CN103088000A

CN103088000A - 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法

Info

Publication number: CN103088000A
Application number: CN2013100098448A
Authority: CN
Inventors: 王媛媛; 赵要风; 李宁
Original assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明提供了一种在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法，其是将编码人源胆盐激活脂酶的基因转入哺乳动物中，从而实现在哺乳动物乳腺中过表达人源胆盐激活脂酶。本发明利用构建BSSL乳腺特异表达载体，制备转基因小鼠，在小鼠乳腺中过表达人的胆盐激活脂酶，其在转基因小鼠奶中的表达量可达0.38mg/ml，活性为91473.94mU/ml。利用高表达胆盐激活脂酶的转基因奶饲喂早产幼鼠，结果表明早产小鼠的存活率较饲喂野生鼠奶提高了约10%。为今后利用大型家畜乳腺生物反应器生产人源胆盐激活脂酶打下基础。

Description

在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法。

背景技术

胆盐激活脂酶(Bile salt-stimulated lipase,BSSL)被发现存在于人、大猩猩、猫、狗、雪貂、小鼠的奶中，而牛奶中却不存在，其活性可在婴儿胃部酸性条件及胃蛋白酶水解条件下保持稳定，对于新生儿肠道吸收奶中甘油三酯起着非常重要的作用。BSSL活性在婴儿胃液的pH环境下稳定，胆盐保护其免受胰蛋白失活，直到与十二脂肠中的胆盐混合BSSL才能水解奶中甘油三脂。BSSL在胃部酸性条件及胃蛋白酶水解条件下保持活性的原因主要是BSSL有氧联的糖基化重复部位。因为粘蛋白起到保护作用，其中可以确定的是保护小肠和胃黏膜上皮抵抗酸性条件和不被蛋白酶水解。相对于胰脂酶，BSSL水解乳化胶溶和水溶的底物，并且没有位置特异性。

BSSL是一种分泌型酶，主要在泌乳期乳腺和外分泌的胰腺中表达，在小肠中被胆盐激活。BSSL占胰液中酶含量的5%。敲除BSSL的小鼠表明缺少BSSL不影响小肠对非酯化脂肪的吸收。但在消化道中BSSL对胆甾醇酯的水解活性是独一无二的，而对于甘油三酯和磷脂的有效水解来说是辅助的。BSSL负责调节小肠对胆甾醇酯的吸收，但对于游离的胆固醇的吸收不起主要作用。

人、大鼠、小鼠的BSSL基因保守地拥有11个外显子和10个内含子。每一个外显子都有一个关键结构和/或功能区域。例如，1号外显子编码信号肽，3号外显子包含第一个分子内的半胱氨酸交联，而第二个分子内的半胱氨酸交联是由7号外显子编码的。活性位点丝氨酸-194、组氨酸-435、天冬氨酸-320分别被5、8、10号外显子编码。表面的环由4号外显子编码部分覆盖在活性位点的凹槽。在不同物种中保守性最低的外显子是11号，其编码氧联糖基化区域和羧基末端富含脯氨酸的重复单元。11号外显子核苷酸序列最重要的不同是富含脯氨酸的重复单元数目的不同。根据以前的报道，大鼠和小鼠的BSSL基因分别有4和3个重复单元。相比较而言，人的BSSL基因具有高度的多态性，大多数共有的等位基因编码16个重复单元的蛋白。高频率的多态性是由于基因3’末端高变区的存在。5’末端序列具有经典的TATA和CCAAT元件，与组织特异表达相关。BSSL基因的上游序列也含有AP1、AP2和SP1绑定位点的共有序列。然而，还不能确定这些顺式元件对调控BSSL基因表达功能方面的作用。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程技术，在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶。

为了实现本发明目的，本发明的一种在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法，其是将编码人源胆盐激活脂酶的基因转入哺乳动物中，从而实现在哺乳动物乳腺中过表达人源胆盐激活脂酶。

