病症(例如，炎性或自身免疫性病症)的第二治疗或药学活性试剂，所述TNFα相关病症包括，但不限于，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)(例如，中度至严重性类风湿性关节炎)，关节炎性病症(例如，银屑病关节炎(psoriatic arthritis)，多关节青少年特发性关节炎(polyarticular juvenile idiopathic arthritis，JIA))，强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)，银屑病(psoriasis)，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)，局限性肠炎(Crohn′s disease)，炎性肠病(inflammatory bowel disease)和/或多发性硬化病(multiple sclerosis)。
在另一个方面中，本发明描述一种改善受试者中的炎性或自身免疫病况的方法。例如，治疗或预防受试者(例如，人受试者)中的TNFα相关病症(例如，炎性或自身免疫病症)的方法。TNFα相关病症的实例包括，但不限于，类风湿性关节炎(RA)(例如，中度至严重性类风湿性关节炎)，关节炎性病症(例如，银屑病关节炎，多关节青少年特发性关节炎(JIA))，强直性脊柱炎(AS)，银屑病，溃疡性结肠炎，局限性肠炎，炎性肠病和/或多发性硬化病。所述方法包括给受试者，例如人受试者施用使TNFα相关病症的一种或多种症状减轻的量的本发明所述的结合TNFα的修饰的SDAB分子，其单独的或与第二治疗或药学活性试剂联合施用，所述第二治疗或药学活性试剂有效用于治疗TNFα相关病症。
在一个实施方案中，本发明所述的修饰的SDAB分子(例如，包含所述修饰的SDAB分子的组合物)适于施用给受试者，例如人受试者(患有TNFα相关病症的患者)。所述SDAB分子可以通过注射(例如，皮下、血管内、肌内或腹膜内)或通过吸入施用给受试者。
在某些实施方案中，所述修饰的SDAB分子和第二试剂组合施用，例如，同时或顺序地施用。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子和第二试剂在相同的组合物中施用，例如，在本文所述的药物组合物中施用。在一个实施方案中，第二试剂是抗-TNFα抗体分子或其结合TNFα的片段，其中第二TNFα抗体与本文所述的结合TNFα的修饰的SDAB分子结合不同的表位。可以与结合TNFα的修饰的SDAB分子共同施用或共同配制的第二试剂的其他非限制性的实例包括，但不限于，细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂和细胞生长抑制剂。在一个实施方案中，另外的试剂是用于关节炎的标准治疗剂，包括，但不限于，非甾体抗炎剂(NSAIDs)；皮质类固醇，包括泼尼松龙(prednisolone)，泼尼松(prednisone)，可的松(cortisone)和曲安西龙(triamcinolone)；和减轻疾病的抗风湿药(DMARDs)，诸如甲氨喋呤(methotrexate)，羟氯喹(hydroxychloroquine)(Plaquenil)和硫氮磺吡啶(sulfasalazine)，来氟米特(leflunomide)
Figure BDA00002930903500131
肿瘤坏死因子抑制剂，包括伊那西普(etanercept)
Figure BDA00002930903500132
英利昔单抗(infliximab)
Figure BDA00002930903500133
(有或无甲氨喋呤)，和阿达木单抗(adalimumab)
Figure BDA00002930903500134
抗-CD20抗体(例如，
Figure BDA00002930903500135
)，可溶性白介素-1受体，如阿那白滞素(anakinra)
Figure BDA00002930903500136
金，二甲胺四环素(minocycline)
Figure BDA00002930903500137
青霉胺(penicillamine)，和细胞毒性试剂，包括硫唑嘌呤(azathioprine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)和环胞菌素(cyclosporine)。所述组合治疗可以有利地利用低剂量施用的治疗剂，因此避免与各种单一治疗相关的可能的毒性或并发症。赋形剂和/或第二治疗剂的备选的组合可以按照本文提供的指导鉴定并检测。
在另一个方面中，本发明描述评估修饰的SDAB分子(例如，本文所述的修饰的SDAB分子)的方法。所述方法包括将本文所述的修饰的SDAB分子施用给受试者，例如人受试者(例如，患有TNFα-相关病症的患者)；并且评估所述修饰的SDAB分子的一种或多种药动学/药效学(PK/PD)参数。所述SDAB分子可以通过注射(例如，皮下、血管内、肌内或腹膜内)或通过吸入施用给受试者。
在一个相关的方面中，本发明描述一种评估或选择修饰的SDAB分子(例如，本发明所述的修饰的结合TNFα的SDAB分子)的方法。所述方法包括：
提供SDAB分子在受试者(例如，人或动物受试者)中的至少一个PK/PD参数的检测值，例如，平均检测值；和
将所提供的检测值，例如，平均检测值，与至少一个参照值比较，从而评估或选择所述SDAB分子。
在一些实施方案中，提供检测值的步骤包括获得SDAB分子的样品，例如，抗体细胞培养物和/或SDAB分子修饰后的样品批次，并且检测本文所述的至少一种药物代谢动力学参数。从方法观点来看，例如，本文公开的方法可以有效用于监测或确保各批次间的一致性或质量。
在某些实施方案中，评估修饰的SDAB分子的方法还包括：提供样品，例如，包含修饰的SDAB分子的样品；并且在捕获检测测定法中检测所述样品，所述捕获检测测定法例如，实施例11b中所述的蛋白检测或完整分子检测测定法。在一个实施方案中，将样品与固定在固体支持物上的靶标(例如，与结合的链霉抗生物素蛋白缔合的生物素化的靶标分子)接触；使用结合所述修饰的SDAB分子的蛋白结构部分的试剂，例如抗体，来检测结合的SDAB-靶标分子复合物。在所述测定形式中，检测所述修饰的SDAB分子的蛋白结构部分。在其他实施方案中，样品与固定在固体支持物上的靶标(例如，与结合的链霉抗生物素蛋白缔合的生物素化的靶标分子)接触；使用结合所述修饰的SDAB分子的聚合物，例如PEG结构部分的试剂，例如抗体，来检测结合的SDAB-靶标分子复合物。在所述实施方案中，检测所述SDAB分子的聚合物(例如，PEG化的)结构部分。优选地，由于未缀合的SDAB分子不被检测，因此，聚合物(例如，PEG)结构部分的检测捕获完整的修饰的SDAB-聚合物缀合物。
通过所述方法评估的PK/PD参数可以选自下述中的一种或多种：所述修饰的SDAB分子的体内浓度(例如，在血液、血清、血浆和/或组织中的浓度)；所述修饰的SDAB分子的清除率(CL)；所述修饰的SDAB分子的容积分布(Vdss或Vc)；所述修饰的SDAB分子的半衰期(t1/2)；所述修饰的SDAB分子的生物利用度；所述修饰的SDAB分子的最大血液、血清、血浆或组织浓度；所述修饰的SDAB分子的暴露(AUC＝浓度-时间曲线下面积)；或所述修饰的SDAB分子的组织与血清的AUC或浓度比率、组织与血浆的AUC或浓度比率、或组织与血液的AUC或浓度比率；所述修饰的SDAB分子的完整或降解产物的尿浓度；或在血清、血浆或组织中游离的、结合的和全部靶标浓度。
在一个实施方案中，所述一种或多种PK/PD参数在给受试者施用所述修饰的SDAB分子后一个、两个或更多个预先确定的时间间隔进行评估。在一个实施方案中，与参照标准(例如，未修饰的SDAB分子)相比，所述修饰的SDAB分子的至少一种PK/PD参数被改变，例如，被提高。例如，与未修饰的SDAB分子相比，所述修饰的SDAB分子具有提高的半衰期和/或生物利用度；不同的组织分布(例如，定位在不同的组织或器官(例如，小肠或大肠))中的一项或多项。在某些实施方案中，所述PK/PD参数用来提供关于治疗的功效值或适用性的量度。其他的功效量度包括，但不限于，一种或多种症状的改善，提高的生活质量，炎性标记的减少，可以另外作为功效评估的一部分进行。
在一些实施方案中，记录或存储，例如在计算机可读媒体中记录或存储所述一种或多种PK/PD参数、功效值、或是否满足预先选择的功效标准的指示。所述值或满足预先选择的功效标准的指示可以列在产品插页、纲要(例如，美国药典)或任意其他材料上，例如，可能被配送的标记，例如，用于商业用途，或用于提交给美国或外国管理结构的标记。
在另一个方面中，本发明描述一种用于检测的方法，或捕获检测测定法，例如，实施例11b所述的蛋白检测或完整分子检测测定法。所述方法或测定法包括：提供包含修饰的SDAB分子的样品(例如，获得由施用SDAB分子后的受试者获得的样品)；将所述样品与固定在固体支持物上的靶标(例如，TNFα)(例如，与结合的链霉抗生物素蛋白缔合的生物素化的靶标分子)接触；使用与所述修饰的SDAB分子的蛋白或聚合物(例如，PEG)结构部分结合的试剂，例如抗体，来检测结合的SDAB-靶标复合物。在试剂与SDAB分子的蛋白结构部分结合的测定形式中，检测所述修饰的SDAB分子的蛋白结构部分。在试剂与所述修饰的SDAB分子的PEG结构部分结合的测定形式中，检测所述SDAB分子的聚合物(例如，PEG化的)结构部分。优选地，由于未缀合的SDAB分子不被检测，因此，PEG结构部分的检测捕获完整的修饰的SDAB-聚合物缀合物。
在另一个方面中，本发明描述一种试剂盒或制品，其包括包含本发明所述的SDAB分子或组合物的装置、注射器或小瓶。所述试剂盒或制品可以任选地包括使用说明书。在某些实施方案中，所述注射器或小瓶包括玻璃、塑料或聚合物材料，诸如环状烯烃聚合物或共聚物。在其他实施方案中，制剂可以存在于注射装置(例如，注射用注射器，例如，预先填充的注射用注射器)。注射器可以适用于单次施用，例如，作为包括自动注射器的单瓶系统(例如，笔式注射器装置)，和/或使用说明书。在一个实施方案中，注射装置是预先填装的笔或其他适合的自动注射装置，任选地具有使用和施用说明书。
在某些实施方案中，向受试者(例如，患者或保健供应者)提供所述试剂盒或制品(例如，具有单个或多个剂量单位的预先填装的笔或注射器)，其预先包装有通过注射(例如，皮下、血管内、肌内、关节内或腹膜内)施用(例如，自我施用)的说明书。
在其他实施方案中，本发明描述用于鼻、透皮、静脉内施用本文所述的制剂的装置。例如，提供用于施用本发明所述的制剂的透皮贴剂。在其他情形中，提供用于施用本发明所述的制剂的静脉输液袋。在一些实施方案中，所述静脉输液袋提供有生理盐水或5％葡萄糖。
在另一个方面中，本发明描述指导需要修饰的SDAB分子(例如，TNFαSDAB分子)的患者(例如，人患者)怎样施用本发明所述的修饰的SDAB分子或组合物的方法。所述方法包括：(i)给所述患者提供至少一个单位剂量的本发明所述的SDAB分子；和(ii)指导所述患者自我施用所述至少一个单位剂量，例如，通过注射(例如，皮下、血管内、肌内或腹膜内)施用。在一个实施方案中，所述患者患有TNFα相关病症，例如，本文所述的炎性或自身免疫病症。
在另一个方面中，本发明描述一种指导接受者施用本发明所述的修饰的SDAB分子的方法。所述方法包括指导所述接受者(例如，终端使用者，患者，医师，药品零售或批发商，发行商，或医院的药学机构、护理家庭诊所或HMO)应该怎样将制剂施用给患者。
在另一个方面中，提供一种分配本发明所述的修饰的SDAB分子的方法。所述方法包括给接受者(例如，终端使用者，患者，医师，药品零售或批发商，发行商，或医院的药学机构、护理家庭诊所或HMO)提供包含足够单位剂量的SDAB分子的包装，从而治疗患者至少6，12，24或36个月。
在另一个方面中，本发明描述一种评估包含本发明所述的修饰的SDAB分子的制剂的一个包装或多个包装的质量(例如，确定其是否已经过期)的方法。所述方法包括评估所述包装是否已经过期。有效期是从预先选择的事件(诸如制备、测定或包装)起至少6，12，24，36或48个月，例如，大于24或36个月。在一些实施方案中，取决于产品是否已经过期，基于分析结果作为决定或步骤，例如，使用或丢弃、分类、选择、许可或扣留、船运、运到新的地点、许可进入商业、出售、或承诺销售包装中的SDAB分子。
在另一个方面中，本发明描述一种符合管理要求(例如，管理机构(如FDA)的许可后要求)的方法。所述方法包括提供抗体制剂关于参数的评估，如本文所述。许可后要求可以包括测量一种或多种上述参数。所述方法还包括，任选地，确定所观察到的溶液参数是否满足预先选择的标准或所述参数是否在预先选择的范围内；任选地，将分析的值或结果递交或传送至给所述机构，例如，通过将所述值或结果传输给管理结构进行。
在另一个方面中，本发明描述一种使得一批修饰的SDAB分子(例如，TNFαSDAB分子)具有预先选择的特性(例如，满足许可说明，标记要求，或简明的要求，例如，本发明所述的特性)的方法。所述方法包括提供包含所述修饰的SDAB分子的测试样品；按照本文所述的方法分析所述测试样品；确定测试制剂是否满足预先选择的标准，例如，与参照值(例如，本文所述的一个或多个参照值)具有预先选择的关系，并且选择所述测试样品制剂来制备一批产品。
在另一个方面中，本发明描述多个批次的修饰的SDAB分子(例如，TNFαSDAB分子)的制剂，其中关于每个批次的一种或多种参数(例如，通过本文所述的方法确定的值或溶液参数)从预先选自的需要的参照值或标准的变化小于预先选择的范围，例如，本发明所述的范围或标准。在一些实施方案中，确定关于一个或多个批次的制剂的一种或多种参数，并且基于确定的结果选择一个批次或多个批次。一些实施方案包括将确定的结果与预先选择的值或标准(例如，参照标准)进行比较。其他实施方案包括调整待施用的批次的剂量，例如，基于所述值或参数确定的结果进行调整。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用完全结合于此。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的普通技术人员常规理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等价的方法和材料可以在实践中使用或者用于检测本发明，但是下文描述适当的方法和材料。另外，所述材料、方法和实施例仅是举例说明性的，并不意欲是限制性的。
本发明的其他特征和优点将通过详细的说明书、附图和权利要求书变得清楚。
附图简述
图1是SDAB-01(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。粗体CDRs对应于单抗原结合结构域结构单元，其分别具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-115的氨基酸序列。挠性连接体以小写字母表示。支持位点特异性PEG化的改造的C端半胱氨酸也以粗体显示。
图2是用在分子SDAB-01中的聚乙二醇(PEG)(分子量40,000；2x20kDa)。PEG活化的基团是马来酰亚胺。
图3是SDAB-01的示意图。
图4A示意直链mPEG-马来酰亚胺(对照2)和两个支链mPEG-马来酰亚胺([SEQ ID NO：1]-PEG40和SDAB-01)的结构。图4B是比较SDAB-01与[SEQ ID NO：1]-PEG40的尺寸的扫描图。
图5是在表达膜结合的TNFα的CHO-TNF-D13(pW2128)细胞上SDAB-01的细胞表面染色的FACS(“荧光活化的细胞分选”)扫描图。细胞按顺序用SDAB-01、生物素化的抗-PEG和链霉抗生物素蛋白-PE(灰色填充)染色或者在链霉抗生物素蛋白-PE后模拟染色(白色填充)。
图6显示在使用人或恒河猴TNFα的细胞毒性测定中，与未PEG化的SDAB多肽对照3和对照4比较，SDAB-01的剂量反应曲线。
图7显示针对SDAB-01的TNFα结合曲线。在固定的SDAB-01上注射0.195nM-100nM的不同浓度的(a)人，(b)猕猴(rhesus macaque)，(c)大鼠和(d)小鼠TNFα，和(e)0.195-400nM的兔TNFα。每个数据组代表至少两次独立的实验。
图8是描述在鼠气囊模型中在实验1中，SDAB-01对全白血细胞浸润的作用的图。
