CN103045760A

CN103045760A - 用于检测i型单纯疱疹病毒的引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN103045760A
Application number: CN2012105459842A
Authority: CN
Inventors: 赵格; 孙士营; 袁青; 翟华蕾; 谢立信
Original assignee: SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Current assignee: SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-04-17

Abstract

本发明涉及一种用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组及试剂盒，其引物序列分别为SEQ ID NO：1-2。本发明的试剂盒由DNA扩增试剂、正反向引物组合、阳性对照核酸和灭菌蒸馏水组成。本发明通过根据I型单纯疱疹病毒基因组DNA的保守序列，设计并合成可以扩增I型单纯疱疹病毒型特异性DNA的正反向引物，利用特殊PCR扩增试剂无需进行样本DNA提取而直接进行PCR反应的方法检测病毒。本发明省去了模板DNA提取步骤，减少了样本量损失的一个重要环节，保证了有限临床样本的最大利用度；同时也使得检测的时间大大缩短，2个小时即可出检测结果，对临床病变的早期诊断可以起到很好的辅助作用。

Description

用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于感染性眼病常见致病微生物的快速检测技术领域，具体涉及一种用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组及试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的具有代表性的疱疹病毒，根据抗原性的差别分为I型和II型两种血清型，目前认为包膜糖蛋白G是I型和II型间差异最大的一个糖蛋白，可诱导机体产生型特异性抗体反应。单纯疱疹病毒能引起人类多种疾病，而常见的病毒性角膜炎主要由I型单纯疱疹病毒感染角膜所致。I型单纯疱疹病毒通过分泌体液和亲密接触粘膜表面或擦伤皮肤而在人与人之间传播，原发感染通常是无明显症状的，但病毒从此可在宿主体内潜伏。当机体受到多种因素如紫外线（太阳暴晒）、发热、创伤和情绪紧张、细菌或病毒感染以及使用肾上腺素等影响后，潜伏的病毒被激活，激活的HSV-1复发感染可以引起眼部病变，反复复发还可以引起角膜瘢痕形成、新生血管化，甚至失明。单纯疱疹病毒性角膜炎临床表现复杂，除了典型的树枝、地图及盘状角膜病灶形态外，还有一些不典型的临床改变，给诊断和治疗带来很大困难。近年来单纯疱疹病毒型角膜炎有明显上升和加剧趋势，由于反复发作，重症病例增多，严重威胁视功能。因此只有早期及时确诊是由哪种病毒感染所致，才能更好的指导后续治疗中的合理用药以及选择合适的手术时机。

目前临床上主要通过典型的角膜病灶形态（树枝、地图及盘状）、多次复发的病史、抗生素治疗无效而皮质激素治疗恶化，以及角膜感觉迟钝或消失等临床症状对单纯疱疹病毒型角膜炎进行确诊，但是其临床表现毕竟复杂多样，而且此过程有一定的主观依赖性，所以单纯的靠临床表现进行确诊还是存在一定的难度。实验室诊断目前主要有病毒分离培养法和荧光抗体染色技术。从病变样本中进行病毒的培养是明确诊断的最可靠依据，但是这种培养方法耗时长，不能提供早期诊断结果，延误治疗；由于患者之前的用药还可能会影响培养的阳性；而且培养病毒也需要专业技术人员和硬件条件的完善。对病变部位细胞直接印迹然后行荧光抗体染色可以在较短时间内做出判断，但是此法检测的阳性率较低，还需要专业的荧光显微镜。可见对I型单纯疱疹病毒引起的眼部感染目前尚无快速有效的早期诊断方法，因此临床上亟需新的快速有效的病毒性角膜炎的诊断方法。利用分子生物学方法诊断病原微生物为单疱病毒性角膜炎的快速诊断提供了新的思路。已有研究者将普通PCR的方法应用于细菌、真菌和病毒引起的感染诊断，对细菌的16S rRNA、真菌rRNA基因的大、小亚基和病毒种特异性序列进行扩增和分析，可有效鉴定至种属。普通PCR方法诊断病原虽然高效特异，但要先对样本进行模板DNA的提取，这个过程本身就会造成样本的损失；加上临床眼科病变样本量本来就很少，即使采用高效便捷的试剂盒提取方法，DNA得率依然是很低的。所以考虑到要进行DNA提取，那么普通PCR难以适应临床需要。直接PCR方法就可以避开DNA提取的步骤，将临床样本直接进行I型单纯疱疹病毒特异性DNA的扩增，既大大缩短了检测的时间，又高效特异，而且需要的话还可以进一步进行基因型的鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组及试剂盒，能够快速、高效、准确地检测I型单纯疱疹病毒，同时省去临床病变样本DNA提取步骤，使得检测更加便捷，从而弥补现有技术的不足。

