CN103110890B - 协日嘎四味有效部位及其制备方法、质量检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种协日嘎四味有效部位及其制备方法，制备方法包括溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界C02流体萃取法、液-液逆流萃取法中的一种或几种，制得的协日嘎四味有效部位中总萜类、总酚类、总生物碱类成分百分含量的总和为5～99％(w/w)，使其有效成分的含量大大提高，克服了汤剂、胶囊剂服用剂量大的缺陷。同时本发明还提供了协日嘎四味有效部位中总酚、总萜、总生物碱、栀子苷、姜黄素、盐酸小檗碱的含量测定方法，有利于提高产品质量的可控性，对蒙药协日嘎四味的开发具有现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种蒙药的有效部位,特别涉及协日嘎四味有效部位及其制备方法、质量检测方法以及在药品和保健食品等领域的应用，属医药技术领域。
背景技术
协日嘎四味由姜黄、黄柏、栀子、蒺藜4味中药组成，蒙医临床较常用，具有利尿、清泻湿热功能；主要用于小便闭止，尿频，尿急，尿中带血，膀胱刺痛，是蒙医治疗膀胱热证的首选方剂。协日嘎四味中主要含有酚酸类、生物碱类、萜类等成分，但是迄今未见涉及协日嘎四味的有效部位及其制备方法和用途的专利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种协日嘎四味有效部位及其制备方法，还在于提供一种协日嘎四味有效部位的质量检测方法，还在于提供一种以协日嘎四味有效部位为活性成分的药物或功能性食品。
本发明中协日嘎四味有效部位的原料药组成为：
姜黄100-200重量份、黄柏50-130重量份、栀子60-180重量份、蒺藜100-200重量份。
本发明中协日嘎四味黄酮有效部位的原料药组成优选为：
姜黄150重量份、黄柏90重量份、栀子120重量份、蒺藜150重量份。
所述蒺藜为蒺藜科植物蒺藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果实经微炒制得。
本发明协日嘎四味有效部位的原料药，可以是市售协日嘎四味中各味药材的饮片，也可以是这些植物的茎、叶、花穗、果实、地下根茎及根等任一部位或全部植株，优选的药材来源为---姜黄：姜科植物姜黄(Curcuma longa L.)的干燥根茎。黄柏：芸香科植物黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)或黄皮树的树皮。栀子：于双子叶植物药茜草科植物山栀(Gardenia jasminoides Ellis)的果实。蒺藜（微炒）:蒺藜科植物蒺藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果实经微炒制得。其中所述的协日嘎四味各味药材包括未经任何炮制处理的原药材、饮片以及炮制品。
本发明协日嘎四味有效部位的制备方法可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备:
1、溶剂萃取法：取协日嘎四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，50%-95%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将提取物混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1：3—1：10（w/v）；然后用低极性的溶剂，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，萃取2-4次，得到脂溶性成分；再用中等极性的溶剂，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，经2-5次萃取其中的成分；与之前萃取得到的脂溶性成分混合得到协日嘎四味有效部位。
所述低极性的溶剂为石油醚、乙醚、己烷、汽油中的任意一种溶剂或任意几种溶剂的混合物；所述中等极性的溶剂为氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇中的任意一种溶剂或任意几种溶剂的混合物。
2大孔吸附树脂法：取协日嘎四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，50%-95%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将提取物混悬于水中，使得药材量与分散后溶液体积比为1:10-1:2.5（w/v）；通过相当生药量的6-10体积倍的大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:4～1:13，以1-5倍树脂体积的水洗脱进行除杂，除杂流速为2～6BV/h；以5-12倍树脂体积的50％-70%乙醇洗脱，洗脱流速为1～3BV/h，收集50％-70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以5-12倍树脂体积的71％-90%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集71％-90%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将50％-70%乙醇洗脱物与71％-90%乙醇洗脱物混合即为协日嘎四味有效部位。
其中所用的大孔树脂是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性任意一种类型，如AB-8、D3520、D101、D4020、HPD400、S-8、HZ-806等，其中优选为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、D4020、D101等。其中所用的洗脱剂还可以为水或含水的乙醇、甲醇、丙酮等，优选为0～100％的乙醇。
其中50％-70%乙醇洗脱物与71％-90%乙醇洗脱物混合可以是洗脱物直接混合，也包括将71％-90%乙醇洗脱物用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与50％-70%乙醇洗脱物混合。β-环糊精与71％-90%乙醇洗脱物量为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
