CN103040799B - 非甾体类抗炎药物在制备预防和治疗糖尿病脑病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非甾体类抗炎药物新的药理作用，即对糖尿病脑病的预防和治疗作用。非甾体类抗炎药物（布洛芬）明显改善糖尿病引起的认知功能损害，显著增加脑内过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的蛋白表达及mRNA水平，显著降低大脑皮质贝塔淀粉样肽前体蛋白β-位裂解酶1（BACE1）活性、蛋白表达及mRNA水平，晚期糖基化终末化产物(AGEs）水平，环加氧酶2（COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达，显著增加血清中超氧化物歧化酶（SOD）还原型谷胱甘肽（GSH）水平等作用。非甾体类抗炎药物可用于糖尿病脑病等糖尿病并发症的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及非甾体类抗炎药物的新用途，特别涉及非甾体类抗炎药物预防和治疗糖尿病脑病药物中的应用。
背景技术
糖尿病脑病（diabetic encephalopathy，DE）是指糖尿病（diabetes mellitus，DM）久病患者渐进发生的以智能减退和大脑神经生理及结构改变为主要特征的精神功能紊乱性疾病，是糖尿病在中枢神经系统中最常见的并发症。在糖尿病状态下，脑的结构改变主要是大脑皮质及皮质萎缩，功能改变主要是认知功能损害，大量的研究报道肯定了糖尿病引起认知功能障碍的事实。在2006年，专门术语糖尿病认知功能障碍（diabetes-associated cognitive decline, DACD）的提出进一步增强了人们对这种功能紊乱的认识，并成为糖尿病脑病研究的焦点。据估计全世界现有约3.47亿成年人罹患糖尿病，其中40%生活在中国和印度。广泛的流行病学调查研究以及基于流行病学调查的前瞻性研究表明：糖尿病是与年龄相关的认知功能下降和痴呆的一个危险因素，相对于非糖尿病患者，认知功能下降的速度在糖尿病患者中增加了1.5-2.0倍；同样地，对于最常见的中枢神经系统退行性疾病阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的发病率，DM患者是非DM患者的1.5-4.0倍。多数研究结果表明，糖尿病脑病是一种大脑加速老化的过程，因而国外学者de la Monte SM研究组提出AD是Ⅲ型DM的观点。因此，糖尿病脑病正在成为本世纪全世界医药界重要的研究课题之一。
某些非甾体类抗炎药物(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)如布洛芬（ibuprofen, IB）、吲哚美辛等，具有解热、镇痛、抗炎和改善血管病变等活性，但未见有关于糖尿病脑病治疗的文献报道。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供非甾体类抗炎药物的新用途。
技术方案
非甾体类抗炎药物在制备预防和治疗糖尿病脑病药物中的应用。所述的非甾体类抗炎药物为布洛芬。
有益效果
以上药理试验结果表明本发明具有以下优点：
（1）本发明发现了非甾体类抗炎药物新的药理作用以及新的医药用途，开拓了一个新的应用领域。
（2）本发明表明布洛芬防治糖尿病脑病药理效果好、作用强，预示着在临床上有良好的应用前景。
（3）在Morris水迷宫试验中，布洛芬可显著降低DM大鼠的逃避潜伏期、增加在平台所在象限停留时间的百分比，说明布洛芬具有明显改善DM大鼠的学习和记忆能力。
（4）本发明表明布洛芬能够减轻DM对海马CA1和CA3区锥体神经元的损伤，表明布洛芬对DM大鼠中枢神经元的凋亡与坏死有一定的抑制作用。
（5）本发明表明布洛芬可显著增加DM大鼠脑内PPARγ的蛋白表达和mRNA水平，说明布洛芬能够激活PPARγ受体，具有促进其信号转导的作用。
（6）本发明表明布洛芬具有显著降低DM大鼠大脑皮质中AGEs水平，说明布洛芬可明显抑制蛋白糖化作用介导的损害。