图9是描述在鼠气囊模型中在实验1中，SDAB-01对嗜中性粒细胞浸润的作用的图。
图10是描述在鼠气囊模型中在实验2中，SDAB-01对全白血细胞浸润的作用的图。
图11是描述在鼠气囊模型中在实验2中，SDAB-01对嗜中性粒细胞浸润的作用的图。
图12是描述在鼠气囊模型中在实验3中，SDAB-01对全白血细胞浸润的作用的图。
图13是描述在鼠气囊模型中在实验3中，SDAB-01对嗜中性粒细胞浸润的作用的图。
图14是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中每周的体重的图。
图15是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中每周的平均疾病严重性评分的图。
图16是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中在治疗后7周的疾病严重性的图。
图17是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中在治疗后7周的微观组平均严重性评分的图。
图18是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中在治疗后7周的微观组平均严重性评分与疾病严重性评分的比较的图。
图19是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1，0.03mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中每周的体重的图。
图20是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1，0.03mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中每周平均疾病严重性评分的图。
图21是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1，0.03mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中在治疗后7周的疾病严重性评分的图。
图22是显示用10，3，1，0.3，0.1，0.03mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂每周两次治疗后的微观组平均严重性评分的图。
图23是显示在每周两次接受10，3，1，0.3，0.1，0.03mg/kg的SDAB-01、1mg/kg的对照SDAB、10和3mg/kg的英利昔单抗、10mg/kg的对照抗体或10ml/kg的赋形剂的动物中在治疗后7周的微观组平均严重性评分与疾病严重性评分的比较的图。
图24是显示在雄性食蟹猴中在单次IV或SC施用3mg/kg后SDAB-01的平均(±SD)血清浓度-时间曲线的图。
图25是显示在对小鼠、大鼠或食蟹猴单次IV给药后PEG化的TNFαSDAB多肽的平均(±SD)剂量-标准化血清浓度的图。对B6CBAF1/J小鼠(A；对于2x20kDa PEG缀合物2mg/kg，对于其余两种缀合物3mg/kg)；Sprague-Dawley大鼠(B；2mg/kg)或食蟹猴(C；3mg/kg)施用单次IV推注剂量的TNFαSDAB多肽2x20kDa PEG(实心圆)，TNFαSDAB多肽4x10kDa PEG(空心圆)或TNFαSDAB多肽1x40kDa PEG(实心三角形)。对于小鼠和猴子的PK研究(A和C)，使用未标记的测试产品，而对于大鼠PK研究(B)，使用125I-标记的测试产品。对小鼠使用非连续取样(每个时间点n＝3)，对于大鼠(每种化合物n＝5-7)和猴子(每种化合物n＝3)使用连续取样。通过特异性免疫测定(小鼠和猴子；单位为ng/mL)或γ-计数(大鼠；单位为ng eq./mL)确定血清浓度。存活持续时间对于小鼠、大鼠和猴子分别为14，24和56-62天。将低于定量限度(LOQ)的个体动物浓度处理为零，以用于计算平均值和SD。数据显示在每个时间点的平均值(±SD)剂量-标准化的浓度(即，对于1mg/kg的剂量)。在对数级别上没有显示具有0ng/mL的平均血清浓度(即，低于所有动物的LQQ)的数据点。
图26是显示在向小鼠单次0.3mg/kg IV给药后125I-标记的PEG化TNFαSDAB多肽的平均组织和血清暴露(AUC0-168小时)的图。对B6CBAF1/J小鼠施用单次0.3mg/kg IV推注剂量的125I-标记的TNFαSDAB分子支链的2x20kDa PEG(黑色柱)或TNFαSDAB分子直链40kDaPEG(灰色柱)。在7天(168小时)内收集血清和组织样品(每个时间点n＝8-12)并且通过γ-计数确定组织和血清中的放射性等价物(RE)浓度。使用零星取样法(sparse sampling method)通过不分区分析(non-compartmental analysis)确定血清(单位μgxeq./mL)和每种组织(μgx eq./g)中的AUC0-168hr(时间从0至168小时的在浓度-时间曲线下面积)，并且使用平均值的标准误差计算95％的置信区间(95％CI，图上的误差条)。星形(*)表示AUC0-168hr在两种构建体之间的统计学显著性差异(p＜0.05)。
图27是PEG化的TNFαSDAB多肽的阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)曲线的图。用制剂缓冲液将每种物质的蛋白浓度调整至1.0mg/mL，并且将10μL注射到Dionex ProPac WCX-10柱上。流动相A是10mM甲酸铵，pH4.0。流动相B是10mM甲酸铵，500mM氯化钠，pH4.0。蛋白缀合物用氯化钠的线性梯度以0.75mL/min的流速洗脱(40分钟内0-40％B)。监测280nm处的吸光度。
图28是显示PEG化的TNFαSDAB多肽的具有多角度光散射的大小排阻高效液相色谱(SEC-MALS)曲线的图。TNFαSDAB多肽2x20kDaPEG(虚线)，TNFαSDAB多肽4x10kDa PEG(点线)或TNFαSDAB多肽1x40kDa PEG(实线)稀释至2.0mg/mL，并且将100μL每种样品注射到保持在30℃的Superose6流动相柱上。使用来自Wyatt Technologies的ASTRAV v5.3.4.14确定保留时间(线)、总质量(实心圆)、PEG质量(空心三角形)和蛋白质量(x)。
图29是显示确定流体动力学半径(Rh)和均方根半径(RMS或Rg)的图。TNFαSDAB多肽2x20kDa PEG(虚线和空心正方形)，TNFαSDAB多肽4x10kDa PEG(绿色线条和符号)或TNFαSDAB多肽1x40kDa PEG(点线和空心三角形)稀释至2.0mg/mL，并且将100μL每种样品注射到保持在30℃的Superose6柱流动相上。使用来自Wyatt Technologies的ASTRA V v5.3.4.14进行保留时间(实线和实心圆)、Rh(A)和RMS(B)分析。
图30是显示与SDAB-01比较的对照1、对照2、对照3和对照IgG1抗体的ADCC活性的图，使用CSFE标记的CHO-TNFD13(pW2128)细胞作为靶标，人NK细胞作为效应器。％ADCC活性值计算为是7AAD+的靶细胞的％。绘图的值是使用测试试剂的％7AAD+靶细胞减去在仅有效应细胞存在下的％7AAD+靶细胞。该图代表进行的四次独立的ADCC测定，其证明对于SDAB-01没有ADCC活性。
图31是显示在体外在幼兔补体存在下在CHO-TNF-D13(pW2128)细胞系上与SDAB-01比较的对照1、对照2、对照3和对照IgG1抗体的CDC活性的图。细胞毒性通过死细胞的7AAD摄入进行评估，绘制的值为使用测试和对照的7AAD+细胞的％减去仅有补体存在下的7AAD+细胞的％。对于阿达木单抗、英利昔单抗和SDAB-01，样品一式两份运行两次。该图代表进行的三次独立的测定，其证明对于SDAB-01没有CDC活性。
详述
本发明涉及修饰的单结构域抗原结合分子(single domain antigenbinding molecules，在本文还称为″SDAB分子″)。所述修饰的SDAB分子可以包含一个或多个与一种或多种靶标相互作用(例如，与之结合)的单抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子的一个或多个单抗原结合结构域与肿瘤坏死因子α(TNFα)结合。所述SDAB分子可以被修饰，从而增加其体内生物特性。例如，所述SDAB分子可以被修饰，从而与未修饰的SDAB分子相比改善下述中的一种或多种：增加的半衰期；减少的免疫原性；或改善至少一种药动学/药效学(PK/PD)参数。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子包含一种或多种聚合物分子，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。所述修饰的SDAB分子是有用的，例如，用于施用给受试者，例如人。本发明还公开了制备所述修饰的SDAB分子的方法，和使用所述修饰的SDAB分子治疗或预防TNFα-相关病症的方法。
为了更容易地理解本发明，首先定义某些术语。另外的定义在整个详述部分描述。
当用于本文时，冠词“一个”(″a″和″an″)是指一个或多于一个(例如，至少一个)该冠词的语法宾语。
术语“或”用在本文中意为术语“和/或”，并且与术语“和/或”可互换使用，除非上下文另外清楚指明。
术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。
“约”和“大概”应该通常意指对于给定测量的性质或精确度所测量的量的可接受的误差程度。示例性的误差程度为百分之二十(20％)之内，典型地在10％之内，更典型地在给定的值或值的范围内的5％之内。
在核苷酸序列的情形中，术语“基本上相同”用在本文中是指包含足够或最少数目的与第二核苷酸序列中比对的核苷酸相同的核苷酸的第一核苷酸序列，以使第一和第二核苷酸序列编码具有共有功能活性的多肽，或编码共有结构多肽结构域或共有功能多肽活性。例如，与参照序列具有至少约85％，90％.91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的核苷酸序列。
本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，以及它们的任意组合。当提及本发明的蛋白时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相对应的天然抗体或多肽的至少一些功能特性的任意多肽。除了本文其他地方讨论的具体的抗体片段之外，本发明的多肽的片段还包括蛋白水解片段，以及缺失片段。本发明的多肽的变体包括上述片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可以用本领域已知的诱变技术制备。变体多肽可以包括保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。本发明的片段的衍生物是被改变以表现出在天然多肽中不存在的另外的特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可以称为“多肽类似物”。当用在本文中时，多肽的“衍生物”是指通过与官能侧基反应而使一个或多个残基化学衍生的受试多肽。作为“衍生物”还包括的是包含一个或多个二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些多肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；和鸟氨酸可以取代赖氨酸。
术语“功能变体”是指具有与天然存在的序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，或由基本上相同的核苷酸序列编码并且能够具有天然存在的序列的一种或多种活性的多肽。
序列间的同源性或序列相同性(该术语在本文中可互换使用)的计算按下述进行。
为了确定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的同一性百分数，出于最佳比较目的(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或二者中引入缺口以便最佳比对，并且出于比较目的可以忽略非同源序列)，比对所述序列。在典型的实施方案中，为比较目的比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30％，至少40％，至少50％或60％，或至少70％，80％，90％或100％。然后比较在相对应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位置被与第二序列中相对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么在该位置分子是相同的(当用于本文时，氨基酸或核酸“同一性”等价于氨基酸或核酸“同源性”)。
考虑缺口数目和每个缺口的长度(需要引入缺口以便最佳比对两种序列)，两个序列之间的同一性百分数是由所述序列共有的相同位置的数目的函数。
序列的比较和两个序列之间的同一性百分数的确定可以使用数学算法完成。在一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分数使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)48：444-453)算法确定，该算法已经结合在GCG软件包中的GAP程序中(在互联网gcg.com上可用)，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，和16，14，12，10，8，6或4的缺口权重(gap weight)和1，2，3，4，5或6的长度权重(1engthweight)。在另一个实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分数使用GCG软件包中的GAP程序确定(在互联网gcg.com上可用)，其使用NWSgapdna.CMP矩阵和40，50，60，70或80的缺口权重以及1，2，3，4，5或6的长度权重。一组典型的参数(并且是应该使用的一组参数，除非另外指明)是Blossum62评分矩阵，其中缺口罚分为12，缺口延伸罚分为4，和移码缺口罚分为5。
两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分数可以使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4：11-17)的算法确定，其已经结合在ALIGN程序(2.0版)中，其使用PAM120权重残基表(PAM120weight residue table)、缺口长度罚分为12，和缺口罚分为4。
本文所述的核酸和蛋白序列可以用作“询问序列”来进行针对公共数据库的检索，例如，以鉴定其他家族成员或相关的序列。所述检索可以使用Altschul，等人.(1990)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，评分＝100，字长＝12，以得到与本发明所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以使用XBLAST程序进行，评分＝50，字长＝3，以得到与本发明所述的蛋白(SEQ ID NO：1)分子同源的氨基酸序列。为了得到用于比较目的的有缺口的比对，可以使用GappedBLAST，如在Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402中所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各种程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似的侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。在本领域中已经定义了具有相似的侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具有β-支链的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
