CN103038366A - 用于核酸合成和扩增的组合物、方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于合成核酸分子的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用以在单步骤RT-PCR法中扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒，其包括用于增强对PCR抑制剂的耐受性的一种或多种试剂。
Description
相关申请的交叉参考:
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年6月21日提交的美国临时专利申请号61/357,021和2011年3月25日提交的美国临时专利申请号61/467,852的优先权的利益，将所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
领域:
本公开内容涉及用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用于在单步RT-PCR法中扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒，其包括一种或多种用于增强对PCR抑制剂的耐受性的试剂。
背景:
核酸的检测、分析、转录和扩增是现代分子生物学中最重要的方法中的一些方法。此类方法用于核酸分析的应用在基因表达的研究、感染性试剂或遗传疾病的诊断、cDNA的产生和逆转录病毒的分析等等应用中特别重要。逆转录RNA，随后通过聚合酶链式反应(PCR)进行cDNA扩增，通常称为RT-PCR或RNA-PCR，已被广泛用于检测和定量核酸靶并且对于病毒基因分析特别重要。
致癌病毒及其在癌症的病理发生中的作用的研究可在癌症的诊断和治疗中具有重要意义。然而，致癌病毒的检测中的可变性可使这些研究成为挑战性的。检测法的灵敏性和特异性是关键问题。早期检测可通过使用分子生物学技术检测还未经历血清转换的样品中的致癌病毒核酸来实现，此类技术适用于不能在组织培养中繁殖的病毒。常规地，免疫检测法已被用于检测致癌病毒的存在，但此类方法具有几个缺点。在人乳头瘤病毒(HPV)(其可引起宫颈癌)的情况下，检测因早期病毒蛋白质的低表达和可区分HPV类型的的灵敏且特异的高质量抗体的缺乏而十分困难(Villa and Denny,International Journal of Gynecology andObstetrics,94(Suppl.1):S71-S80(2006))。当样品因可以在样品收集之前已发生数目或数年的感染(如在爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的情况下)而显示残余的抗体水平时，结果还可引起误导或不能得出结论，所述爱泼斯坦-巴尔病毒与何杰金淋巴瘤及其它癌相关(国家传染病中心(NationalCenter for Infectious Diseases)。“爱泼斯坦-巴尔病毒和传染性单核细胞增多症”，CDC.http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/ebv.htm(2010年11月))。病毒核酸的基于PCR的检测不仅因序列特异性引物结合而具有高度特异性的有利方面，而且其还因为其扩增更短的核酸片段的能力而比其它杂交技术例如Northern和Southern印迹那样麻烦比它们更灵敏。序列特异性探针结合给实时PCR添加了额外层的特异性并且具有提供病毒载量信息的额外有利方面。
RT-PCR通常包括两个单独的分子合成：(i)cDNA从RNA模板的合成；和(ii)新合成的cDNA通过PCR扩增的复制。可使用两种或更多种酶，通过单步(或偶联)RT-PCR法进行RT-PCR，其中将至少两种单独的酶(例如，逆转录酶和聚合酶)分别用于初始cDNA合成和随后的扩增。
在单步RT-PCR中，将逆转录和PCR扩增组合至单个反应混合物中，这提供了优于两步骤RT-PCR(其中使用两个不同的或单独的反应进行合成和扩增步骤)的众多有利方面。单步骤RT-PCR需要比二步骤RT-PCR更少的对于反应混合物和核酸产物的操作(例如，两个反应步骤之间为了添加组分或酶而进行的反应管的打开)，从而是劳动密集度较低并且耗时较少的方法。必要时，单步骤RT-PCR还允许使用更少的样品，以及减小污染的风险(Sellner和Turbett,Biotechniques25:234-238(1998))。
然而，单步骤RT-PCR法的使用具有一些缺点。例如，逆转录酶对DNA聚合酶的比率的个体优化对于用于单步骤RT-PCR的即可使用的组合物或试剂盒通常是不可行的。几篇报道也已证明当在单管RT-PCR反应中组合使用时逆转录酶与DNA聚合酶之间的干扰导致低灵敏性或结果的缺乏(Sellner,L.N.,等人,Nucl. Acids Res.20:1487-1490(1992))。
此外，从其提取病毒核酸的样品通常包含抑制PCR的额外化合物。土壤和粪便中的腐殖酸、血液中的血色素、血清中的免疫球蛋白G以及各种血液抗凝剂如肝素和柠檬酸盐全都是此类抑制剂的实例。此类抑制剂在核酸提取和纯化过程中不可能被完全去除，从而负面影响下游PCR扩增，如通过当利用实时PCR测定时Ct(即，循环阈值)的增加和dRn(即，标准化报道分子信号的差异)的减小所反映的。
与低dRn偶联的高Ct通常表示定量PCR(qPCR)和逆转录酶-qPCR(RT-qPCR)应用中的反应中的低靶核酸浓度。显示减小的扩增或无扩增的反应表示靶核酸不存在或以少至不可被检测的量存在。包含可检测量的靶但因PCR抑制剂的存在而被抑制的反应可显示假的高Ct和低dRn，这可导致用户相信靶核酸的量少于实际存在的量。如果抑制的水平足够严重，则反应可能不能完全扩增，从而导致假阴性结果。
由于核酸合成应用对分子生物学和细胞生物学领域的重要性，因此以一般化的即可使用的组合物的形式存在的显示高灵敏性的、不受样品的量限制、减少医生操作的量、使污染的风险降至最低、使试剂的费用减少至最少、以及使核酸终产物的量最大化的单步骤RT-PCR系统，是本领域所需要的。此外，减少或消除PCR抑制剂的负面影响的方法，特别地当分析其中样品来源通常包含此类抑制剂的病毒靶时，是确保准确结果所必需的。
概述:
本发明总地说来涉及用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用于在单步骤RT-PCR法中使用与一种或多种DNA聚合酶例如来自水生栖热菌(Thermophilus aquaticus)(Taq)的DNA聚合酶组合的一种或多种逆转录酶例如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶的扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒。优选地，所述组合物还包含一种或多种用于增强对通常在从其提取核酸，特别地病毒核酸的样品(例如,粪便、血液、土壤等)中发现的多种化合物的耐受性(即，阻断或减缓PCR抑制)的试剂。此类PCR抑制剂阻断剂可包括例如牛血清白蛋白(BSA)和鱼胶(fish gelatin)。本教导从而有利于核酸分子的快速和高效的扩增和靶序列的检测和定量(这可用于多种工业、医学、法医和诊断目的)。本文中公开的实施方案对于病毒基因包括RNA和DNA靶的快速扩增和检测是特别有用的。
具体地，本教导涉及包含至少一种活性DNA聚合酶和至少一种活性逆转录酶(RT)的组合物。在一些实施方案中，此类组合物还包含至少一种PCR抑制剂阻断剂,其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂(如果存在的话)的耐受性。
在一些实施方案中，本发明的逆转录酶为逆转录酶。在一些优选实施方案中，逆转录酶是热稳定性的。例如，热稳定性逆转录酶可以是M-MLV逆转录酶、其突变体、变体或衍生物。在一些实施方案中，M-MLV RT可包含一个或多个突变。此类突变可包括例如：Y64、R116、D124、H126、Y133、K152、Q190、T197、H204、V223、M289、T306或F309。在一些实施方案中，逆转录酶的浓度为约0.5U/μL至约5U/μL。
在一些实施方案中，本发明的聚合酶为DNA聚合酶。在一些优选实施方案中，DNA聚合酶为热稳定性DNA聚合酶。例如，热稳定性DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶、其突变体、变体或衍生物。在一些实施方案中，DNA聚合酶的浓度为约0.005U/μL至约0.5U/μL。
在一些实施方案中，本发明组合物的PCR抑制剂阻断剂为蛋白质、多肽或其肽衍生物。在一些优选实施方案中，PCR抑制剂阻断剂可以是明胶、白蛋白或其组合。这些可以包括例如鱼胶或牛血清白蛋白(BSA)。在一些更优选实施方案中，本发明组合物可包含至少鱼胶和BSA。在一些实施方案中，本发明组合物中BSA的浓度可以为约500ng/μL至约5000ng/μL。在其它实施方案中，本发明组合物中鱼胶的终浓度可以为约0.4%至约4%。
在一些实施方案中，PCR抑制剂，如果存在于组合物中，可以是血色素、腐殖酸、肝素、EDTA、柠檬酸钠或免疫球蛋白G(IgG)。
在一些实施方案中，本发明组合物在-20°C可以是液体或凝胶。在其它实施方案中，组合物在约-20°C可以不是固体。在其它实施方案中，组合物在约-20°C可以不冻结。在一些优选实施方案中，组合物在使用前不需要解冻。
在一些实施方案中，本发明组合物还可包含一种或多种核苷酸(dNTP)。此类核苷酸可以是例如dTTP、dATP、dCTP、dGTP或dUTP。在一些实施方案中，组合物中每一种核苷酸的浓度为约0.5mM至约5mM。