3、超临界C02流体萃取法：取协日嘎四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，加30-90％甲醇，超临界流体萃取2-3次，每次提取1-3小时，溶剂用量为8L，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的乙酸乙酯，萃取其中的成分，得协日嘎四味有效部位；
可以对协日嘎四味原材料直接进行萃取，也可以对上述任一方法和步骤所获得的产物进行萃取。萃取时可以使用或不使用以下任一种类溶剂及溶剂混合物:水、醇类、酮类及酯类溶剂。
4、液-液逆流萃取法：取协日嘎四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，50％-80%乙醇回流提取2-4次，溶剂用量为5-15体积份，每次提取1-3小时，减压回收溶剂，得提取物；先将提取物混悬于水中，然后用低极性溶剂萃取得到脂溶性成分，然后用中等极性的溶剂萃取获得其中的萜类、酚类、生物碱类成分，将脂溶性成分与萜类、酚类、生物碱类成分混合得协日嘎四味提取物。
脂溶性成分与萜类、酚类、生物碱类成分可以是直接混合，也可以将脂溶性成分用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与萜类、酚类、生物碱类成分混合。β-环糊精与脂溶性成分量为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
本发明所述的重量份与体积份的关系为g/mL的关系。
本发明所述的协日嘎四味有效部位,其中总萜类、总酚类、总生物碱类成分百分含量的总和为5～99％(w/w)，其中优选为50～99％（w/w）。
本发明所述的协日嘎四味提取物中酚类活性成分最主要的是姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、1,7-bis（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-1,4,6-heptarien-3-one、1,7-bis（4-hydroxyphenyl）-1,4,6-heptatrien-3-one等成分。本发明所述的协日嘎四味提取物中萜类活性成分最主要的是京尼平苷、羟异栀子苷、山栀子苷、栀子苷、京尼平甙酸、京尼平苷龙胆二糖苷、栀子酮苷、10-乙酰京尼平苷、栀子酸、熊果酸等成分。本发明所述的协日嘎四味提取物中生物碱类活性成分最主要的是小檗碱、巴马亭、药根碱、黄柏酮、黄柏内酯、关黄柏内酯A、关黄柏内酯B、关黄柏酰胺A等成分。
本发明所述的协日嘎四味提取物中主要的酚类化合物结构见表1：
表1主要的酚类化合物结构
本发明所述的协日嘎四味有效部位可以单独、组合或与其它中西药物、食物配伍，制成胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等药物或功能性食品。
本发明所述的协日嘎四味有效部位的质量检测方法包括如下含量测定方法中的任意一种或几种：
1、协日嘎四味有效部位中总酚的含量测定
精密吸取浓度为23.68μg/ml的姜黄素对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5ml，置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0．3%十二烷基硫酸钠2．0ml及1∶0．9的0．6%三氯化铁－0．9%铁氰化钾混合溶液1．0ml，混匀，在暗处放置5min，加0．1mol/L盐酸溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，在720nm波长处测定吸收度；以姜黄素对照品取样量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
精密称取协日嘎四味有效部位样品各3份，每份30mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶，加70%乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0．3%十二烷基硫酸钠2．0ml及1∶0．9的0．6%三氯化铁－0．9%铁氰化钾混合溶液1．0ml，混匀，在暗处放置5min，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，在720nm波长处测定吸收度；外标两点法计算含量，即得本发明协日嘎四味有效部位中总酚以姜黄素计为15%～26%。
2.协日嘎四味有效部位中总萜的含量测定
精密吸取0.0948mg/mL的栀子苷对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL,置10mL具塞刻度试管中；向试管中缓慢滴加浓度为1mg/mL的香草醛-浓硫酸溶液，并不时振摇试管；最后定容至5mL，摇匀，室温静置10min，于438nm处测定吸光度；以栀子苷对照品取样量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
精密称取协日嘎四味有效部位样品各3份，每份25mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶，加70%乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10mL具塞刻度试管中；向试管中缓慢滴加浓度为1mg/mL的香草醛-浓硫酸溶液,并不时振摇试管；最后定容至5mL,摇匀,室温静置10min,于438nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明协日嘎四味有效部位中总萜以栀子苷计为25%～36%。
3.协日嘎四味有效部位中总生物碱的含量测定
精密吸取0.0592mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液0.5ml，1.5ml，2.5ml，3.5ml，4ml，5.5ml置10ml具塞刻度试管中，挥干溶剂，分别加6ml溴麝香草酚蓝试液溶解样品，再加入6ml氯仿，用力振摇2min，倾入分液漏斗中，静置30min，取氯仿层，同法萃取三次，取氯仿层置25ml容量瓶中，并用氯仿补足至刻度；以相应试剂为空白，于415nm测定吸光度，以盐酸小檗碱对照品取样量（mg）为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线；
精密称取协日嘎四味有效部位样品各3份，每份30mg，置25mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10ml具塞刻度试管中，挥干溶剂，分别加6ml溴麝香草酚蓝试液溶解样品，再加入6ml氯仿，用力振摇2min，倾入分液漏斗中，静置30min，取氯仿层，同法萃取三次，取氯仿层置25ml容量瓶中，并用氯仿补足至刻度；以相应试剂为空白，于415nm测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明协日嘎四味有效部位中总生物碱以盐酸小檗碱计为12%～28%。