在下文更详细地描述本发明的各个方面。
单结构域抗原结合(SDAB)分子
单结构域抗原结合(SDAB)分子包括这样的分子，其互补决定区是单结构域多肽的一部分。实例包括，但不限于，重链可变结构域，天然缺乏轻链的结合分子，纳米抗体TM，来源于常规4-链抗体的单结构域，改造的结构域和不同于来源于抗体的构架之外的单结构域构架。SDAB分子可以是本领域的任何单结构域分子、或任何将来的单结构域分子。SDAB分子可以来源于任何物种，包括，但不限于，小鼠，人，骆驼，美洲驼，鱼，鲨鱼，山羊，兔和牛。该术语还包括来自除骆驼科动物和鲨鱼之外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面中，SDAB分子可以来源于存在于鱼中的免疫球蛋白的可变区，诸如例如，其来源于存在于鲨鱼血清中的已知为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。WO03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.(蛋白质科学)14：2901-2909中记述了来源于NAR(″IgNARs″)的可变区的单结构域分子的制备方法。
按照另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，其已知为缺乏轻链的重链。例如，所述单结构域分子公开在WO9404678和Hamers-Casterman，C.等人.(1993)Nature363：446-448中。为了清楚的原因，本文将该来源于天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域称为VHH或纳米抗体TM，以区分其与常规VH或四链免疫球蛋白。所述VHH分子可以来源于骆驼科物种，例如，骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和栗色羊驼。除骆驼科动物之外的其他物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子；此类VHHs在本发明的范围之内。
所述SDAB分子可以是重组的、CDR-嫁接的、人源化的、骆驼源化的、去免疫的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)，如下文更详细地描述。
术语“抗原-结合”意欲包括多肽的部分，例如，本文所述的单结构域分子的部分，其包含形成与靶抗原结合的界面的决定簇或包含其表位。关于蛋白(或蛋白模拟物)，抗原-结合位点典型地包括形成与靶抗原结合的界面的一个或多个环(至少四个氨基酸或氨基酸模拟物的环)。典型地，多肽的抗原结合位点，例如，所述单结构域抗体分子的抗原结合位点，包括至少一个或两个CDRs，或更典型地包含至少三个、四个、五个或六个CDRs。
术语“免疫球蛋白可变结构域”在本领域中通常理解为与人或动物来源的VL或VH结构域相同或基本上相同。应该认识到，在某些物种中，例如，在鲨鱼和美洲驼中，免疫球蛋白可变结构域可以进化，从而在氨基酸序列上与人或哺乳动物的VL或VH不同。然而，这些结构域主要参与抗原结合。术语“免疫球蛋白可变结构域”典型地包括至少一个或两个CDRs，或更典型地至少三个CDRs。
“恒定免疫球蛋白结构域”或“恒定区”意欲包括与人或动物来源的CL，CH1，CH2，CH3或CH4结构域相同或基本上相似的免疫球蛋白结构域。例如，参见，Charles A Hasemann和J.Donald Capra，Immunoglobulins：Structure and Function(免疫球蛋白：结构和功能)，在William E.Paul，编，Fundamental Immunology(基础免疫学)，第二版，209，210-218(1989)中。术语“Fc区”是指恒定免疫球蛋白结构域的Fc部分，其包括免疫球蛋白结构域CH2和CH3或与这些基本上相似的免疫球蛋白结构域。
在某些实施方案中，所述SDAB分子是单价的或多特异性分子(例如，二价、三价或四价分子)。在其他实施方案中，SDAB分子是单特异性、双特异性、三特异性或四特异性的分子。分子是“单特异性的”还是“多特异性的”，例如是“双特异性的”，是指结合多肽与之反应的不同表位的数目。多特异性分子可以是对本文所述的靶多肽的不同表位特异性的，或者可以对靶多肽特异性并且对异源表位(诸如异源多肽或固体支持物质)特异性的。
当用于本文时，术语“价”是指在SDAB分子中存在的潜在的结合结构域的数目，例如，抗原结合结构域的数目。每个结合结构域特异性结合一个表位。当SDAB分子包含多于一个结合结构域时，每个结合结构域可以特异性结合相同的表位，对于具有两个结合结构域的抗体，称为“二价单特异性的”，或可以特异性结合不同的表位，对于具有两个结合结构域的SDAB分子，称为“二价双特异性的”。SDAB分子也可以是双特异性的和对于每种特异性二价的(称为“双特异性四价分子”)。双特异性二价分子，和制备其的方法，例如，记述在美国专利号5,731，168；5,807,706；5,821,333中；和美国申请公布号2003/020734和2002/0155537中；所有这些的公开内容通过引用结合于此。双特异性四价分子，和制备其的方法，例如，记述在WO02/096948和WO00/44788中，二者的公开内容通过引用结合于此。一般地，参见，PCT公布WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147：60-69(1991)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人，J.Immunol.(免疫学杂志)148：1547-1553(1992)。
在某些实施方案中，SDAB分子是结合一种或多种靶抗原的单链融合多肽，其包含一个或多个缺乏互补可变结构域或免疫球蛋白恒定区(例如，Fc区)的单结构域分子。由所述抗原-结合多肽识别的示例性的靶标抗原包括肿瘤坏死因子α(TNFα)。在特定的实施方案中，所述抗原-结合的单结构域分子通过将结构域与PEG(例如，支链的PEG分子)缔合(例如，共价连接)而被修饰。
TNFα
在本领域中已知肿瘤坏死因子与炎性病症相关，所述炎性病症诸如类风湿性关节炎、局限性肠炎、溃疡性结肠炎和多发性硬化病。已经非常详细地研究了TNFα和受体(CD120a和CD120b)。TNFα的生物活性形式是三聚体。已经开发了一些使用抗-TNFα抗体拮抗TNFα作用的策略，并且目前是可以商购的，诸如
Figure BDA00002930903500281
和
Figure BDA00002930903500282
针对TNFα的抗体分子是已知的。结合TNFα的单结构域抗原结合分子的多种实例公开在WO2004/041862，WO2004/041865，WO2006/122786中，所有这些的内容通过引用完全结合于此。单结构域抗原结合分子的另外的实例公开在US2006/286066，US2008/0260757，WO06/003388，US05/0271663，US06/0106203中，所有这些的内容通过引用完全结合于此。在其他实施方案中，针对TNFα和PEG的单特异性、双特异性、三特异性和其他多特异性单结构域抗体。
当用于本文时，术语″TNF″、″TNFα″和″TNF-alpha″可互换并且具有相同的意思。
在具体的实施方案中，所述结合TNFα的SDAB分子包含本文中表11中和WO2006/122786中所公开的一种或多种SDAB分子。例如，所述结合TNFα的SDAB分子可以是WO2006/122786中公开的单价的、二价的、三价的结合TNFα的SDAB分子。示例性的结合TNFα的SDAB分子包括，但不限于，TNF1，TNF2，TNF3，其人源化形式(例如，TNF29，TNF30，TNF31，TNF32，TNF33)。WO2006/122786的表8中公开了单价结合TNFα的SDAB分子的另外的实例。示例性的二价结合TNFα的SDAB分子包括，但不限于，TNF55和TNF56，其包含通过肽连接体连接的两个TNF30SDAB分子，从而形成单融合多肽(在WO2006/122786中公开)。二价结合TNFα的SDAB分子的另外的实例在WO2006/122786的表19中公开为TNF4，TNF5，TNF6，TNF7，TNF8)。
在其他实施方案中，所述SDAB分子的两个或更多个单抗原结合结构域用或不用连接基团融合为遗传或多肽融合体。所述连接基团可以是本领域技术人员知晓的任意连接基团。例如，所述连接基团可以是长度为1至100个原子的生物相容的聚合物。在一个实施方案中，所述连接基团包括下述或由下述组成：聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酰胺、聚异亮氨酸或聚精氨酸残基、或它们的组合。例如，聚甘氨酸或聚丝氨酸连接基团可以包括至少五个、七个、八个、九个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、三十五个和四十个甘氨酸和丝氨酸残基。可以使用的示例性的连接基团包括Gly-Ser重复，例如，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个重复的(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：8)重复。在一些实施方案中，连接体具有下述序列：(Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser(SEQ IDNO：9)或((Gly)4-Ser)n(SEQ ID NO：10)，其中n为4，5或6。
在一个示例性的实施方案中，包含两个结合靶抗原(例如，肿瘤坏死因子α(TNFα))的单结构域抗体分子(例如，两个骆驼科动物可变区)的单链多肽融合体和支链的PEG分子的抗原-结合多肽显示对在转基因小鼠模型中建立的关节炎具有剂量依赖性治疗效果。SDAB-01是人源化的、二价、双特异性的抑制TNFα的融合蛋白。针对该蛋白的抗原是肿瘤坏死因子α(TNFα)。
由相对应的表达载体的DNA序列预测的SDAB-01多肽链的完整的氨基酸序列显示在图1中(残基由SEQ ID NO：1的残基号1的NH2-末端开始编号)。由该DNA序列编号的最后的氨基酸残基是C264，并且组成蛋白的COOH-末端。对于二硫键连接的SDAB-01(没有翻译后修饰)的预测的分子量约为27000Da。通过纳米电喷射离子化四极飞行时间质谱法对主要的同种型观察到的分子量对应于67000Da，这证实不存在翻译后修饰。具体的生物化学特征如下：264个氨基酸，分子量为27,365Da，PI＝8.67和在280nm处，UV＝Ec＝1.83。
在图1中，互补决定区(CDR)以粗体显示。连接这些结合结构域的氨基酸连接体以小写字母表示。
制备SDAB分子
所述SDAB分子可以包含一种或多种重组的、CDR-嫁接的、人源化的、骆驼源化的、去免疫的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)单结构域分子。产生抗体和SDAB分子的技术和重组修饰这些分子的技术在本领域中是已知的，并且在下文详细描述。
本领域技术人员已知的多种方法可以用于获得抗体。例如，单克隆抗体可以通过按照已知方法产生杂交瘤而制备。然后，使用标准方法，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORETM)分析筛选以这种方式形成的杂交瘤，从而鉴定产生特异性结合指定的抗原的SDAB分子的一种或多种杂交瘤。任何形式的指定的抗原可以用作免疫原，例如，重组抗原，天然存在的形式，其任意的变体或片段，以及其抗原肽。
一种制备抗体和SDAB分子的示例性的方法包括筛选蛋白表达文库，例如，噬菌体或核糖体展示文库。例如，噬菌体展示记述在Ladner等人，U.S.专利号5,223,409；Smith(1985)Science(科学)228：1315-1317；WO92/18619；WO91/17271；WO92/20791；WO92/15679；WO93/01288；WO92/01047；WO92/09690；和WO90/02809中。
除了使用展示文库之外，指定的抗原可以用来免疫非人动物，例如，啮齿动物，例如，小鼠、仓鼠或大鼠。在一个实施方案中，所述非人动物包括至少一部分人免疫球蛋白基因。例如，可以用人Ig基因座的大片段的改造缺少小鼠抗体产生的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以生产并选择具有需要的特异性的来源于基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSETM，Green等人.(1994)Nature Genetics(自然遗传学)7：13-21，US2003-0070185，WO96/34096(于1996年10月31日公开)，和PCT申请号PCT/US96/05928(于1996年4月29日提交)。
在另一个实施方案中，SDAB分子由非人动物获得，然后被修饰，例如，人源化、去免疫化、嵌合，可以使用本领域已知的重组DNA技术生产。已经记述了多种用于制备嵌合抗体和SDAB分子的方法。例如，参见，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)81：6851，1985；Takeda等人，Nature(自然)314：452，1985，Cabilly等人，U.S.专利号4,816,567；Boss等人，U.S.专利号4,816,397；Tanaguchi等人，欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494，英国专利GB2177096B。例如，还可以使用表达人重链和轻链基因但是不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的转基因小鼠产生人源化的抗体和SDAB分子。Winter描述了一种示例性的CDR-嫁接方法，其可以用来制备人源化的抗体和本文所述的SDAB分子(U.S.专利号5,225,539)。特定的人抗体的所有CDRs都可以被非人CDR的至少一部分取代，或者仅有一些CDRs可以被非人CDRs取代。仅需要取代所述人源化抗体和SDAB分子与预先确定的抗原结合所需要的CDRs的数目。
人源化的抗体可以通过用来自人Fv可变结构域的等价序列取代不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列而产生。产生人源化抗体或其片段的示例性的方法由Morrison(1985)Science(科学)229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques(生物技术)4：214；和US5,585,089；US5,693,761；US5,693,762；US5,859,205；和US6,407,213提供。这些方法包括分离、操作和表达编码来自至少一条重链或轻链的全部或部分的免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。所述核酸可以从产生针对预先确定的靶标的SDAB分子的杂交瘤获得，如上文所述，以及从其他来源获得。然后，可以将编码人源化SDAB分子的重组DNA克隆到适当的表达载体中。
在某些实施方案中，人源化SDAB分子通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变而被优化。所述改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的几种技术中的任一种制备(例如，例如，Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，Immunology Today(今日免疫学)，4：7279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.(酶学方法)，92：3-16，1982)，并且可以按照PCT公布WO92/06193或EP0239400的技术制备。