在一些实施方案中，本发明组合物还可包含甘油。在一些实施方案中，甘油的浓度为约5%至约50%。
在本发明组合物的一些实施方案中，组合物还可包含RNA酶抑制蛋白(RIP)。在一些实施方案中，RIP的浓度为约0.1U/μL至约1.0U/μL。
在一些实施方案中，本发明组合物还可包含一种或多种去垢剂。在一些实施方案中，一种或多种去垢剂的浓度为约0.005%至约0.05%。在一些实施方案中，一种或多种去垢剂可以是阳离子、两性离子、阴离子或非离子型的。在一些实施方案中，非离子型去后剂可以是例如Nonidet P-40(NP-40)去垢剂或TWEEN20去垢剂。
在一些实施方案中，本发明组合物还可包含一种或多种被动参考对照(passive reference control)。在一些实施方案中，一种或多种被动参考对照可以是例如ROX染料。
在一些实施方案中，可将本发明组合物配制为浓缩原液。在一些实施方案中，此类浓缩原液可以为约2X至约6X原液。在一些实施方案中，此类原液可被稀释用于随后用于例如核酸合成法中。在一些优选实施方案中，可将组合物配制为至少4X原液。
本教导还涉及用于进行核酸样品的RT-PCR的方法。在一些实施方案中，本方法可包括步骤：(i)将包含至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶或至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物与：(a)核酸样品;(b)一种或多种标记的探针；和(c)一种或多种引物混合,其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂(当存在时)的耐受性；和(ii)对所述核酸样品进行RT-PCR。
在本发明方法的一些实施方案中，可从来源例如血液、汗、眼泪、土壤、唾液、尿或粪便提取核酸样品。
在本发明方法的一些实施方案中，可在单个容器(例如，管、室、孔)或单个反应混合物中进行RT-PCR。
在本发明方法的一些实施方案中，将包含至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶和至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物与(a)核酸样品;(b)一种或多种标记的探针；或(c)一种或多种引物混合。在本发明方法的一些实施方案中，一种或多种标记的探针可以是
探针。在本发明方法的一些实施方案中，在与(a)、(b)或(c)混合之前不解冻组合物。
在本发明方法的一些实施方案中，包含至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物的使用可增强对多种PCR抑制剂(如果存在的话)的耐受性(在本文中称为“抑制剂耐受性”)。在一些实施方案中，抑制剂耐受性的增强可由Ct的减少来表示。在一些本发明方法的优选实施方案中，当与使用不包含任何PCR抑制剂阻断剂的组合物的方法相比较时，Ct减少至少约10%。在一些实施方案中，Ct可减少至少1。在一些实施方案中，包含至少500ng/μL BSA的组合物的使用对于包含至少40μM血色素的反应可使Ct减少至少8，或对于包含至少10ng/μL腐殖酸的反应可使Ct减小至少7。在其它实施方案中，包含至少1%鱼胶的组合物的使用对于包含至少10ng/μL腐殖酸的反应可使Ct减小至少3，或对于包含至少0.06U肝素的反应可使Ct减小至少6。
在另一个方面，本教导涉及用于扩增核酸分子的方法。在一些实施方案中，用于扩增的方法可包括步骤：(i)将核酸模板与包含一种或多种逆转录酶、一种或多种DNA聚合酶和一种或多种PCR抑制剂阻断剂的组合物混合，以形成反应混合物；和(ii)在足以扩增与所述核酸模板的全部或部分互补的核酸分子的条件下温育反应混合物。在一些实施方案中，核酸模板可以是RNA或DNA。
在本发明方法的一些实施方案中，可利用PCR进行核酸扩增。在一些实施方案中，PCR可以是qPCR。在其它实施方案中，可利用实时PCR进行qPCR。在其它实施方案中，PCR可以是终点PCR。在一些其它实施方案中，PCR可以是多重PCR。在其它实施方案中，PCR可包括热循环。在一些实施方案中，可优化热循环以进行快速热循环。
在另一个方面，本教导涉及用于核酸合成的方法。在一些实施方案中，用于核酸合成的方法可包括：(i)将一种或多种第一核酸分子与一种或多种逆转录酶、一种或多种聚合酶以及一种或多种PCR抑制剂阻断剂混合；和(ii)在足以产生与一种或多种第一核酸分子的全部或部分互补的一种或多种第二核酸分子的条件下温育混合物。在一些实施方案中，第一核酸分子为RNA分子。在一些实施方案中，第一和第二核酸分子为DNA分子。在其它实施方案中，第一或第二核酸分子为DNA分子。在一些实施方案中，用于核酸合成的方法还可包括在足以产生与一种或多种第一核酸分子的全部或部分互补的一种或多种第二核酸分子的条件下温育一种或多种第一核酸分子。
本发明还涉及反应混合物，其包含：(a)至少一种逆转录酶;(b)至少一种聚合酶;(c)至少一种PCR抑制剂阻断剂;和(d)至少一种引物。在一些实施方案中，反应混合物还可包含核酸模板(例如RNA或DNA)。在其它实施方案中，反应混合物还可包含标记的探针(例如,
探针)。
本发明还涉及试剂盒，所述试剂盒在例如单个容器中包括具有至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶和至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物。在一些实施方案中，可将组合物装在单个管或容器中。在其它实施方案中，组合物在-20°C可以是液体或凝胶(例如非固体或未冻结)。
在本发明试剂盒的一些实施方案中，可将组合物配制为4X原液。在试剂盒的一些优选实施方案中，组合物可用于RT-PCR法、核酸合成法或核酸扩增(例如,PCR)法。在一些实施方案中，PCR或RT-PCR法可包括多重(multiplexing)。
应理解上述一般描述和下列详细描述是示例性的并且仅为示例性的，并且不限制所要求保护的本发明。
附图概述:
包括在本说明书中以及构成本说明书的部分的附图举例说明了本公开内容的几个示例性实施方案并且与说明书一起用于解释某些教导。本领域技术人员将理解，所述附图仅用于举例说明目的。附图无意以任何方式限定本发明的范围。
图1描述鱼胶在增强对肝素和腐殖酸抑制的抑制剂耐受性中是有效的。使用的鱼胶的浓度越高，反应对肝素和腐殖酸抑制越耐受(即，更低的Ct)。
图2描述BSA在减轻腐殖酸和血色素抑制中是有效的。在2000ng/μl BSA时，由血色素和腐殖酸导致的抑制被完全消除，如通过与阴性(水)对照相当的Ct值所反映的。
图3描述dRn随BSA的量的不断增加而减小。令人惊讶地，对照反应的dRn值也随不断增加的BSA浓度而减小。
图4描述基线信号随BSA的量的不断增加而增强。
图5描述鱼胶在减轻腐殖酸和肝素抑制(在测试的抑制剂浓度)中是有效的，如通过更低的Ct值显示的。
图6描述dRn随着鱼胶的量的不断增加而逐渐减小。令人惊讶地，对照反应的dRn值也随不断增加的鱼胶浓度而减小。
图7描述更低浓度的鱼胶和BSA的使用(当一起使用时)，与以更高的浓度单独使用鱼胶或BSA的反应相比较，获得相当的或更好的抑制剂耐受性水平。以非限定性实例为例，0.8%鱼胶和500ng/μl的BSA的组合比仅使用0.8%的单独的鱼胶(对于腐殖酸抑制)或500ng/μL的单独的BSA(对于血色素和腐殖酸抑制)更有效。通过使用更少的每一种PCR抑制剂，当组合时，使dRn的减小和基线信号的偏移最小化。
图8描述鱼胶和BSA，特别地当组合时，在减轻各种抑制剂的抑制包括血色素、肝素、腐殖酸、EDTA、柠檬酸钠和免疫球蛋白G抑制中是有效的。
图9描述溴化乙锭染色的凝胶的照片，该凝胶显示包含鱼胶和BSA的制剂也可在基于PCR应用中用于增强对各种PCR抑制剂的耐受性。
图10描述单步骤RT-PCR预混合物(即，在单个反应中包含逆转录酶和DNA聚合酶的组合物)当用于扩增DNA或RNA核酸模板时提供相当的测定灵敏性。
图11描述单步骤RT-PCR预混合物(即，在单个反应中包含逆转录酶和DNA聚合酶)可用于多重扩增测定。
图12描述常用PCR抑制剂对腺病毒扩增的作用。
图13描述常用PCR抑制剂对RNA内部阳性对照(IPC)扩增测定的作用。
图14描述预混合物在利用IPC进行的腺病毒的双重扩增中的多重可行性。
详细描述:
概述
本发明涉及用于核酸的产生或分析的组合物、方法和试剂盒。具体地，本教导提供了几个与用于产生或扩增核酸(利用例如RT-PCR)的已知组合物或方法相比较有利的方面。此类有利方面包括但不限于:
a)提供了真正的“单管/单步”RT-PCR法(相对于具有从RNA模板合成DNA和随后扩增DNA的两个单独的反应)，该法消除了预混合步骤或额外的等分步骤，因为逆转录酶和DNA聚合酶被一起包含在预混合物中，用户不必在进行RT-PCR之前将逆转录酶添加至预混合物;
b)提供了用于核酸合成(例如RT-PCR)的组合物，该组合物在-20°C以液体或凝胶(即，非固体)的形式存在，其消除了反复使用的与多个冻融循环相关的问题;
c)提供更浓缩的组合物以用于核酸合成(例如RT-PCR)，如果或当样品模板浓度较低(这对于病毒靶或法医分析来说是常见的情况)时这允许更大体积的样品输入;
d)提供了用于核酸合析(例如RT-PCR)的组合物，所述组合物具有增加的对各种PCR抑制剂的耐受性;
e)提供了用于核酸合成(例如RT-PCR)的组合物，所述组合物提供了最大特异性和灵敏性;
f)提供了可与用于更快读出的快速热循环方案一起使用的核酸合成(例如RT-PCR)组合物和方法;
