CN103105408B - 一种鉴别山茱萸药材或衍生品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别山茱萸药材或衍生品的方法，包括：1）对山茱萸药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的山茱萸环烯醚萜苷特征提取物；2）对山茱萸环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；3）通过定量分析手段测定得到标准参照品的绝对含量；4）利用特征峰峰强度的比值和绝对含量，计算出山茱萸药材或衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。本发明可以反映山茱萸中含有哪些山茱萸环烯醚萜苷类化合物以及它们之间的比例，达到对山茱萸药材品种和质量质量鉴定的目的。
Description
技术领域
本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别山茱萸药材或衍生品的方法。
背景技术
山茱萸（SalviamiltiorrhizaBge.）是山茱萸科植物山茱萸（CornusofficinalisSieb.etZucc.）的干燥成熟果肉，为我国著名的中药材。山茱萸归肝、肾经，药性微温，味酸、涩，具有补益肝肾、收涩固脱的功效[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部.中国医药科技出版社，26]。其活性成分主要为环烯醚萜苷类化合物，具有降血糖、抗失血性休克、抑制血小板聚集、调节免疫、抗菌抗炎等作用[刘洪，等.南京中医药大学学报2003，19(4):254.]。
定性鉴别上述某类活性成分或定量测定其某种活性成分含量，已成为评价山茱萸及其制剂质量的重要方法。例如中国药典2010版是用HPLC法对山茱萸药材中环烯醚萜苷类成分马钱苷进行定性和定量分析。但这种针对单一成分进行定性、定量分析的质量检测模式不能有效控制中药材的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制山茱萸及其制剂质量的迫切要求。
指纹图谱技术是目前国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方法。人们凭借实用的指纹图谱不仅可确认该产品的真伪，同时能评价其质量。目前，山茱萸药材及其制剂的环烯醚萜苷类化合物的指纹图谱研究工作，集中在HPLC指纹图谱[①王花红,等.西北植物学报2004,24(10):1922.②李小娜,等.中华中医药杂志2006,21(10):617.]。而HPLC指纹图谱由于受非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）影响较大和需用多个标准品等等原因，重复性和可行性均存在许多局限性。
IGD核磁共振碳谱偶联（IGD13CNMRcoupling）指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，该技术是在已研究多年的核磁共振氢谱（1HNMR）指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药，中草药2000，31(11)：868-870]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术[谢培山等，中药色谱指纹图谱，人民卫生出版社，2005]）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。
山茱萸的品质不在于某个单一成分，其疗效是多个成分协同配比的结果。因此，建立不仅能控制山茱萸活性成分，而且能控制这些活性成分之比例的IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱势在必行。山茱萸药材或衍生品核磁共振碳谱偶联指纹图谱的研究与应用，不仅可以解决我国山茱萸药材或衍生品鉴别和评价的难题，也为加强山茱萸药材或衍生品内在成分研究的系统化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材或衍生品中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种鉴别山茱萸药材或衍生品的方法，该方法利用了IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。
为了实现上述目的，本发明提供的鉴别山茱萸药材或衍生品的方法，包括以下步骤：
1）对山茱萸药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的山茱萸环烯醚萜苷特征提取物；
2）对所述山茱萸环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述绝对含量，计算出山茱萸药材或衍生品中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，步骤1）中，山茱萸环烯醚萜苷特征提取物的制备方法，包括：称取山茱萸药材或饮片粉碎，加入体积为6~10倍量、20~25%的乙醇回流提取或超声提取2~3次，每次提取1~2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为1~2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以10~20%乙醇、30~50%乙醇和90~95%乙醇冲柱，收集30~50%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得山茱萸环烯醚萜苷特征提取物。这里表示乙醇浓度的百分数均为质量浓度。