人源化SDAB分子的技术公开在WO06/122786中。
SDAB分子还可以通过WO98/52976和WO00/34317中公开的方法特异性删除人T细胞表位或“去免疫化”而被修饰。简言之，关于与II类MHC结合的肽，可以分析SDAB分子的重链和轻链可变结构域；这些肽代表潜在的T细胞表位(如在WO98/52976和WO00/34317中定义)。为了检测潜在的T细胞表位，可以应用称为“肽穿线(peptide threading)”的计算机建模方法，并且除了人II类MHC结合肽数据库之外，可以搜索在VH和VL序列中存在的基序，如在WO98/52976和WO00/34317中所述。这些基序结合18种主要MHC II类DR同种异型中的任一种，因此组成潜在的T细胞表位。所检测到的潜在的T细胞表位可以通过取代可变结构域中少数氨基酸残基或通过单个氨基酸取代而被消除。典型地，进行保守取代。通常，但是不排除地，可以使用在人种系抗体序列中共有的氨基酸。例如，人种系序列公开在Tomlinson，等人.(1992)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227：776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today(今日免疫学)Vol16(5)：237-242；Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227：799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：4628-4638中。V BASE目录提供人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson，I.A.等人，MRC Centre for Protein Engineering(蛋白质工程MRC中心)，Cambridge，UK编撰)。这些序列可以用作人序列的来源，例如，用于构架区和CDRs。还可以使用共有的人构架区，例如，如U.S.6,300,064中所述。
SDAB分子的产生
SDAB分子可以通过已被遗传改造生产该蛋白的活宿主细胞产生。遗传改造细胞生产蛋白的方法在本领域中是公知的。参见，例如，Ausabel等人，编(1990)，Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学方法)(Wiley，New York)。这样的方法包括将编码和允许蛋白表达的核酸引入到活宿主细胞中。这些宿主细胞可以是培养生长的细菌细胞、真菌细胞或动物细胞。细菌宿主细胞包括，但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。适当的大肠杆菌菌株的实例包括：HB101，DH5a，GM2929，JM109，KW251，NM538，NM539，以及不能裂解外源DNA的任意大肠杆菌菌株。可以使用的真菌宿主细胞包括，但不限于，酿酒酵母(Sacchammycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和曲霉菌属(Aspergillus)细胞。可以使用的动物细胞系的一些实例为CHO，VERO，BHK，HeLa，Cos，MDCK，293，3T3和WI38。可以使用本领域技术人员公知的方法(例如，通过转化、病毒感染和/或选择)建立新的动物细胞系。任选地，蛋白可以由宿主细胞分泌到培养基中。
在一些实施方案中，所述SDAB分子可以在细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)中产生。例如，如果Fab是由在展示实体和噬菌体蛋白(或其片段)之间包含可抑制终止密码子的噬菌体展示载体中的序列编码，则可以将该载体核酸转移到不能抑制终止密码子的细菌细胞中。在这种情形中，Fab不与基因III蛋白融合，并且分泌到周质和/或培养基中。
SDAB分子还可以在真核细胞中产生。在一个实施方案中，抗体(例如，scFvs)在酵母细胞中表达，所述酵母细胞诸如毕赤酵母(Pichia)(参见，例如，Powers等人(2001)J Immunol Methods.(免疫学方法杂志)251：123-35)，Hanseula或Sacchammyces。
在一个实施方案中，SDAB分子在哺乳动物细胞中产生。用于表达克隆抗体或其抗体-结合片段的典型的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，其记述在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)77：4216-4220中，使用DHFR选择标记，例如，如在Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.(分子生物学)159：601-621中所述)，淋巴细胞系，例如，NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞以及来自转基因动物(例如，转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞是乳房上皮细胞。
除了编码SDAB分子的核酸序列之外，重组表达载体还可以携带另外的序列，诸如调节载体在宿主细胞中的表达的(例如，复制起点)序列和选择标记基因。选择标记基因促进对其中已经引入载体的宿主细胞的选择(例如，参见，例如，U.S.专利号4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，选择标记基因赋予已经引入载体的宿主细胞的药物抗性，诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤抗性。
在重组表达SDAB分子的示例性系统中，编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因分别可操作地与增强子/启动子调节元件(例如，来源于SV40，CMV，腺病毒等，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)连接，从而驱动该基因高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许利用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经转染了该载体的CHO细胞。可以培养所选择的转化体宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并且从培养基中回收完整的抗体。可以使用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞并且从培养基中回收抗体分子。例如，一些SDAB分子可以通过亲和层析分离。
SDAB分子还可以由转基因动物产生。例如，U.S.专利号5,849,992描述了一种在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建转基因，其包含乳特异性启动子和编码抗体分子的核酸以及用于分泌的信号序列。由所述转基因动物中的雌性产生的乳汁中包括分泌在乳汁中的目的抗体。抗体分子可以从乳汁中纯化，或者对于一些应用，可以直接使用。
SDAB分子的结合特性可以通过任意方法测量，例如，下述方法中的一种：BIACORETM分析，酶联免疫吸附测定(ELISA)，x射线晶体学，序列分析和扫描诱变。
SDAB分子与靶标(例如，TNFα)的结合相互作用可以使用表面等离子体共振(SPR)进行分析。SPR或生物分子相互作用分析(BiomolecularInteraction Analysis，BIA)实时检测生物特异性相互作用，无需标记任何相互作用物。BIA芯片上结合表面的质量变化(指示结合事件)导致表面附近光折射率的改变。这种折射性的改变产生可检测的信号，检测其作为生物分子间的实时反应的指示。例如，使用SPR的方法记述在U.S.专利号5,641,640；Raether(1988)Surface Plasmons Springer Verlag；Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.(分析化学)63：2338-2345；Szabo等人，(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.(当代结构生物学观点)5：699-705和由BIAcore International AB(Uppsala，Sweden)提供的在线资源中。
来自SPR的信息可以用来提供对关于分子与靶标结合的平衡解离常数(Kd)和动力学参数(包括Kon和Koff)的准确定量测量。这样的数据可以用来比较不同的分子。来自SPR的信息还可以用来发展结构-活性关系(SAR)。例如，可以评估不同抗体分子的动力学和平衡结合参数。在给定位置的变体氨基酸可以被鉴定出来，其与特定的结合参数(例如，高亲和力和缓慢的Koff)相关。该信息可以与结构建模(例如，使用同源性建模、能量最小化或通过x射线晶体学或NMR进行结构确定)组合。结果，可以阐明对蛋白与其靶标之间的物理相互作用的理解，并且用来指导其他的设计工艺。
修饰的SDAB分子
SDAB分子可以具有在一个构架区中的至少一个氨基酸位置与天然存在的结构域(例如，VH结构域)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
应该理解，一些SDAB分子(诸如人源化SDAB分子)的氨基酸序列可以在至少一个构架区中的至少一个氨基酸位置与天然存在的结构域(例如，天然存在的VHI-I结构域)的氨基酸序列不同。
本发明还包括SDAB分子的衍生物的制剂。所述衍生物通常可以通过修饰、并且特别是通过化学和/或生物学(例如，酶)修饰SDAB分子和/或形成本文公开的SDAB分子的一个或多个氨基酸残基获得。
所述修饰的实例，以及SDAB分子序列内可以以这样的方式修饰的氨基酸残基(即，在蛋白主链或在侧链上)的实例，可以用于引入这样的修饰的方法和技术以及这样的修饰的潜在的用途和优点对于熟练的技术人员是清楚的。
例如，这样的修饰可以包括向SDAB分子中或其上引入(例如，通过共价连接或以任何其他适当的方式)一个或多个官能团、残基或结构部分，并且特别是赋予所述SDAB分子一种或多种需要的特性或功能性的一个或多个官能团、残基或结构部分。所述官能团的实例是熟练的技术人员所清楚的。
例如，所述修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其他适当的方式)增加SDAB分子的半衰期、溶解度和/或吸收、降低SDAB分子的免疫原性和/或毒性、消除或减轻SDAB分子的任何不需要的副作用、和/或赋予SDAB分子其他有利的特性和/或减少不需要的特性的一个或多个官能团；或前述中两个或更多个的任意组合。所述官能团的实例和引入所述官能团的技术的实例是熟练的技术人员所清楚的，并且通常可以包括在上文引用的一般背景中提及的所有官能团和技术以及对于药物蛋白的修饰本身是已知的官能团和技术，特别是用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFvs和-148-单结构域抗体)的官能团和技术，例如，参考Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)，第16版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1980)。例如，所述官能团可以直接连接(例如，共价连接)到本发明所述的SDAB分子上，或者任选地通过适当的连接体或间隔区连接，这也是熟练的技术人员所清楚的。
非肽连接体
在本文所述的SDAB分子中，所述一个或多个SDAB分子和/或蛋白和所述一个或多个可接受的聚合物可以彼此直接连接和/或可以通过一个或多个适当的连接体彼此连接。
在本文中定义某些术语。
术语“烷氧基”(″alkoxyl″或″alkoxy″)用在本文中是指如下文定义的烷基在其上连接有一个氧基团。代表性的烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
术语“烷基”是指饱和的脂肪族基团，包括直链烷基基团和支链烷基基团。在优选的实施方案中，直链或支链烷基在其主链上具有12个以下的碳原子(除非另外指明)，例如，1-12，1-8，1-6或1-4个碳原子。示例性的烷基结构部分包括甲基、乙基、丙基(例如，异丙基)、丁基(例如，异丁基或叔丁基)。
术语“亚烷基”是指二价烷基，例如，-CH2-，-CH2CH2-和-CH2CH2CH2-。
术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘的任意基团。
在一个实施方案中，用于“连接”适当的可接受的聚合物与本文所述的SDAB分子的连接体结构部分由式(I)的结构部分所示：
在一些实施方案中，所述连接体由下式所示：
Figure BDA00002930903500372
当在本文所述的SDAB分子中使用两个以上的连接体时，这些连接体可以是相同的或不同的。本领域普通技术人员能够认识到并且理解用于本发明的SDAB分子的最佳连接体。
PEG化
关于增加半衰期和/或减少药物蛋白的免疫原性的一种广泛应用的技术包括连接适当的药用聚合物诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般地，可以应用PEG化作用的任何适当的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFvs)的PEG化作用；例如，参考Chapman，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)，54，531-545(2002)；Veronese和Harris，Adv.Drug Deliv.Rev.(高级药物递送综述)54，453-456(2003)，Harris和Chess，Nat.Rev.Drug.Discov.(药物发现自然评论)，2，(2003)以及在WO04/060965中。用于蛋白PEG化的各种试剂还可以商购，例如从NOF美国公司(NOF AmericaCorporation)购得(例如，PEG式B)。典型地，应用定向PEG化，特别是通过半胱氨酸-残基(参见例如Yang等，Protein Engineering(蛋白质工程)，16，10，761-770(2003))。例如，为了这一目的，PEG可以连接到在SDAB分子中天然存在的半胱氨酸残基上，所述SDAB分子可以被修饰，以适当地引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基。另外，SDAB分子可以被修饰，以适当地引入一个或多个用于PEG化的半胱氨酸残基，或者，可以将包括一个或多个用于PEG化作用的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的SDAB分子的N-端和/或C-端，其全部使用蛋白质工程技术。
关于PEG化，应该注意，通常本发明还包括已经在一个或多个氨基酸位置被PEG化的任何SDAB分子，诸如以这样的方式，即，所述PEG化(1)增加体内半衰期；(2)减少免疫原性；(3)提供关于PEG化本质上已知的一种或多种更有利的其他特性；(4)基本上不影响所述SDAB分子的亲和性(例如，当通过适当的检测测定时，诸如下述实施例中所述的那些检测，没有减小大于90％的所述亲和力，优选地没有减小大于50％的所述亲和力，并且更优选地没有减小大于10％的所述亲和力)；和/或(4)没有影响所述SDAB分子的任何其他需要的特性。熟练的技术人员应该清楚适宜的PEG-基团以及特异性地或非特异性地连接其的方法。