（7）本发明表明布洛芬具有显著降低DM大鼠大脑皮质中BACE1活性、表达及mRNA水平的作用，提示出布洛芬可明显降低脑内神经细胞毒剂Aβ的生成及其对中枢神经系统的损伤。
（8）布洛芬显著降低DM大鼠大脑皮质中COX-2和iNOS水平，表明布洛芬具有强大的抗炎作用。
（9）布洛芬显著增加血清中SOD活性和GSH水平，表明布洛芬能够增强机体抗氧化系统的功能。
附图说明
图1布洛芬(IB)对DM大鼠大脑切片中PPARγ蛋白表达免疫组织化学（IHC）研究 (×100)。A:正常组（Normal），B:糖尿病模型组（DM），C:布洛芬组（DM+IB）
图2布洛芬(IB)对DM大鼠脑内海马神经元凋亡与坏死的影响。光镜下观察三组大鼠石蜡切片（3 μm）HE染色后海马部位CA1区和CA3区锥体细胞的凋亡与坏死（×400倍）。
具体实施方式
实施例1：布洛芬对DM大鼠认知功能的影响
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SD品系大鼠，8-9周龄，190-220g，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 药品与试剂
布洛芬购自武汉华怡达科技有限公司（纯度>99%），STZ购自美国Sigma-Aldrich公司，葡萄糖测试盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3方法
1.3.1模型建立 雄性SD大鼠禁食不禁水12 h以上，按60 mg/kg一次性腹腔注射STZ（临用前溶于0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液，pH 4.4）进行造模，造模7天后，眶静脉丛取血约0.2 ml，25℃、3000 rpm离心10 min，分离血清。用葡萄糖试剂盒检测非空腹血糖（nFBG），取nFBG值大于300 mg/dl (16.7 mmol/L)的大鼠作为成功的糖尿病大鼠。
1.3.2 分组及给药 将造模成功的糖尿病大鼠按照血糖值随机分为2组，分别为糖尿病模型组（DM）和布洛芬组（DM+IB），每组10只大鼠。另设一组正常对照组（Normal），每组10只大鼠。布洛芬组按40 mg/kg灌胃（按10 ml/kg体积）给予布洛芬（用1% CMC-Na制成混悬液），每天一次，连续8周。Normal组给予同体积蒸馏水，DM组给予同体积1% CMC-Na。每周监测一次体重，调整给药体积，每月监测一次非空腹血糖。
1.3.3指标测定 给药7周后，各组大鼠进行Morris水迷宫测试，观察学习、记忆功能，记录大鼠的逃避潜伏期、平台穿越次数以及在平台所在象限停留时间的百分比。之后，各组大鼠股静脉取血，分离血清，低温保存，备用；即刻处死，取脑，分离海马和皮质，-80℃保存。
1.4 统计学处理 所有结果用mean±SD表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1布洛芬对DM大鼠学习、记忆功能的影响
在Morris水迷宫测试中，与正常组大鼠比较，在4天的训练中DM大鼠的逃避潜伏期（P<0.01）均显著增加，平台穿越次数（P<0.05）以及在平台所在象限的停留时间的百分（P<0.01）比显著减少；在训练的第2、3、4天布洛芬均显著（均P<0.01）降低DM大鼠的逃避潜伏期，结果见表1。布洛芬可显著增加DM大鼠在平台所在象限的停留时间的百分比（P<0.01），对于平台穿越次数，布洛芬表现出明显增加的趋势，结果见表2。
表1布洛芬对DM大鼠学习功能的影响
注：mean±SD，** P<0.01，与Normal组比较；## P<0.01，与DM组比较。
表2布洛芬对DM大鼠记忆功能的影响
注：mean±SD，* P<0.05，** P<0.01，与Normal组比较；## P<0.01与DM组比较。
2.2布洛芬对DM大鼠血糖和体重的影响
在整个实验过程中，DM大鼠的nFBG一直处于高水平状态，显著高于正常大鼠（P<0.01）。DM大鼠给予布洛芬4周及8周后，nFBG仍然处于高水平状态，与未给药DM大鼠比较，无统计学差异，见表3。在整个实验过程中，DM大鼠的体重始终显著低于正常大鼠的体重（P<0.01）；在给药的过程中，布洛芬对DM大鼠的体重均无显著影响，见表4。