进一步地，回流提取的温度为90~95℃，超声提取的温度为60~65℃。
进一步地，山茱萸药材或饮片粉碎后过24~50目筛。
进一步地，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201、SP-825或SP-70，优选HP-20、D-101或SP-825。
进一步地，所述大孔吸附树脂的径高比为8~15：1，优选10~12：1。
进一步地，用于冲柱的乙醇的体积为浓缩后滤液的20-40倍，优选三次冲柱的体积分布为20-25，30-40和20-25倍。其中，步骤2）中，对山茱萸环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解山茱萸环烯醚萜苷特征提取物的溶剂为氘代氯仿（CDCl3）、氘代甲醇（CD3COCD3）或氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），优选氘代甲醇；山茱萸环烯醚萜苷特征提取物和相应溶剂的质量体积比为55:1~65:1（mg：mL），优选60:1。
山茱萸饮片可用上述方法进行鉴别；其他山茱萸衍生品，如山茱萸环烯醚萜苷提取物可直接作为山茱萸环烯醚萜苷特征提取物，用上述方法进行鉴别。
其中，步骤2）中，山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰为C-11吸收峰，其化学位移为δC164.0~220.0。
其中，步骤2）中，所述峰强度可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
其中，步骤3）中，所述定量分析手段为：高效液相（HPLC）法。
进一步地，所述高效液相法的条件包括：流动相为乙腈：水=10~20:80~9，优选15：85；检测波长为240nm。
其中，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
进一步地，山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分的标准参照品为马钱苷。
其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度；该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Wn相加之和，即活性成分组的含量。
本发明方法所述活性成分组，既可以是山茱萸单味药材中的活性成分组，也可是山茱萸衍生品中的活性成分组。所述山茱萸环烯醚萜苷特征提取物指该提取物中含有山茱萸环烯醚萜苷类活性成分，活性成分组即指相应同类活性成分的总和。
其中，所述山茱萸衍生品包括：山茱萸饮片、山茱萸提取物（如山茱萸环烯醚萜苷提取物）或山茱萸天然药物。
本发明所述的山茱萸药材，包括山茱萸植物的各个部位，如根、皮、茎、叶、花和果实等。
本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD13CNMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：
①稳定性（重复性）：IGD13CNMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。
②整体性（全面性）：IGD13CNMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
③可靠性（单一性）：IGD13CNMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD13CNMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。
IGD核磁共振碳谱指纹图谱只能表明特征提取物中有哪些活性成分，以及这些活性成分之间的定量比例，而这些活性成分的绝对含量必须通过标准参照品和其他分析定量手段，再通过偶联公式而得到。
本发明采用IGD核磁共振碳谱指纹图谱对山茱萸药材或衍生品进行鉴别，可以反映山茱萸药材或衍生品中含有哪些山茱萸环烯醚萜苷类化合物以及它们之间的比例，达到对山茱萸药材或衍生品品种和质量质量鉴定的目的。线性范围宽，灵敏度高，重复性和可行性好。不仅能够有效控制山茱萸药材或衍生品的内在质量，也可以满足当前对于客观有效地评价和控制山茱萸质量的迫切要求。总体来看，不仅可以解决我国山茱萸药材或衍生品鉴别和评价的难题，也为加强山茱萸药材或衍生品内在成分研究的系统化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。
附图说明
图1-a为实施例1河南西峡山茱萸药材环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-b为实施例1河南西峡山茱萸药材环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-a为实施例2陕西丹凤山茱萸药材环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-b为实施例2陕西丹凤山茱萸药材环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-a为实施例3中原正信山茱萸药材环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-b为实施例3中原正信山茱萸药材环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-a为实施例4市售山茱萸环烯醚萜苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图4-b为实施例4市售山茱萸环烯醚萜苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