4．协日嘎四味有效部位中栀子苷、姜黄素、盐酸小檗碱的含量测定
色谱条件：色谱柱:Elite C18色谱柱,4.6mm×250mm,5μm；流动相:乙腈(A)–0.4%磷酸二氢钾水溶液(B),梯度洗脱条件：0～15min，8%A→18%A；15～18min，18%A→45%A；18～22min，45%A→27%A；22～35min，,27%A→12%A；35～40min，12%A→45%A；40～55min，48%A→52%A；流速1.0mL·min-1；检测波长分别为238nm、346nm、346nm；柱温30℃;进样量20μL；
标准曲线绘制：精密称取经减压干燥至恒重的栀子苷对照品0.89mg与姜黄素对照品0.98mg至5ml量瓶中，精密称取盐酸小檗碱0.81mg于10ml容量瓶中，吸取2ml至混有上述两个对照品的5ml容量瓶中，分别配制成浓度为0.178,0.0392,0.0324mg·mL-1的混合对照品储备液，用50乙醇定容至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液；分别取混合对照品溶液分别进样2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0,25.0μl在上述色谱条件下进行HPLC分析,以峰面积Y为纵坐标,溶液的质量X(μg)为横坐标绘制标准曲线，得到栀子苷、姜黄素、小檗碱的回归方程；
含量测定：精密称取3批协日嘎四味有效部位样品各3份，每份25mg，于25ml容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液；
精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得本发明协日嘎四味有效部位中含姜黄素、栀子苷、盐酸小檗碱分别为1.30-2.50%、9.25-19.50%，0.80-2.10%。
本发明对协日嘎四味的原料药提取物进行纯化得到协日嘎四味有效部位，使其有效成分的含量大大提高，克服了汤剂、胶囊剂服用剂量大的缺陷；同时，以前的协日嘎四味缺乏具体的质量标准控制指标，未形成系统的质量标准体系，本发明通过纯化得到协日嘎四味有效部位，进行了协日嘎四味有效部位中总酚、总萜、总生物碱、栀子苷、姜黄素、盐酸小檗碱的含量测定，有利于提高产品质量的可控性，对蒙药协日嘎四味的开发具有现实意义。
下面实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。
实验例1：协日嘎四味有效部位富集所用树脂工艺的筛选
经查阅文献资料和实际结合，采用4因素3水平正交实验，考察因素：（50％-70%乙醇）洗脱流速、径高比、上样浓度、生药和树脂的体积比。以总萜类、总酚类、总生物碱提取量为考察指标。具体见下表。
表3因素水平表
样品的制备：称取复方协日嘎四味药材共18份，按L9（3）4正交实验表，分别制备各样品（重复一份,共18次），过滤，回收溶剂，真空干燥，称重，见下表。
表4样品制备表
样品溶液的制备：将上述18份样品分别置于25mL量瓶，以70%乙醇溶解，超声，分别吸取一定量的待测液，平行操作两份，以姜黄素、栀子苷、盐酸小檗碱为对照品，按照本发明中协日嘎四味有效部位中总酚、总萜、总生物碱的含量测定方法，测定总酚、总萜、总生物碱的量。
正交试验结果分析：
因素A、B、C、D均有显著性差异，即（50％-70%乙醇）洗脱流速、径高比、上样浓度、生药和树脂的体积比均有显著性差异。用SAS软件比较因素A、B、C、D中各水平之间的差异，进行水平相关性分析，因素A中水平1、2明显优于3；因素B中2、3水平明显优于1水平，而2、3水平没有明显差异；因素C中2水平明显优于1、3水平；因素D中1、2水平明显优于3水平，而1、2水平没有明显差异。
综上所述：蒙药协日嘎-4有效部位的最佳纯化工艺为：A1 B2 C2 D2。
即最佳工艺为：洗脱流速3BV/h，径高比1：10，上样浓度2g/5ml，生药和树脂的体积比1：7.5。
实验例2：协日嘎四味提取物中总酚的含量测定
1.仪器与测定条件：
TU-1901型紫外可见分光光度计(北京),
SARTORIUS-BS224S型电子分析天平（北京塞多利斯仪器系统公司），
KQ-250DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。
测定波长：720nm
2.对照品与试剂：
姜黄素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110823-201004),
试剂:水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯
3.对照品溶液的制备：
精密称取姜黄素对照品适量,加无水甲醇制备成0.0592mg/mL的对照品溶液。
4.样品溶液的制备
精密称取实施例3制备的协日嘎四味有效部位样品各3份，每份30mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶，加70%乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液。
5.协日嘎四味有效部位中总酚的含量测定
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0．3%十二烷基硫酸钠2．0ml及0．6%三氯化铁－0．9%铁氰化钾(1∶0．9)混合溶液1．0ml，混匀，在暗处放置5min，加0．1mol/L盐酸溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，在720nm波长处测定吸收度；外标两点法计算含量,即得。
表5有效部位总酚含量
实验例3：协日嘎四味提取物中总萜的含量测定
1.仪器与测定条件：
TU-1901型紫外可见分光光度计(北京),
SARTORIUS-BS224S型电子分析天平（北京塞多利斯仪器系统公司），
KQ-250DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。
测定波长：720nm
2.对照品与试剂：
栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110749-200714),
试剂:水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯
3.对照品溶液的制备：
精密称取栀子苷对照品适量,加无水甲醇制备成0.0948mg/mL的对照品溶液。