本发明根据GenBank中所公布的不同株I型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白G的核酸序列中同源性较高的部位，设计并合成型特异性的引物组。

本发明的用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组，其核苷酸序列为分别为SEQ ID NO：1～2，单疱病毒扩增片段长度为346bp；其中：

正向引物HSV-1F：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

反向引物HSV-1R：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的I型单纯疱疹病毒快速检测试剂盒包括：

1）DNA扩增试剂：

DNA扩增试剂包含有2×MightyAmp 缓冲液、 MightyAmp DNA聚合酶；

2）正反向引物组合：

正反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，反向引物的序列为SEQID NO：2。

3）阳性对照核酸：

阳性对照核酸为含有I型单纯疱疹病毒序列的质粒pUC-HSV-1；

4）灭菌蒸馏水。

利用本发明的检测试剂盒对病毒性角膜炎的临床样本进行I型单纯疱疹病毒检测的方法：

（1）临床样本的处理：病变角膜刮片用5~10μL灭菌蒸馏水吹打重悬于小离心管；房水或玻璃体经高速离心后吸弃上清，最终收集5~10μL（含沉淀），然后用移液器吹打均匀；结膜囊棉拭子用500μL灭菌纯水吹打数次后弃拭子，余液同房水处理方法。

（2）I型单纯疱疹病毒特异性DNA扩增体系的配置：

在反应管中分别加入下列组分：

（3）I型单纯疱疹病毒特异性DNA扩增程序（TouchDown法）：

步骤1: 98℃ 5分钟，

步骤2: 98℃ 30秒，

步骤3: 65℃ 30秒，每一个循环温度降低0.5℃，

步骤4: 72℃ 30秒，

步骤5: 重复2、3、4步骤9个循环，

步骤6: 98℃ 30秒，

步骤7: 60℃ 30秒，

步骤8: 72℃ 30秒，

步骤9: 重复6、7、8步骤25个循环，

步骤10: 72℃ 10分钟，

步骤11: 4℃ 保持。

（4）I型单纯疱疹病毒特异DNA的琼脂糖凝胶电泳检测：

常规琼脂糖凝胶电泳检测I型单纯疱疹病毒特异性DNA，根据扩增产物分子量是否与I型单纯疱疹病毒特异性DNA预定分子量相符确定有无阳性扩增，从而确定引发病毒性角膜炎的致病病毒类型。

本发明通过根据I型单纯疱疹病毒基因组DNA的保守序列，设计并合成可以扩增I型单纯疱疹病毒型特异性DNA的正反向引物，利用特殊PCR扩增试剂无需进行样本DNA提取而直接进行PCR反应的方法检测病毒。本发明省去了模板DNA提取步骤，减少了样本量损失的一个重要环节，保证了有限临床样本的最大利用度；同时也使得检测的时间大大缩短，2个小时即可出检测结果，对临床病变的早期诊断可以起到很好的辅助作用。本发明采用的直接PCR扩增试剂扩增效率很高，扩增的虽然是未经模板DNA提取的粗样，但是特殊的聚合酶依然有很高的扩增效率。本发明采用的TouchDown的扩增程序，既避免了粗样本中模板的复杂性可能带来的非特异性扩增，又保证了特异序列的高效扩增。

