CN103113462A - 一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法和用途，本发明所述鲨鱼糖蛋白是从鲨鱼鱼肉经组织捣碎、脱脂、酶解、再经DEAE-cellulose-52柱层析、Sephadex G-100柱层析和反相高效液相色谱纯化，浓缩、再经冷冻干燥步骤得到鲨鱼糖蛋白。本发明的鲨鱼糖蛋白的分子量约为26.4kDa，糖和蛋白含量分别为33.65％和66.35％，含有O-糖肽键和N-糖肽键，单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09；蛋白质由17中氨基酸组成。本发明的鲨鱼糖蛋白在临床上可以作为一种新生血管抑制剂使用，可用于肿瘤等疾病的治疗，具有广阔的市场前景。

Description

一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药工程技术领域，尤其涉及是一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法以及在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

糖蛋白(glycoprotein)是一类由糖类物质(多为寡糖)与蛋白质或多肽以共价键(O-糖苷键或N-糖苷键)连接而形成的结合蛋白，广泛地存在于动物、植物和微生物体内，是生物体内一类非常重要的功能大分子。自20世纪60年代以来，生物化学、化学和药学等领域的研究人员经过广泛和深入的研究，发现糖蛋白具有显著的药用价值和保健价值，具有抗肿瘤、提高免疫力、降血脂、抗糖尿病、抗氧化和防衰老等多种功能。目前已成功应用于临床并具有显著生物活性的药用蛋白制剂大都是糖蛋白。近年来，天然产物来源的糖蛋白，在生物化学、蛋白质工程学、临床医学、药物化学及功能食品等领域受到高度重视。特别是存在于动、植物中的具有显著生物活性的糖蛋白，在创新药物及功能性食品开发方面具有广阔的应用前景。

鲨鱼肉味甘、咸，性平，归脾、肺经。具补虚、健脾、利水、祛瘀消肿之功效。主治久病体虚、脾虚浮肿和创口久不愈合等病症。目前，国内外学者对鲨鱼研究主要集中在软骨抗肿瘤活性成分(多糖、蛋白质、多肽)、鲨鱼皮胶体蛋白、鲨鱼肝脏的鱼肝油(角鲨烯)等领域。鱼肉主要作为食补材料，而其活性成分，特别是鱼肉糖蛋白的制备工艺及其作为抗肿瘤物质的应用尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种鲨鱼糖蛋白，对血管生成及肿瘤有明显的抑制作用。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种鲨鱼糖蛋白的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种鲨鱼糖蛋白的应用。

本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种鲨鱼糖蛋白，其特征在于该鲨鱼糖蛋白的分子量为26.4Da，其中糖和蛋白含量分别为33.65％和66.35％，该鲨鱼糖蛋白中单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09。

作为优选，所述鲨鱼糖蛋白的分子量为26.4Da，其中糖和蛋白含量分别为33.65％和66.35％，所述鲨鱼糖蛋白中单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09。

作为改进，所述鲨鱼糖蛋白的组分在280nm处有蛋白质特征吸收值，同时用苯酚-硫酸法检测时，在490nm有多糖特征吸光值的组分。

再改进，所述鲨鱼糖蛋白的糖肽的结合方式为N-糖肽键和O-糖肽键。

最后，所述鲨鱼糖蛋白中有17种氨基酸，其中100g总氨基酸中含有丙酸酸10.4g，精氨酸5.9g，天冬氨酸8.3g，半胱氨酸0.1g，谷氨酸8.7g，甘氨酸15.6g，组氨酸0.2g，异亮氨酸1.2g，亮氨酸2.9g，赖氨酸2.2g，蛋氨酸0.9g，苯丙氨酸2.6g，脯氨酸9.5g，丝氨酸16.7g，苏氨酸8.9g，酪氨酸0.3g，缬氨酸5.6g。

本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种鲨鱼糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤为：

1)匀浆：鲨鱼肉于80％～95(v)％乙醇溶液中匀浆2～4min，匀浆液用0.5～1.5mol/LNaOH调pH值至8.5～9.5，用双蒸水调乙醇浓度至50％～70(v)％，于20～30℃水浴中保温20～40min后，于3000～5000r/min离心10～20min，收集上清液；加NaCl将上清液的NaCl浓度调至5％～10(wt)％，于20～30℃水浴中10～15小时，于3000～5000r/min离心10～20min，收集沉淀；

2)脱脂：将1)所得沉淀物加入乙醚处理2～3小时，过滤得沉淀物，冻干得脱脂蛋白粉末；

3)酶解：将2)所得脱脂蛋白粉末按照料液比1∶40～1∶60溶于双蒸水中，用0.5～1.5mol/LHCl调pH至5.5～6.5，按照脱脂蛋白粉末0.8～1.2(wt)％的量加入木瓜蛋白酶，于50～60℃酶解2～4小时；将所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，酶解液3000～5000r/min离心20～40min，取上清液脱盐、浓缩和冷冻干燥，得糖蛋白粗品；