e)提供了核酸合成(例如RT-PCR)组合物和方法，所述组合物和方法允许进行多重反应(例如，在单个反应中几乎同时使用单种样品(例如，一种样品上的两个靶)或多种样品(例如，两种不同样品上的两个靶)扩增多个靶)的能力;和
f)提供多重核酸合成(例如,RT-PCR)组合物和方法，所述组合物和方法允许在单个反应中进行核酸(例如，致癌病毒核酸)的类型鉴定和定量，从而减少使用的样品的量以及减少获得结果所花费的成本和时间量。
组合物
本教导提供了包含多种以不同组合存在的组分的组合物。此类组分包括一种或多种具有逆转录酶活性的酶，一种或多种DNA聚合酶或一种或多种PCR抑制剂阻断剂例如牛血清白蛋白(BSA)或鱼胶。其它组分还可包括例如一种或多种引物、一种或多种脱氧核糖核苷三磷酸、RNA酶抑制蛋白(RIP)、表面活性剂或去垢剂(例如，TWEEN20、NP-40或CHAPS)或尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)以及适当的PCR缓冲剂组分，包括但不限于DMSO、甘油和Mg2+。
可将此类组合物配制为浓缩原液(例如，2X,3X,4X,6X,10X等)或工作溶液(例如,1X)。在一些实施方案中，使组合物成为浓缩(例如,4X)原液允许添加更大量的核酸样品(例如，当组合物用于核酸合成时)。此类组合物可在本发明方法中用于使用单步(或偶联)RT-PCR法产生、分析、定量和另外地操纵核酸分子。
在一些实施方案中，可将本教导的组合物配制为预混合物(mastermix)。预混合物提高效率并且减少与高通量分析所需的大量反应的装配相关的错误。在一些实施方案中，预混合物可包含所有反应的共同试剂的组合。例如，预混合物可包含缓冲剂、盐例如MgCl2、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、标记的探针或染料、逆转录酶、热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂。每一个反应则可包含共同预混合物和特定靶核酸及引物对的等份。可制备预混合物，随后以浓缩液的形式分配。当装配终反应时则可稀释预混合物。
在一些实施方案中，可将本发明组合物包装在能够保持组合物并且不与组合物的组分显著相互作用的适当的储器或容器中。储器或容器可被设计来允许由个人或通过液体操作仪容易地分配剂型。还可将此类组合物的储器或容器包装至多包(multi-pack)单元中。
逆转录酶
本教导的组合物包含具有逆转录酶活性的多肽(即,逆转录酶)。在一些优选实施方案中，具有逆转录酶活性的多肽是热稳定性的。如本文中所用，术语"热稳定性的”是指具有热稳定性或耐热性的酶。为了本公开内容的目的，具有逆转录酶活性的热稳定性多肽还可被定义为这样的具有逆转录酶活性的多肽，所述多肽在热处理后保持比在相同的处理后具有野生型热稳定性的具有逆转录酶活性的多肽保持的活性更大的百分比的其活性。
根据一些实施方案，具有逆转录酶活性的酶可以是例如逆转录病毒逆转录酶例如M-MLV逆转录酶、劳斯肉瘤病毒(RSV)逆转录酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶、禽成髓细胞瘤病毒(Avian MyeloblastosisVirus)(AMV)逆转录酶、劳斯伴随病毒(RAV)逆转录酶、禽白血病病毒(MAV)逆转录酶、禽类肉瘤-白细胞增生病毒(Avian Sarcoma LeukosisVirus)(ASLV)逆转录酶以及慢病毒逆转录酶，或其具有逆转录酶活性的相应的突变体、变体或衍生物。如本文中所用，“突变体、变体或衍生物”是指化学种类的可存在或可被产生的所有变换，其仍然保留该化学种类的确定的化学活性。一些优选实施方案包括为RNA酶H+酶的酶，例如RNA酶H+M-MLV或RNA酶H+AMV逆转录酶。或者，本发明组合物中使用的逆转录酶可具有减小的，显著减小的或消除的RNA酶H活性(参见，例如，美国专利号7,078,208，将其公开内容通过引用整体并入本文)。RNA酶H为特异于RNA-DNA杂合体的RNA链的连续性5’和3’核糖核酸酶(Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,New York:Wiley&Sons,pp。23-24(1984))。RNA酶H活性可通过许多测定例如在例如美国专利号5,244,797中，在Kotewicz,等人，Nucl.Acids Res.16:265-277(1988)中和Gerard,等人,FOCUS(LifeTechnologies)14:91-93(1992)(将所述专利和文献的公开内容通过引用整体并入本文)中描述的那些测定来进行测定。
可按照本教导使用其它具有逆转录酶活性的酶，例如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)逆转录酶，其在Mn2+存在的情况下具有逆转录酶活性并且在Mg2+存在的情况下具有DNA聚合酶活性(Myers和Gelfand,Biochemistry30:7661-7666(1991),将其公开内容通过引用整体并入本文)。用于分离或纯化逆转录酶的方法已于例如美国专利号4,943,531和5,017,492(将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中进行了描述。此类酶还可商购获得(例如，可从Life Technologies,Carlsbad,CA获得的SUPERSCRIPT IITM、SUPERSCRIPT IIITM和ArrayScript)。应理解在不背离其范围或优选实施方案的情况下，多种逆转录酶可用于本教导，包括上文中未明确公开的逆转录酶。
根据本教导，可对逆转录酶产生任意数目的突变，在优选实施方案中，可产生多个导致增强的逆转录酶稳定性或功能性的突变。本文中使用的酶还可包括其中末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性已被减小，显著减小或消除的酶。显示此类增强的或减弱的功能性的逆转录酶描述于例如美国专利号7,056,716和7,078,208(将所专利的公开内容通过引用整体并入本文)中。在一些实施方案中，此类突变的逆转录酶可包括在等同于或相应于M-MLV逆转录酶的Y64,R116,D124,H126,Y133,K152,Q190,T197,H204,V223,M289,T306或F309的氨基酸位置上具有一个或多个改变的逆转录酶。此类突变可包括点突变、移框突变、缺失和插入，一个或多个(例如，1、2、3、4、5、10、12、15、20、30个等)点突变是优选的。
可使用本领域技术人员已知的任何方法将突变引入本教导的逆转录酶。在一个实施方案中，突变型或修饰的逆转录酶可通过重组技术来产生。许多克隆的逆转录酶基因是可获得的，或可使用标准重组技术(参见，例如，美国专利号5,668,005和PCT公布号WO98/47912)来获得。例如，寡核苷酸定点诱变可用于产生突变型聚合酶，所述聚合酶允许在沿着编码DNA分子的任何确定的位置上产生所有可能种类的碱基对改变。或者，还可通过例如在锰作为二价金属离子辅因子存在的情况下进行PCR反应来随机引入突变。
可将具有逆转录酶活性的多肽添加至本发明组合物中以在工作溶液中产生约0.001U/μL至约500U/μL、约0.005U/μL至约100U/μL、约0.01U/μL至约50U/μL、约0.05U/μL至约20U/μL、约0.1U/μL至约10U/μL、约0.2U/μL至约5U/μL的终浓度，或优选约0.2U/μL、约0.4U/μL、约0.8U/μL、约1.0U/μL、约1.2U/μL、约1.4U/μL、约1.8U/μL、约2U/μL、约3U/μL、约4U/μL或约5U/μL的终浓度。
聚合酶
本教导的组合物还可包含一种或多种聚合酶。此类聚合酶可以是能够复制DNA分子的任何酶。优选，DNA聚合酶是热稳定性DNA聚合酶。热稳定DNA聚合酶，如本文中所用，当经历升高的温度、持续实现单链核酸的去稳定作用或在PCR扩增过程中实现双链核酸的变性所必需的时间时，不被不可逆地灭活。酶的不可逆变性是指大体上失去了酶活性。优选地，热稳定性DNA聚合酶在例如进行PCR扩增通常所需要的条件下在约90°-100°C下将不会发生不可逆变性。
根据本教导的DNA聚合酶可利用本领域公知的技术从天然或重组来源分离(参见，例如,PCT公开号WO92/06200;WO96/10640;美国专利No.5,455,170;5,912,155和5,466,591，其公开内容通过引用整体并入本文),从商购可得的多种嗜热菌(例如，来自美国典型培养物保藏中心,Rockville,Md.)或可利用重组DNA技术(参见，例如，PCT公开号WO96/10640和美国专利号5,912,155)获得。适合用作用于在重组系统中表达的热稳定性聚合酶或其基因的来源是例如嗜热菌(Thermusthermophilus)、热球菌(Thermococcus litoralis)、火球菌(Pyrococcusfuriosus),焦球菌(Pyrococcus woosii)和焦球菌属的其它种类，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus sterothermophilus)、嗜热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(Thermus ruber)、Thermus brockianus、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)和栖热袍菌属的其它种类，以及嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)及其突变体、变体或衍生物。然而，应理解在不背离其范围或优选实施方案的情况下也可在本文中使用来自其它生物的DNA聚合酶。作为分离的替代方式，可以从例如LifeTechnologies(Carlsbad,CA)、New England BioLabs(Beverly,MA)、Finnzymes Oy(Espoo,Finland)、Stratagene(La Jolla,CA)、BoehringerMannheim Biochemicals(Indianapolis,IN)和Perkin ElmerCetus(Norwalk CT)商购获得DNA聚合酶。