4.样品溶液的制备
精密称取实施3制备的协日嘎四味有效部位样品各3份，每份25mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶，加70%乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液。
5.协日嘎四味有效部位中总萜的含量测定
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10mL具塞刻度试管中。向试管中缓慢滴加浓度约为1mg/mL的香草醛-浓硫酸溶液,并不时振摇试管。最后定容至5mL,摇匀,室温静置10min,于438nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得。
表6有效部位总萜含量
实验例4：协日嘎四味提取物中总生物碱的含量测定
1.仪器与测定条件：
TU-1901型紫外可见分光光度计(北京),
SARTORIUS-BS224S型电子分析天平（北京塞多利斯仪器系统公司），
KQ-250DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。
测定波长：720nm
2.对照品与试剂：
盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200911),
试剂:水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯
3.对照品溶液的制备：
精密称取盐酸小檗碱对照品适量,加无水甲醇制备成0.0592mg/mL的对照品溶液。
4.样品溶液的制备
精密称取实施例3制备的协日嘎四味有效部位样品各3份，每份30mg，置25mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
5.协日嘎四味有效部位中总生物碱的含量测定
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10ml具塞刻度试管中，挥干溶剂，分别加6ml溴麝香草酚蓝试液溶解样品，再加入6ml氯仿，用力振摇2min，倾入分液漏斗中，静置30min，取氯仿层，同法萃取三次，取氯仿层置25ml容量瓶中，并用氯仿补足至刻度。以相应试剂为空白，于415nm测定吸光度；外标两点法计算含量,即得。
表7有效部位总生物碱含量
实验例5：协日嘎四味有效部位中栀子苷、姜黄素、盐酸小檗碱的含量测定
1.仪器与测定条件：
日本日立公司LC-2000全自动进样高效液相色谱仪、L-2455紫外检测器，AgilentChemstation；AB135-S型超声清洗仪，AB135-S电子天平(Mettler Toledo公司)电子天平。
色谱条件：色谱柱:Elite C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)–0.4%磷酸二氢钾水溶液(B),梯度洗脱（0～15min，8%A→18%A；15～18min，18%A→45%A；18～22min，45%A→27%A；22～35min，,27%A→12%A；35～40min，12%A→45%A；40～55min，48%A→52%A）,流速1.0mL·min-1;检测波长分别为238nm、346nm、346nm;柱温30℃;进样量20μL。在上述色谱条件下,栀子苷、姜黄素、盐酸小檗碱与相邻色谱峰的分离度均大于1.5,对称因子在0.95～1.05之间。
2.对照品与试剂：
栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110749-200714)；盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200911)；姜黄素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110823-201004),；蒙药复方协日嘎四味中各味药材均由安国市康达中药材有限公司、内蒙古天立药材有限公司提供，乙腈为Fisher色谱纯试剂，水为娃哈哈纯净水，其它试剂均为分析纯。
3.对照品溶液的制备：
精密称取经减压干燥至恒重的栀子苷对照品0.89mg与姜黄素对照品0.98mg置5ml量瓶中，精密称取盐酸小檗碱0.81mg于10ml容量瓶中，吸取2ml至混有上述两个对照品的5ml容量瓶中，分别配制成浓度为0.178,0.0392,0.0324mg·mL-1的混合对照品储备液，用50乙醇定容至刻度,摇匀,即得混合对照品储备液。
4.样品溶液的制备
精密称取实施例3制备的3批协日嘎四味有效部位样品各3份，每份约25mg，于25ml容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
5.协日嘎四味有效部位中栀子苷、姜黄素、盐酸小檗碱的含量测定
精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。
表8有效部位栀子苷、姜黄素、小檗碱含量
实验例6：小鼠抗炎、镇痛实验
1．实验目的和要求
本实验通过给予小鼠蒙药复方协日嘎四味，考察其抗炎镇痛的药理作用。要求实验应在干净、整洁、无菌的环境下进行，看其是否具有显著性差异。
2．仪器和配料
体重18g-22g小鼠，原方提取物干粉（原方提取物干粉按照中华人民卫生部药品标准《蒙药分册》公开的方法制备而成，将：姜黄、黄柏、栀子、蒺藜四味药材按照该文所述比例，粉碎成中粉，过筛、混匀，即得下同）、有效部位干粉（按实施例3方法制备）、阳性前列康片（浙江康恩贝制药股份有限公司）、阳性三金片（桂林三金药业股份有限公司）；0.5%羧甲基纤维素钠溶液、0.7%醋酸溶液、二甲苯、灌胃器、剪刀、直径8mm的打孔器、电子天平，GB204型精密电子称、恒温干燥箱（均由上海仪器厂制）。
3．原理、步骤和方法
3.1小鼠肉芽肿实验
实验原理：由于小鼠背部植入棉球，可导致局部增生产生肉芽肿，经过给予蒙药复方协日嘎四味，其给药组与对照组的肉芽肿增值重量有明显不同，从而可证明本复方有抗炎作用。
步骤和方法：取取体重18-22g70只小鼠,雌雄各半,按体重随机分为7组：（1）空白组；(2)原方提取物组；（3-5）有效部位（低剂量、中剂量、高剂量）；（6）阳性前列康组（7）阳性三金片组，每组10只小鼠。
用乙醚将小鼠麻醉后,分别于小鼠背部与前肢平行处皮下植入高压灭菌棉球两个（注：两棉球植入时应分置与脊椎两侧，且每个棉球均为精密称定10mg）。手术后第2天开始灌胃给药，空白对照组给予蒸馏水，各组灌胃等体积蒸馏水的药物溶液，按1次/d给药,，连续给药7d。于末次给药1h后脱臼颈椎处死小鼠,手术取出棉球肉芽肿,剥尽脂肪组织,然后将其置于60℃烘干箱中,干燥至恒重,取出称重,其重量减去棉球重量即为肉芽肿干重。