用于本文所述的SDAB分子和蛋白的PEG可以具有1KDa以上的分子量，诸如10KDa，并且小于200KDa，诸如90KDa。在一些实施方案中，用在本文所述的SDAB分子和蛋白中的PEG可以具有1KDa-100KDa范围内的分子量。典型地，对于SDAB分子，使用分子量大于5000，诸如大于10,000并且小于200,000，诸如小于100,000；例如在20,000-80,000范围内的PEG。在一些实施方案中，用在本文所述的SDAB分子和蛋白中的PEG可以具有10KDa-50KDa范围内的分子量。在一些实施方案中，用在本文所述的SDAB分子和蛋白中的PEG可以具有15KDa-45KDa范围内的分子量。在一些实施方案中，用在本文所述的SDAB分子和蛋白中的PEG可以具有20KDa的分子量。在一些实施方案中，用在本文所述的SDAB分子和蛋白中的PEG可以具有40KDa的分子量。在一些实施方案中，用在本文所述的SDAB分子和蛋白中的PEG可以具有10KDa的分子量。
在一些实施方案中，每个PEG分子独立地是PEG单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG是甲氧基PEG衍生物(mPEG)单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有1KDa-100KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有10KDa-50KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有40KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有15KDa-35KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有30KDa的分子量。在一些实施方案中每个PEG分子独立的具有20KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有17.5KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有12.5KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有10KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有7.5KDa的分子量。在一些实施方案中，每个PEG分子独立的具有5KDa的分子量。
另外，通常较不典型的修饰包括N-连接或O-连接的糖基化作用，通常作为共-翻译和/或翻译后修饰的部分，其取决于用于表达所述SDAB分子的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述PEG分子是支链的。在一些实施方案中，所述PEG分子选自式(a)-(h)的结构部分：
Figure BDA00002930903500391
其中每个PEG分子独立地为PEG单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG分子是mPEG单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，所述修饰的SDAB分子包含与PEG分子连接的式(I)的连接体，并且具有选自下述的结构：
其中每个PEG分子独立地为PEG单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG分子是mPEG单体、其聚合物或衍生物。
在一些实施方案中，所述修饰的SDAB分子包含与PEG分子连接的式(I)的连接体，并且具有选自下述的结构：
Figure BDA00002930903500411
其中每个PEG分子独立地为PEG单体、其聚合物或衍生物。在一些实施方案中，每个PEG分子是mPEG单体、其聚合物或衍生物。
在一些实施方案中，式(I)的连接体与PEG分子连接，由下式所示：
Figure BDA00002930903500412
在一些实施方案中，式(I)的连接体与PEG分子连接，由下式所示：
Figure BDA00002930903500421
在一些实施方案中，式(I)的连接体与PEG分子连接，由下式所示：
Figure BDA00002930903500422
连接体-PEG分子可以与SDAB分子缔合(例如，偶联)，由此形成修饰的SDAB分子。所述SDAB分子的单结构域分子从N端到C端可以按下述顺序排列：结合TNFα的单结构域分子-结合TNFα的单结构域分子-PEG分子(例如，支链的PEG分子)。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子由下式所示：
Figure BDA00002930903500423
在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子由下式所示：
在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子由下式所示：
Figure BDA00002930903500431
所述修饰的SDAB分子的一个示例性的实施方案由下式所示：
Figure BDA00002930903500432
SDAB分子的反应基团通常通过连接到所述SDAB分子上的亲核结构部分连接。在一些实施方案中，亲核结构部分是硫(例如，来自半胱氨酸残基的硫)。在其他实施方案中，所述亲核结构部分是氮(例如，来自末端α-氨基基团或含氮氨基酸侧链(例如，来自赖氨酸链的ε-氨基基团))。在其他实施方案中，所述亲核结构部分是C端基团。SDAB分子的反应基团通常通过连接到连接体的亲电性结构部分连接。在一些实施方案中，所述亲电性结构部分是羰基基团(例如，活化的酯或醛)。在一些实施方案中，所述亲电性结构部分是马来酰亚胺基团。
施用和治疗方法
SDAB分子可以单独或与第二试剂(例如，第二治疗或药学活性试剂)组合施用给受试者(例如，人受试者)来治疗或预防(例如，减轻或改善与之相关的一种或多种症状)TNFα相关病症，例如，炎性或自身免疫病症。术语“治疗”是指以有效改善与病症相关的病况、症状或参数、或防止病症的进展至统计学显著的程度或至本领域技术人员可检测的程度的量、方式和/或模式实施治疗。在治疗应用的情形中，治疗可以改善、治愈、维持在受试者中的病症或病况或缩短病症或病况在受试者中的持续时间。在治疗应用中，受试者可能具有症状的部分或完全的表现。在典型的情形中，治疗改善受试者的病症或病况至医师可检测的程度，或者防止病症或病况恶化。有效的量、方式或模式可以因受试者而不同，并且可以为受试者定制。
当用于本文时，术语“受试者”和“患者”可互换使用。当用于本文时，术语“一个或多个受试者”是指动物，例如，哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、驴、山羊、骆驼、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、绵羊)和灵长类动物(例如，猴子，诸如食蟹猴、大猩猩、黑猩猩和人)。
可以治疗的免疫病症的非限制性实例包括，但不限于，自身免疫病症，例如，关节炎(包括类风湿性关节炎，青少年类风湿性关节炎，骨关节炎(osteoarthritis)，银屑病关节炎，狼疮-相关的关节炎或强直性脊柱炎)，硬皮病(scleroderma)，全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis)，舍格伦综合征(Sjogren′s syndrome)，血管炎(vasculitis)，多发性硬化病，自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis)，皮炎(dermatitis)(包括特应性皮炎(atopic dermatitis)和湿疹性皮炎(eczematous dermatitis))，重症肌无力(myasthenia gravis)，炎性肠病(IBD)，局限性肠炎，结肠炎(colitis)，糖尿病(diabetes mellitus)(I型)；炎性病症，例如，皮肤的炎性病症(例如，银屑病(psoriasis))；急性炎性病症(例如，内毒素血症(endotoxemia)，脓毒症(sepsis)和败血病(septicemia)，中毒性休克综合征(toxic shock syndrome)和传染病(infectious disease))；移植排斥(transplant rejection)和变态反应(allergy)。在一个实施方案中，所述TNFα相关病症是关节炎性病症，例如，选自以下中的一种或多种的病症：类风湿性关节炎，青少年类风湿性关节炎(RA)(例如，中度至严重性类风湿性关节炎)，骨关节炎，银屑病关节炎或强直性脊柱炎，多关节青少年特发性关节炎(polyarticular juvenile idiopathic arthritis，JIA)；或银屑病，溃疡性结肠炎，局限性肠炎，炎性肠病和/或多发性硬化病。
在某些实施方案中，所述SDAB分子(或制剂)与第二治疗剂组合施用。例如，对于TNFαSDAB分子，第二试剂可以是抗-TNFα抗体或其结合TNFα的片段，其中第二TNFα抗体具有与制剂中的结合TNFα的SDAB分子不同的表位特异性。可以与结合TNFα的SDAB共同配制的试剂的其他非限制性的实例包括，例如，细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂和细胞生长抑制剂。在一个实施方案中，另外的试剂是用于关节炎的标准治疗剂，包括，但不限于，非甾体抗炎剂(NSAIDs)；皮质类固醇，包括泼尼松龙，泼尼松，可的松，和曲安西龙；和减轻疾病的抗风湿药(DMARDs)，诸如甲氨喋呤，羟氯喹(Plaquenil)和硫氮磺吡啶，来氟米特
Figure BDA00002930903500451
肿瘤坏死因子抑制剂，包括伊那西普
Figure BDA00002930903500452
英利昔单抗
Figure BDA00002930903500453
(有或无甲氨喋呤)，和阿达木单抗抗-CD20抗体(例如，
Figure BDA00002930903500455
)，可溶性白介素-1受体，如阿那白滞素(Kineret)，金，二甲胺四环素
Figure BDA00002930903500456
青霉胺，和细胞毒性试剂，包括硫唑嘌呤，环磷酰胺和环胞菌素。所述组合治疗可以有利地利用较低剂量施用的治疗剂，因此避免与各种单一治疗相关的可能的毒性或并发症。
SDAB分子可以以液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)的形式施用。所述组合物可以通过肠胃外模式(例如，皮下、腹膜内或肌内注射)或通过吸入施用。短语“肠胃外施用”和“通过肠胃外施用”用在本文中意指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常是通过注射施用，并且包括皮下或肌内施用，以及静脉内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、表皮下、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中，本文所述的制剂通过皮下施用。
药物组合物或制剂是无菌的并且在制备和存储条件下是稳定的。还可以检测药物组合物以确保其满足关于施用的管理和工业标准。
药物组合物可以配制为溶液剂、微乳液、分散剂、脂质体或其他适合高蛋白浓度的有序结构。可以通过将需要量的本文所述的试剂结合在适当的溶剂中，需要时，与上述列举的一种成分或多种成分的组合一起结合在适当的溶剂中，然后过滤灭菌，而制备无菌注射液。通常，通过将本文所述的试剂结合在包含基本的分散介质和来自上述列举的那些中的需要的其他成分的无菌赋形剂中而制备分散剂。可以维持溶液的适当的流动性，例如，通过使用包衣，如磷脂酰胆碱，在分散剂的情形中通过维持需要的粒度，和通过使用表面活性剂。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)而产生注射组合物的延长的吸收。
组合物/制剂
SDAB分子的制剂包括SDAB分子、可以作为低温保护剂的化合物和缓冲剂。所述制剂的pH通常为pH5.5-7.0。在一些实施方案中，制剂作为液体存储。在其他实施方案中，制剂制备成液体，然后在存储之前干燥，例如，通过冷冻干燥或喷雾干燥。干燥的制剂可以作为干化合物使用，例如，作为气雾剂或粉剂，或重构至其初始浓度或另一种浓度，例如，用水、缓冲剂或其他适当的液体重构。
设计SDAB分子纯化方法，以允许SDAB分子转移到作为冷冻液体然后冷冻干燥(例如，使用组氨酸/蔗糖制剂)的适于长期存储的制剂中。所述制剂与特定浓度的蛋白一起冻干。然后，在需要时，用适当的稀释剂(例如，水)将该冻干的制剂重构，从而将原始制剂成分重新溶解至需要的浓度，通常是与冻干前的浓度相同或高于冻干前的浓度。
冻干的制剂可以重构，取决于相对于初始冷冻干燥的液体体积加入到冻干物中的水或稀释剂的量，产生具有与初始浓度(即，冻干前浓度)不同的浓度的制剂。通过测定抗体完整性的一个或多个参数可以鉴定适当的制剂。
制品
本发明还提供一种制品，其包含本文所述的制剂并且提供使用该制剂的说明书。
用于施用给受试者的制剂，例如，作为药物的制剂，必须是无菌的。这使用本领域已知的方法实现，例如，在液体配制或冻干和重构之前或之后通过无菌过滤膜过滤。备选地，当其不破坏结构时，制剂的成分可以通过高压灭菌进行灭菌，然后与过滤或照射灭菌的成分组合，从而产生所述制剂。
药物制剂可以用经皮递送装置如注射器(包括皮下注射器或多室注射器)施用。在一个实施方案中，所述装置是带有针头或与针头构成整体的预先填装的注射器。在其他实施方案中，所述装置是不带有针头的预先填装的注射器。针头可以与预先填装的注射器一起包装。在一个实施方案中，所述装置是自动注射装置，例如，自动注射型注射器。在另一个实施方案中，注射装置是笔式注射器。在另一个实施方案中，注射器是杆式针头注射器，路厄锁式注射器(luer lock syringe)或路厄滑动式注射器(luer slipsyringe)。其他适当的递送装置包括支架、导管、显微操作针和植入的控制释放装置。组合物可以用有或无嵌入的滤器的标准的IV设备(包括，例如，IV管)静脉内施用。
在某些实施方案中，注射器适合用于自动注射器装置。例如，所述自动注射器装置包括单瓶系统，诸如用于递送溶液剂的笔式注射器装置。所述装置可从诸如BD Pens，BD
Figure BDA00002930903500472
Figure BDA00002930903500473
和
Figure BDA00002930903500476
Figure BDA00002930903500477
的供应商商购，如由BectonDickensen(Franklin Lakes，N.J.)，Ypsomed(Burgdorf，瑞士，互联网为ypsomed.com；Bioject，Portland，Oreg.；National Medical Products，WestonMedical(Peterborough，UK)，Medi-Ject Corp(Minneapolis，Minn.)和Zogenix，Inc，Emeryville，CA制备或开发的。经过验证的包括双瓶系统的装置包括那些笔式注射器系统，用于在药筒中重构冻干的药物，用以递送重构的溶液，诸如
所述制品可以包括适于容纳所述制剂的容器。适当的容器可以是，但不限于，装置、瓶、小瓶、注射器、测试管、喷雾器(例如，超声或振荡网式喷雾器)、静脉内溶液袋或吸入器(例如，计量吸入器(MDI)或干粉吸入器(DPI))。容器可以由任意适当的材料制成，诸如玻璃、金属或塑料，如聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯。
通常，容器是由不吸收显著量的制剂中的蛋白并且不与制剂成分反应的材料制成的。
本文所述的制品还可以包括包装材料。除了关于使用或施用的信息之外，例如，包装材料提供管理机构需要的关于产品可以在什么样的条件下使用信息。例如，包装材料可以为患者提供在指定的时限内，例如，2-24小时或更多的时间，怎样注射包含本文所述的制剂的预先填充的注射器或怎样在水性稀释剂中重构冻干的制剂以形成溶液的指示。本发明要求的制剂用于人药物产品应用。