优选地，前述方法是将编码人源胆盐激活脂酶的基因通过显微注射法、体细胞克隆法或精子载体法等方法转入哺乳动物中，以实现在哺乳动物乳腺中过表达人源胆盐激活脂酶。

其中，人源胆盐激活脂酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

优选地，编码上述人源胆盐激活脂酶的基因序列如SEQ ID No.2所示。

前述的方法，所述哺乳动物为大猩猩、猫、狗、雪貂、小鼠等。

本发明还提供含有编码人源胆盐激活脂酶的基因的乳腺特异表达载体。优选的出发载体为pBC1。

本发明还提供含有上述表达载体的转基因哺乳动物细胞。

本发明还提供一种制备克隆胚胎的方法，其以上述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。

本发明进一步提供一种制备转基因家畜的方法，其是将上述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。

本发明利用构建BSSL乳腺特异表达载体，制备转基因小鼠，在小鼠乳腺中过表达人的胆盐激活脂酶，其在转基因小鼠奶中的表达量可达0.38mg/ml，活性为91473.94mU/ml。利用高表达胆盐激活脂酶的转基因奶饲喂早产幼鼠，结果表明早产小鼠的存活率较饲喂野生鼠奶提高了约10%。为今后利用大型家畜乳腺生物反应器生产人源胆盐激活脂酶打下基础。

附图说明

图1为pBC-hBSSL载体线性化酶切回收结构图。

图2为双酶切pBC-hBSSL载体后，回收用于显微注射的目的片段的电泳结果；其中，M为λ/HindⅢ分子量标准；pBC-hBSSL为18kb线性化的载体片段。

图3为转基因小鼠制备流程。

图4为PCR检测F0代阳性转基因小鼠结果；其中，M为1kb梯度DNA分子量标准;转基因小鼠基因组分别为4、6、9、13、14、24、25和29，WT为阴性对照，P为阳性质粒的PCR结果。

图5为Southern杂交检测转基因小鼠基因组中外源基因的整合；其中，M为1kb梯度DNA分子量标准；WT为野生型小鼠对照；P1、P5、P10分别为相当于1、5、10拷贝数的阳性质粒对照杂交结果；4、6、9、13、14、24、25和29分别为F0代阳性小鼠对应基因组的杂交结果。

图6为转基因与野生型母鼠分别饲喂早产与正常生产的幼仔的存活率状况；其中，H为人奶样品杂交结果；WT为野生型小鼠乳样杂交对照；9、13、14、24、25和29分别为F0代阳性小鼠乳样杂交结果。

图7为转基因与野生型母鼠分别饲喂早产与正常生产的幼仔的存活率状况；其中，WN，野生型母鼠代哺正常生产的幼仔；BN,转基因母鼠代哺正常生产的幼仔；BP，转基因母鼠代哺早产幼仔；WP，野生型母鼠代哺早产幼仔；每组分别为3只母鼠共代喂30只幼仔。

图8为转基因与野生型母鼠分别饲喂早产与正常生产的幼仔的体重增长状况；其中，WN，野生型母鼠代哺正常生产的幼仔；BN,转基因母鼠代哺正常生产的幼仔；BP，转基因母鼠代哺早产幼仔；WP，野生型母鼠代哺早产幼仔。每组控制在8-10幼仔。对幼仔的体重测定从第一天一直到断奶的第21天，每天上午9:00-12:00进行测定。

图9为转基因与野生型母鼠分别饲喂早产与正常生产的幼仔的粪便主要成分的状况；其中，WN，野生型母鼠代哺正常生产的幼仔；BN,转基因母鼠代哺正常生产的幼仔；BP，转基因母鼠代哺早产幼仔；WP，野生型母鼠代哺早产幼仔。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例所使用的载体、试剂及其来源：

pBC1载体(Invitrogen)，含有人脂蛋白脂酶cDNA序列的IRATp970H1068D载体购自Imagenes公司。引物合成及序列测定由上海生工完成。实验动物用昆明小白鼠，购自北京实验动物中心。Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均为Biolabs公司产品；质粒纯化及回收试剂盒为Omega公司产品；同位素标记试剂盒购自Promega公司；放射性同位素α-³²P-dCTP以及Southern杂交膜购自美国Amershambiosciences公司。抗人胆盐激活脂酶的一抗购自Santa Cruz公司。BSSL含量检测ELISA试剂盒购自GBD公司。甘油三酯、胆固醇、葡萄糖检测试剂盒购自中生北控公司，BCA蛋白检测试剂盒购自碧云天公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