具体实施方式

下面对本发明的试剂盒和检测方法进行具体的描述。

一、扩增引物组的获得

根据I型单纯疱疹病毒基因组序列中相对保守的包膜糖蛋白G所对应的US4区域设计PCR扩增引物，从GenBank数据库中下载9个不同株I型单纯疱疹病毒编码糖蛋白G的核酸序列，对应Accession Number如下：AB297670.1，AY240761.1，JX142173.1，HQ833203.1，GQ898900.1，JN420337.1，HM585514.1，JQ780693.1，HM585511.1。利用序列分析软件DNAMAN version 6进行同源性比较，在同源性为100% 的区位，设计PCR扩增引物，利用DNAMAN软件中的引物分析功能对所设计引物进行各项参数的具体分析，最终确定本发明的正反向引物组。

二、试剂盒的制备

直接PCR检测I型单纯疱疹病毒试剂盒的制备（5样次）：

(1)DNA扩增试剂，1管，内装15份扩增反应（每样次需做1个阳性反应，1个实验样品反应,1个阴性反应）所需试剂，10.5μL/份，每份含有10μL 2×MightyAmp 缓冲液、0.5μL MightyAmp DNA聚合酶；（MightyAmp 缓冲液及对应DNA聚合酶是TaKaRa公司生产的一种PCR反应体系，货号为DR071）

(2)正反向引物组合，1管，内装15份，2μL/份，每份含I型单纯疱疹病毒正向引物和反向引物的浓度均为5μM，引物的具体序列如SEQ ID NO：1～2。

(3)阳性对照核酸，1管，内装5μL包含I型单纯疱疹病毒目的DNA的质粒，命名为pUC-HSV-1。质粒制备的具体操作是利用上述正反向引物对I型单纯疱疹病毒基因组DNA进行PCR扩增，将所得的目的大小的片段用切胶回收试剂盒进行回收，然后连接到克隆质粒pMD-18T上，转入大肠杆菌DH5α中，经氨苄培养基平板筛选培养，挑取阳性克隆进行测序验证，确定为I型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白G型内保守序列后，提取此阳性克隆的质粒即可作为阳性核酸。

(4) 灭菌蒸馏水，1管，内装1mL。

检测方法按照以下(1)-(4)程序进行：

（1）临床样本的处理：病变角膜刮取物用5~10μL灭菌蒸馏水吹打重悬于小离心管；房水或玻璃体经高速离心后吸弃上清，最终收集5~10μL（含沉淀），然后用移液器吹打均匀；结膜囊棉拭子用500μL灭菌纯水吹打数次后弃拭子，余液同房水处理方法。

（2）I型单纯疱疹病毒特异性DNA扩增体系的配置：

在反应管中加入下列组分：

同时各做阳性和阴性对照，即阳性反应中模板各加入对应阳性核酸，阴性反应则不加模板。

（3）I型单纯疱疹病毒特异性DNA扩增程序（TouchDown法）：

98℃ 5分钟/ 98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度降低0.5℃），72℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒；（25个循环）/72℃ 10分钟，4℃保持。

（4）I型单纯疱疹病毒特异DNA的琼脂糖凝胶电泳检测：

常规琼脂糖凝胶电泳检测I型单纯疱疹病毒特异性DNA，根据扩增产物分子量是否与I型单纯疱疹病毒特异性DNA预定分子量相符确定有无阳性扩增，从而确定引发病毒性角膜炎的病毒类型。

本发明的直接PCR法检测I型单纯疱疹病毒的引物及试剂盒不仅可以对病毒性角结膜炎的病灶刮片或结膜囊拭子样本进行I型单纯疱疹病毒的检测，还可以对病毒性眼内炎的房水以及玻璃体样本进行相应致病原检测。下列具体实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。

实施例1本发明的试剂盒的敏感性检测

将已知滴度I型单纯疱疹病毒悬液梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹,10⁰PFU/μL，采用本发明试剂盒中的DNA扩增试剂和引物组合进行扩增，评价直接PCR对I型单纯疱疹病毒检测的敏感性，具体方法如下：