在某些实施方案中，制剂可以作为喷雾器施用。以非限制性的实例，喷雾器的实例包括，喷射式喷雾器，超声喷雾器和振荡网式喷雾器。这些种类使用不同的方法由液体产生气雾剂。通常，可以保持这些制剂中的蛋白的完整性的任意的气雾剂产生装置适合用于递送本文所述的制剂。
在其他实施方案中，药物组合物可以用医学装置施用。例如，药物组合物可以用无针皮下注射装置施用，诸如U.S.专利号5,399,163，5,383,851，5,312,335，5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公开的装置。公知的植入物和组件的实例包括：U.S.专利号4,487,603，其公开一种用于以可控速率分散药物的植入式微量输液泵；U.S.专利号4,486,194，其公开一种用于施用药物通过皮肤的治疗装置；U.S.专利号4,447,233，其公开一种用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；U.S.专利号4,447,224，其公开一种用于连续药物递送的可变流动植入式输注设备；U.S.专利号4,439,196，其公开一种具有多室分隔区的渗透药物递送系统；以及U.S.专利号4,475,196，其公开一种渗透药物递送系统。治疗组合物还可以以生物降解或非生物降解缓释制剂的形式存在用于皮下或肌内施用。例如，参见U.S.专利号3,773,919和4,767,628以及PCT申请号WO94/15587。还可以使用植入泵或外部泵实现连续施用。施用还可以间歇性进行，例如，单次的每天注射，或以低剂量连续进行，例如，缓释制剂。递送装置可以改进以最佳适用于施用SDAB分子。例如，注射器可以被渗硅至最适于存储和递送SDAB分子的程度。当然，多种其他此类植入物、递送系统和组件也是已知的。
本发明还描述一种用于施用第一试剂和第二试剂的装置。所述装置可以包括，例如，一个或多个用于存储药物制剂的室，并且可以设置为递送单位剂量的第一试剂和第二试剂。第一试剂和第二试剂可以存储在相同或分开的分隔区中。例如，所述装置可以在施用前组合各种试剂。也可以使用不同的装置来施用第一试剂和第二试剂。
描述下述实施例来帮助对本发明的理解，但是目的不在于，也不应该解释为以任何方式限制其范围。
实施例
实施例1：产生抗-TNFα结构单元并且改造SDAB-01
通过用包含4个甘氨酸和1个丝氨酸的6次重复的挠性30个氨基酸连接体遗传融合两个相同的TNFα抗原结合结构域(SEQ ID NO：1的1-115位氨基酸)而构建SDAB-01二价人源化SDAB多肽。为了准备位点特异性的PEG化，在C端在三个甘氨酸连接体后改造一个游离的半胱氨酸(图1)。蛋白在CHO哺乳动物表达系统中生产，并且通过蛋白质A亲和捕获纯化。然后，通过二硫苏糖醇处理还原C端半胱氨酸，并且与活化的2x20kDa支链PEG的马来酰亚胺官能团反应(图2)。终产物进一步从游离的PEG和少量的未PEG化的蛋白中纯化，并且表征。
因此，SDAB-01包含由30个氨基酸的挠性连接体分开的两个相同的人源化抗-TNFα特异性SDAB分子的遗传融合体，所述SDAB分子具有SEQ ID NO：1的氨基酸1-115的氨基酸序列，和C端半胱氨酸位点特异性PEG化(2x20PEG)，带有马来酰亚胺衍生的40kDa(2x20kDa)支链聚乙二醇(图3)。图4A显示包括SDAB-01的直链和两种支链mPEG-马来酰亚胺。图4B是比较SDAB-01和[SEQ ID NO：1]-PEG40的大小的扫描图。
分析性分析表明，直链40K mPEG-马来酰亚胺和支链40K mPEG-马来酰亚胺SDAB之间的PEG化效率是相当的。用直链或支链40K mPEG-马来酰亚胺PEG化的抗-TNFαSDAB分子显示出相当的生物活性。在两种支链40K mPEG-马来酰亚胺材料(支链PEG制剂A和支链PEG制剂B)之间，表观电荷和形状似乎是最相当的。
在基于细胞的TNFα中和测定中，与其单价形式相比，通过长度优化的挠性连接体构建作为两个相同的TNFα抗原结合结构域(SEQ ID NO：1的氨基酸1-115)的二价形式的SDAB-01的功效提供约五十倍。改造的C端半胱氨酸的位点特异性PEG化赋予药物候选物需要的药物代谢动力学曲线，具有延长的体内半衰期而不影响其功效。
实施例2：通过流式细胞计数法检测的SDAB-01与膜结合的TNFα的结合特征
通过流式细胞计数法已经证明SDAB-01与在其细胞表面上表达人TNFα的重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系结合。通过定点诱变法向人TNFα编码区引入13个氨基酸的缺失，以减少导致TNFα释放到培养基中的蛋白水解裂解。使用该构建体来产生稳定的CHO株系。通过使用特异性抗-人TNFα抗体的流式细胞计数法证明了TNFα在细胞表面上表达。SDAB-01用来染色细胞系pW2128CHO-TNF-D13，然后用生物素化的抗-PEG抗体第二次染色，然后用链霉抗生物素蛋白-PE第三次染色进行检测，这证明实现了细胞表面结合(图5)。
实施例3：SDAB-01对人或恒河猴TNF的亲和力
在Biacore设备上使用表面等离子体共振进行抗-TNFαSDAB-01与人和恒河猴结合TNFα的详细表征。生物素化的SDAB-01捕获在链霉抗生物素蛋白传感器芯片表面上，并且在这一实验中检测不同浓度的人或恒河猴TNFα。注射TNFα蛋白并且允许以100μL/min缔合1.5分钟并且允许解离20分钟。通过在Biaevaluation软件v4.1中使用1∶1结合模型通过整体拟合(global fit)确定速率常数和Kd。关于速率常数显示的数据是至少2次独立的实验的平均值和标准偏差。Kd由结合(on)和解离(off)速率的平均值计算。SDAB-01对人或恒河猴TNFα的亲和力显示在表1中。
表1.通过Biacore确定的SDAB-01对人或恒河猴TNFα的亲和力
实施例4：在基于细胞的细胞毒性测定中表征SDAB-01
在基于L929细胞的细胞毒性测定中，使用人或恒河猴TNFα，与对照4SDAB分子和未PEG化的SDAB分子对照3相比较来评估SDAB-01的生物活性。在基于细胞的剂量-反应测定中评估SDAB-01中和TNFα(0.5ng/ml)的细胞毒性的能力。在相同的实验中测定SDAB-01和对照3(其为未PEG化的TNFαSDAB分子)。剂量反应曲线显示在图6中，并且EC50结果总结在表2中。
表2.SDAB对照4、SDAB-01和未PEG化的对照3的生物活性
Figure BDA00002930903500511
这些结果表明，在基于L929细胞的测定中，SDAB-01能够中和人和恒河猴TNFα。结果还表明，PEG化对SDAB-01的中和活性没有显著影响。
实施例5：比较TNFαSDAB-01与不同物种的TNFα的结合动力学
本研究的目的是研究SDAB-01与不同物种的TNFα(包括人、猕猴、大鼠、小鼠和兔)之间的结合速率和平衡解离常数，以了解怎样比较这些不同物种之间的结合亲和力，所述物种可以用于功效、药物代谢动力学和毒性学模型。使用Biacore设备通过表面等离子体共振来实时测量动力学结合。直接测量速率常数，并且使用Biacore评估软件v4.1由结合速率获得平衡解离常数。
对于结合TNFα的评估，将SDAB-01以60-75RU的密度固定在传感器芯片表面上。人和恒河猴TNFα相似地以快速结合速率和非常缓慢的解离速率与SDAB-01结合(图7a，b)。与SDAB-01的结合依赖于人和恒河猴TNFα的浓度，并且达到饱和。在最高浓度时，结合达到平衡。同SDAB-01与人和恒河猴TNFα的高亲和力结合相反，存在可以忽略的大鼠和小鼠TNFα与SDAB-01的结合(图7c，d)。对于在测试的最高浓度，即100nM的大鼠和小鼠TNFα结合，观察到非常低的结合信号，并且达到小于5RU的结合响应(图7)。表观快速解离速率和在测试的最高浓度(至多100nM)缺乏饱和指示微弱的结合。由于缺乏饱和并且结合速率太快无法测量，所以对大鼠或小鼠TNFα不能计算平衡解离常数。这表明，尽管存在一些可以忽略的结合，但是大鼠和小鼠TNFα极端微弱地结合SDAB-01。甚至在400nM兔TNFα(测试的最高浓度)也没有观察到兔TNFα与SDAB-01的结合(图7)。这些数据表明SDAB-01与恒河猴TNFα的结合与人TNFα类似，但是不结合小鼠、大鼠或兔中的TNFα配体。
使用1∶1结合模型由图7所示的结合计算人和恒河猴TNFα与SDAB-01的结合之间的缔合和解离速率常数(表3)。人和恒河猴TNFα具有非常相似的结合和解离速率，这导致几乎相同的Kd值，分别为19.5+4.17和34.1+7.23pM。
表3.SDAB-01与人和恒河猴TNFα的结合亲和力
ka(M-1s-1) Kd(s-1) Kd(pM)
人TNFα 7.8+/-1.6E+06 14.7+/-0.45E-05 19.5+/-4.17
猕猴TNFα 4.19+/-0.41E+06 14.1+/-2.53E-05 34.1+/-7.23
实施例6：对于SDAB-01缺少补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性
SDAB-01表现出高的对人和猴TNFα的中和功效。CDC和ADCC均为Fc介导的效应功能。当C1q(备选的补体级联中的第一种蛋白)结合两种以上IgG分子上的Fc区的CH2结构域时，发生CDC。这引发最终导致在细胞表面上膜攻击复合物形成的下游补体途径成分，导致其裂解。ADCC可以通过与细胞表面上的结合TNFα的抗-TNFα抗体的Fc区域与在免疫效应细胞(如NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)上表达的FcγRs之间的相互作用引发对靶细胞的杀伤。本研究的目的是检测SDAB-01的CDC和ADCC活性，并且将其与抗-TNFα抗体对照1和抗-TNFα抗体对照2、抗-TNFα抗体对照3进行比较。抗体对照1和2具有人IgG1Fc，因此可以具有效应功能。抗体对照3和SDAB-01缺少Fc区。
分析证明，与抗体对照1和2比较，SDAB-01和抗体对照3不具有任何CDC和ADCC活性(图30&31)。抗体的Fc区是分子介导CDC和ADCC活性必需的，并且抗体对照3和SDAB-01缺少Fc区。因此，SDAB-01可以有力地结合并中和细胞表面上的TNFα，而不引起可能有细胞毒性的任何效应功能。
实施例7：SDAB-01对嗜中性粒细胞浸润的作用
这些体内研究的目的是在鼠气囊模型中评估不同剂量的SDAB-01减少由重组人TNFα诱导的细胞浸润的能力。
Tessier等人(Jour of Immunol.(免疫学杂志)159：3595-3602，1997)先前已经表示将TNFα注射到小鼠气囊中诱导白细胞在囊中的积累。设计SDAB-01来结合并且中和TNFα的作用。为了检测SDAB-01在体内模型中是否对细胞积累有作用，在将TNFα注射到气囊中之前，给小鼠施用SDAB-01。从囊中收集细胞，并且在施用TNFα后6小时差异性计数。
在每次实验结束时(施用TNFα后6小时)收集囊中流体，并且在Cell Dyne上确定细胞计数。实验1的结果显示在图8和图9中。
以0.18mg/kg给药的SDAB-01显著减少由10ng重组人TNFα诱导的细胞向气囊中的浸润。使用0.18mg/kg的SDAB-01还显著抑制嗜中性粒细胞的累积。在6小时的时间点，淋巴细胞和单核细胞浸润是较少的细胞浸润成分，并且在本研究中，这不被SDAB-01影响。
实验2使用与实验1相同的流程进行，并且结果显示在图10和图11中。结果与实验1中观察到的那些结果一致，不同的是，在本实验中，0.18mg/kg和0.09mg/kg剂量的SDAB-01显著抑制嗜中性粒细胞的浸润。总的细胞浸润仅被0.09mg/kg的SDAB-01显著减少，而对于单核细胞或淋巴细胞浸润没有观察到显著减少。
在实验3中，以与先前进行的相同剂量施用SDAB-01。以0.09mg/kg的剂量观察到总白血细胞浸润的显著减少，并且用两种剂量的SDAB-01都观察到嗜中性粒细胞浸润，如图12和图13所示。以0.09mg/kg的剂量，淋巴细胞显著减少，但是在0.18mg/kg组没有减少。在所测试的任何剂量都对单核细胞浸润没有影响。
总之，与对照组相比，用两种浓度的SDAB-01均观察到对嗜中性粒细胞浸润的显著抑制，例外的是，在一次研究中，0.09mg/kg的剂量给出不显著的阳性趋势(表4)。
表4.使用SDAB-01进行的鼠气囊实验总结
总WBC嗜中性粒细胞淋巴细胞单核细胞
Figure BDA00002930903500541
+与赋形剂对照相比较，细胞浸润的显著减少(p≤0.05)。
+/-降低的浸润趋势，但不显著。
-与赋形剂对照相比没有显著差异。
施用低至0.09mg/kg SDAB-01的剂量显著减少由10ng重组人TNFα诱导的细胞浸润和嗜中性粒细胞浸润。在所测试的任意剂量对淋巴细胞和单核细胞浸润有很小作用到没有作用。这些数据表明，SDAB-01可以一致性地阻断由重组人TNFα刺激引起的嗜中性粒细胞浸润.
实施例8：在Tg197人TNFα转基因小鼠关节炎模型中SDAB-01的功效
在类风湿性关节炎的TNFα转基因小鼠模型中评估SDAB-01的治疗效果。在该模型中，TNFα转基因小鼠在4-7周龄时以100％的发病率发展慢性多关节炎。所述疾病依赖于人TNFα的过表达。在治疗给药方案中研究不同治疗剂量(10，3，1，0.3，0.1，0.03mg/kg)的SDAB-01的作用。当100％的小鼠表现出疾病迹象时，将动物随机分组。一经分组就开始用SDAB-01、抗-TNFα抗体对照2、对照抗体或赋形剂进行治疗，并且每周两次持续7周。所有动物每周以盲目方式对疾病症状的可见迹象进行评分。在研究结束时，收集后爪，处理，并且显微镜评估疾病的指征。
在实验1中，与赋形剂-治疗组相比，用剂量为10，3和1mg/kg的SDAB-01治疗显示出显著的作用，以剂量依赖性方式防止关节炎的进一步发展。与两个对照组相比，用较高剂量的SDAB-01(10，3，1mg/kg)治疗显示对组织病理学评分的显著改善。因此，与对照-治疗的组相比，临床和通过显微镜评估的表现出关节炎改善的最低治疗剂量为1mg/kgSDAB-01。
在实验2中，用剂量为10，3和1mg/kg的SDAB-01治疗显示对建立的关节炎的治疗作用，临床和组织病理学评分均减小。因此，与对照-治疗的组相比，临床和通过显微镜评估的表现出关节炎改善的最低治疗剂量为1mg/kg。
总之，用SDAB-01进行的抗-TNFα治疗显示对建立的关节炎的剂量依赖性治疗效果，这由防止疾病恶化和临床和组织病理学评分的减小证明。由于在Tg197小鼠关节炎模型中，对照抗体治疗重现赋形剂治疗的病理学迹象，故而这一治疗结果是对人TNFα的特异性拮抗作用的直接结果。
实验设计
在Pfizer通过标准方法制备SDAB-01和抗-破伤风毒素(对照)抗体。英利昔单抗(
Figure BDA00002930903500551
抗-TNFα抗体，Lot No.7HD98016)购自MedWorld Pharmacy(Catalog No.NDC57894-030-01)。
雄性Tg197小鼠，对人TNF-珠蛋白杂化转基因是纯合的(保持在CBAxC57BL/6遗传背景)，与(CBAxC57BL/6)F1代雌鼠杂交。将杂合转基因后代用于研究。当100％的小鼠表现出关节炎迹象时，所有小鼠随机分配到治疗组中。在动物分配到治疗组的那天，小鼠开始通过腹膜内注射接受PF-05230905、对照抗体(抗-破伤风毒素抗体)、英利昔单抗或赋形剂对照(10mM L-组氨酸，5％蔗糖缓冲液，Lot No.C-51683，D-20216)给药。给药的剂量和给药频率在每个实验部分描述。在确定的时间间隔，按下述评估每只小鼠的两只后爪的疾病进展：
0没有关节炎，(正常的外观和俯屈)。
0.5关节炎开始(轻微的关节肿胀)。
1轻度关节炎(关节扭曲)。
1.5同上，具有手指变形，俯屈少力。
2中度关节炎(严重肿胀，关节变形，俯屈无力)。
2.5同上，爪的手指变形。
3重度关节炎(俯屈检测到关节强直和运动严重受损)。
然后对每只小鼠分配0-3的平均评分。为了监测疾病进展，将也具有关节炎的4只同窝出生的Tg197小鼠在6周龄时(即，治疗开始的时间点)处死。在研究结束时，处死所有小鼠，并且对踝关节进行组织病理学分析。将实验小鼠的评分与4只同窝出生的小鼠进行比较。以盲目方式按下述以0-4显微镜评估组织病理学评分：
0没有可检测的病理学