用于本发明组合物和方法中的特别优选的热稳定性DNA聚合酶包括但不限于Taq、Tne、Tma、Tfi/VENT、DEEPVENT、Pfu、Pwo、Tfi或Tth DNA聚合酶或其具有DNA聚合酶的活性的突变体、变体或衍生物。Taq DNA聚合酶及其突变形式可以例如从LifeTechnologies(Carlsbad,CA)商购获得，或可从其天然来源嗜热菌嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离而来，如先前所描述的(参见，例如，美国专利号4,889,818和4,965,188，将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)。Tne DNA聚合酶可从其天然来源嗜热菌新阿波罗栖热袍菌(参见,例如,PCT公开号WO96/10640和美国专利号5,912,155)分离而来，Tma DNA聚合酶可从其天然来源嗜热菌海栖热袍菌(参见，例如,美国专利号5,374,553,将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)分离而来。应理解，可在不背离其范围或优选实施方案的情况下，在本发明组合物、方法和试剂盒中使用多种DNA聚合酶，包括本文中未明确公开的聚合酶。
用于产生嗜热DNA聚合酶，特别地Tne和Tma聚合酶的突变体和衍生物的方法公开于例如都于1996年9月6日提交的美国申请号08/689,807和08/689,818(将两者通过引用整体并入本文)中。Tfi、Tli/VENT和DEEPVENT可商购获得(例如,从New England BioLabs;Beverly,MA)，或可如所描述的产生(关于Tli/VENT，Bej和Mahbubani,见:PCR Technology:Current Innovations，Griffin,H.G.和Griffin,A.M.,eds.,CRC Press,pp.219-237(1994);关于DEEPVENT，Flaman,等人，Nucl. Acids Res.22:3259-3260(1994))。可将本发明的热稳定性DNA聚合酶添加至本发明组合物中以在工作溶液中产生约0.0001U/μL至约50U/μL、约0.0005U/μL至约10U/μL、约0.001U/μL至约5U/μL、约0.005U/μL至约2U/μL、约0.01U/μL至约1U/μL、约0.02U/μL至约0.5U/μL的终浓度，或优选约0.02U/μL、约0.04U/μL、约0.08U/μL、约0.1U/μL、约0.12U/μL、约0.14U/μL、约0.18U/μL、约0.2U/μL、约0.3U/μL、约0.4U/μL或约0.5U/μL的终浓度。
在一些实施方案中，可将DNA聚合酶的浓度测定为具有逆转录酶活性的酶的浓度对具有DNA聚合酶活性的酶的浓度的比率。因此，在一些组合物中，逆转录酶对DNA聚合酶的单位比率可为约500U/μL至约0.001U/μL、约250U/μL至约0.005U/μL、约100U/μL至约0.01U/μL、约50U/μL至约0.05U/μL、约25U/μL至约0.1U/μL，或优选约5U/μL至约0.5U/μL。当然，适用于本发明组合物、方法和试剂盒的逆转录酶对DNA聚合酶的单位活性的其它适当比率对于本领域技术人员来说是显然的。
PCR抑制剂阻断剂
根据本教导，可将一种或多种PCR抑制剂阻断剂添加至本发明组合物以帮助克服多种通常在用于核酸制备、分离或纯化的样品中发现的化合物对PCR反应的抑制。此类抑制剂包括例如肝素(血液);血色素(血液);EDTA(血液);柠檬酸盐(血液);免疫球蛋白G(血液,血清);腐殖酸(土壤,粪便);乳铁蛋白(牛奶、唾液、其它分泌液体);尿素(尿);植物多糖(植物)；黑色素(皮肤、头发);肌红蛋白(组织);和靛青染料(纺织品)。单独地和组合地添加PCR抑制剂阻断剂可增强对此类PCR抑制剂污染物的耐受性。因此，本发明组合物还可包括单独或组合地作用以增强对各种PCR抑制剂包括例如腐殖酸、血色素和肝素的耐受性的试剂。
用于本教导的此类PCR抑制剂阻断剂可包括蛋白质例如但不限于白蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、重组BSA和来源于其它物种的白蛋白)、明胶(例如，人重组明胶、鱼胶和来源于其它物种的明胶)以及DNA结合蛋白(例如,噬菌体T4基因32(T4gP32))或其肽或多肽变体、片段或衍生物。用于本教导的其它非基于蛋白质的PCR抑制剂阻断剂包括例如甲磺酸去铁胺。用作PCR抑制剂阻断剂的一些优选蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)、鱼胶和T4gP32蛋白。用于本发明组合物和方法的特别优选的是PCR抑制剂阻断剂BSA和鱼胶的组合。
在一些实施方案中，鱼胶在减弱由至少腐殖酸和肝素导致的PCR抑制中是有效的，BSA在减弱由至少腐殖酸和血色素导致的PCR抑制中是有效的。在一些实施方案中，该现象由更低的Ct值来显示。如本文中所用，术语“Ct”或“Ct值”是指循环阈值，表示其中来自报道分子的表示扩增子产生的信号(例如,荧光)最早变得高于本底水平而可被检测的PCR扩增测定的循环。在一些实施方案中，循环阈值或“Ct”为PCR扩增变成指数扩增时的循环数。
根据不同的实施方案，可使用PCR曲线的导数来测定Ct值。例如，可对PCR曲线进行一阶、二阶或n阶导数法以测定Ct值。在不同的实施方案中，导数的特征可用于测定Ct值。此类特征可包括但不限于二阶导数的正拐点、二阶导数的负拐点、二阶导数的零交叉或一阶导数的正拐点。在不同的实施方案中，可使用阈值和基线法(thresholding andbaselining method)来测定Ct值。例如，可使用导数法来确定PCR曲线的指数期的上限，可测定PCR曲线的基线来确定PCR曲线的指数期的下限。根据PCR曲线的上限和下限，可确定阈值，从其可测定Ct值。用于测定Ct值的其它方法包括但不限于拟合点法(fit point method)的各种实施方案以及反曲法(sigmoidal method)的各种实施方案(参见，例如，美国专利号6,303,305;6,503,720;6,783,934;7,228,237和美国申请公开号2004/0096819;将所述专利和申请公布的公开内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，使用的BSA的浓度越高，反应对血色素和腐殖酸抑制越耐受。然而，在一些实施方案中，随着BSA的量不断增加，dRn减小并且基线值(或本底信号)增加。如本文中所用，术语“dRn”或“ΔRn”是指从本底信号(基线)扣除标准化的报道分子信号(Rn)之差，其随后通过被动参考信号标准化。ΔRn可利用式[Rn+–Rn–]来测定,其中Rn+是包括所有组分(包括模板)的反应的Rn值，Rn–是未反应的样品的值。
令人惊讶地，通过使用此类组合的PCR抑制剂阻断剂，例如鱼胶和BSA，抑制剂耐受性的水平得到增强而无PCR性能的显著降低。该性质允许当组合时使用更少量的每种试剂来获得相同水平的抑制剂耐受性(与单独使用任意PCR抑制剂阻断剂相比较)，从而使耐受性最大化(如通过更低的Ct显示的)，和使dRn的减小和增加的基线值最小化。因此，PCR抑制剂阻断剂包括但不限于鱼胶、BSA或其组合的添加在减轻或消除通常在用于核酸分析的样品中发现的多种PCR抑制剂的抑制中是有效的。
可将PCR抑制剂阻断化合物或试剂添加至本发明组合物来在工作溶液中产生约1ng/μL至约10,000ng/μL、约50ng/μL至约8000ng/μL、约100ng/μL至约6000ng/μL、约200ng/μL至约3000ng/μL的终浓度或优选约500ng/μL至约1000ng/μL的终浓度。还可以以例如约0.001%至约15%、约0.05%至约10%、约0.01%至约5%或优选约0.1%至约1%的工作浓液中的百分比终浓度添加PCR抑制剂阻断剂。
在一些方面，PCR抑制剂阻断剂可使此类PCR抑制剂导致的PCR抑制的量与在此类PCR抑制剂阻断剂不存在的情况下观察到的抑制水平相比较减少至少1至100%。例如，抑制可被减小至少约1%、约2%、约5%、约10%、约20%、约50%、约75%、约100%或其间的任何百分数。
核苷酸
本教导的组合物还可包含一种或多种核苷酸(例如，脱氧核苷三磷酸(dNTP))。本发明组合物的核苷酸组分用作新合成的核酸的"构件块(building block)"，通过逆转录酶或DNA聚合酶的作用掺入其中。适用于本发明组合物的核苷酸包括但不限于dUTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dITP、7-脱氮-dGTP、a-硫代-dATP、a-硫代-dTTP、a-硫代-dGTP、a-硫代-dCTP或其衍生物，其全都可从来源包括LifeTechnologies(Carlsbad,CA)、New England BioLabs(Beverly,MA)和Sigma Chemical Company(Saint Louis,MO)商购获得。此类dNTP可以是未标记的，或它们可通过利用本领域已知的方法将其与放射性同位素(例如,3H、14C、32P或35S)、维生素(例如，生物素)、荧光部分(例如,荧光素、罗丹明、Texas Red或藻红蛋白)、化学发光标记地高辛(DIG)等偶联来进行可检测地标记。标记的dNTP也可例如从LifeTechnologies(Carlsbad,CA)或Sigma Chemical Company(Saint Louis,MO)商购获得。
