CN103081893B

CN103081893B - 一种心肌细胞的中药保存液及其应用

Info

Publication number: CN103081893B
Application number: CN201110345947.2A
Authority: CN
Inventors: 田杰
Original assignee: BEIJING QMLC STEM CELL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING QMLC STEM CELL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2031-11-07
Also published as: CN103081893A

Abstract

本发明公开了一种心肌细胞保存液及其应用。本发明提供的心肌细胞保存液，10^-6mol/L-10^-8mol/L的川芎嗪浓度、1％(质量百分含量)的N2添加剂和1％(质量百分含量)所述B27添加剂是用9％生理盐水溶液配制成的。本发明提供的心肌细胞保存液用于保存心肌细胞，在12小时以内细胞存活率为89％以上，甚至达到97％以上。本发明公开的心肌细胞保存液具有稳定性高、疗效好、安全性高、无毒副作用、便于储存和运输，适应临床大规模使用，应用前景广阔的特点。

Description

一种心肌细胞的中药保存液及其应用

技术领域

本发明涉及一种心肌细胞保存液及其应用。

背景技术

心肌梗死后，心肌细胞永久性丢失。且成熟心肌不可再生，不可能通过分裂增殖来弥补病理性细胞数量减少。虽然近来有研究证实在心肌梗死后梗死区边缘有少量心肌细胞发生有丝分裂，但这种分裂十分微弱，根本不足以代偿有临床意义的坏死心肌。现有治疗手段也无法促使心肌再生。近年来有研究使用细胞移植至受损心脏替代坏死心肌，修复心肌结构和功能，该技术称之为“心肌再生”或“细胞心肌成形术”(cellular cardiomyoplasty，CCM)。

心肌重塑是梗死后心功能持续恶化的核心机制，很多实验发现干细胞移植能阻止心肌重塑。Mangi等移植携带Akt基因的大鼠MSCs，发现心肌重塑被抑制、心功能改善，移植细胞占据80％～90％的瘢痕，有完全正常的收缩和舒张功能。他们认为心功能改善机制是CCM可以抑制心肌内炎症和病理性肥厚、减少胶原沉积。Kudo等。。发现骨髓干细胞移植的获益机制主要是减少心肌梗死面积和抑制纤维化。Chachques等.结扎羊两支冠脉，将骨骼肌卫星细胞(skeletal myoblasts，SMs)和VEGF注射至梗死中心和周边，3个月后细胞移植抑制了左室扩大。Olivares等发现MSCs移植后梗死心脏的心室几何形状得以很好的保持。

川芎嗪(Ligustrazine)来源于伞形科植物川芎的干燥根茎，为吡嗪类生物碱。川芎辛香行散，温通血脉，上行头颠，下走血海，功能活血行气，祛风止痛，被前人誉为血中之气药。现代研究表明川芎嗪有解痉、降低血管阻力和强烈抑制血小板聚集的作用，对已聚集的血小板有解聚作用，能明显降低全血粘度；还能增加冠脉流量、有改善心肌供氧、降低心肌耗氧的作用，治疗缺血性脑血管及冠心病效果良好，还可以治疗偏头痛和重症肺心病。川芎嗪的分子量为136.20，分子式：C₈H₁₂N₂，

金氏等发现东川芎能使SOD活性和MDA含量明显恢复，证实了东川芎能够稳定细胞的膜性结构，抵抗细胞膜和膜性结构受自由基攻击，最终达到清除自由基的目的，对缺氧缺糖心肌起保护作用。梁氏等在实验发现川芎嗪预处理对整体动物缺血再灌注损伤的保护作用后，用体外培养乳鼠心肌细胞观察了川芎嗪预处理对低氧/再给氧损伤的保护作用。结果表明川芎嗪预处理对体外培养乳鼠心肌细胞低氧/再给氧所致损伤具有保护作用，其机制可能与提高心肌细胞抗氧化酶活性，清除氧自由基有关。

目前大多动物实验和医学研究均取得积极结果，很多实验就细胞移植途径作出有意义的探索，但符合应用要求、安全高效的给入途径研究甚少。

发明内容

本发明的目的是提供一种心肌细胞保存液及其应用。

本发明提供的心肌细胞保存液，含有川芎嗪、N2添加剂、B27添加剂。所述川芎嗪浓度为10^-6mol/L-10^-8mol/L；所述N2添加剂百分浓度为1％(质量百分含量)；所述B27添加剂百分浓度为1％(质量百分含量)。