表3布洛芬对DM大鼠非空腹血糖的影响
注mean±SD，** P<0.01, 与Normal组比较。
表4布洛芬对DM大鼠体重的影响
注：mean±SD，n=9-10，** P<0.01，与Normal组比较。
实施例2：布洛芬对DM大鼠脑内PPARγ表达和mRNA水平的影响
1 材料与方法
1.1 实验动物 同实施例1。
1.2 药品与试剂 兔抗PPARγ抗体和兔抗GAPDH抗体购自美国Bioworld公司，碱性磷酸酶二抗、苯甲基磺酰氟化物（PMSF）和BCA蛋白质测试盒购自江苏碧云天生物公司，Na3VO4和NaF购自国药集团（上海）化学试剂有限公司，大鼠Ppar-γ和β-actin引物由上海生工生物工程公司合成，TRIzol购自Invitrogen中国公司，cDNA合成试剂盒购自美国ABI公司，无核酶水和2×Master Mix购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA ladder购自Fermentas生物科技公司。
1.3方法
1.3.1 免疫组织化学（IHC）法测定脑内PPARγ的表达
将大鼠左侧大脑半球以包含海马为界、制成2-3 mm厚的组织切片两块，用10%福尔马林溶液固定，做成蜡块，保存。蜡块切成3 μm厚的切片用于的免疫组织化学法测定PPARγ的表达。
1.3.2 Western blotting（WB）法测定大脑皮质中PPARγ的表达
取-80℃保存的大脑皮质组织，提取总蛋白，电泳分离样品，转膜（硝酸纤维素膜），洗膜，封闭，一抗反应，二抗反应，显色，扫描或拍照，Image J软件分析蛋白表达水平的变化。采用GAPDH作为内参。
1.3.3 RT-PCR法测定大脑皮质中PPARγ的mRNA水平
取-80℃保存的大脑皮质组织，提取总RNA，cDNA的合成，PCR扩增，电泳分离样品，溴化乙锭反应，扫描或拍照，Image J软件分析mRNA水平的变化。采用β-actin作为内参。
1.4 统计学处理 同实施例1。
2 结果
2.1布洛芬对DM大鼠脑内PPARγ蛋白表达的影响
2.1.1免疫组织化学结果
DM大鼠大脑切片中PPARγ蛋白的相对表达显著降低，与正常大鼠大脑皮质中的比较有统计学意义（P<0.01）；布洛芬可显著增加DM大鼠大脑皮质中的PPARγ蛋白表达（P<0.01）。代表性图片见附图1，对应的分析结果见表5。
表5布洛芬对DM大鼠脑内PPARγ蛋白表达（IHC法）的影响
| 1. 组别 | 2. n | 3. PPAR-γ相对含量 |
| 4. Normal | 5. 3 | 6. 0.877±0.294 |
| 7. DM | 8. 3 | 9. 0.468±0.179** |
| 10. DM+IB | 11. 3 | 12. 1.124±0.283## |
注：mean±SD，**P<0.01，与Normal组比较；## P<0.01，与DM组比较。
2.1.2 Western blotting 结果
DM大鼠大脑皮质胞浆中PPARγ蛋白的相对表达显著降低，与正常大鼠大脑皮质中的比较有统计学意义（P<0.05）；布洛芬可显著增加DM大鼠大脑皮质中的PPARγ蛋白表达（均P<0.05）。结果见表6。
表6布洛芬对DM大鼠大脑皮质中PPARγ蛋白表达（WB法）的影响
| 13. 组别 | 14. n | 15. PPARγ相对含量（PPARγ/GAPDH） |
| 16. Normal | 17. 4 | 18. 1.216±0.396 |
| 19. DM | 20. 4 | 21. 0.537±0.220* |
| 22. DM+IB | 23. 4 | 24. 1.090±0.345# |
注：mean±SD，* P<0.05，与Normal组比较；# P<0.05，与DM组比较。
2.2布洛芬对DM大鼠脑内PPARγ mRNA水平的影响
DM大鼠大脑皮质中PPARγ mRNA的相对表达显著减少，与正常大鼠大脑皮质中的比较有统计学意义（P<0.01）；布洛芬可显著增加DM大鼠大脑皮质中的PPARγ mRNA水平（P<0.05和P<0.01），结果见表7。