荧光标记的核苷酸的具体实例包括可从Life Technologies,FosterCity，CA获得的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TA MRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP。FluoroLinkTM DeoxyNucleotides、FluoroLink Cy3-dCTP、FluOroLinkCy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLink Cy3-dUTP和FluoroLink Cy5-dUTP可从Amersham Arlington Heights,IL获得;荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR.sub.770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2'-dATP可从Boehringer Mannheim Indianapolis,IN获得;以及ChromaTideTM标记的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、Cascade蓝-7-UTP、Cascade蓝-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红-5-UTP、德克萨斯红-5-dUTP和德克萨斯红-12-dUTP可从Molecular Probes,Eugene,OR获得。DIG标记包括可从Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN获得的地高辛-11-UTP，生物素标记包括可从Clontech,Palo Alto,CA获得的生物素-21-UTP和氨基-7-dUTP。术语核苷酸包括修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的许多实例公开于美国专利号6,200,757(将其公开内容通过引用整体并入本文)中。
在本发明组合物的一些实施方案中，可添加dNTP以在工作溶液中产生约0.001mM至约100mM、约0.01mM至约10mM、约0.1mM至约1mM或优选约0.2mM至约0.6mM的每一种dNTP的终浓度。
引物
除了核苷酸外，本发明组合物还可包含一种或多种帮助合成与RNA模板的全部或部分互补的第一DNA分子(例如，单链cDNA分子)的引物。此类引物还可用于合成与第一DNA分子的全部或部分互补的DNA分子，从而形成双链cDNA分子。此外，此类引物可用于按照本教导扩增核酸分子。寡核苷酸引物可以是在长度上具有2或更多个(例如,2、3、4、5、10、20个等)核苷酸的任意寡核苷酸。此类引物包括但不限于靶特异性引物(其优选为基因特异性引物)、oligo(dT)引物、随机引物或任意引物(arbitrary primer)。可用于按照本文中公开的方法扩增DNA分子的其它引物对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。应理解，在不背离其范围或优选实施方案的情况下，可将广泛多样的引物可用于本发明组合物、方法和试剂盒，包括本文中未明确公开的那些。
在公开的组合物的一些实施方案中，工作溶液中引物的终浓度可为约25nM至约2000nM例如约50nM至约1700nM、约75nM至约1500nM、约100nM至约1200nM、约200nM至约1000nM或其间任意范围。在一些示例性实施方案中，引物的浓度为约400nM至约900nM。
探针
根据本教导，组合物还可包含用于检测靶核酸的探针。各种探针在本领域是已知的，例如
探针(参见，例如,美国专利号5,538,848)、各种茎-环分子信标(参见，例如，美国专利号6,103,476和5,925,517以及Tyagi和Kramer,Nature Biotechnology14:303-308(1996))、无茎或线性信标(参见，例如，PCT公开号WO99/21881)、PNA Molecular BeaconsTM(参见，例如美国专利号6,355,421和6,593,091)、线性PNA信标(参见，例如，Kubista等人，Proceedingsin SPIE4264:53-58(2001))、非-FRET探针(参见，例如，美国专利号6,150,097),探针(美国专利号6,548,250)、茎-环和双链体ScorpionTM探针(参见，例如，Solinas等人,Nucleic Acids Research29:E96(2001)和美国专利号6,589,743)、凸环(bulge loop)探针(参见，例如，美国专利号6,590,091)、假结(pseudo knot)探针(参见，例如，美国专利号6,589,250)、cyclicon(参见，例如，美国专利号6,383,752)、MGBEclipseTM探针(Epoch Biosciences,Bothell,WA)、发夹型探针(参见，例如，美国专利号6,596,490)，在例如美国专利号6,485,901;Mhlanga等人，Methods25:463-471(2001);Whitcombe等人,Nature Biotechnology17:804-807(1999);Isacsson等人，Molecular Cell探针14:321-328(2000);Svanvik等人,Anal. Biochem.281:26-35(2000);Wolffs等人,Biotechniques766:769-771(2001);Tsourkas等人,Nucleic AcidsResearch 30:4208-4215(2002);Riccelli等人，Nucleic Acids Research30:4088-4093(2002);Zhang等人，Shanghai34:329-332(2002);Maxwell等人，J.Am.Chem.Soc.124:9606-9612(2002);Broude等人，TrendsBiotechnol.20:249-56(2002);Huang等人,Chem Res.Toxicol.15:118-126(2002);和Yu等人，J.Am.Chem.Soc.14:11155-11161(2001)中描述的肽核酸(PNA)照亮探针(light-up probe)、自装配纳米颗粒探针和二茂络铁修饰探针。探针可包含报道染料例如6-羧基荧光素(6-FAM)或四氯荧光素(TET)等。检测探针还可包含猝灭剂部分例如四甲基罗丹明(TAMRA)、Black Hole猝灭剂(Biosearch Technologies,Novato,CA)、Iowa Black(IDT,Coralville,IA)、QSY猝灭剂(Molecular Probes,Eugene,OR)以及DABSYL和DABCEL磺酸盐/羧酸盐猝灭剂(EpochBiosciences,Bothell,WA)等。探针还可包含两个探针，其中例如荧光基团是一个探针，猝灭剂是另一个探针，其中两个探针一起对靶的杂交猝灭信号，或其中对靶的杂交通过荧光的改变来改变信号特征。
示例性可检测标记包括例如荧光染料或荧光基团(例如，可被光激发而发射荧光或磷光的化学基团)、能够猝灭来自荧光供体染料的“受体染料”等。适当的可检测标记可包括例如荧光素(例如,5-羧基-2,7-二氯荧光素;5-羧基荧光素(5-FAM);5-HAT(羟色胺);6-HAT;6-JOE;6-羧基荧光素(6-FAM);FITC);Alexa fluors(例如,350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750);
荧光基团(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-神经酰胺、R6G SE、TMR、TMR-X缀合物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)、香豆素(例如，7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素鬼笔环肽、羟基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)、钙黄绿素、钙黄绿素AM、钙黄绿素蓝、钙染料(例如，钙深红(calciumcrimson)、钙绿、钙黄(calcium orange)、钙荧光白(calcofluor white))、Cascade蓝、Cascade黄;CyTM染料(例如，3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、cyan GFP、环AMP Fluorosensor(FiCRhR)、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(例如，GFP、EGFP)、蓝色荧光蛋白(例如，BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、蓝绿色荧光蛋白质(cyan fluorescent protein)(例如，ECFP、Cerulean、CyPet)、黄色荧光蛋白(例如、YFP、柠檬黄、Venus、YPet)、FRET供体/受体对(例如，荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/dabcyl、荧光素/荧光素、