一、山茱萸药材或衍生品IGD核磁共振碳谱指纹图谱研究
（1）由山茱萸药材或衍生品提取得到的山茱萸环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）山茱萸环烯醚萜苷特征提取物的获得
①从山茱萸药材或饮片中获得
称取山茱萸药材或饮片粉碎（过24~50目），加入体积为6~10倍量、20%~25%的乙醇于90~95℃下回流提取或60~65℃下超声提取2~3次，每次提取1~2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为1~2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以10~20%乙醇、30~50%乙醇和90~95%乙醇冲柱，收集30~50%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得山茱萸环烯醚萜苷特征提取物（CET）。大孔吸附树脂HP-20、SP-825为三菱DIAION系列，D-101购自南开大学化工厂。大孔吸附树脂的径高比为10~12：1，用于用于冲柱的乙醇的体积为浓缩后滤液的20-40倍。②从其他山茱萸衍生品中获得
直接取其他山茱萸衍生品（除山茱萸饮片外的山茱萸衍生品，如山茱萸环烯醚萜苷提取物）作为山茱萸环烯醚萜苷特征提取物。
2）山茱萸环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取山茱萸环烯醚萜苷特征提取物30mg，溶于0.5mLCDCl3、DMSO-d6或CD3OD中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得山茱萸环烯醚萜苷IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
3）山茱萸环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
①鉴别
山茱萸环烯醚萜苷特征提取物（CET）IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示山茱萸环烯醚萜苷类化合物的特征信号，马钱苷、α-莫诺苷、β-莫诺苷等均有相应的NMR信号。
②山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中的各活性成分特征峰选取
由于山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中含有一系列环烯醚萜苷类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，选择δC164.0~220.0左右一组C-11羰基碳碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰，其原因为C-11羰基碳与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同化合物C-11羰基碳碳峰之间化学位移也有一定差别。
③标准参照品的选择
马钱苷是山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中主要活性成分之一，其C-11化学位移为δC167.2（DMSO-d6）或169.5（CD3OD），与其他主要脂溶性成分在此没有重叠；因此，选择马钱苷作为标准参照品。
4）采用HPLC法测定山茱萸药材或衍生品中马钱苷的含量
①马钱苷含量测定
i）色谱条件（参照2010版药典）
流动相为乙腈：水=15：85；
色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）；
检测波长：240nm。
ii）马钱苷标准参照品溶液的配制
精确称取马钱苷5mg，置50mL容量瓶中，用质量浓度为80%的甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得马钱苷标准参照品溶液。
iii）含有山茱萸环烯醚萜苷活性成分的供试品溶液的制备
准确称取供试品：山茱萸药材/饮片的粉末或其他山茱萸衍生品0.4~0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，用80％甲醇补足重量，滤过，取续滤液，作为山茱萸药材、饮片或其他山茱萸衍生品供试品溶液（如山茱萸环烯醚萜苷提取物供试品溶液）。
iv）测定法
分别精密吸取马钱苷标准参照品溶液与含有山茱萸环烯醚萜苷类活性成分的供试品溶液各20μ1，注入液相色谱仪，测定，即得马钱苷含量。
②马钱苷绝对含量计算（山茱萸药材或衍生品中马钱苷绝对含量计算）
i）由下式计算含有环烯醚萜苷类活性成分的供试品溶液中马钱苷质量浓度：
CX：含有环烯醚萜苷类活性成分的供试品溶液中马钱苷质量浓度（ug/mL）；
CR：马钱苷标准参照品溶液质量浓度（ug/mL）；
AX：含有环烯醚萜苷类活性成分的供试品溶液的峰面积；
AR：马钱苷标准参照品溶液的峰面积。
ii）由下式计算山茱萸药材或衍生品中马钱苷质量百分含量
W1（%）：山茱萸药材或衍生品中马钱苷质量百分含量；
CX：含有环烯醚萜苷类活性成分的供试品溶液中的马钱苷质量浓度(ug/mL)；