3.2小鼠耳肿胀实验
实验原理：因为二甲苯可以导致小鼠有炎症，故将二甲苯涂于小鼠耳朵上可引起炎症，从而耳朵肿胀，因而耳朵的重量增加。用此药后，如有抗炎作用的效果，重量就会有所减少，因此就可根据重量差法而计算出减少的重量来衡量其是否有抗炎作用。左右耳片重量差值为肿胀度。肿胀度抑制率=(空白组肿胀度-给药组肿胀度)/空白组肿胀度。将对照组与给药组的肿胀度进行统计学处理(SPSS13.0统计软件做t检验)。
步骤和方法：取体重18g-22g小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，即(l)空白组;(2)原方提取物组；（3-5）有效部位（低剂量、中剂量、高剂量）；（6）阳性前列康组（7）阳性三金片组，每组10只。分别灌胃给药，空白对照组给予等体积蒸馏水，每天一次，共给7天。末次给药30分钟后，取0.lml二甲苯涂于各鼠右耳前后两面致炎。1小时后，将小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径8mm的打孔器分别在两耳同一部位打下圆耳片，迅速用电子天平称重，每鼠右耳片减去左耳片重量即为耳片炎症肿胀度。各组与空白组比较，进行t检验。
3.3小鼠醋酸扭体实验
实验原理：0.7%醋酸溶液可引起小鼠疼痛出现扭体反应，用此药后，如有镇痛作用的效果，扭体次数就会有所减少，因此就可根据与空白对照观察扭体次数来衡量其是否有镇痛作用。计算镇痛百分率:
镇痛百分率(%)=[(空白组扭体次数一给药组扭体次数)/空白组扭体次数]*100%
步骤与方法：取体重18g-20g小鼠70只，雌雄各半，按体重随机分为7组，(l)空白组;(2)原方提取物组；（3-5）有效部位（低剂量、中剂量、高剂量）；（6）阳性前列康组（7）阳性三金片组。各给药组灌胃相应药的蒸馏水溶液，空白对照组灌胃给予等体积的蒸馏水，给药体积均为0.2ml/l0g体重。给药7天。末次给药30分钟后，给每只鼠腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2ml/只，观察并记录45分钟内各小鼠的扭体次数。各组与空自组比较，进行t检验。
4．实验数据与结果
（1）实验数据：
表9小鼠肉芽肿实验结果n=10
注：*P＜0.05，**P＜0.01
表10小鼠二甲苯实验结果n=10
注：*P＜0.05，**P＜0.01
表11小鼠醋酸扭体实验结果n=10
注：*P＜0.05，**P＜0.01
（2）实验结果：
本实验选择抗炎、镇痛2个药理指标，比较了蒙药复方协日嘎四味有效部位（低、中、高剂量）及原方提取物的抗炎、镇痛药效作用。实验结果表明，在抗炎实验中，肉芽肿实验结果中，蒙药复方协日嘎四味有效部位中剂量组具有非常显著性差异；小鼠耳肿胀实验结果中蒙药复方协日嘎四味有效部位中剂量组具有非常显著性差异；在镇痛实验中，蒙药复方协日嘎四味有效部位中剂量组具有非常显著性差异。
因此，通过以上实验设计模型，均证明蒙药复方协日嘎四味有效部位具有明显的抗炎镇痛作用。将抗炎镇痛作用综合考虑，本发明所得的蒙药复方协日嘎四味有效部位药效作用明显优于原方提取物。
实验例7：抑菌试验
所用菌种：金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌（以上菌株均为标准菌株）。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌用普通培养基培养,甲型链球菌用血清培养基培养,白色念珠菌用沙氏培养基培养。
所用药物：原方提取物干粉（同实验例6）、有效部位干粉（按实施例3方法制备）
体外抑菌试验
药物最低抑菌浓度(MIC)测定：将药物0.2g/mL，用相应的培养基在试管中作连续对倍稀释，1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，每管中加含菌量为1×106个/mL菌液0.1mL，置37℃培养箱中培养24h，观察最低抑菌浓度(MIC)。
药物最低杀菌浓度(MBC)测定：采用肉汤对倍稀释平板活菌计数法测定最小杀菌浓度(MBC)，即先测出MIC，再依次将未见细菌生长各管培养物分别吸取0.1mL倾倒在平皿上，37℃，再培养18h，平皿上菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度(MBC)，并观察最低杀菌浓度。
表12试验结果
实验结论：协日嘎四味有效部位与原方提取物均对金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌有抑菌作用，协日嘎四味有效部位较原方提取物的抑菌作用较强。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1：协日嘎四味有效部位的制备-大孔吸附树脂法
取协日嘎四味复方药材饮片1kg，50％乙醇10L回流提取2次，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1：
2.5（上样浓度2g/5ml）。通过7.5LAB-8大孔吸附树脂，吸附流速2Bv/h，树脂柱径高比为1:10，以1.5倍树脂体积的水洗脱进行除杂，除杂流速为2Bv/h，以8倍树脂体积的70％乙醇洗脱，洗脱流速为2Bv/h，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以8倍树脂体积的90%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集90%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将90%乙醇洗脱物用磷酸氢钙吸收后再与70%乙醇洗脱物混合即为协日嘎四味有效部位。
实施例2：协日嘎四味有效部位的制备-大孔吸附树脂法
取协日嘎四味复方药材饮片1kg，加70%乙醇15L超声提取3次，每次提取1.5小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1：2.5（上样浓度2g/5ml）。通过10L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2Bv/h，树脂柱径高比为1：6，以2倍树脂体积的水洗脱进行除杂，除杂流速为4Bv/h，以12倍树脂体积的70％乙醇洗脱，洗脱流速为1Bv/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以10倍树脂体积的90%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集90%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥；将90%乙醇洗脱物用β-环糊精包合，β-环糊精与90%乙醇洗脱物量为5：1，包合温度为70℃，包合时间为2小时，包合后再与70%乙醇洗脱物混合，即为协日嘎四味有效部位