实施例1人源BSSL乳腺表达载体构建

以IRATp970H1068D质粒为模板PCR扩增得到人源BSSL基因cDNA序列。用于扩增cDNA序列的一对引物为hBSSL-F(5′-CCGCTCGAGACCATGCTCACCATGGGGCGC-3′)和hBSSL-R(5′-CCGCTCGAGTTCAGGGGTATGAGGCTTTAT-3′)，分别在引物中引入XhoI酶切位点。将扩增序列回收，克隆到经过XhoI酶切的pBC1载体中(图1)，通过PCR鉴定插入片段序列及方向，并进行测序，最终将插入正确的表达载体命名为pBC-hBSSL。

实施例2转基因小鼠模型的建立及检测

1.1显微注射生产转基因小鼠

研究表明，用显微注射法生产转基因小鼠，线性DNA比环状DNA整合效率高，因此要将构建好的表达载体pBC-hLPL酶切去除无用的原核部分同时线性化后进行显微注射。

用NotI/SalI酶切构建好的表达载体pBC-hBSSL，去掉原核载体骨架结构部分，然后将酶切DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下待回收的含目的片段的18kb所在位置处的凝胶，利用可回收10kb以上DNA片段的凝胶回收试剂盒(Omega)进行回收，结果如图2所示。

将回收片段溶于TE溶液(10mmol/L Tris.cl(pH7.4)，0.1mmol/LEDTA，用Milli-Q水配制)后，紫外分光光度计中测定260nm和280nm下OD比值并计算浓度，上述两种纯化方法的OD260/OD280比值都在1.8以上，可用于注射小鼠受精卵。将含有外源基因片段的TE溶液稀释至终浓度2.5ug/ml，注射到小鼠受精卵的雄原核，然后移植到同期发情的假孕母鼠输卵管中。转基因小鼠制备流程如图3所示。

1.2转基因小鼠的PCR检测

取3周龄转基因小鼠的尾巴组织样，提取DNA。以提取好的基因组为模板，利用人源BSSL cDNA序列设计的引物(L-F:5’-GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC-3’，L-R:5’-ACAGGTAGTTGTTGAGGAAGTT-3’)在转基因阳性小鼠中可以扩增出499bp大小的片段，以野生型小鼠基因组为阴性对照，以载体pBC-hBSSL为阳性对照。扩增条件为94℃，30sec；58℃，30sec；72℃，90sec；30个循环。1.0%琼脂糖电泳观察结果。PCR在F0代42只小鼠中检测出8只阳性小鼠，结果如图4所示，第4、6、9、13、14、24、25和29号均为转基因阳性小鼠。

1.3转基因小鼠的Southern blotting检测

将PCR检测为阳性的F0代8只转基因小鼠，剪尾部组织提取基因组，取10μg用PstI内切酶消化，以PstI酶切的野生型小鼠基因组为阴性对照，PstI酶切的pBC-hBSSL注射载体片段为阳性对照，杂交探针是以人BSSLcDNA为模板利用PCR扩增后回收1.1kb的基因片段(引物为S-F:5’-AGACCCTCTCCCCCTACAACAA-3’，S-R:5’-GGCATATGAGCTTCCTTGGAGT-3’)。将样品低压慢速电泳，采用碱转移方法将DNA从琼脂糖转移至尼龙膜，将尼龙膜有DNA的一面朝内,卷成筒状放入杂交管中，加入预杂交液，于65°C预杂交不短于1hr，加入经过加热变性的α-P³²dCTP同位素标记的探针,65°C杂交12~16hr，洗膜后用保鲜膜包好,放进暗盒中,暗室中压上X光片,于-70°C放射自显影，12小时冲洗X光片观察结果。Southern blotting结果如图5所示，结果表明阳性小鼠Southern blotting检测结果与PCR检测结果一致。

实施例3重组人BSSL在转基因小鼠乳样中的表达分析

1.1转基因小鼠乳样的Western blotting检测

采集F0代9、13、14、24、25和29号小鼠泌乳中期的奶样，野生型小鼠乳汁作为阴性对照，人奶为阳性对照。乳汁在小鼠出生后第8-12天采集，采集前将母鼠与仔鼠分离3小时以上，并向腹腔注射一定剂量的催产素。将离心后去除乳脂和酪蛋白的乳清在10%的SDS-PAGE上电泳后转到尼龙膜上。用抗人的BSSL一抗进行WesternBlot分析，即可检测重组人BSSL在转基因小鼠乳汁中的表达。重组人BSSL与人奶中BSSL分子量大小相一致，约为100kDa，结果如图6所示。