荧光素/QSY7和QSY9)、LysoTracker和LysoSensor(例如，LysoTracker Blue DND-22、LysoTracker Blue-WhiteDPX、LysoTracker Yellow HCK-123、LysoTracker Green DND-26、LysoTracker Red DND-99、LysoSensor Blue DND-167、LysoSensorGreen DND-189、LysoSensor Green DND-153、LysoSensor Yellow/BlueDND-160、LysoSensor Yellow/Blue10,000MW葡聚糖)、俄勒冈绿(例如，488、488-X、500、514);罗丹明(例如，110、123、B、B200、BB、BG、B extra、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基罗丹明6G、丽丝胺、丽丝胺罗丹明B、类鬼笔环肽、鬼笔环肽、Red、Rhod-2、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、磺酰罗丹明B和C、磺酰罗丹明G Extra、四甲基罗丹明(TRITC)、WT)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、VIC及在例如美国公开号2009/0197254中描述的其它标记)等等，这对于本领域技术人员来说是已知的。
在一些实施方案中，按照例如美国专利号6,727,356(将其公开内容通过引用整体并入本文)中描述的方法和原理设计探针。一些探针可以是基于序列的，例如5'核酸酶探针，一些探针例如
绿可以是非序列特异性DNA结合染料。在一些优选实施方案中，检测探针为
探针(Applied Biosystems,Foster City,CA)。应理解，许多种可用于本发明组合物、方法和试剂盒的探针在本领域是已知的，包括本文中未明确公开的那些。
在公开的组合物的一些实施方案中，工作溶液中的探针终浓度可以为约5nM至约750nM例如约10nM至约600nM、约25nM至约500nM、约50nM至约400nM、约75nM至约300nM或其间的任意数字。在一些示例性实施方案中，探针浓度为约100nM至约250nM。
其它组分/添加剂
除本文中公开的那些添加剂外，能够促进或增强逆转录、扩增或两个反应的组合的其它添加剂(例如，用于促进或增强RT-PCR的试剂)在本领域也是已知的。根据本发明组合物和方法，可将此类添加剂的一种或多种掺入本发明组合物以优化核酸从核糖核酸或脱氧核糖核酸模板的产生和复制。添加剂可以是有机或无机化合物。用于本发明组合物、方法和试剂盒的一些添加剂包括多肽以及非多肽添加剂。此类添加剂可包括例如RNA酶抑制蛋白(RIP)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、外源凝集素、大肠杆菌(E.coli)单链结合(SSB)蛋白、tRNA、rRNA、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷(dC7GTP)、含硫化合物、含乙酸酯化合物、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、甲酰胺、甜菜碱、氯化四甲胺(TMAC)、聚乙二醇(PEG)、各种表面活性剂或一般地任何两性离子、阳离子、阴离子或非离子型(例如,TWEEN20、NP-40、Tritin X-100和CHAPS)去垢剂、四氢嘧啶(ectoine)、叠氮化钠、凯松(kathon)和多元醇等等。本领域技术人员将能够鉴定按照本发明组合物、方法和试剂盒使用的其它添加剂。
根据本教导的组合物和方法还可包括另外的“热启动(hot start)”PCR组分或步骤，作为进步阻止、减少或消除非特异性核酸合成的手段。术语“热启动”，如本文中所用，是指通过在更低的退火温度下使聚合酶活性失活并且在延伸期中在更高的温度下重新激活或激活聚合酶活性来防止DNA的非特异性扩增的PCR的任何改进形式。许多热启动机制对于本领域技术人员来说是公知的并且可基于他们按照本教导工作的能力容易地进行选择。在一些实施方案中，可被任选地添加至本发明组合物的热启动组分可包括例如抗体、专门设计的引物、竞争性寡核苷酸或适体、聚合酶结合蛋白或隔离珠。用于热启动PCR的隔离石蜡珠是商购可得的，例如,
PCR Gem100和
PCR Gem50(Applied Biosystems,Foster City,CA)。适当的适体的选择可通过本领域已知的方法来进行，或可使用商购可得的适体。类似地，可按照本领域已知的方法进行适当的引物的选择，或可使用商购可得的引物。在一些情况下，适当的引物可以是专门设计来具有二级结构的引物，所述二级结构在循环温度使引物变性之前阻止引物退火。用于热启动PCR的抗体可通过本领域已知的方法来产生或选择。或者，可使用商购可得的抗体例如
Antibody(Clontech,Mountain View,CA)，其对于任何Taq-衍生的DNA聚合酶包括天然的、重组的和N末端缺失的突变体都是有效的。在装配PCR中用于热启动PCR的试剂的适当浓度可由本领域已知方法来测定或，对于商业产品，按照制造商建议的。用于该目的的热启动组分或机制的其它实例在本领域是已知的(参见，例如，美国专利号6,403,341和美国专利申请公开号2009/0269766，将其公开内容通过引用整体并入本文)。
根据本教导的组合物和方法还可包括被动参考对照。在一些实施方案中，被动参照对照被用于在定量实时核酸检测测定中使样品间或孔间变化减小至最小，并且可以以允许其用作可检测对照的浓度使用。在实施方案中，将参照发色团，特别地荧光基团，用作被动参考对照。在实施方案中，参照发色团为染料ROX(Invitrogen,Carlsbad,CA)。在一个实施方案中，可将ROX以约40nM至约80nM，特别地约60nM的在工作溶液中的浓度包含在组合物中。
应理解，本领域已知的许多种其它组分可用于本发明组合物、方法和试剂盒，包括本文中未明确公开的那些。本领域技术人员还将理解确定按照本教导的每一种组分的使用的具体条件或浓度所需的方法。
缓冲剂和盐
为了形成本教导的组合物，优选将一种或多种逆转录酶和一种或多种DNA聚合酶与缓冲盐溶液混合。根据本教导，本发明组合物和反应混合物中使用的缓冲剂或盐溶液提供了维持具有逆转录酶活性或DNA聚合酶活性的酶的稳定性的适当的pH和离子条件。术语"稳定的"和"稳定性"，如本文中所用，通常意指在将酶在约室温(例如，约20°C至约25°C)的温度下贮存约3天后，在约4°C的温度下贮存约1周后，在约-20°C的温度下贮存约2至6个月后，以及在约-80°C的温度下贮存约6个月或更长时间后，使组合物例如酶组合物保留至少70%，优选至少80%，最优选至少90%的原始酶活性(以单位表示)。此类缓冲剂的实例可包括例如TRIS、TRICINE、BIS-TRICINE、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES和CAPS。此类盐溶液的实例可包括例如氯化钾、醋酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、氯化镁、醋酸镁、硫酸镁、氯化锰、醋酸锰、硫酸锰、氯化钠、醋酸钠、氯化锂和醋酸锂。应理解，可用于本发明组合物、方法和试剂盒的许多缓冲剂和盐溶液在本领域是已知的，包括例如未在本文中明确公开的那些。
在一些实施方案中，可以以浓缩原液的形式提供通组合物。如本文中所用，术语"浓缩原液"意指在需要进一步稀释以达到用于进行特定功能(例如核酸的逆转录)的溶液的最佳浓度的浓度。如本文中所用，“工作溶液”可用于指具有进行特定功能的最佳浓度的溶液。例如，本教导的组合物可以是约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约10X等的原液。在一些优选实施方案中，组合物可需要高于2X、高于3X、高于4X、高于5X、高于6X、高于10X等的稀释度以成为用于核酸合成法所需的工作浓度或最佳浓度。
核酸样品
适合按照本教导使用的核酸样品可包括任意量的一种或多种核酸分子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是细胞外核酸分子。在其它实施方案中，此类核酸分子可来源于细胞。一般而言，此类细胞可包括例如任意原核细胞、真核细胞或植物细胞。此类细胞可以是正常细胞、患病细胞、转化的细胞、建立的细胞(established cell)、祖细胞、前体细胞、胎儿细胞、胚胎细胞、细菌细胞、酵母细胞、动物细胞(包括人细胞)、鸟类细胞、植物细胞等，或从植物或动物(例如，人、牛、猪、小鼠、绵羊、马、猴、犬、猫、大鼠、兔、鸟、鱼、昆虫等)分离的组织。在一些优选实施方案中，还可从病毒分离核酸分子。根据本方法，此类核酸样品可从多种来源提取。此类核酸样品包括但不限于衣服、土壤、皮肤、头发、血液、血清、粪便、奶、唾液、尿或其它分泌液体。此类来源还可包含抑制PCR扩增的化合物。