实施例3：协日嘎四味有效部位的制备-大孔吸附树脂法
取协日嘎四味复方药材饮片1kg，70％乙醇10L回流提取2次，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1：4。通过10L D101大孔吸附树脂，吸附流速2Bv/h，树脂柱径高比为1:12，以1.5倍树脂体积的水洗脱进行除杂，除杂流速为4Bv/h，以8倍树脂的70％乙醇洗脱体积，洗脱流速为3Bv/h，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以8倍树脂体积的90%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集90%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥；将70%乙醇洗脱物与90%乙醇洗脱物混合即为协日嘎四味有效部位。
实施例4：协日嘎四味有效部位的制备-溶剂萃取法
取协日嘎四味复方药材饮片1Kg，75%乙醇回流提取2次，溶剂用量为10L，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将提取物混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1：8（w/v）；然后用低极性的溶剂石油醚，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，萃取3次，得到脂溶性成分；再用中等极性的溶剂氯仿，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，经4次萃取其中的成分；与之前萃取得到的脂溶性成分混合得到协日嘎四味有效部位。
实施例5：协日嘎四味有效部位的制备-超临界C02流体萃取法
取协日嘎四味复方药材饮片1Kg，加70％甲醇，超临界流体萃取2次，每次提取2小时，溶剂用量为8L，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的乙酸乙酯，萃取其中的成分，得协日嘎四味有效部位。
实施例6：协日嘎四味有效部位的制备-液-液逆流萃取法
取协日嘎四味复方药材饮片1Kg，70%乙醇回流提取3次，溶剂用量为10L，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将提取物混悬于水中，然后用乙酸乙酯萃取得到脂溶性成分，然后用氯仿萃取获得其中的萜类、酚类、生物碱类成分，将脂溶性成分与萜类、酚类、生物碱类成分混合得协日嘎四味提取物。
实施例7：协日嘎四味有效部位中总酚、总萜、总生物碱的含量测定
协日嘎四味有效部位中总酚的含量测定
精密吸取姜黄素对照品溶液(浓度为23.68μg/ml)0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5ml，置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0．3%十二烷基硫酸钠2．0ml及0．6%三氯化铁－0．9%铁氰化钾(1∶0．9)混合溶液1．0ml，混匀，在暗处放置5min，加0．1mol/L盐酸溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，在720nm波长处测定吸收度。以姜黄素对照品取样量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
精密称取实施例2中协日嘎四味有效部位样品各3份，每份30mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶，加70%乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液。
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0．3%十二烷基硫酸钠2．0ml及0．6%三氯化铁－0．9%铁氰化钾(1∶0．9)混合溶液1．0ml，混匀，在暗处放置5min，加0．1mol/L盐酸溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，在720nm波长处测定吸收度；外标两点法计算含量,即得本发明协日嘎四味有效部位中总酚以姜黄素计为18.91%。
协日嘎四味提取物中总萜的含量测定
精密吸取栀子苷对照品溶液（0.0948mg/mL）0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL,置10mL具塞刻度试管中。向试管中缓慢滴加浓度约为1mg/mL的香草醛-浓硫酸溶液,并不时振摇试管。最后定容至5mL,摇匀,室温静置10min,于438nm处测定吸光度。以栀子苷对照品取样量（mg）为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
精密称取实施例2协日嘎四味有效部位样品各3份，每份25mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶，加70%乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液。
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10mL具塞刻度试管中。向试管中缓慢滴加浓度约为1mg/mL的香草醛-浓硫酸溶液,并不时振摇试管。最后定容至5mL,摇匀,室温静置10min,于438nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明协日嘎四味有效部位中总萜以栀子苷计为27.04%。
协日嘎四味提取物中总生物碱的含量测定
精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液（0.0592mg/mL）0.5ml，1.5ml，2.5ml，3.5ml，4ml，5.5ml置10ml具塞刻度试管中，挥干溶剂，分别加6ml溴麝香草酚蓝试液溶解样品，再加入6ml氯仿，用力振摇2min，倾入分液漏斗中，静置30min，取氯仿层，同法萃取三次，取氯仿层置25ml容量瓶中，并用氯仿补足至刻度。以相应试剂为空白，于415nm测定吸光度，以盐酸小檗碱对照品取样量（mg）为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