本发明提供的心肌细胞保存液，是优选为是将10^-6mol/L-10^-8mol/L川芎嗪、1％的N2添加剂(质量百分含量)、1％的B27添加剂(质量百分含量)，添加入9％生理盐水。

所述川芎嗪可以以液体的形式加入，也可以以干粉的形式加入。

本发明提供的心肌细胞保存液用于保存心肌细胞，在12小时以内细胞存活率为85％以上，甚至达到95％以上。

所述心肌细胞保存液可用于保存心肌细胞，特别是离体的心肌细胞，优选为离体的人心肌细胞。

本发明还保护一种保存心肌细胞的方法，是将心肌细胞悬浮于所述心肌细胞保存液，4-8℃保存12小时以下(如4-6℃保存12小时或6-8℃保存12小时)；所述心肌细胞和所述心肌细胞保存液的配比为6×10⁵-7×10⁵个心肌细胞活细胞：1mL心肌细胞保存液(如6×10⁵-6.8×10⁵个心肌细胞活细胞：1mL心肌细胞保存液，或6.8×10⁵-7×10⁵个心肌细胞活细胞：1mL心肌细胞保存液)。所述心肌细胞可为离体的心肌细胞，优选为离体的人心肌细胞。

本发明还保护一种治疗心脑血管疾病的药物，是将心肌细胞悬浮于所述心肌细胞保存液得到的细胞悬液；所述心肌细胞和所述心肌细胞保存液的配比为6×10⁵-7×10⁵个心肌细胞活细胞：1mL心肌细胞保存液(如6×10⁵-6.8×10⁵个心肌细胞活细胞：1mL心肌细胞保存液，或6.8×10⁵-7×10⁵个心肌细胞活细胞：1mL心肌细胞保存液)。所述心肌细胞可为离体的心肌细胞，优选为离体的人心肌细胞。

本发明提供的心肌细胞保存液具有稳定性高、疗效好、安全性高、无毒副作用、便于储存和运输，适应临床大规模使用，应用前景广阔的特点。

本发明提供的药物可分化成有功能的心肌细胞，具有再生修复实质器官和发挥免疫调节的双向作用，可以提高心肌功能、改善心脏的微环境。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、心肌细胞保存液的制备

所述川芎嗪购自上海源叶生物科技有限公司，产品目录号为YY90188；N2添加剂购自于invitrogen公司，产品目录号为17502048；B27添加剂购自于invitrogen，产品目录号为17504-044。

所述川芎嗪在所述分化培养基中的浓度为10^-6mol/L-10^-8mol/L；所述N2添加剂在所述分化培养基中的百分浓度为0.3-1％(质量百分含量)；所述B27添加剂在所述分化培养基中的百分浓度为0.3-1％(质量百分含量)。

心肌细胞保存液I的制备方法：将10^-6mol/L川芎嗪，0.3％N2添加剂，0.3％B27添加剂融入9％生理盐水。

心肌细胞保存液II的制备方法：将10⁷mol/L川芎嗪，0.6％N2添加剂，0.6％B27添加剂融入9％生理盐水。

心肌细胞保存液III的制备方法：将10^-8mol/L川芎嗪，1％N2添加剂，1％B27添加剂融入9％生理盐水。

实施例2、人心肌细胞的细胞的扩大培养

D-hank’S平衡盐液缓冲液：溶剂为水，含有如下溶质：0.8％的NaCl、0.04％的KCl、0.006％的Na₂HPO₁·H₂O和0.006％的KH₂PO₁；％均为质量百分含量。

1、将1瓶人心肌细胞用10ml D-hank’S平衡盐液缓冲液清洗两次。

2、收集细胞，用胰酶37℃条件下消化6分钟(5-7分钟均可)；消化过程中在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保人心肌细胞完全消化。

3、终止消化，然后每瓶中加入10ml D-hank’S平衡盐液缓冲液，反复吹打使细胞悬浮，得到细胞悬液。

4、将细胞悬液进行活细胞计数，方法如下：将细胞悬液和0.4％台盼兰溶液等体积混合，轻轻混匀；1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数细胞；活细胞排斥台盼兰，染成蓝色的细胞是死细胞。

5、将细胞悬液移入离心管中，以2000rpm的离心速度离心10min，离心结束，弃上清，获得人心肌细胞。

实施例3、实施例1制备的心肌细胞保存液的应用

将实施例2中的人心肌细胞分别重悬于实施例1制备的三种心肌细胞保存液，配比均为6.8×10⁵个人心肌细胞活细胞：1ml心肌细胞保存液，4℃保存12小时后取样(细胞悬液)测定细胞存活率。