表7布洛芬对DM大鼠大脑皮质中PPARγ mRNA水平的影响
| 25. 组别 | 26. n | 27. PPARγ相对mRNA（PPARγ/β-actin） |
| 28. Normal | 29. 5 | 30. 1.0444±0.1561 |
| 31. DM | 32. 5 | 33. 0.3719±0.0528** |
| 34. DM+IB | 35. 5 | 36. 0.7639±0.0455## |
注：mean±SD，** P<0.01，与Normal组比较；
# P<0.05，##P<0.01，与DM组比较。
实施例3：布洛芬对DM大鼠脑内海马神经元凋亡与坏死的影响
1 材料与方法
1.1 实验动物 同实施例1。
1.2 药品与试剂 常规HE染色试剂由徐州医学院病理学教研室提供。
1.3方法
采用HE染色法光镜下观察DM大鼠脑内海马神经元凋亡与坏死。取保存的蜡块，切成3 μm厚的切片进行常规HE染色。大鼠脑切片的HE染色委托徐州医学院病理学教研室完成。
2 结果
大鼠海马CA1区HE染色结果显示，正常组：观察到整齐排列的3-5层锥体细胞，细胞形态正常，核居中；DM组：锥体细胞数目明显减少，部分细胞核固缩明显、核膜界线不清，多数细胞核内可见染色质浓缩成团、集中分布在核膜的边缘，核仁形态不规则，界线模糊；DM+IB组：锥体细胞数目明显增加，核仁形态较规则、核膜界线较清晰，损伤较DM组明显减轻。
大鼠海马CA3区HE染色结果显示，正常组：约2层锥体细胞，细胞形态正常，核居中；DM组：锥体细胞数目明显减少，少数细胞破裂，部分细胞核固缩明显；DM+IB组：锥体细胞数目明显增加，病变较DM组明显减轻。代表性图片见附图2。
实施例4：布洛芬对DM大鼠大脑皮质中AGEs水平的影响
1 材料与方法
1.1 实验动物 同实施例1。
1.2 药品与试剂Ⅰ型胶原酶购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.3方法
1.3.1 AGEs水平测定
荧光分光光度法检测AGEs水平。将保存的大脑皮质标本，称重后按10倍量（w/v）加入100 mM的PBS（pH7.4）缓冲液，4℃下超声匀浆。匀浆液于4℃下 10000×g离心15 min后，上清液用于总蛋白质含量及其他相关指标测定。取沉淀，以双蒸水洗涤2次，在沉淀中加入氯仿/甲醇(1:1) 1.0 ml，振荡过夜。再加入甲醇/水(4:1) 0.5 ml，4℃下 4000 ×g离心5 min。沉淀以甲醇1.0 ml洗涤2次，双蒸水洗涤2次，再用pH7.5, 0.02 mol/L Hepes缓冲液（含0.1 mol/L CaCl2）洗2次。沉淀于1.0 ml Hepes缓冲液中4℃下过夜。离心去除缓冲液，将颗粒悬浮于1.0 ml含Ⅰ型胶原酶（150 U）的Hepes缓冲液中，加入甲苯和氯仿各2.0 μl。以只含Hepes缓冲液和胶原酶的空白管为标准，37℃振荡24 h，将消化液离心，留取上清液。采用荧光仪器(9203-941，Promega Biosystems Sunnyvale, Inc., CA, USA)检测上清液中的荧光强度（反映AGEs的含量）。AGEs的含量以U/mg大脑皮质蛋白表示。
1.4 统计学处理 同实施例1。
2 结果
2.1布洛芬对DM大鼠大脑皮质中AGEs含量的影响
DM大鼠大脑皮质中AGEs含量显著增加，与正常大鼠大脑皮质中的比较有统计学意义（P<0.01）；布洛芬可显著降低DM大鼠大脑皮质中的AGEs含量（P<0.01）。结果见表8。
表8布洛芬对DM大鼠大脑皮质中AGEs含量的影响
| 37. 组别 | 38. n | 39. AGEs含量（U/mg protein） |
| 40. Normal | 41. 7 | 42. 8.8±0.8 |
| 43. DM | 44. 7 | 45. 10.3±0.5** |
| 46. DM+IB | 47. 7 | 48. 9.2±0.6# |
注：mean±SD，** P<0.01，与Normal组比较；# P<0.05，与DM组比较。