m：称取的山茱萸药材或衍生品的质量(mg)。
5）通过偶联公式计算山茱萸药材或衍生品中环烯醚萜苷类各个主要活性成分的含量及总量，即环烯醚萜苷类活性成分组的含量
W1：山茱萸药材或衍生品中标准参照品马钱苷的质量百分含量；
M1：标准参照品马钱苷的分子量；
h1：标准参照品马钱苷的特征峰峰强度（峰高）；
Wn：山茱萸药材或衍生品中某一环烯醚萜苷类活性成分的质量百分含量；
Mn：山茱萸药材或衍生品中某一环烯醚萜苷类活性成分分子量；
hn：山茱萸药材或衍生品中某一环烯醚萜苷类活性成分特征峰峰强度（峰高）。
二、仪器、试剂与材料
主要仪器和设备
核磁共振波谱仪BrukerDPX400型。
质谱仪：WatersMicromass公司Q-TofMicroTM型。
半制备高效液相色谱仪：Waters600型。
高效液相色谱仪：Agilent1200型。
2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。
DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
柱层析硅胶G和薄层层析硅胶H：青岛海洋化工厂。
硅胶层析柱6cm×70cm（直径×高度）。
山茱萸（河南西峡）、山茱萸（陕西丹凤）、山茱萸（中原正信药材公司），均经河南省农业大学朱长山教授鉴定；马钱苷，化学对照品，实验室自制（经光谱数据鉴定）。
试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。
三、基础研究
（1）环烯醚萜苷分离流程
称取山茱萸果实1kg，用95%乙醇进行提取，加相当于药材8倍量的提取溶剂在85℃下回流提取两次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩约至300ml，然后加相当于浓缩液1倍量的蒸馏水，搅拌均匀后静置过夜，离心，得深红色上清液和沉淀两部分。按上述方法共提取山茱萸果实5kg，将得到的上清液在上述得出的最佳工艺条件下，全部经过HP20大孔吸附树脂分离纯化，然后蒸干50%乙醇洗脱液共得固体粉末140g。将所得固体140g用甲醇溶解后硅胶，氯仿-甲醇（20:1、10:1、9:1、6:1、5:1、4:1、3:1）溶剂体系进行梯度洗脱，每500ml收集一份。9:1洗脱组分：第51份为白色无定形粉末（G-7）；第81～84份经液相制备纯化（甲醇:水=40:60）后得G-8（114.6mg）。6:1洗脱组分：第125～128份经液相制备纯化后（甲醇:水=35:65）得到G-9（38.2mg）。
（2）山茱萸果实药材或衍生品中主要活性成分的结构及核磁共振碳谱数据
马钱苷7-脱氢马钱苷
莫诺苷7-O-甲基莫诺苷
獐牙菜苷山茱萸新苷
马钱苷（Loganin）
13CNMR(100MHz,MeOD)δC:97.71(C-1),152.10(C-3),114.03(C-4),32.15(C-5),42.70(C-6),75.04(C-7),42.16(C-8),46.50(C-9),13.41(C-10),169.52(C-11),51.62(C-12),100.05(C-1′),74.72(C-2′),78.02(C-3′),71.59(C-4′),78.35(C-5′),62.76(C-6′)
13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:96.15(C-1),150.71(C-3),112.21(C-4),30.88(C-5),41.74(C-6),73.11(C-7),40.58(C-8),44.80(C-9),13.62(C-10),167.14(C-11),51.13(C-12),98.63(C-1′),72.18(C-2′),76.64(C-3′),70.05(C-4′),77.31(C-5′),61.12(C-6′)
7-脱氢马钱苷（7-dehydrogenation）
13CNMR(100MHz,D2O)δC:95.04(C-1),152.60(C-3),110.35(C-4),26.74(C-5),42.52(C-6),225.04(C-7),44.08(C-8),44.87(C-9),12.61(C-10),169.78(C-11),52.26(C-12),99.07(C-1′),73.00(C-2′),75.95(C-3′),69.94(C-4′),76.72(C-5′),61.07(C-6′)
山茱萸新苷（Cornuside）
13CNMR(100MHz,MeOD-d6)δC:97.58(C-1),153.71(C-3),111.28(C-4),31.55(C-5),30.13(C-6),64.29(C-7),135.53(C-8),45.19(C-9),119.66(C-10),169.23(C-11),51.80(C-12),121.50(C-1′),110.09(C-2′),146.31(C-3′),139.64(C-4′),146.31(C-5′),139.64(C-6′),168.44(C-7′),100.00(Glc-1),74.50(Glc-2),77.83(Glc-3),71.39(Glc-4),78.18(Glc-5),62.63(Glc-6)
獐牙菜苷（Sweroside）
13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:95.75(C-1),151.60(C-3),105.01(C-4),26.94(C-5),24.45(C-6),67.86(C-7),132.54(C-8),41.69(C-9),120.48(C-10),164.83(C-11),98.27(Glc-1),73.30(Glc-2),76.57(Glc-3),70.22(Glc-4),77.52(Glc-5),61.21(Glc-6)