细胞存活率测定方法：将0.5ml细胞悬液与0.5ml 0.2％台盼兰溶液混合，得到混合液；吸取10微升混合液，滴加在盖片边缘，使混合液充满盖片和计数板之间；静置1分钟；随机选取几个视野，共计数300个细胞(计数着色细胞数目，即死细胞数目)，细胞存活率＝(300-死细胞数目)/300×100％；重复计数5次，结果取5次计数的平均值。

共进行三次重复实验，结果取平均值，见表1。

表1实施例3的实验结果

	计数细胞数目	着色细胞数目	细胞存活率％
				心肌细胞保存液I	500	69±3	87.0±1
心肌细胞保存液II	500	12±2	97±0.7
				心肌细胞保存液III	500	9±1	98.0±0.3

在显微镜下观察细胞的聚集情况，细胞稳定性良好，没有聚集成团现象。结果表明：心肌细胞保存液I、心肌细胞保存液II、心肌细胞保存液III作为保存液，4℃保存人心肌细胞12小时，人心肌细胞的存活率均在87％以上；特别是心肌细胞保存液II、心肌细胞保存液III，作为保存液保存人心肌细胞时，存活率均在97％以上。

实施例4、实施例1制备的心肌细胞保存液的应用

将实施例2中的人心肌细胞分别重悬于实施例1制备的三种心肌细胞保存液，配比均为6×10⁵个人心肌细胞活细胞：1ml心肌细胞保存液，6℃保存12小时后取样(细胞悬液)测定细胞存活率。

细胞存活率测定方法同实施例3。

共进行三次重复实验，结果取平均值，见表2。

表2实施例4的实验结果

	计数细胞数目	着色细胞数目	细胞存活率％
				心肌细胞保存液I	300	34±4	89.2±0.3
心肌细胞保存液II	300	7±1	97.7±0.3
				心肌细胞保存液III	300	8±1	97.7±0.3

在显微镜下观察细胞的聚集情况，细胞稳定性良好，没有聚集成团现象。结果表明：心肌细胞保存液I、心肌细胞保存液II、心肌细胞保存液III作为保存液，6℃保存人心肌细胞12小时，人心肌细胞的存活率均在89％以上；特别是心肌细胞保存液II、心肌细胞保存液III，作为保存液保存人心肌细胞时，存活率均在97％以上。

实施例5、实施例1制备的心肌细胞保存液的应用

将实施例2中的人心肌细胞分别重悬于实施例1制备的三种心肌细胞保存液，配比均为7×10⁵个人心肌细胞活细胞：1ml心肌细胞保存液，8℃保存12小时后取样(细胞悬液)测定细胞存活率。

细胞存活率测定方法同实施例3。

共进行三次重复实验，结果取平均值，见表3。

表3实施例5的实验结果

	计数细胞数目	着色细胞数目	细胞存活率％
				心肌细胞保存液I	300	40±5	86.7±0.3
心肌细胞保存液II	300	5±1	98.3±0.3
				心肌细胞保存液III	300	7±2	97.7±0.3

在显微镜下观察细胞的聚集情况，细胞稳定性良好，没有聚集成团现象。结果表明：心肌细胞保存液I、心肌细胞保存液II和心肌细胞保存液III作为保存液，8℃保存人心肌细胞12小时，人心肌细胞的存活率均在86％以上；特别是心肌细胞保存液II，作为保存液保存人心肌细胞时，存活率均在96％以上。

Claims

1.一种心肌细胞保存液，其中，川芎嗪浓度为10^-6mol/L-10^-8mol/L；N2添加剂百分浓度为1％(质量百分含量)；B27添加剂百分浓度为1％(质量百分含量)。

2.如权利要求1所述的心肌细胞保存液，其特征在于：所述川芎嗪浓度为10^-6mol/L-10⁸mol/L，所述N2添加剂百分浓度为1％(质量百分含量)，所述B27添加剂百分浓度为1％(质量百分含量)，是用9％生理盐水溶液配制成的。

3.权利要求1或2所述的心肌细胞保存液在保存心肌细胞中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述心肌细胞为离体的心肌细胞。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述心肌细胞为人心肌细胞。

6.一种保存心肌细胞的方法，是将心肌细胞悬浮于权利要求1或2所述的心肌细胞保存液，4-8℃保存12小时以下；所述心肌细胞和所述心肌细胞保存液的配比为6×10⁵-7×10⁵个心肌细胞活细胞：1mL心肌细胞保存液。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述心肌细胞为离体的心肌细胞。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述心肌细胞为人心肌细胞。