实施例5：布洛芬对DM大鼠大脑皮质中BACE1活性、蛋白表达及mRNA水平的影响
1 材料与方法
1.1 实验动物 同实施例1。
1.2 药品与试剂 兔抗BACE1抗体购自英国abcam公司，兔抗GAPDH抗体购自美国Bioworld公司，BACE1的人工合成的荧光底物（货号ES004）购自美国R&D System公司。大鼠Bace1和β-actin引物由上海生工生物工程公司合成，TRIzol购自Invitrogen中国公司，cDNA合成试剂盒购自美国ABI公司，无核酶水和2×Master Mix购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA ladder购自Fermentas生物科技公司。
1.3方法
1.3.1 BACE1活性测定
荧光分光光度法测定BACE1活性。在测定AGEs水平时制备的大脑皮质匀浆液，离心所得的上清作为BACE1活性测定的样本。BCA法测定总蛋白浓度后，在荧光底物终浓度为10 μM的100 μl反应体系中加入50-70 μg蛋白，在37℃反应10 min，加入20 μl二甲基亚砜（DMSO）终止反应，采用荧光仪器(9203-941，Promega Biosystems Sunnyvale, Inc., CA, USA)测定反应体系的荧光强度（FSU），反映BACE1活性。BACE1活性的大小表示为正常组产物生成量的百分比。
1.3.2 BACE1蛋白表达测定
Western blotting法测定BACE1蛋白表达。取分装保存的大脑皮质组织浆液（曾用于PPARγ表达测定），电泳分离样品，转膜（硝酸纤维素膜），洗膜，封闭，一抗反应，二抗反应，显色，扫描或拍照，Image J软件分析 蛋白表达水平的变化。采用GAPDH作为内参。
1.3.3 BACE1 mRNA水平测定
RT-PCR法测定大脑皮质中BACE1的mRNA水平。样本与方法与PPARγ mRNA水平测定相同。采用β-actin作为内参。
1.4 统计学处理 同实施例1。
2 结果
2.1布洛芬对DM大鼠大脑皮质中BACE1活性的影响
DM大鼠大脑皮质中BACE1活性显著增加，为正常大鼠大脑皮质的129%，两组间比较有统计学意义（P<0.05）；布洛芬可显著降低DM大鼠大脑皮质中BACE1活性（P<0.05），结果见表9。
表9 布洛芬对DM大鼠大脑皮质中BACE1活性的影响
| 49. 组别 | 50. n | 51. BACE1活性（%） |
| 52. Normal | 53. 7 | 54. 100±9 |
| 55. DM | 56. 7 | 57. 129±22* |
| 58. DM+IB | 59. 7 | 60. 99±15# |
注：mean±SD，* P<0.05，与Normal组比较；#P<0.05，与DM组比较。
2.2布洛芬对DM大鼠大脑皮质中BACE1蛋白表达的影响
DM大鼠大脑皮质中BACE1蛋白的相对表达显著增加，与正常大鼠大脑皮质中的比较有统计学意义（P<0.01）；布洛芬可显著降低DM大鼠大脑皮质中的BACE1蛋白表达（P<0.01），结果见表10。
表10 布洛芬对DM大鼠大脑皮质中BACE1表达的影响
| 61. 组别 | 62. n | 63. BACE1相对含量（BACE1/GAPDH） |
| 64. Normal | 65. 4 | 66. 0.520±0.186 |
| 67. DM | 68. 4 | 69. 0.862±0.224** |
| 70. DM+IB | 71. 4 | 72. 0.444±0.126## |
注：mean±SD，** P<0.01，与Normal组比较；# P<0.05，## P<0.01，与DM组比较。
2.3布洛芬对DM大鼠大脑皮质中BACE1 mRNA水平的影响
DM大鼠大脑皮质中BACE1 mRNA的相对表达显著增加，与正常大鼠大脑皮质中的比较有统计学意义（P<0.05）；布洛芬可显著降低DM大鼠大脑皮质中的BACE1 mRNA水平（P<0.05），结果见表11。
表11布洛芬对DM大鼠大脑皮质中BACE1 mRNA水平的影响