1滑膜增生并且存在多形核白细胞浸润
2形成血管翳和纤维组织并且病灶处软骨下骨糜烂
3软骨破坏和骨糜烂。
4广泛的软骨破坏和骨糜烂。
实验1
在实验1中，在类风湿性关节炎的治疗性TNFα转基因鼠模型中评估不同剂量的SDAB-01的功效。小鼠两周一次(bi-weekly)监测关节炎迹象。当100％的小鼠显示疾病迹象时，将所有动物随机分配到治疗组中。将杂合Tg197小鼠分组，每组8只小鼠。用SDAB-01(10，3，1，0.3，0.1mg/kg)、对照抗体(10mg/kg)、英利昔单抗(10，3mg/kg)或赋形剂(组氨酸/蔗糖缓冲液，10mL/kg)开始治疗，两周一次。治疗持续7周，并且每周记录关节形态的目测变化(关节评分)和每只动物的平均体重。用CO2麻醉后，收集血清并且处理每只动物的两只后爪进行组织学评估。
在实验1中，与赋形剂-治疗组相比，施用SDAB-01表现出非常显著的作用：改善体重减轻(图14)并且防止疾病进展(图15)。在稳定临床评分方面，英利昔单抗与SDAB-01(10，3，1mg/kg)剂量相同。
图16显示在评分最后一天评估的疾病严重性。与赋形剂或对照抗体相比，在用SDAB-01(10，3，1mg/kg)和英利昔单抗(10mg/kg)治疗的组中，疾病症状减少的动物数量最多。
以盲目方式通过显微镜评估每只小鼠两只后爪的每一只的一张苏木精和伊红-染色的切片。对建立的关节炎用SDAB-01(10，3，1mg/kg)治疗表现出功效：防止疾病恶化，并且逐渐引起组织病理学评分减小。由于对照抗体治疗重现赋形剂治疗的病理学迹象，故而该治疗结果是针对人TNFα的特异性拮抗作用的直接结果(图17，图18)。
实验2
在实验2中，重复每周两次10，3，1，0.3，and0.1mg/kg SDAB-01治疗的作用，并且包括每周两次0.03mg/kg SDAB-01和每周两次10和3mg/kg英利昔单抗。SDAB-01的剂量(10，3，1，0.3，0.1和0.03)表现出显著作用：改善体重减少(图19)。然而，与赋形剂-治疗组相比，仅10，3和1mg/kg的剂量对防止疾病进展是成功的(图20)。与赋形剂-或对照抗体-治疗组相比，用SDAB-01(0.3mg/kg)或英利昔单抗(3mg/kg)治疗导致中等但非显著的临床评估改善。
图21显示在评分最后一天评估的疾病严重性。与赋形剂对照相比，在用SDAB-01(10，3，1mg/kg)和英利昔单抗(10mg/kg)治疗的组中，疾病症状减少的动物数量最多。
以盲目方式通过显微镜评估每只小鼠两只后爪的每一只的一张苏木精和伊红-染色的切片。对建立的关节炎用SDAB-01(10，3，1mg/kg)治疗表现出功效：防止疾病恶化，并且逐渐引起组织病理学评分减小(图22)。由于人对照抗体治疗重现赋形剂治疗的病理学迹象，故而该治疗结果是针对人TNFα的特异性拮抗作用的直接结果。由于赋形剂-治疗组和对照抗体-治疗组的评分没有显著差异，与两个对照组相比，3个较高的SDAB-01剂量(10，3和1mg/kg)是有效的，这得到组织病理学评分的显著减少的证明(图23)。因此，临床和显微镜评估的最小有效剂量为1mg/kg SDAB-01。
用3个较高的SDAB-01剂量(10，3和1mg/kg)治疗产生改善的组织病理学评分。这些得分显著低于在研究开始时收集的对照同窝出生的小鼠的评分。
在1mg/kg MED，观察到的平均稳态(末次采血)血清SDAB-01浓度为4.81μg/mL，与基于对Tg197小鼠单次1mg/kg IP给药后SDAB-01的药物代谢动力学曲线预测的稳态(末次采血)血清为7.70μg/mL相比，具有2倍以内的差异。在0.3，3和10mg/kg剂量组中，平均稳态(末次采血)血清SDAB-01浓度分别为0.21，42.1和120μg/mL。对于0.03和0.1mg/kg剂量组，除一只动物外其他全部具有低于0.049μg/mL的定量界限的血清SDAB-01浓度。
实施例9：在巴斯德毕赤酵母中表达的二价SDAB分子的PEG化
向中和的级分中加入二硫苏糖醇(DTT)以还原在SDAB分子的羧基端半胱氨酸之间形成的潜在的二硫键。发现终浓度为10mM的DTT和在4℃温育过夜是最合适的。通过分析型大小排阻色谱(SEC)评估所述还原。因此，将25ml还原的SDAB分子添加到75ml Dulbecco′s PBS(D-PBS)中，并且注射到用D-PBS平衡的Sup7510/300GL柱上。
未还原的SDAB分子和DTT在用D-PBS平衡的Hiload26/60Superdex75制备级柱上通过制备级SEC去除。
通过测量280nm处的吸光度确定还原的SDAB分子的浓度。使用Uvikon943Double Beam US/VIS分光光度计。以245-330nm的波长扫描测量吸光度。使用由Quartz Suprasil制备的两个精密元件。首先，通过放置两个装满900μl D-PBS的孔在280nm测量空白的吸光度。通过向第一个孔中加入100μl样品并且在读数前混合而将样品稀释(1/10)。在280nm测量样品的吸光度。用下式计算浓度：
为使SDAB分子PEG化，向还原的SDAB分子溶液中加入5X摩尔过量的新鲜制备的1mM PEG40溶液。
SDAB分子-PEG混合物在轻微摇动下在RT温育1小时，然后转移到4℃。通过分析型SEC评估PEG化。然后，将25μl SDAB分子加入到75μlD-PBS中，并且注射到用D-PBS平衡的Sup75HR10/300柱上。PEG化的SDAB分子在柱的排阻体积范围内洗脱下来(＞75KDa)。
PEG化的和未-PEG化的SDAB分子通过阳离子交换色谱分离(CEX-缓冲液A为25mM柠檬酸和缓冲液B为在PBS中的1M NaCl)。将样品稀释至5mS/cm的传导率，并且将pH调节至4.0。将柱平衡并且在样品上样后，用缓冲液A彻底洗涤。PEG化的SDAB分子用3CV的梯度洗脱。
收集的SDAB分子在用D-PBS平衡的Hiload26/60Superdex75制备级柱上通过SEC缓冲液交换到D-PBS中。随后，通过流过阴离子交换柱而使SDAB分子无LPS。该柱在1M NaOH中消毒，然后用无内毒素的D-PBS平衡。
生物素化
为使SDAB分子生物素化，向还原的SDAB分子中加入来自10mM储液的5X摩尔过量的生物素。将生物素SDAB分子混合物在轻微摇动下在RT温育1小时，然后保存在4℃。
生物素化的SDAB分子的纯度通过分析型SEC控制。然后将25μl生物素化的SDAB分子添加到75μl的D-PBS中，并且注射到用D-PBS平衡的Sup75HR10/300柱上。产生的色谱显示，SDAB分子生物素不需要进一步的纯化：通过氧化游离的巯基没有可以检测到的SDAB分子的二聚化。通过脱盐柱Sephadex G25精制柱将缓冲液换为D-PBS。
通过阴离子交换柱使SDAB分子-生物素无LPS。该柱在1M NaOH中消毒，然后用D-PBS平衡。
实施例10a：在单次静脉内和皮下施用后SDAB-01在雄性食蟹猴中的药物代谢动力学
在第一次研究中，通过单次IV或SC推注注射向雄性食蟹猴(n＝3/组：猴子SAN1-3进行IV，猴子SAN4-6进行SC)施用3mg/kg(基于蛋白含量)的SDAB-01。在给药前(0小时)和给药后0.083至1536小时从每只动物采集血清样品用于PK分析。在给药前(0小时)和在给药后336、672、1008和1536小时采集另外的血清样品，以评估抗-SDAB-01抗体的形成。使用定性的酶联免疫吸附测定(ELISA)确定血清SDAB-01浓度，并且结果用来确定SDAB-01的药物代谢动力学参数。使用定性的ELISA确定抗-SDAB-01抗体的存在。
在IV或SC施用后SDAB-01在雄性食蟹猴中的平均血清浓度-时间曲线显示在图24中。IV或SC施用后SDAB-01在猴子中的平均药物代谢动力学参数总结在表5中。
表5.单次IV或SC施用3mg/kg(基于蛋白含量，n＝3/治疗组)后SDAB-01在雄性食蟹猴中的平均(±SD)药物代谢动力学参数
a.在5min时SANs1和3的浓度；在IV施用后在0.5hr时SAN2的浓度。
NA.不适用。
在SC施用3mg/kg后，SDAB-01从注射部位充分吸收。在三只雄性食蟹猴中单次SC3mg/kg剂量后，在给药后72小时时观察到31.7±2.72μg/mL的平均最大血清浓度(Cmax)，这表明SDAB-01在SC注射后的吸收是缓慢的过程。在三只猴子中，终末半衰期在110-131小时范围内，平均值为123小时(即，大约5天)。SC施用后观察到的相对短的t1/2可能是由于抗-SDAB-01抗体的形成。
来自SC治疗组的两只猴子是抗-SDAB-01抗体阳性的。来自三只猴子的平均AUC为8958μg·hr/mL。由于在IV和SC治疗的猴子中都形成了抗-SDAB-01抗体，故而在猴子中SC施用后的生物利用度不能由该研究准确确定。然而，利用SC和IV施用之间的AUC0-∞比率可以得到估计值，发现其约为69.3％。由于其可能低估或高估SDAB-01在猴子中的生物利用度，该值应该谨慎应用。
总体上，在用抗-SDAB-01给药的50％(3/6)的动物中检测到抗-SDAB-01抗体形成。抗-SDAB-01抗体的出现，对于3mg/kg IV组的动物为33.3％(1/3)，对于3mg/kg SC组的动物为66.7％(2/3)。对于猴子SAN1(IV治疗组)和猴子SAN5(SC治疗组)，在给药后1008和1536小时检测到抗体(对数滴度为2.19-2.52)。对于猴子SAN4(SC治疗组)，在给药后1536小时检测到抗体(对数滴度为1.71)。由于所有的给药前样品都是阴性的，因此认为这些动物具有针对SDAB-01的免疫反应。应该注意，检测抗-SDAB-01抗体可能已经干扰SDAB-01的循环水平。
在抗-SDAB-01抗体形成是阳性的猴子中，SDAB-01的半衰期较短，这表明，在猴子中，抗-SDAB-01抗体的形成对SDAB-01的药物代谢动力学有影响。
在第二次研究中，雄性和雌性食蟹猴(n＝12/组)施用单次5mg/kg IV、100mg/kg IV和100mg/kg SC剂量的SDAB-01，并且用定性的ELISA测量血清浓度。在5或100mg/kg IV剂量的SDAB-01后，平均AUC0-∞，CL和t1/2值分别为24,600和395,000μg·h/mL，0.210和0.263mL/hr/kg，和149与144小时。系统暴露(Cmax，AUC0-∞和AUC0-168)以近似与剂量成比例方式随剂量增加而增加。在单次100mg/kg SC给药后，平均Tmax，AUC0-∞和t1/2值分别为150小时，352,000μg·h/mL和165小时。SC施用后的生物利用度(利用100mg/kg IV和SC剂量后的平均AUC0-∞值估算)为89％。在5mg/kg(IV)、100mg/kg(IV)和100mg/kg(SC)剂量组中，抗-SDAB-01抗体的出现率分别为4/12只动物(33.3％)、1/12只动物(8.3％)和1/12只动物(8.3％)。
实施例10b：比较SDAB-01(TNFαSDAB分子2x20PEG)、TNFαSDAB分子4x10PEG和TNFαSDAB分子直链1x40PEG的血清药物代谢动力学
在B6CBAF1/J小鼠、Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中，在单次IV施用2或3mg/kg(基于蛋白含量)后检验TNFαSDAB分子支链2x20kDaPEG、TNFαSDAB分子支链4x10kDa PEG和TNFαSDAB分子直链1x40kDa PEG构建体的血清PK曲线。利用特异性ELISA(小鼠和猴子)或γ-计数(大鼠)确定血清浓度。
在所有所检验的3个物种中，与直链1x40kDa PEG构建体相比，支链2x20kDa PEG构建体具有显著更高的暴露(AUC)(p＜0.05)(图25和表6-8)。具体地，在小鼠、大鼠和猴子中，相对于直链1x40kDa PEG构建体，支链2x20kDa PEG构建体的平均剂量-标准化的AUC0-∞的相对增加分别为～94，102和136％。相应地，与直链1x40kDa PEG构建体相比，支链2x20kDa PEG构建体的全身清除率(CL)较低，支链2x20kDa PEG的清除半衰期(t1/2)似乎更长。具体地，在小鼠、大鼠和猴子中，支链2x20kDaPEG构建体的平均CL值的相对减少分别为～48，50和66％，在小鼠、大鼠和猴子中，平均t1/2值的相对增加分别为43，26，54％。
与直链1x40kDa PEG构建体相比，支链4x10kDa PEG构建体在大鼠和猴子中还具有较高的平均血清AUC0-∞和较低的CL，但是在小鼠中不是这样(表6-8)。在大鼠和猴子中，与支链2x20kDa PEG构建体相比，相对于直链构建体，支链4x10kDa PEG构建体的PK参数的变化幅度较不明显(AUC0-∞增加43-51％，CL减少35-45％)。
Figure BDA00002930903500631
雄性B6CBAF1/J小鼠施用单次IV推注剂量的指示的测试产品。在给药后5min至14天立刻从每只小鼠(n＝3/时间点)采集血清样品，并且通过特异性ELISA确定血清浓度。使用零星取样法通过不分区分析(non-compartmental analysis)确定PK参数，并且用带有Dunnett′s post检验的ANOVA进行AUC最后/剂量的统计学分析，其中使用直链1x40PEG组作为对照。
星号(*)表示相对于直链PEG组的统计学显著性差异(p＜0.05)。
C5min＝在5min时(即IV施用后第一个取样时间点)的浓度。
CL＝基于血清浓度的全身清除率。
Vdss＝稳态分布容积。
t1/2＝清除半衰期。
AUC0-∞＝从时间0至无穷大的浓度-时间曲线下面积。
AUC最后＝从时间0至发现可定量的浓度时的取样时间的浓度-时间曲线下面积。
Figure BDA00002930903500651
雄性Sprague-Dawley大鼠给药单次IV推注剂量的所示125I-标记的测试产品，在给药后5min至24天采集血清样品，并且通过γ-计数确定血清中的放射性当量(RE)浓度。通过不分区分析计算每只个体动物(对于2X20和4x10kDa PEG构建体n＝7，对于1x40kDa PEG构建体n＝5)的PK参数。用带有Dunnett′s post检验的ANOVA进行AUC0-∞，AUC0-∞/剂量，CL，Vdss和t1/2值的统计学分析，其中使用直链1x40kDa PEG组作为对照。星号(*)表示相对于直链PEG的统计学显著性差异(p＜0.05)。
雄性食蟹猴施用单次IV推注剂量的所示测试产品，在5min至62，57和56天分别对于2x20，4x10和1x40kDa PEG构建体分别采集血清样品，并且通过ELISA确定血清浓度。通过不分区分析计算每只个体动物(每种构建体n＝3)的PK参数。具有急剧浓度下降的数据点不用于PK计算(对于给药2x20kDa PEG构建体的3只猴子中的一只)。用带有Dunnett′spost检验的ANOVA进行AUC0-∞，AUC0-∞/剂量，CL，Vdss和t1/2值的统计学分析，其中使用直链1x40kDa PEG组作为对照。星号(*)表示相对于直链PEG组的统计学显著性差异(p＜0.05)。
仅对SDAB-01构建体进行另外的研究：
首先，利用两种不同的免疫测定形式分析小鼠和猴子血清样品，所述两种不同的免疫测定形式为：测量完整分子的免疫测定vs.测量分子的蛋白部分的免疫测定。蛋白检测测定利用生物素化的靶分子通过蛋白部分捕获PEG化的药物缀合物。多克隆抗-药物抗体检测剂也结合分子的蛋白部分，因此该测定检测游离的和PEG化的蛋白。完整分子测定检测测定使用与蛋白检测测定相同的捕获模式，但是检测经由单克隆兔抗-PEG抗体通过PEG结构部分进行。这种检测剂抗体对PEG分子的甲氧基基团有特异性。该测定形式不显著影响PK曲线，并且计算小鼠和猴子动物模型中的参数。
其次，在对小鼠单次SC或IP给药后检验SDAB-01的药物代谢动力学曲线。在对雄性B6CBAF1/J小鼠单次2mg/kg SC给药或3mg/kg IP给药后，Tmax为24小时；t1/2值分别为52.4小时(即，大约2.2天)和57.7小时(即，大约2.4天)。IP或SC施用后的生物利用度分别为68.7％和56.6％。在对雄性Tg197小鼠单次0.3mg/kg IP给药后，Tmax，t1/2和AUC0-∞值分别为6小时、24.6小时和165μg·h/mL。IP剂量增加至1mg/kg，导致暴露(AUC0-∞＝528μg·h/mL)近似与剂量成比例的增加，其中Tmax(6小时)和t1/2(21.4小时)值与以0.3mg/kg观察到的那些相当。
