CN103088159A - 南方菜豆花叶病毒的rt-lamp检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料，检测方法通过样品总RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应1.5h内即可完成，通过4条引物识别靶基因6段不同的序列，提高了检测的特异性，25μL体系中总RNA含量为2pg也能灵敏检测，其灵敏度比普通RT-PCR检测高10倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，反应结束后在自然光照条件下裸眼观察颜色变化，判定结果，不需进行后处理，避免了开盖污染，操作简单，可现场实时快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及南方菜豆花叶病毒的检测技术，具体涉及南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
背景技术
南方菜豆花叶病毒（Southern bean mosaic virus, SBMV）是南方菜豆花叶病毒属（Sobemovirus）的典型成员，主要分布在美洲和非洲的温热带地区，法国和亚洲的印度也有报道，该病毒主要通过豆科作物的种子进行远距离传播。目前检测南方菜豆花叶病毒的方法主要包括血清学检测、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术和实时荧光RT-PCR检测技术等。血清学方法需要制备血清，较为繁琐，且检测周期长，并因南方菜豆花叶病毒存在不同株系易导致漏检现象。RT-PCR技术需对PCR产物进行开盖处理，易发生交叉污染，造成假阳性现象。实时荧光RT-PCR技术需要昂贵的检测设备，检测成本较高，不适合基层和小型实验室推广使用。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）作为一种新颖的核酸扩增方法，同样具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点；该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6～8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60℃～65℃进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1 h左右，检测周期非常短。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒；并提供了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括2×反应缓冲液，浓度8 U/μL 的Bst DNA聚合酶液，浓度为20μM的内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物和外侧下游引物， 钙黄绿素荧光染料（购自Eiken公司），所述2×反应缓冲液与Bst DNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5：1：2：2：0.25：0.25：1，所述内侧上游引物的核苷酸序列为5’- CGCCAACAGC CGTTGTGAAA TCGTTGGACA GCTTGGCAAG A-3’，所述内侧下游引物的核苷酸序列为5’- TGGTCCCGGC GAGGCTTATA AGCGTCCAGT ACTCACAGC-3’，所述外侧上游引物的核苷酸序列为5’- ACGGCCAATG CTATCACG-3’，所述外侧下游引物的核苷酸序列为5’- GCAGTGGGCT CTATCAGTTG-3’。
南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法，其步骤如下：
a、总RNA提取：0.1 g检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA；具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；
b、RT-LAMP扩增：RT-LAMP扩增反应体系为2×反应缓冲液12.5μL，浓度8 U/μL 的Bst DNA聚合酶液1.0μL，钙黄绿素荧光染料1.0μL，浓度为20μM的内侧上游引物和内侧下游引物各2.0μL，浓度为20μM的外侧上游引物和外侧下游引物各0.25 μL，样品总RNA2.5μL，无RNase的水补至25μL，反应条件为恒温63℃的水浴锅中扩增1 h，再95℃ 2 min，得到扩增产物；
c、判断：在自然光照条件下，肉眼观察扩增产物颜色，若扩增产物呈黄绿色，则样品感染南方菜豆花叶病毒，若扩增产物呈橙色，则样品中无南方菜豆花叶病毒。
与现有技术相比，本发明的优点在于南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料，检测方法通过样品总RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应1.5 h内即可完成，通过4条引物识别靶基因6段不同的序列，提高了检测的特异性，25μL体系中总RNA含量为2pg也能灵敏检测，其灵敏度比普通RT-PCR检测高10倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，反应结束后在自然光照条件下裸眼观察扩增产物颜色变化，判定结果，不需进行后处理，避免了开盖污染，操作简单，可现场实时快速检测。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1、根据GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中已登录的南方菜豆花叶病毒的外壳蛋白基因序列：acggccaatg ctatcacgac cacactggac gttggacagc ttggcaagaa gtggtatcct ttcaagacta gcacagattt cacaacggct gttggcgtaa atgtcaacat tgccactccc ctggtcccgg cgaggcttat aatagccatg ctggatgggt cgagttctac ggctgtgagt actggacgct tatacgtgtc gtatactatt caactgatag agcccactgc，利用DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析，找出SBMV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4设计了5组特异性引物，其中有1组引物不满足设计原则，合成4组：SB1组引物、SB2组引物、SB3组引物和SB5组引物，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。