4)精制：将3)所得糖蛋白粗品溶于双蒸水中，经阴离子交换树脂柱层析，先用0.09～0.11mol/L NaCl洗脱，然后用0.45～0.55mol/L NaCl洗脱，收集0.45～0.55mol/LNaCl洗脱组分，即得粗糖蛋白组分；将所收集的粗糖蛋白组分再上葡聚糖凝胶柱，用去离子水洗脱，收集糖蛋白组分；将凝胶色谱收集的糖蛋白组分用高效液相色谱纯化，收集洗脱峰，冷冻干燥得糖蛋白。

作为优选，所述步骤3)中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1×10⁶U/g。

作为改进，所述步骤3)中的灭酶处理为：将所得的酶解产物升温至95～100℃，并于此温度保持10～15min，再冷却至10～20℃以终止酶反应；所述步骤3)中的脱盐过程为：将酶解液制成浓度10mg/ml～20mg/ml的溶液，进行D101大孔树脂脱盐；脱盐后的酶解液在不高于40℃的低温下进行真空浓缩，得到浓缩酶解液于低温冻干。

最后，所述步骤4)中的阴离子交换树脂为DEAE-cellulose-52，葡聚糖凝胶为Sephadex G-100；高效液相色谱的条件为：色谱柱为Inertsil ODS-3C₁₈柱，流动相为：乙腈-水，含0.1(wt)％三氟乙酸梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min。

本发明解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种鲨鱼糖蛋白应用于抗肿瘤药物中或者作为一种新生血管抑制剂使用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明以鲨鱼鱼肉为原料，利用脱脂、酶解、离子交换树脂柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化制备糖蛋白，不仅原料丰富，而且制备工艺简单、易操作，制得的鲨鱼糖蛋白经鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制实验显示对新生血管具有显著抑制作用，且呈现量效关系，体外抗肿瘤实验显示对肿瘤细胞株P388(人白血病细胞株)、A-549(人肺腺癌)和BEL-7402(肝癌细胞株)均显示出明显的抑制作用，并呈剂量依赖关系。本发明的鲨鱼糖蛋白在临床上可以作为一种新生血管抑制剂使用，可用于肿瘤等疾病的治疗，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1鲨鱼脱脂蛋白酶解物在DEAE-Cellulose-52层析柱上的洗脱曲线(0.5mol/LNaCl洗脱组分)；

图2粗糖蛋白组分在Sephadex G-100层析柱上的洗脱曲线；

图3糖蛋白组分在RP-HPLC上的洗脱曲线；

图4鲨鱼糖蛋白FT-IR图；

图5糖蛋白的SDS-PAGE图；其中第一栏：鲨鱼糖蛋白；第二栏：由PNGase F酶解后的鲨鱼糖蛋白降解物；

图6碱处理前后鲨鱼糖蛋白的UV图谱；

图7鲨鱼糖蛋白的温度降解曲线；

图8鲨鱼糖蛋白抑制CAM血管生成的测定的结果，其PBS为阴性对照，CS为阳性对照。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明所用的仪器设备：

Agilent 1200高效液相色谱(美国Agilent公司)

Milli-Q system(美国Millipore公司)

DEAE-cellulose-52和Sephadex G-100柱层析设备(瑞典Pharmacia公司)；

FDU-1200小型冷冻干燥机(日本EYELA公司)

DS-21高速组织捣碎机(上海标本模型厂)；

UV-22000型紫外分光光度计(尤尼柯仪器(上海)有限公司)；

DYY-22C电泳仪(北京六一仪器厂)；

Hei-VAP旋转蒸发器(德国Heidolph公司)；

BSZ-100型自动部分收集器(上海琪特分析仪器有限公司)

LXB型离心机(上海医用分析仪器厂)；

本发明所使用的试剂及原料：

PNGase F(美国Sigma公司)

蛋白质标准品(上海源聚生物技术有限公司)

牛血清白蛋白(上海源聚生物技术有限公司)

其它试剂均为分析纯，均由国药集团化学试剂有限公司提供。

一种鲨鱼糖蛋白的制备方法，制备工艺流程如下：鲨鱼肉→组织捣碎→乙醚脱脂→木瓜蛋白酶酶解→阴离子交换层析→葡聚糖凝胶层析→高效液相色谱精制→理化性质、活性分析。

具体步骤为：

1、匀浆：灰星鲨(Mustelus griseus)鱼肉于90(v)％乙醇溶液中匀浆3min，匀浆液用1mol/L NaOH调pH值至9.0，用双蒸水调乙醇浓度至60(v)％，于25℃水浴中保温30min后，于4000r/min离心15min，收集上清液，加NaCl将上清液的NaCl浓度调至5(wt)％，于25℃水浴中15小时，于4000r/min离心15min，收集沉淀。