| 73. 组别 | 74. n | 75. BACE1 mRNA相对含量（BACE1/β-actin） |
| 76. Normal | 77. 5 | 78. 0.4840±0.2381 |
| 79. DM | 80. 5 | 81. 0.7769±0.2296* |
| 82. DM+IB | 83. 5 | 84. 0.5276±0.1663# |
注：mean±SD，* P<0.05，与Normal组比较；# P<0.05，与DM组比较。
实施例6：布洛芬对DM大鼠大脑皮质中COX-2和iNOS表达的影响
1 材料与方法
1.1 实验动物 同实施例1。
1.2 药品与试剂 兔抗COX-2抗体购自美国Bioworld公司，兔抗iNOS抗体购自英国abcam公司。
1.3 方法
Western blotting法测定COX-2和iNOS蛋白表达。取分装保存的大脑皮质组织浆液（曾用于PPARγ表达测定），电泳分离样品，转膜（硝酸纤维素膜），洗膜，封闭，一抗反应，二抗反应，显色，扫描或拍照，Image J软件分析蛋白表达水平的变化。采用GAPDH作为内参。
1.4 统计学处理 同实施例1。
2 结果
DM大鼠大脑皮质中COX-2和iNOS的相对表达显著增加，与正常大鼠的比较均有统计学意义（均P<0.01）；布洛芬可显著降低DM大鼠大脑皮质中的COX-2（均P<0.01）和iNOS（均P<0.05）的相对表达，结果见表12。
表12布洛芬对DM大鼠大脑皮质中COX-2和iNOS表达的影响
| 85. 组别 | 86. n | 87. COX-2相对含量（COX-2/GAPDH） | 88. iNOS相对含量（iNOS/GAPDH） |
| 89. Normal | 90. 4 | 91. 0.494±0.102 | 92. 0.374±0.151 |
| 93. DM | 94. 4 | 95. 0.876±0.194** | 96. 0.655±0.259** |
| 97. DM+IB | 98. 4 | 99. 0.538±0.073## | 100. 0.473±0.141# |
注：mean±SD，** P<0.01，与Normal组比较；# P<0.05，## P<0.01，与DM组比较。
实施例7：布洛芬对DM大鼠血清中SOD活性和GSH水平的影响
1 材料与方法
1.1 实验动物 同实施例1。
1.2 药品与试剂 SOD和GSH试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3 方法
分光光度法测定SOD 活性和GSH水平。取保存的血清样本，测定SOD活性和GSH水平，严格按照各自试剂盒的操作步骤进行。
1.4 统计学处理 同实施例1。
2 结果
DM大鼠血清中SOD活性和GSH水平显著降低，与正常大鼠血清中的比较均有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；布洛芬可显著增强DM大鼠血清中的SOD活性（均P<0.01），显著增加DM大鼠血清中的GSH水平（均P< 0.01），结果见表13。
表13 布洛芬对DM大鼠血清中SOD活性和GSH水平的影响
| 101. 组别 | 102. n | 103. SOD（U） | 104. GSH（μmol/L） |
| 105. Normal | 106. 10 | 107. 315±18 | 108. 5.46±1.31 |
| 109. DM | 110. 9 | 111. 204±14** | 112. 3.86±0.87* |
| 113. DM+IB | 114. 9 | 115. 290±19## | 116. 5.44±0.84## |
注：mean±SD，* P<0.05，** P<0.01，与Normal组比较；## P<0.01，与DM组比较。
Claims (1)
1.非甾体类抗炎药物在制备预防和治疗糖尿病脑病药物中的应用，其特征在于所述的非甾体类抗炎药物为布洛芬。
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