精密称取实施例2协日嘎四味有效部位样品各3份，每份30mg，置25mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理5分钟，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10ml具塞刻度试管中，挥干溶剂，分别加6ml溴麝香草酚蓝试液溶解样品，再加入6ml氯仿，用力振摇2min，倾入分液漏斗中，静置30min，取氯仿层，同法萃取三次，取氯仿层置25ml容量瓶中，并用氯仿补足至刻度。以相应试剂为空白，于415nm测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明协日嘎四味有效部位中总生物碱以盐酸小檗碱计为14.29%。
实施例8：协日嘎四味有效部位中栀子苷、姜黄素、盐酸小檗碱的含量测定
色谱条件：色谱柱:Elite C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)–0.4%磷酸二氢钾水溶液(B),梯度洗脱（0～15min，8%A→18%A；15～18min，18%A→45%A；18～22min，45%A→27%A；22～35min，,27%A→12%A；35～40min，12%A→45%A；40～55min，48%A→52%A）,流速1.0mL·min-1;检测波长分别为238nm、346nm、346nm;柱温30℃;进样量20μL。
标准曲线绘制：精密称取经减压干燥至恒重的栀子苷对照品0.89mg与姜黄素对照品0.98mg至5ml量瓶中，精密称取盐酸小檗碱0.81mg于10ml容量瓶中，吸取2ml至混有上述两个对照品的5ml容量瓶中，分别配制成浓度为0.178,0.0392,0.0324mg·mL-1的混合对照品储备液，用50乙醇定容至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。分别取混合对照品溶液分别进样2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0,25.0μl在上述色谱条件下进行HPLC分析,以峰面积Y为纵坐标,溶液的质量X(μg)为横坐标绘制标准曲线,得到栀子苷、姜黄素、小檗碱的回归方程。
含量测定：精密称取3批实施例3所得协日嘎四味有效部位样品各3份，每份约25mg，于25ml容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得本发明协日嘎四味有效部位中含姜黄素、栀子苷、盐酸小檗碱分别为1.86%、12.50%，1.39%。
实施例9：片剂的制备
取实施例1制备的协日嘎四味有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。
实施例10：胶囊剂的制备
取实施例4制备的协日嘎四味有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成胶囊剂。
实施例11：口服液体制剂的制备
取实施例5制备的协日嘎四味有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成口服液体制剂。
实施例12：颗粒剂的制备
取实施例5制备的协日嘎四味有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
Claims (5)
1.一种协日嘎四味有效部位，其特征在于所述协日嘎四味有效部位由大孔吸附树脂法制成，包括如下步骤：取协日嘎四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，50％-95％乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将提取物混悬于水中，使得药材量与分散后溶液体积比为1:10-1:2.5，以w/v计；通过相当生药量的6-10体积倍的大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:4～1:13，以1-5倍树脂体积的水洗脱进行除杂，除杂流速为2～6BV/h；以5-12倍树脂体积的50％-70％乙醇洗脱，洗脱流速为1～3BV/h，收集50％-70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以5-12倍树脂体积的71％-90％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集71％-90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将50％-70％乙醇洗脱物与71％-90％乙醇洗脱物混合即为协日嘎四味有效部位，其中有效部位中总萜类、总酚类、总生物碱类成分百分含量的总和为50～99％，百分含量以w/w计；
其中所述协日嘎四味复方药材饮片的原料药组成为：
姜黄150重量份、黄柏90重量份、栀子120重量份、蒺藜150重量份，所述蒺藜为蒺藜科植物蒺藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果实经微炒制得；
所述大孔吸附树脂是弱极性或非极性的树脂。
2.如权利要求1所述的协日嘎四味有效部位的制备方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤：
取协日嘎四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，50％-95％乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将提取物混悬于水中，使得药材量与分散后溶液体积比为1:10-1:2.5，以w/v计；通过相当生药量的6-10体积倍的大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:4～1:13，以1-5倍树脂体积的水洗脱进行除杂，除杂流速为2～6BV/h；以5-12倍树脂体积的50％-70％乙醇洗脱，洗脱流速为1～3BV/h，收集50％-70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以5-12倍树脂体积的71％-90％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集71％-90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将50％-70％乙醇洗脱物与71％-90％乙醇洗脱物混合即为协日嘎四味有效部位；
其中所述协日嘎四味复方药材饮片的原料药组成为：