2、脱脂：将所得沉淀物加入乙醚处理3小时，过滤得沉淀物，冻干得脱脂蛋白粉末。

3、酶解：将步骤2所得的脱脂蛋白粉末按照料液比1∶50溶于双蒸水中，用0.1mol/LHCl调pH至6，按照脱脂蛋白粉末1(wt)％的量加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的酶活力≥1×10⁶U/g，于55℃酶解3小时；将所得的酶解产物于100℃水域中10min灭酶处理，冷却至10℃得酶解液，酶解液4000r/min离心25min，取上清液上D101大孔树脂脱盐、低于40℃温度下进行真空浓缩至原体积1/4，浓缩液冷冻干燥，得糖蛋白粗品。

4、精制：将所得糖蛋白粗品溶于双蒸水中，经DEAE-cellulose-52阴离子交换树脂柱层析，先用0.1mol/L NaCl洗脱，然后用0.5mol/L NaCl洗脱，收集0.5mol/L NaCl洗脱组分，即得粗糖蛋白组分；将所收集的粗糖蛋白组分再上葡聚糖Sephadex G-100凝胶柱，去离子水洗脱，收集糖蛋白组分；将凝胶色谱收集的糖蛋白组分用高效液相色谱，色谱柱为Inertsil ODS-3 C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为：乙腈-水(0.1％三氟乙酸)梯度洗脱，流速为1mL/min纯化，收集洗脱峰，冷冻干燥得糖蛋白。

下面对制得的糖蛋白进行检测：

1、所得的鲨鱼糖蛋白组分是在280nm处有蛋白质特征吸收值，同时用苯酚-硫酸法检测时，在490nm又有多糖特征吸光值的组分。

2、将制得的鲨鱼糖蛋白采用KBr压片法，在4000cm^-1-500cm^-1范围内扫描，得红外图谱，如附图4所示，吸收峰位于3500cm^-1-2800cm^-1之间，表明本发明提取物为糖类化合物，3367.5，2930.3，1652.3，1557.7，1406.5，1149.5，1077.5cm^-1处有明显吸收峰，进一步证明该样品为糖蛋白。其中3367.5cm^-1左右为多糖控基伸缩振动吸收峰，2930.3cm^-1左右为糖C-H伸缩振动吸收峰，1403cm^-1为多糖C-O振动吸收峰；1652.3cm^-1和1557.7cm^-1处为酰胺基的N-H振动吸收峰。

3、将鲨鱼糖蛋白经PNGase F酶解，分子量降低(图5)，表明鲨鱼糖蛋白中糖肽的结合方式有N-糖肽键；本发明所得的鲨鱼糖蛋白配成0.5mol/L的水溶液和0.2mol/L的NaOH溶液，于45℃水浴处理2h，分别以水和0.2mol/L的NaOH溶液为空白，在200nm～400nm范围内扫描得紫外光谱图，如附图6所示，碱处理样品的紫外光谱230nm～240nm间出现吸收，由此确定本发明所得的鲨鱼糖蛋白中糖肽的结合方式有O-糖肽键。

4、所述鲨鱼糖蛋白经SDS-PAGE电泳分析分子量约为26.4kDa(图5)。

5、所述鲨鱼糖蛋白经高效液相色谱分析其半数降解温度为74.7℃(图7)。

6、所述鲨鱼糖蛋白中糖和蛋白含量分别为33.65％和66.35％；经GC/MS测定，糖蛋白中单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09。

7、将鲨鱼糖蛋白经氨基酸分析仪分析，糖蛋白由17中氨基酸组成，详见表1。

表1.鲨鱼糖蛋白中氨基酸组成及含量

8、将鲨鱼糖蛋白作抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术-无气室孵育法”[记载于《中山大学学报(自然科学版)》，2003年第2册(第42卷)：第126-128页]，测定时滤纸片大小为3mm×3mm；加样前孵化时间为4天；加样量：糖蛋白分别为0.1g/L、0.4g/L、0.8g/L；0.0lmol/L pH 7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)为阴性对照；0.4g/L的硫酸软骨素(CS)为阳性对照，加样量为10μL。加样后继续孵化24h，以给药点为中心，以半径间隔5mm将CAM划分为3个区域，计数各区域的血管数.