13CNMR(100MHz,MeOD)δC:98.2(C-1),153.9(C-3),106.0(C-4),28.5(C-5),26.0(C-6),69.7(C-7),133.5(C-8),43.8(C-9),120.1(C-10),168.5(C-11),99.7(C-1′),74.7(C-2′),77.8(C-3′),71.5(C-4′),78.4(C-5′),62.7(C-6′)
α-莫诺苷（α-Morroniside）
13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:95.38(C-1),152.95(C-3),109.92(C-4),30.30(C-5),36.39(C-6),94.37(C-7),73.74(C-8),39.99(C-9),19.56(C-10),166.51(C-11),51.34(C-12),98.41(C-1′),71.60(C-2′),76.82(C-3′),70.35(C-4′),77.65(C-5′),61.24(C-6′)
β-莫诺苷（β-Morroniside）
13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δC:93.98(C-1),153.00(C-3),110.70(C-4),25.74(C-5),33.64(C-6),90.01(C-7),40.12(C-8),40.43(C-9),19.52(C-10),166.47(C-11),51.28(C-12),98.37(C-1′),73.74(C-2′),76.82(C-3′),70.35(C-4′),77.70(C-5′),78.46.(C-5′),61.39(C-6′)
7-O-甲基莫诺苷（7-O-Methylmorroniside）
13CNMR(100MHz,CD3OD)δC:95.1(C-1),152.0(C-3),110.7(C-4),29.9(C-5),33.8(C-6),102.4(C-7),71.6(C-8),38.9(C-9),18.4(C-10),166.1(C-11),50.9(C-12),96.7(C-1′),70.7(C-2′),72.0(C-3′),68.6(C-4′),72.5(C-5′),61.6(C-6′)
13CNMR(100MHz,CD3OD)δC:94.7(C-1),152.1(C-3),111.7(C-4),26.1(C-5),32.6(C-6),97.7(C-7),64.1(C-8),39.4(C-9),18.6(C-10),166.5(C-11),51.0(C-12),96.7(C-1′),71.0(C-2′),72.0(C-3′),68.6(C-4′),72.5(C-5′),61.7(C-6′)
实施例1：河南西峡山茱萸药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱
（1）特征提取物制备
选择河南西峡的山茱萸药材，按下述方法制备山茱萸药材环烯醚萜苷特征提取物：称取山茱萸药材100g粉碎（过24目），两次均加入体积为8倍量、20%的乙醇于90℃下回流提取2次，每次提取1小时，过滤，合并2次滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为1倍量的大孔吸附树脂（HP-20，径高比12:1）装柱，先后以20%乙醇、50%乙醇和95%乙醇冲柱（体积分别为浓缩后滤液的20，30和20倍），收集50%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得山茱萸环烯醚萜苷特征提取物。乙醇的浓度均为质量浓度。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取山茱萸环烯醚萜苷特征提取物30mg，溶于0.5mLDMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得山茱萸环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）山茱萸环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
河南西峡产山茱萸药材的山茱萸环烯醚萜苷特征提取物(CET)的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示山茱萸环烯醚萜苷类化合物的特征信号：δC95.0-97.0,150.0-153.5,105.0-112.5,26.0-31.0,24.0-42.5，67.0-95.0，131.0-133.0或39.0-42.0,39.0-45.0，12.0-21.0或118.0-121.0，164.0-226.0分别为环烯醚萜苷骨架上1,3,4,5,6,7,8,9,10,11位碳信号。山茱萸环烯醚萜苷类化合物：马钱苷、莫诺苷、獐牙菜苷等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-b。
2）河南西峡山茱萸药材的山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）河南西峡山茱萸药材中马钱苷质量百分含量测定结果如下：
| 药材中山茱萸马钱苷质量百分含量W马钱苷（%） | 1.062% |
（5）河南西峡山茱萸药材中山茱萸环烯醚萜苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
实施例2：陕西丹凤山茱萸药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱
（1）特征提取物制备
选择陕西丹凤的山茱萸药材，按下述方法制备山茱萸药材环烯醚萜苷特征提取物：将筛分后符合规定的山茱萸药材100g（过50目），依次加入体积为6︰6︰6倍量、质量比为25%的乙醇于95℃下回流提取3次，每次提取1.5h，过滤，合并三次滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用它重量为1.5倍量的SP-825树脂装柱（径高比为10:1），先后以15%乙醇、45%乙醇和90%乙醇冲柱（冲柱的乙醇的体积分别浓缩后滤液的25，40和20倍），收集45%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得山茱萸环烯醚萜苷特征提取物。乙醇的浓度均为质量比。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测与实施例1的相同。
（3）山茱萸环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
陕西丹凤山茱萸药材的山茱萸环烯醚萜苷特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示山茱萸环烯醚萜苷类化合物的特征信号：δC95.0-97.0,150.0-153.5,105.0-112.5,26.0-31.0,24.0-42.5，67.0-95.0，131.0-133.0或39.0-42.0,39.0-45.0，12.0-21.0或118.0-121.0，164.0-226.0分别为环烯醚萜苷骨架上1,3,4,5,6,7,8,9,10,11位碳信号。山茱萸环烯醚萜苷类化合物：马钱苷、莫诺苷、獐牙菜苷等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图2-b。
2）陕西丹凤山茱萸药材的山茱萸环烯醚萜苷特提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）陕西丹凤山茱萸药材中马钱苷质量百分含量测定结果如下：
| 药材中山茱萸马钱苷质量百分含量W马钱苷（%） | 0.853% |
（5）陕西丹凤山茱萸药材中山茱萸环烯醚萜苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
实施例3：中原正信山茱萸药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱
（1）特征提取物制备
选择中原正信的山茱萸药材，按下述方法制备山茱萸药材山茱萸环烯醚萜苷特征提取物：将筛分后符合规定的山茱萸药材50g（过50目），依次加入体积为10︰10倍量、质量比为20%乙醇60℃下超声提取2次，每次提取1h，过滤，合并2次滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用它重量为1倍量的HP-20树脂装柱（径高比为12:1），先后以20%乙醇、30%乙醇和95%乙醇冲柱（冲柱的乙醇的体积分别浓缩后滤液的25，40和20倍），收集30%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得山茱萸环烯醚萜苷特征提取物。乙醇的浓度均为质量比。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取山茱萸环烯醚萜苷特征提取物30mg，溶于0.5mLCD3OD中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得山茱萸环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）山茱萸环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
中原正信山茱萸药材的山茱萸环烯醚萜苷特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示山茱萸环烯醚萜苷类化合物的特征信号:δC95.0-99.0,151.0-155.5,105.0-115.0,26.0-33.0,24.0-44.0，64.0-95.0，131.0-136.0或39.0-43.0,39.0-45.0，13.0-22.0或118.0-121.0，166.0-226.0分别为环烯醚萜苷骨架上1,3,4,5,6,7,8,9,10,11位碳信号。山茱萸环烯醚萜苷类化合物：马钱苷、莫诺苷、獐牙菜苷等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图3-b。
2）中原正信山茱萸药材的山茱萸环烯醚萜苷特提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）中原正信山茱萸药材中马钱苷质量百分含量测定结果如下：
| 药材中山茱萸马钱苷质量百分含量W马钱苷（%） | 0.788% |
（5）中原正信山茱萸药材中山茱萸环烯醚萜苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
实施例4：市售山茱萸环烯醚萜苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
（1）特征提取物选择
直接选择市售山茱萸环烯醚萜苷提取物（陕西太极华青科技有限公司）作为特征提取物。