根据本教导，核酸样品或模板可以是对于医生来说是已知的或未知的任何目标核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。核酸样品可人工合成或从天然来源分离。在一些优选实施方案中，核酸样品是单链的。或者核酸样品可以是双链的。在一些实施方案中，核酸样品可以是信使RNA(mRNA)、RNA、基因组DNA(gDNA)或cDNA。许多核酸样品制备或分离方法在本领域是已知的。许多核酸分离或制备试剂盒也是商购可得的，例如MagMAXTM(Applied Biosystems,Foster City,CA)、iPrepTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)和QIAmp MinElute(Qiagen,SanDiego,CA)。
核酸合成的方法
根据本教导，上述组合物可用于用于一种或多种(例如，1、2、3、4、5、10、12、15、20种等)核酸分子的核酸合成的方法，所述方法包括混合一种或多种(例如，1、2、3、4、5、10、12、15、20种等)核酸模板。在一些实施方案中，RNA或mRNA可用作利用一种或多种逆转录酶进行核酸合成的模板。或者，cDNA或gDNA可用作用于利用一种或多种聚合酶进行核酸合成的模板。在一些实施方案中，此类方法可包括在足以产生与一种或多种(例如，1、2、3、4、5、10、12、15、20、30种等)模板的全部或部分互补的核酸分子的条件下温育包含一种或多种逆转录酶或一种或多种聚合酶的混合物。为了产生与一种或多种模板互补的核酸分子，优选将引物(例如，oligo(dT)引物)和一种或多种核苷酸用于以5'至3'方向进行的核酸合成。
其它实施方案提供了用于扩增核酸分子的方法，所述方法包括将核酸分子与聚合酶接触。在一些实施方案中，在单个反应或容器中同时进行单一(即，单个)扩增反应。在其它实施方案中，在单个反应或容器中同时进行多重(例如,2,3,4,5,10,100,1000个等)扩增反应。如本文中所用，“多重”或“多路(multiplexing)”是指在单个反应中基本上同进行的多个靶的扩增或分析。在一些实施方案中，多路可包括在相同的反应容器(例如，管、室、孔)内从一个或多个样品输入扩增单个或多个靶以及从一个外源对照模板扩增外源对照靶。在一些优选实施方案中，此类方法可包括一个或多个聚合酶链式反应(PCR)。例如，此类多重PCR反应可包括在相同反应内基本上同时扩增超过1个、超过2个、超过3个、超过5个、超过10个、超过20个、超过50个、超过100个、超过1000个等核酸靶。
在一些实施方案中，此类PCR法可以是定量PCR(qPCR)或终点PCR扩增法。在一些优选实施方案中，此类PCR法为实时PCR扩增法。在一些实施方案中，此类PCR法可包括热循环，所述热循环可包括足以扩增DNA分子的混合物的交替加热和冷却，并且其最优选包括从约90°C至约100°C的第一温度范围转换至约45°C至约75°C，约50°C至约70°C，约55°C至约65°C的第二温度范围，或优选在约58°C、约59°C、约60°C、约61°C或约62°C。在一些实施方案中，可进行热循环任意次，例如超过约10次、超过约20次、超过约30次，或约5至约80次、约10至约70次、约20至约60次，或优选约30至约50次的任意次。在一些其它实施方案中，可优化热循环以进行快速热循环。此类用于快速热循环的方案和装置可见于例如美国专利号6,210,882或Kopp,等人，Science280:1046-1048(1998);Chiou,等人，Anal. Chem.73:2018-2021(2001)(关于改进的电加热元件);Kalinina,等人，NucleicAcids Res.25:1999-2004(1997)(关于热气循环仪(hot air cycler));和Giordano,等人,Anal. Biochem.291:124-132(2001)(关于红外线控制的反应)(将所述专利和文献的公开内容通过引用整体并入本文)中。
可在本领域技术人员已知的多种仪器上进行此类PCR热循环。一些仪器可以例如从Applied Biosystems商购获得(例如,AB SDSInstruments 7300实时PCR系统、7500实时PCR系统、7500快速实时PCR系统、7900HT实时PCR系统、StepOne实时PCR系统和StepOne Plus实时PCR系统或ViiA7实时PCR系统)。应理解，可用于本发明方法的许多仪器在本领域是已知的，包括本文中未明确公开的那些。
在其它实施方案中，本发明组合物可用于进行单步骤(或偶联)RT-PCR的方法。在一些实施方案中，在足以合成与RNA模板(例如,cDNA)的全部或部分互补的DNA分子的条件下温育RT-PCR反应混合物，随后在足以扩增新合成的cDNA分子的第二温度下温育所述混合物。根据本方法，用于cDNA合成的此类温度可为约30°C至约75°C、约35°C至约70°C、约40°C至约60°C，或优选约45°C至约55°C。根据本方法，用于cDNA扩增的此类温度可为约40°C至约80°C、约45°C至约75°C、约50°C至约70°C或优选约55°C至约65°C。
在本发明方法的(包括，例如用于核酸合成、核酸扩增或RT-PCR的方法)一些实施方案中，至少一种PCR抑制剂阻断剂的使用可增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性。在一些实施方案中，增强的耐受性可通过例如Ct的减小或dRn的增加(例如，当通过实时PCR分析时)或通过扩增的产物的量的增加(例如，当通过琼脂糖凝胶电泳分析时)来显示。
在本发明方法的一些实施方案中，当使用至少一种PCR抑制剂阻断剂时，与不使用所述阻断剂的方法相比较，PCR抑制剂耐受性(如由Ct测定的)可增加至少约10%(例如，约10%、约20%、约30%、约40%、约60%、约80%等)。在本发明发方法的其它实施方案中，与对于使用无PCR抑制剂阻断剂的组合物的方法所获得的Ct值相比较，Ct值减小至少1(例如，至少1、至少2、至少3、至少5、至少10等)。在其它实施方案中，使用包含至少500ng/μL BSA的组合物的方法可使包含至少40μM血色素的反应的Ct减小至少8，或使包含至少10ng/μL腐殖酸的反应的Ct减小至少7。在其它实施方案中，利用包含至少1%鱼胶的组合物的方法使包含至少10ng/μL腐殖酸的反应的Ct减小至少3，或使包含至少0.06U肝素的反应的Ct减小至少6。
试剂盒
在另一个实施方案中，可将本发明组合物和方法装配至用于核酸分子的逆转录或扩增的试剂盒内。根据该实施方案的试剂盒可包括将一个或多个容器装置例如小瓶、管、安瓿、板、瓶子等封装在其中的运载工具例如箱、硬纸盒、管等，其中第一容器装置包含一种或多种具有逆转录酶活性的本教导的多肽和一种或多种DNA聚合酶。当使用超过一种逆转录酶或DNA聚合酶时，可将它们作为两种或更多种(例如，2、3、4、5种等)逆转录酶或DNA聚合酶的混合物装在单个容器中，或装在单独的容器中。本文中提供的试剂盒还可包括(在相同或单独的容器中)适当的缓冲液、一种或多种核苷酸、一种或多种PCR抑制剂阻断剂、一种或多种探针或一种或多种引物。在一些优选实施方案中，将逆转录酶、DNA聚合酶、PCR抑制剂阻断剂、核苷酸和适当的缓冲液组合在单个管或容器中。
在具体的实施方案中，逆转录和扩增试剂盒可包括一种或多种组分(在混合物中或单独地)，包括一种或多种具有逆转录酶活性的多肽和一种或多种DNA聚合酶。此类逆转录和扩增试剂盒还可包括合成核酸分子所需的一种或多种核苷酸、一种或多种探针或一种或多种引物(例如,用于逆转录的oligo(dT))。适用于本文中提供的逆转录和扩增试剂盒的优选的具有逆转录酶活性的多肽、DNA聚合酶、核苷酸、探针、引物和其它组分包括上文中描述的所述物质。本实施方案包括的试剂盒还可包括进行标准核酸逆转录和/或扩增方案所必需的其它试剂和化合物。可将此类具有逆转录酶活性的多肽、DNA聚合酶、PCR抑制剂阻断剂、核苷酸、探针、引物和其它试剂、组分或化合物装在一个或多个容器中，可将它们于上文指出的组分的两种或更多种组分的混合物中装在此类容器中，或可将它们在本试剂盒中装在单独的容器中。本领域技术人员将理解还可将置于相同管或单独的管中的其它组分包括在试剂盒中以进一步帮助或增强逆转录或扩增。此类组分或添加剂可包括例如Mg2+、尿嘧啶DNA糖基化酶、被动参考对照(以使定量实时DNA检测测定的样品间或孔间变化降至最低)(例如，染料例如ROX)和各种热启动组分(例如，抗体、寡核苷酸、珠粒等)。
在另一个实施方案中，本发明试剂盒可包括用于核酸合成(例如,RT-PCR)的组合物。可将此类组合物配制为浓缩原液(例如，2X、3X、4X、5X、6X等)。在一些实施方案中，可将组合物在单个管或容器中配制为浓缩原液，包含一种或多种具有逆转录酶活性的多肽和一种或多种DNA聚合酶。在一些优选实施方案中，此类浓缩原液还可在缓冲液中包含一种或多种PCR抑制剂阻断剂、一种或多种核苷酸、一种或多种热启动组分、一种或多种被动参考对照或一种或多种RNA酶抑制蛋白(RIP)。在一些另外优选的实施方案中，此类缓冲液可包含甘油、DMSO、Mg2+或去垢剂(例如TWEEN20或NP-40)。综上所述，可将本发明组合物的组分配制在一起以产生预混合物。
通常，将用于核酸合成或扩增法的预混合物于冻结温度下贮存以维持酶稳定性(例如，逆转录酶或DNA聚合酶的稳定性)，随后解冻和稀释以随后配制成终反应混合物。然而，随时间反复的预混合物冻融循环可导致酶的降解，从而导致减小的稳定性或功能性。在一个方面，可将组合物、试剂盒或本文中描述的试剂盒中包括的预混合物于约-16°C、约-18°C、约-20°C、约-22°C、约-24°C、约-26°C、约-28°C、约-30°C贮存而不冻结。在一些优选实施方案中，可将试剂盒的组合物于约-20°C贮存而不冻结。在一些实施方案中，可将本组合物于冻结温度(例如，低于0°C，低于-5°C，低于-20°C，低于-30°C，低于-40°C等)下贮存而不必在使用前解冻。如本文中所用，术语“解冻”、“融化”或“解冻的”是指其中热将某物质从固体(例如，冻结的)改变成凝胶或液体的过程。在一些实施方案中，本发明组合物在冻结温度可以是液体或凝胶(或粘性液体)。在一些实施方案中，可将此类组合物(特别地如果以凝胶形式存在)在随后使用之前在约4°C温育，以确保适当的混合，但本身不需要解冻。