结果表明，鲨鱼糖蛋白显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成并呈剂量依赖关系(表2，图8)

表2加样48h后CAM上鲨鱼糖蛋白的血管生成抑制效果的统计学分析

9、本发明所得的鲨鱼糖蛋白作体外抗肿瘤活性的测定，测定方法参考王斌，任舒文，李国强，管华诗“柽柳抗肿瘤甾体和黄酮类化合物研究”[记载于《中国药学杂志》，2009年第44卷第4期：第576-580页]，测定时将一定数量处于对数生长期的细胞每孔90μL接种于96孔微量培养板内，培养24h后每孔加入待测样10μL，每个细胞株，每个浓度均为3个复孔。细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48h后，每孔加用生理盐水配制的5g·L^-1的MTT液20μL；继续培养4h后，每孔加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol·L^-1HCl)50μL，于CO₂培养箱中过夜。然后用酶标仪在最适合波长570nm测每孔A值。按下列公式计算抑制率：生长抑制率IR(％)＝(1-A用药组/A对照组)×100％。

结果表明，鲨鱼糖蛋白对肿瘤细胞株P388(人白血病细胞株)、A-549(人肺腺癌)和BEL-7402(肝癌细胞株)均显示出明显的抑制作用，并呈剂量依赖关系(表3)。

表3鲨鱼糖蛋白体外抗肿瘤活性

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种鲨鱼糖蛋白，其特征在于该鲨鱼糖蛋白的分子量为26.4Da，其中糖和蛋白含量分别为33.65％和66.35％，该鲨鱼糖蛋白中单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09。

2.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白，其特征在于所述鲨鱼糖蛋白中有17种氨基酸，其中100g总氨基酸中含有丙酸酸10.4g，精氨酸5.9g，天冬氨酸8.3g，半胱氨酸0.1g，谷氨酸8.7g，甘氨酸15.6g，组氨酸0.2g，异亮氨酸1.2g，亮氨酸2.9g，赖氨酸2.2g，蛋氨酸0.9g，苯丙氨酸2.6g，脯氨酸9.5g，丝氨酸16.7g，苏氨酸8.9g，酪氨酸0.3g，缬氨酸5.6g。

3.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白，其特征在于所述鲨鱼糖蛋白的组分在280nm处有蛋白质特征吸收值，同时用苯酚-硫酸法检测时，在490nm有多糖特征吸光值的组分。

4.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白，其特征在于所述鲨鱼糖蛋白的糖肽的结合方式为N-糖肽键和O-糖肽键。

5.一种根据权利要求1至4任一权利要求所述的鲨鱼糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤为：

1)匀浆：鲨鱼肉于80％～95(v)％乙醇溶液中匀浆2～4min，匀浆液用0.5～1.5mol/LNaOH调pH值至8.5～9.5，用双蒸水调乙醇浓度至50％～70(v)％，于20～30℃水浴中保温20～40min后，于3000～5000r/min离心10～20min，收集上清液；加NaCl将上清液的NaCl浓度调至5％～10(wt)％，于20～30℃水浴中10～15小时，于3000～5000r/min离心10～20min，收集沉淀；

2)脱脂：将1)所得沉淀物加入乙醚处理2～3小时，过滤得沉淀物，冻干得脱脂蛋白粉末；

3)酶解：将2)所得脱脂蛋白粉末按照料液比1∶40～1∶60溶于双蒸水中，用0.5～1.5mol/LHCl调pH至5.5～6.5，按照脱脂蛋白粉末0.8～1.2(wt)％的量加入木瓜蛋白酶，于50～60℃酶解2～4小时；将所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，酶解液3000～5000r/min离心20～40min，取上清液脱盐、浓缩和冷冻干燥，得糖蛋白粗品；

4)精制：将3)所得糖蛋白粗品溶于双蒸水中，经阴离子交换树脂柱层析，先用0.09～0.11mol/L NaCl洗脱，然后用0.45～0.55mol/L NaCl洗脱，收集0.45～0.55mol/LNaCl洗脱组分，即得粗糖蛋白组分；将所收集的粗糖蛋白组分再上葡聚糖凝胶柱，用去离子水洗脱，收集糖蛋白组分；将凝胶色谱收集的糖蛋白组分用高效液相色谱纯化，收集洗脱峰，冷冻干燥得糖蛋白。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1×10⁶U/g。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的灭酶处理为：将所得的酶解产物升温至95～100℃，并于此温度保持10～15min，再冷却至10～20℃以终止酶反应；所述步骤3)中的脱盐过程为：将酶解液制成浓度10mg/ml～20mg/ml的溶液，进行D101大孔树脂脱盐；脱盐后的酶解液在不高于40℃的低温下进行真空浓缩，得到浓缩酶解液于低温冻干。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中的阴离子交换树脂为DEAE-cellulose-52，葡聚糖凝胶为Sephadex G-100；高效液相色谱的条件为：色谱柱为Inertsil ODS-3 C₁₈柱，流动相为：乙腈-水，含0.1(wt)％三氟乙酸梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min。

9.一种根据权利要求1至4任一权利要求所述的鲨鱼糖蛋白应用于抗肿瘤药物中或者作为一种新生血管抑制剂使用。

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