姜黄150重量份、黄柏90重量份、栀子120重量份、蒺藜150重量份，所述蒺藜为蒺藜科植物蒺藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果实经微炒制得；
所述大孔吸附树脂是弱极性或非极性的树脂。
3.如权利要求2所述的协日嘎四味有效部位的制备方法，其特征在于所述50％-70％乙醇洗脱物与71％-90％乙醇洗脱物为直接混合。
4.如权利要求1所述的协日嘎四味有效部位的检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定方法中的任意一种或几种：
协日嘎四味有效部位中总酚的含量测定：精密吸取浓度为23.68μg/ml的姜黄素对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5ml，置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3％十二烷基硫酸钠2.0ml及1∶0.9的0.6％三氯化铁－0.9％铁氰化钾混合溶液1.0ml，混匀，在暗处放置5min，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，在720nm波长处测定吸收度；以姜黄素对照品取样量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；精密称取协日嘎四味有效部位样品各3份，每份30mg，置50mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3％十二烷基硫酸钠2.0ml及1∶0.9的0.6％三氯化铁－0.9％铁氰化钾混合溶液1.0ml，混匀，在暗处放置5min，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，在暗处放置20min，以显色剂为空白，在720nm波长处测定吸收度；外标两点法计算含量，即得协日嘎四味有效部位中总酚以姜黄素计为15％～26％；
协日嘎四味有效部位中总萜的含量测定：精密吸取0.0948mg/mL的栀子苷对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL,置10mL具塞刻度试管中；向试管中缓慢滴加浓度为1mg/mL的香草醛-浓硫酸溶液，并不时振摇试管；最后定容至5mL，摇匀，室温静置10min，于438nm处测定吸光度；以栀子苷对照品取样量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；精密称取协日嘎四味有效部位样品各3份，每份25mg，置50mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5.0mL于10mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10mL具塞刻度试管中；向试管中缓慢滴加浓度为1mg/mL的香草醛-浓硫酸溶液,并不时振摇试管；最后定容至5mL,摇匀,室温静置10min,于438nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得协日嘎四味有效部位中总萜以栀子苷计为25％～36％；
协日嘎四味有效部位中总生物碱的含量测定：精密吸取0.0592mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液0.5ml，1.5ml，2.5ml，3.5ml，4ml，5.5ml置10ml具塞刻度试管中，挥干溶剂，分别加6ml溴麝香草酚蓝试液溶解样品，再加入6ml氯仿，用力振摇2min，倾入分液漏斗中，静置30min，取氯仿层，同法萃取三次，取氯仿层置25ml容量瓶中，并用氯仿补足至刻度；以相应试剂为空白，于415nm测定吸光度，以盐酸小檗碱对照品取样量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线；精密称取协日嘎四味有效部位样品各3份，每份30mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10ml具塞刻度试管中，挥干溶剂，分别加6ml溴麝香草酚蓝试液溶解样品，再加入6ml氯仿，用力振摇2min，倾入分液漏斗中，静置30min，取氯仿层，同法萃取三次，取氯仿层置25ml容量瓶中，并用氯仿补足至刻度；以相应试剂为空白，于415nm测定吸光度；外标两点法计算含量,即得协日嘎四味有效部位中总生物碱以盐酸小檗碱计为12％～28％；
协日嘎四味有效部位中栀子苷、姜黄素、盐酸小檗碱的含量测定：色谱条件：色谱柱:Elite C18色谱柱,4.6mm×250mm,5μm；流动相:乙腈–0.4％磷酸二氢钾水溶液，乙腈以A表示，0.4％磷酸二氢钾水溶液以B表示，梯度洗脱条件：0～15min，8％A→18％A；15～18min，18％A→45％A；18～22min，45％A→27％A；22～35min，,27％A→12％A；35～40min，12％A→45％A；40～55min，48％A→52％A；流速1.0mL·min-1；检测波长分别为238nm、346nm、346nm；柱温30℃；进样量20μL；标准曲线绘制：精密称取经减压干燥至恒重的栀子苷对照品0.89mg与姜黄素对照品0.98mg至5ml量瓶中，精密称取盐酸小檗碱0.81mg于10ml容量瓶中，吸取2ml至混有上述两个对照品的5ml容量瓶中，分别配制成浓度为0.178,0.0392,0.0324mg·mL-1的混合对照品储备液，用50乙醇定容至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液；分别取混合对照品溶液分别进样2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0,25.0μl在上述色谱条件下进行HPLC分析,以峰面积Y为纵坐标,溶液的质量X为横坐标绘制标准曲线，得到栀子苷、姜黄素、小檗碱的回归方程；含量测定：精密称取3批协日嘎四味有效部位样品各3份，每份25mg，于25ml容量瓶中，70％乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液；精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得协日嘎四味有效部位中含姜黄素、栀子苷、盐酸小檗碱分别为1.30-2.50％、9.25-19.50％，0.80-2.10％。
5.如权利要求1所述的协日嘎四味有效部位在制备具有抗炎、镇痛、抑菌作用的药物或功能性食品中的应用。
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