1) DNA扩增试剂10.5μL，各梯度I型单纯疱疹病毒悬液1μL,正反向引物组合2μL，补灭菌蒸馏水至20μL；

2) 98℃ 5分钟/ 98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度降低0.5℃），72℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒；（25个循环）/72℃ 10分钟，4℃ 保持。

3) PCR反应结束后，在各浓度梯度反应管中加入上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果显示，本发明的试剂盒对微量的I型单纯疱疹病毒就可扩增出阳性结果，检测敏感性可达10个拷贝数，灵敏度很高，在实际操作中使用本发明的引物检测的时候不会出现假阴性。

实施例2：本发明的试剂盒的特异性检测

利用眼科常见的其他病毒如腺病毒、带状疱疹病毒、巨细胞病毒，单疱病毒另一血清型II型单纯疱疹病毒，眼科常见其他病原如细菌中的表皮葡萄球菌，真菌中的茄病镰刀菌和棘阿米巴原虫以及角膜刮片中常混有的角膜上皮细胞对I型单纯疱疹病毒的引物进行了特异性检测。

具体操作同实施例1的具体方法，结果显示，本发明的试剂盒中I型单纯疱疹病毒引物组合只特异扩增I型单纯疱疹病毒，对其他病原微生物未产生扩增，说明本发明的引物在检测的时候不会出现假阳性。

实施例3：本发明的试剂盒对动物病变组织样品的检测

利用临床上高度怀疑病毒性角膜炎病变角膜组织刮取物对本发明的试剂盒进行有效性验证，具体方法如下：

(1)病变角膜刮取物加入5~10μL灭菌蒸馏水吹打散开至均匀。

(2)视样品量取1~5μL上述样品悬液分别加入1个小PCR反应管中，加入10.5μL DNA扩增试剂，然后再加入I型单纯疱疹病毒引物组合2μL，加灭菌蒸馏水补足20μL 。同时对做加阳性核酸的阳性对照和不加模板的阴性对照。

(3)将上述反应管放入PCR仪进行TouchDown PCR反应：98℃ 5分钟/98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度降低0.5℃），72℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒；（25个循环）/72℃ 10分钟，4℃ 保持。

(4)PCR反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳检测。

结果病毒性角膜炎病变角膜组织样品扩增出与阳性反应管大小相同的I型单纯疱疹病毒特异DNA条带，阴性反应管无扩增。

实施例4：本发明的试剂盒对动物组织病变累及体液样品的检测

利用临床上高度怀疑病毒性眼内炎的房水样品对本发明的试剂盒进行有效性验证，具体方法如下：

取收集的房水样品10000r/min离心10min，吸弃上清，留约20μL样品，吹打均匀；余步骤同实施例3中(2)～(4)，结果显示病毒性眼内炎的房水样品反应管扩增出与阳性反应管大小相同的I型单纯疱疹病毒特异DNA条带，阴性反应管无阳性扩增。

Claims

1.用于检测I型单纯疱疹病毒的引物组，其特征在于，所述的引物组的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.权利要求1所述的引物组用于I型单纯疱疹病毒的检测。

3.一种I型单纯疱疹病毒快速检测试剂盒，包括如下的组份：

1）DNA扩增试剂：

DNA扩增试剂每份含10μL 2×MightyAmp 缓冲液、0.5μL MightyAmp DNA聚合酶；

2）正反向引物组合：

正反向引物组合是针对I型单纯疱疹病毒保守序列设计并合成的正向及反向引物等量混合液；其中正反向引物为权利要求1所述的引物组，其正向引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，反向引物的序列为SEQ IDNO：2；

3）阳性对照核酸：

阳性对照核酸为含有I型单纯疱疹病毒序列的质粒pUC-HSV-1

4）灭菌蒸馏水。

4.权利要求3所述的I型单纯疱疹病毒快速检测试剂盒用于对病毒性角膜炎或眼内炎临床病变样本进行I型单纯疱疹病毒检测。