（2）山茱萸环烯醚萜苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取市售山茱萸环烯醚萜苷提取物30mg，溶于0.5mLDMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得市售山茱萸环烯醚萜苷提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）山茱萸环烯醚萜苷特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
市售山茱萸环烯醚萜苷提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示山茱萸环烯醚萜苷类化合物的特征信号:δC95.0-99.0,151.0-155.5,105.0-115.0,26.0-33.0,24.0-44.0，64.0-95.0，131.0-136.0或39.0-43.0,39.0-45.0，13.0-22.0或118.0-121.0，166.0-170.0分别为环烯醚萜苷骨架上1,3,4,5,6,7,8,9,10,11位碳信号。山茱萸环烯醚萜苷类化合物：马钱苷、莫诺苷、獐牙菜苷等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图4-b。
2）市售山茱萸环烯醚萜苷提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）市售山茱萸环烯醚萜苷提取物中马钱苷质量百分含量测定结果如下：
（5）市售山茱萸环烯醚萜苷提取物中山茱萸环烯醚萜苷类活性成分质量百分含量测定结果如下：
Claims (10)
1.一种鉴别山茱萸药材或衍生品的方法，包括以下步骤：
1)对山茱萸药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的山茱萸环烯醚萜苷特征提取物；
2)对所述山茱萸环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3)通过定量分析手段测定得到所述标准参照品的绝对含量；
4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出山茱萸药材或衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量；
步骤1)中，山茱萸环烯醚萜苷特征提取物的制备方法，包括：称取山茱萸药材或饮片粉碎，加入体积为6～10倍量、20～25％的乙醇回流提取或超声提取2～3次，每次提取1～2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为1～2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以10～20％乙醇、30～50％乙醇和90～95％乙醇冲柱，收集30～50％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得山茱萸环烯醚萜苷特征提取物；
步骤2)中对山茱萸环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解山茱萸环烯醚萜苷特征提取物的溶剂为氘代氯仿、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜；山茱萸环烯醚萜苷特征提取物和相应溶剂的质量体积比为55:1～65:1；
步骤2)中，山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰为C-11吸收峰，其化学位移为δC164.0～220.0；
步骤3)中定量分析手段为高效液相色谱法，流动相为乙腈：水＝10～20:80～90，检测波长为240nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201、SP-825或SP-70；所述大孔吸附树脂的径高比为8～15：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，山茱萸环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分的标准参照品为马钱苷。
5.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
其中：
W1为步骤3)用定量分析手段测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
其中：
W1为步骤3)用定量分析手段测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的山茱萸药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度。
7.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述山茱萸衍生品包括：山茱萸饮片、山茱萸提取物或山茱萸天然药物。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述山茱萸衍生品包括：山茱萸饮片、山茱萸提取物或山茱萸天然药物。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述山茱萸衍生品包括：山茱萸饮片、山茱萸提取物或山茱萸天然药物。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述山茱萸衍生品包括：山茱萸饮片、山茱萸提取物或山茱萸天然药物。
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