实施例10c：SDAB-01(TNFαSDAB分子2x20PEG)与TNFαSDAB分子直链1x40PEG的生物分布
在B6CBAF1/J小鼠中，在单次IV给药0.3mg/kg(基于蛋白含量)的125I-标记的测试产品后，在7天(168hr)内检查TNFαSDAB分子支链2x20kDa PEG和TNFαSDAB分子直链1x40kDa PEG构建体的生物分布。利用γ-计数确定放射性当量(RE)血清和组织浓度，计算血清和组织暴露(AUC0-168hr)和组织与血清(T/S)AUC比率。
与在B6CBAF1/J小鼠中用非放射性标记的PEG缀合物进行的早期研究中的观察结果相似，与直链1x40kDa构建体相比，支链2x20kDa PEG构建体具有～80％更高的AUC0-168hr(p＜0.05)(图26)。在一些但不是所有检查的组织中，支链构建体还具有显著更高的暴露(图26)。具体地，相对于直链1x40kDa PEG构建体，在心脏、肺、肌肉、皮肤和胃中支链2x20kDa PEG构建体的AUC0-168hr的增加分别为72，115，43，55和80％。对于这些组织，在这两种构建体之间的T/S AUC比率(表9)和T/S浓度比率(数据未显示)大致相似。
与血清、心脏、肺、肌肉、皮肤和胃相反，在脂肪、肾脏、肝脏和脾脏中这两种构建体的AUC0-168hr相似，对于支链2x20kDa PEG构建体导致较低的T/S AUC比率(表9)和T/S浓度比率(数据未显示)。
对于TNFαSDAB分子直链1x40PEG和SDAB-01二者，在给药后1周(168小时)内，大约60％的施用的总放射性排泄在尿中，其中排泄在尿中的大部分放射性(约70％)归因于游离的碘。
表9.对B6CBAF1/J小鼠单次0.3mg/kg IV给药后125I-标记的PEG化的TNFα纳米抗体的组织与血清(T/S)AUC比率
Figure BDA00002930903500691
Figure BDA00002930903500701
B6CBAF1/J小鼠施用单次0.3mg/kg IV推注剂量的125I-标记的TNFαSDAB分子支链2x20kDa PEG(黑色柱)或TNFαSDAB分子直链40kDaPEG(灰色柱)。在7天(168hr)内收集血清和组织样品(每个时间点n＝8-12)，并且通过γ-计数确定组织和血清中的放射性当量(RE)浓度，如在本文中所述。使用零星取样法通过不分区分析确定血清(单位为μgxeq./mL)和每种组织(μgxeq./g)的AUC0-168hr，并且计算组织与血清(T/S)AUC比率(AUC0-168hr，组织/AUC0-168hr，血清)。
实施例11：SDAB分子与对照分子的生物物理学分析
为了研究三种TNFαSDAB分子40kDa PEG缀合物的差异性PK曲线潜在的原因，进行另外的生物物理学分析。
进行CEX-HPLC来监测三种构建体的电荷不均匀性。各自的色谱图显示在图27中。对于所有PEG化的TNFαSDAB分子缀合物均观察到显著量的电荷不均匀性。当与两种支链缀合物(2x20kDa和4x10kDa)比较时，直链PEG缀合物的主峰在较晚的保留时间洗脱下来，这表明，与支链缀合物相比，直链缀合物在表面上具有更多暴露的正电荷。关于两种支链缀合物(2x20kDa和4x10kDa)的主峰的保留时间是相似的。比较来看，与所测试的所有PEG化的缀合物相比，未缀合的蛋白洗脱下来要晚得多，这表明其具有甚至更大的表面正电荷密度。未缀合的蛋白的理论等电点大于9；因此，预测该蛋白在CEX运行缓冲液(其pH为4)中具有净正电荷。
利用SE-HPLC，使用通过UV吸光度监测的多角度光散射(MALS)、差异性屈光检查(dRI)和在线准弹性光散射(QELS)确定大小和质量分布。由于TNFαSDAB分子-PEG缀合物上的PEG在280nm不吸光，因此可以用带有UV和dRI检测的SEC-MALS确定缀合物中蛋白和PEG的分布。所有3种缀合物每一种的计算的蛋白和PEG质量分布是一致的(表10和图28)。
支链4x10kDa PEG缀合物具有明显比支链2x20kDa和直链1x40kDaPEG缀合物更晚的SEC-MALS洗脱体积，这表明，与其余两种缀合物相比，支链4x10kDa PEG缀合物在流体动力学上较小(图29)。通过QELS测量证实了4x10kDa支链PEG缀合物的较小的流体动力学半径(Rh，定义为具有与被检测的样品相同的扩散系数的球体的半径)(表10)。
利用通过MALS测量的散射光的角度依赖性，可以确定均平方根(RMS)半径分布。RMS半径(也称为回转半径，Rg)是在任意给定的时间分子的所有部分到其质量中心的均平方根距离的测量，并且提供关于分子占据的平均体积的信息。支链2x20kDa和支链4x10kDa PEG缀合物都具有比直链PEG缀合物小的Rg(RMS半径)(表10和图29)。
最后，通过计算RMS/Rh(Rg/Rh)比率可以获得构象信息：比率的值越大，分子更拉长或延长。直链1x40kDa PEG、支链2x20kDa和支链4x10kDa PEG缀合物的RMS/Rh比率分别为1.77、1.45和1.37，这表明与包含支链PEGs的更致密的缀合物相比，具有直链1x40kDa PEG的缀合物具有更延长的构象(表10)。应该注意到，用于分析PEG化的缀合物的SE-HPLC法不适用于未缀合的蛋白的并行分析。
表10.来自SEC-MALS分析的PEG化的TNFαSDAB分子的计算的重均分子量和尺寸
Figure BDA00002930903500721
所有样品稀释至2.0mg/mL，并且将100μL每种样品注射到保持在30℃的Superose6柱(400mM NaCl.20mM NaPO4，pH7.2，0.5mL/min)上。使用Wyatt Technologies的ASTRA V v5.3.4.14确定摩尔质量、Rh和RMS。
在基于细胞的生物测定中(基于TNFα在U937细胞中诱导的凋亡)，相对于PEG化的参照物质，所有三种SDAB PEG缀合物和未PEG化的蛋白具有≥92％的生物活性，这表明PEG化不改变所述蛋白的活性。
表11.蛋白序列
Figure BDA00002930903500731
表12.cDNA序列
Figure BDA00002930903500741
本文所引用的所有参考文献通过引用全部结合在本文中，并且用于所有目的，其程度如同每份单独的出版物或专利或专利申请专门且独立表示通过引用完全结合用于所有目的。
本发明不被本文所述的具体实施方案限制范围。事实上，除了本文所述的那些之外，本领域技术人员从前述描述和附图将清楚本发明描述的各种修改。此类修改旨在落入附上的权利要求的范围内。
Figure IDA00002930904400011
Figure IDA00002930904400021
Figure IDA00002930904400031
Figure IDA00002930904400051
Figure IDA00002930904400061
Figure IDA00002930904400081
Figure IDA00002930904400091
Figure IDA00002930904400101
Figure IDA00002930904400111
Figure IDA00002930904400121

Claims (31)

1.一种修饰的单结构域抗原结合分子，其包含：
(i)结合一种或多种靶标的一个或多个单抗原结合结构域；
(ii)非肽连接体；和
(iii)一个或多个聚合物分子，
其中所述非肽连接体是式(I)的结构部分：
Figure FDA00002930903400011
其中
W1和W2各自独立地选自键或NR1；
Y是键，被0-2个存在的Ra取代的C1-4亚烷基，或吡咯烷-2，5-二酮；
X是O，键或不存在；
Z是O，NR3，S或键；
R1和R3各自独立地是氢或C1-6烷基；
R2不存在或是一个或多个聚合物结构部分；
Ra选自羟基、C1-4烷基或C1-4烷氧基；
m是0或1；
n是0，1，2或3；
p是0，1，2，3或4。
2.权利要求1的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述一个或多个聚合物分子包括聚(乙二醇)(PEG)单体或其衍生物。
3.权利要求2的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述PEG聚合物分子是支链的，并且所述PEG单体是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)或其衍生物。
4.权利要求3的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述PEG聚合物分子是选自由式(a)-(h)组成的组的支链PEG聚合物分子：
Figure FDA00002930903400021
5.权利要求2-4的修饰的单结构域抗原结合分子，其中每个PEG聚合物结构部分独立地具有1KDa至100KDa的分子量。
6.权利要求5的修饰的单结构域抗原结合分子，其中每个PEG聚合物结构部分独立地具有10KDa至50KDa的分子量。
7.权利要求5的修饰的单结构域抗原结合分子，其中每个PEG聚合物结构部分独立地具有选自由10KDa、20KDa、30KDa、40KDa和50KDa组成的组的分子量。
8.权利要求5的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述连接体和所述PEG聚合物分子具有选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA00002930903400031
9.权利要求8的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述连接体和所述PEG聚合物分子由下式表示：
Figure FDA00002930903400032
10.权利要求1-9中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其中至少一个所述单抗原结合结构域结合人TNFα。
11.权利要求1-10中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其为单价的、二价的或三价的。
12.权利要求1-11中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其为单特异性的、双特异性的或三特异性的。
13.权利要求1-12中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其中一个或多个所述单抗原结合结构域是CDR-嫁接的、人源化的、骆驼源化的、去免疫的或是通过噬菌体展示选择的。
14.权利要求1-10中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其为单链融合多肽，所述单链融合多肽从N端到C端以下述顺序包含：抗-TNFα单抗原结合结构域-(任选地，肽连接体)-抗-TNFα单抗原结合结构域-非肽连接体-一个或多个聚合物分子。
15.权利要求1-14中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其中一个或多个所述单抗原结合结构域包含图2所示的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列。
16.权利要求14或15的修饰的单结构域抗原结合分子，其中一个或多个所述单抗原结合结构域包含三个CDR，所述CDR具有下述氨基酸序列：DYWMY(CDR1)，EINTNGLITKYPDSVKG(CDR2)和SPSGFN(CDR3)，或具有与所述CDR之一区别在于1个氨基酸取代的CDR。
17.权利要求14-16中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述肽连接体包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个(Gly)3-Ser或(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：8)重复。
18.权利要求17的修饰的单结构域抗原结合分子，其由以下结构表示：
Figure FDA00002930903400041
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-18中任一项所述的修饰的单结构域抗原结合分子和药用载体。
20.权利要求19的药物组合物，其还包含选自以下中的一种或多种的第二试剂：细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
21.一种改善受试者中的炎性或自身免疫性病症的方法，所述方法包括：以使TNFα相关病症的一种或多种症状减轻的量，给所述受试者施用权利要求1-18中任一项所述的修饰的单结构域抗原结合分子。
22.权利要求21的方法，所述方法还包括：与所述修饰的单结构域抗原结合分子联合施用第二试剂，其中所述第二试剂选自以下中的一种或多种：细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
23.权利要求21或22的方法，其中所述TNFα-相关病症选自以下中的一种或多种：类风湿性关节炎(RA)，关节炎性病症，银屑病关节炎，多关节青少年特发性关节炎(JIA)，强直性脊柱炎(AS)，银屑病，溃疡性结肠炎，局限性肠炎，炎性肠病，或多发性硬化病。
24.权利要求23的方法，其中所述修饰的单结构域抗原结合分子或第二试剂通过皮下、血管内、肌内或腹膜内注射或通过吸入被施用给所述受试者。
25.一种评估修饰的单结构域抗原结合分子的方法，所述方法包括：
将权利要求1-18中任一项所述的修饰的SDAB分子施用给受试者；和
评估所述修饰的SDAB分子的一种或多种药动学/药效学(PK/PD)参数。
26.一种评估或选择修饰的单结构域抗原结合分子的方法，所述方法包括：
提供施用给受试者的权利要求1-18中任一项所述的修饰的SDAB分子在受试者中的至少一个PK/PD参数的检测值；和
将所提供的检测值与至少一个参照值比较，从而评估或选择所述修饰的SDAB分子。
27.权利要求25或26的方法，所述方法还包括：提供包含所述修饰的SDAB分子的样品；并且在捕获检测测定中检测所述样品。
28.权利要求25-27中任一项的方法，其中所评估的PK/PD参数选自以下中的一种或多种：所述修饰的SDAB分子的体内浓度(例如，在血液、血清、血浆和/或组织中的浓度)；所述修饰的SDAB分子的清除率(CL)；所述修饰的SDAB分子的稳定-容积分布(Vdss)；所述修饰的SDAB分子的半衰期(t1/2)；所述修饰的SDAB分子的生物利用度；所述修饰的SDAB分子的剂量标准化的最大血液、血清或血浆浓度；所述修饰的SDAB分子的剂量标准化的暴露；或所述修饰的SDAB分子的组织与血清的比率。
29.一种用于评估修饰的单结构域结合分子的捕获检测测定法，所述测定法包括提供：固定到固体支持物上的靶标；和一种试剂，所述试剂与修饰的单结构域抗原结合分子的蛋白或聚合物结构部分结合，以检测结合的修饰的单结构域抗原结合分子-靶标复合物。
30.一种试剂盒或制品，其包括装置、注射器或小瓶，所述装置、注射器或小瓶包含权利要求1-17中任一项的修饰的单结构域结合分子，并且任选地包括使用说明书。
31.一种制备修饰的单结构域结合分子的方法，所述方法包括：
提供单结构域结合分子；
使所述单结构域结合分子与式(I)的非肽连接体在形成至少一个化学键的条件下接触：
Figure FDA00002930903400061
其中
W1和W2各自独立地选自键或NR1；
Y是键，被0-2个存在的Ra取代的C1-4亚烷基，或吡咯烷-2，5-二酮；
X是O，键或不存在；
Z是O，NR3，S或键；
R1和R3各自独立地是氢或C1-6烷基；
R2不存在或是一个或多个聚合物结构部分；
Ra选自羟基、C1-4烷基或C1-4烷氧基；
m是0或1；
n是0，1，2或3；
p是0，1，2，3或4。
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