1.2转基因小鼠乳样中BSSL表达量分析

采用ELISA法对转基因小鼠乳汁中的BSSL表达量进行分析，选取了6只转基因小鼠泌乳中期的奶样进行检测。由于采用商业化的ELISA试剂盒，并不能有效地区分人源与鼠源的BSSL，因而本发明检测了6只野生型小鼠泌乳中期的奶样作为对照（具体操作按说明书）。转基因鼠表达的BSSL含量显著高于野生型鼠奶中的BSSL含量，最高表达量达到0.38mg/ml（表1）。

1.3转基因小鼠奶样中BSSL的活性检测

采用与进行BSSL表达量分析所使用的同样一批转基因和野生型的鼠奶进行酶活性的检测。使用含³H标记三油酸甘油酯的甘油乳剂为底物，标本与底物37℃孵育反应后通过抽提将甘油酯与游离脂肪酸分开，脂解产生的游离脂肪酸的放射活性与标本中脂肪酶的活性成正比的放射性同位素标记法测定体外BSSL活性。具体操作可参考张爱宏，刘国庆，放射性同位素标记法检测脂蛋白脂肪酶活性及其应用）。检测结果如表1所示。

表1转基因鼠奶及野生型鼠奶在泌乳中期BSSL表达量和活性统计表

*P<0.05;***P<0.001。以上数据代表平均值

实施例4转基因鼠奶对早产幼鼠生长影响的检测

1.1对早产幼仔存活率的检测

转基因与野生型母鼠分别代喂早产与正常生产的幼仔，所有的幼仔均不是生母喂养，每只母鼠代喂得幼仔控制在8-10只，幼仔间不进行性别区分。正常生产的小鼠来源于自然分娩，早产小鼠通过对怀孕19天的孕鼠剖腹产获得。

正常生产的幼仔无论是转基因还是野生型母鼠代喂，其存活率为100%。而早产小鼠的存活率由转基因母鼠代喂的为93.3%高于由野生型母鼠代喂的83.3%(图7)。

1.2对早产幼仔胃中BSSL活性的检测

对母乳中BSSL在胃中的活性检测是确保BSSL没有被胃中消化酶所降解及确保其在幼鼠消化道中活性的。在出生后第10天，正常生产的小鼠饲喂转基因奶的胃中BSSL显著高于早产小鼠饲喂转基因奶的。早产小鼠由转基因母鼠代喂的较由野生型母鼠代喂的来说，胃容物中BSSL活性在第10天增加了108%，在第20天增加了73%（表2）。

表2出生后第10天和第20天，正常生产和早产幼仔胃中母乳的BSSL活性

*P<0.05;**P<0.01。n为实验动物数目。

1.3早产幼仔断奶前体重增长的测定

早产和正常生产的幼仔出生时的体重均值分别在1.50g和2.06g。由图8可以看出，转基因奶饲喂的早产儿较野生型饲喂的体重增长显著，在断奶的第21天，BP组和WP组幼仔的体重均值分别为12.38和8.61g，BP组较WP增长了43.79%。

1.4早产幼仔断奶前粪便中主要成分的测定

对粪便中主要成分的测定是为了分析小鼠营养成分的流失状况。对幼仔哺乳期的粪便中的主要成分（脂肪、蛋白质、干物质）进行测定，各成分以在粪便中所占百分比如图9所示(**P<0.01,*P<0.05)，粪便中脂肪的含量，BN组为WN组中的71.16%(P<0.01)；BP组为WP组的67.66%(P<0.05)。粪便中蛋白和干物质的含量各组间没有显著性差异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法，其特征在于，其是将编码人源胆盐激活脂酶的基因转入哺乳动物中，从而实现在哺乳动物乳腺中过表达人源胆盐激活脂酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其是将编码人源胆盐激活脂酶的基因通过显微注射法、体细胞克隆法或精子载体法转入哺乳动物中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，人源胆盐激活脂酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，编码人源胆盐激活脂酶的基因序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物为大猩猩、猫、狗、雪貂、小鼠。

6.含有编码人源胆盐激活脂酶的基因的乳腺特异表达载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，其出发载体为pBC1。

8.含有权利要求6或7所述表达载体的转基因哺乳动物细胞。

9.一种制备克隆胚胎的方法，其以权利要求8所述的转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。

10.一种制备转基因家畜的方法，其是将权利要求9所述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。