4组引物分别对感染南方菜豆花叶病毒：SB-AT分离物（由中国检科院植物检疫实验所提供）、SB-D分离物（购自德国DSMZ公司）、SB-A分离物（购自美国Agdia公司）进行RT-LAMP检测。检测方法为南方菜豆花叶病毒总RNA提取：0.1 g样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂（购自Invitrogen公司）提取总RNA，得到各分离物总RNA，具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；再RT-LAMP扩增：RT-LAMP扩增反应体系为2×反应缓冲液12.5 μL， 浓度8 U/μL 的Bst DNA聚合酶液1.0μL，钙黄绿素荧光染料1.0μL，浓度20μM的内侧上游引物和内侧下游引物各2.0μL、浓度20μM的外侧上游引物和外侧下游引物各0.25μL，分离物总RNA2.5μL，无RNase的水补至25μL，反应条件为恒温63℃的水浴锅中扩增1 h，再95℃ 2 min，得到扩增产物。RT-LAMP引物筛选检测试验结果：SB2组引物和SB5组引物仅对SB-D和SB-A扩增产物呈黄绿色，对SB-AT扩增产物呈橙色；SB3组引物仅对SB-A扩增产物呈黄绿色，对SB-D和SB-AT扩增产物呈橙色；SB1组引物对三个分离物扩增产物均呈黄绿色，故SB1组引物为SBMV RT-LAMP检测的最佳引物。SB1组的内侧上游引物的核苷酸序列为5’- CGCCAACAGC CGTTGTGAAA TCGTTGGACA GCTTGGCAAG A-3’，内侧下游引物的核苷酸序列为5’- TGGTCCCGGC GAGGCTTATA AGCGTCCAGT ACTCACAGC-3’，外侧上游引物的核苷酸序列为5’- ACGGCCAATG CTATCACG-3’，外侧下游引物的核苷酸序列为5’- GCAGTGGGCT CTATCAGTTG-3’，其分别识别外壳蛋白编码基因的6个位点。
实施例2、南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒可以为2×反应缓冲液12.5μL×100或200等，浓度8 U/μL 的Bst DNA聚合酶液1.0μL×100或200等，摩尔浓度为20μM的内侧上游引物2.0μL×100或200等，摩尔浓度为20μM的内侧下游引物2.0μL×100或200等，摩尔浓度为20μM的外侧上游引物0.25μL×100或200等，摩尔浓度为20μM的外侧下游引物0.25μL×100或200等，钙黄绿素荧光染料1.0 μL×100或200等和无RNase的水。
实施例3、RT-LAMP特异性试验：用上述实施例1的RT-LAMP检测方法分别对购自美国Agdia公司的感染南方菜豆花叶病毒SB-A样品、感染菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）样品、感染南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）样品、感染烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）样品，感染番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）样品，进行扩增，水浴温度为63℃，反应60 min，再95℃ 2 min，结果感染南方菜豆花叶病毒SB-A样品扩增产物呈黄绿色，其它样品扩增产物呈橙色，说明RT-LAMP扩增反应体系对南方菜豆花叶病毒特异。
实施例4、RT-LAMP灵敏性试验：用RT-PCR反应体系和上述RT-LAMP扩增反应体系分别对感染南方菜豆花叶病毒SB-AT样品总RNA进行扩增反应，RT-PCR反应的试剂盒为One-step RNA PCR kit (AMV)（购自大连宝生物公司），RT-PCR反应依试剂盒说明书进行；RT-LAMP扩增反应用上述实施例1的RT-LAMP检测方法。25μL反应体系中样品总RNA浓度分别为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg，结果RT-LAMP扩增反应最小检测限为2pg；RT-PCR最小检测限为20pg；因此RT-LAMP扩增灵敏度是RT-PCR的10倍。
<110> 宁波检验检疫科学技术研究院
<120> 南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法
<160> 5
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Claims (2)
1.南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括2×反应缓冲液，浓度8U/μL的Bst DNA聚合酶液，浓度为20μM的内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物和外侧下游引物，钙黄绿素荧光染料，所述2×反应缓冲液与Bst DNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5：1：2：2：0.25：0.25：1，其特征在于所述内侧上游引物的核苷酸序列为CGCCAACAGC CGTTGTGAAA TCGTTGGACA GCTTGGCAAG A，所述内侧下游引物的核苷酸序列为TGGTCCCGGC GAGGCTTATA AGCGTCCAGT ACTCACAGC，所述外侧上游引物的核苷酸序列为ACGGCCAATG CTATCACG，所述外侧下游引物的核苷酸序列为GCAGTGGGCT CTATCAGTTG。
2.利用权利要求1所述的南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒检测南方菜豆花叶病毒的方法，其特征在于步骤如下：
a、总RNA提取：0.1 g检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA；具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；
b、RT-LAMP扩增：RT-LAMP扩增反应体系为2×反应缓冲液12.5μL，浓度8U/μL 的BstDNA聚合酶液1.0μL，钙黄绿素荧光染料1.0μL，浓度为20μM的内侧上游引物和内侧下游引物各2.0μL，浓度为20μM的外侧上游引物和外侧下游引物各0.25μL，样品总RNA2.5μL，无RNase的水补至25μL，反应条件为恒温63℃的水浴锅中扩增1 h，再95℃ 2 min，得到扩增产物；
c、判断：在自然光照条件下，肉眼观察扩增产物颜色，若扩增产物呈黄绿色，则样品感染南方菜豆花叶病毒，若扩增产物呈橙色，则样品中无南方菜豆花叶病毒。
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