除本文中公开的组合物外，试剂盒的组分，视情况而定，可提供于单独的容器中或单个容器中。有利地可提供使用试剂盒的说明书和方案。
对于相关领域内的技术人员很明显的是可在不背离本公开内容或其任意实施方案的范围的情况下对本文中描述的方法和应用进行其它适当的改进和改变。本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请通过引用并入本文，其引用程度就如同将每一个别公开案、专利或专利申请特定且个别地通过引用并入本文。
下文中描述的是仅为了举例说明目的而随同包括的实施例，并且所述实施例无意限定本公开内容。
实施例1
用于RT-PCR/PCR反应的示例性预混合物
将示例性组合物于缓冲盐溶液中配制为4倍的(4X)浓缩原液，其包含4U/uL热稳定性逆转录酶(例如,M-MLV)、0.4U/μL热稳定性DNA聚合酶(例如,Taq)、+/-PCR抑制剂阻断剂(如下文中指示的)、各3.2mM的核苷酸(例如，dTTP、dATP、dCTP、dGTP)、0.8U/μL RNA酶抑制蛋白(RIP)、152nM热启动组分、24%甘油、0.04%非离子型去垢剂和240nM被动参考染料。在如下列实施例中描述的许多测定中测试示例性预混合物。
实施例2
鱼胶浓度对由腐殖酸和肝素导致的PCR抑制的作用
使用上述示例性预混合物在1X20μL反应中使用1ng的UHRRNA(Stratagene,La Jolla,CA)进行RT-PCR(TaqMan Gene ExpressionAssays Hs00817723_g1(ACADVL))。按照制造商的说明书或利用下文中指示的任何改变进行测定，除了每反应使用0.5X的测定外。在0-1%鱼胶存在的情况下，将10ng/μL腐殖酸(Fluka53680)和0.01U至0.1U肝素(Sigma H3393)掺入分别的RT-PCR反应管。在对照反应中用水替代抑制剂。以4个技术重复运行鱼胶与抑制剂的所有组合。使用下列热条件在7900HT快速实时PCR系统(Life Technologies,Foster City,CA)上进行RT-PCR：50°C进行5分钟，95°C进行20秒，40个循环(95°C进行15秒，60°C进行60秒)。基于Ct值评估每一种抑制剂/鱼胶组合。
如图1中显示的，当将0-0.6%的鱼胶添加至反应混合物时，具有10ng/μL腐殖酸的RT-PCR反应被腐殖酸完全抑制。这已通过与在无任何抑制剂的反应中观察到的约30的Ct相比较为40的Ct显示。然而，当将0.8%和1%的鱼胶添加至反应中时，观察到增强的腐殖酸(在10ng/μL时)耐受性，如分别通过35.99和31.90的Ct所显示的。除包含最高肝素浓度(0.08U和更高)的反应物外，发现随着始于低至0.2%(针对0.04U的肝素)的鱼胶的添加，肝素抑制不断下降。
实施例3
BSA对腐殖酸、血色素和肝素抑制的作用
使用上述示例性预混合物在1X20μL反应中使用1ng的UHRRNA(Stratagene,La Jolla,CA)进行RT-PCR(TaqMan Gene ExpressionAssays Hs00817723_g1(ACADVL)PN4331182,Life Technologies,Foster City,CA)。按照制造商的说明书或利用下文中指示的任何改变进行测定，除每反应使用0.5X的测定外。在添加0-8000ng/μL BSA的情况下，将10ng/μL腐殖酸(Fluka53680)、40μM血色素(Sigma H3281)、0.01U或0.1U肝素(Sigma H3393)掺入分别的RT-PCR反应。在对照反应中用水替代抑制剂。以4个技术重复运行BSA与抑制剂的所有组合。在下列热条件下在7900HT快速实时PCR系统(Life Technologies,Foster City,CA)上进行RT-PCR：50°C进行5分钟，95°C进行20秒，40个循环(95°C进行15秒，60°C进行60秒)。基于Ct和dRn值评估每一种抑制剂/BSA组合。
如图2中所示，观察到0.01U的肝素未抑制任何测试的RT-PCR反应，如通过与水对照的Ct相当的Ct显示的。然而，对于所有测试的BSA的浓度，观察到0.1U的肝素完全抑制反应。通过添加500ng/μL的BSA，血色素和腐殖酸抑制被极大地降低，如通过分别地从40(表示完全抑制)变至31.3和32.7的Ct所显示的。通过添加2000ng/μL BSA，血色素和腐殖酸抑制被完全消除，如通过与水对照的Ct相当的~30的Ct所显示的。
如图3中所示，减小的dRn也与成功的扩增相关。对于血色素和腐殖酸，包含2000ng/μl BSA的反应显示比仅具有500ng/μL的BSA的反应更高的dRn，这表明添加的BSA的浓度越高，抑制越低。与图2中水对照的Ct值(其中所述值对于所有添加的BSA的浓度都是一致的(表明不存在抑制))相比较,dRn值随着BSA浓度增加而减小。如图4中所示，作为递增的BSA浓度的结果，在非标准化原始信号与递增的基线之间存在相关性。
实施例4
作为腐殖酸、血色素和肝素的PCR抑制剂阻断剂的鱼胶的有效浓度的确定
使用上述示例性预混合物在1X20μL反应中使用1ng的UHRRNA(Stratagene,La Jolla,CA)进行RT-PCR(TaqMan Gene ExpressionAssays Hs00817723_g1(ACADVL)PN4331182,Life Technologies,Foster City,CA)。按照制造商的说明书或利用下文中指示的任何改变进行测定，除每反应使用0.5X的测定外。在0-5%鱼胶存在的情况下将10ng/μL腐殖酸(Fluka53680)、40μM血色素(Sigma H3281)、0.06U和0.08U肝素(Sigma H3393)掺入分别的RT-PCR反应。在对照反应中用水替代抑制剂。以4个技术重复运行鱼胶与抑制剂的所有组合。在下列热条件下在7900HT快速实时PCR系统(Life Technologies,FosterCity,CA)上进行RT-PCR：50°C进行5分钟，95°C进行20秒，40个循环(95°C进行15秒，60°C进行60秒)。基于Ct和dRn值评估每一种抑制剂/鱼胶组合。
如图5中所示，掺有10ng/μL腐殖酸的反应显示随着鱼胶逐渐增加直至至少约2-3%的鱼胶，Ct稳定地减小，其中Ct值最低为30.6-30.7。通过添加5%的鱼胶，Ct值略增至32.6。
如图5中所示，肝素的浓度越高，抵消抑制所需的鱼胶浓度越高。例如，当将0.06U的肝素掺入反应时，使用1%的鱼胶观察到扩增，然而当将0.08U的肝素掺入反应时，需要1.5%的鱼胶才能观察到扩增。对于0.06U的肝素添加2-3%的鱼胶，Ct值最低为31.2；对于0.08U的肝素添加3%鱼胶，Ct值最低为33.4。当对于两个被测试的肝素浓度将鱼胶浓度增加至5%时，观察到增加的Ct值。
观察到随着鱼胶浓度增加PCR抑制下降，如通过减小的Ct值显示的。如图6中显示的，该作用是所有包含各种测试的抑制剂的反应的递增的dRn值的必然结果。然而，在水对照反应(在不存在任何抑制的情况下)中，也观察到dRn值随鱼胶的量递增而减小。
实施例5
鱼胶和BSA对腐殖酸、血色素和肝素抑制的作用
使用上述示例性预混合物在1X20μL反应中使用1ng的UHRRNA(Stratagene,La Jolla,CA)进行RT-PCR(TaqMan Gene ExpressionAssays Hs00817723_g1(ACADVL)PN4331182，Life Technologies,Foster City,CA)。按照制造商的说明书或利用下文中指示的任何改变进行测定，除每反应使用0.5X的测定外。在进行0-1%鱼胶、0-8000ng/μLBSA的滴定或鱼胶与BSA的交叉滴定的情况下，将10ng/μL腐殖酸(Fluka53680)和40μM血色素(Sigma H3281)掺入分别的RT-PCR反应。在对照反应中用水替代抑制剂。以4个技术重复运行鱼胶/BSA与抑制剂的所有组合。在下列热条件下在7900HT快速实时PCR系统(LifeTechnologies,Foster City,CA)上进行RT-PCR：50°C进行5分钟，95°C进行20秒，40个循环(95°C进行15秒，60°C进行60秒)。基于Ct和dRn值评估每一种抑制剂/鱼胶和/或BSA组合。
图7显示，通过使用与递减量的BSA组合的递增量的鱼胶，当与包含单独的BSA的反应的PCR抑制的水平相比较时，对血色素或腐殖酸的耐受性增强。0.8%鱼胶与500ng/μL BSA的组合几乎完全消除了血色素和腐殖酸抑制，然而，为了实现相同的作用，需要2000ng/μL单独的BSA。所有包含鱼胶与BSA的各种组合的反应都显示血色素和腐殖酸抑制的完全消除。
实施例6
鱼胶和BSA单独地和组合地对其它PCR抑制剂的作用
使用上述示例性预混合物在1X20μL反应中使用1ng的UHRRNA(Stratagene,La Jolla,CA)进行RT-PCR(TaqMan Gene ExpressionAssays Hs99999903_m1(ACTB)PN4331182，Life Technologies,FosterCity,CA)。按照制造商的说明书或利用下文中指示的任何变化进行测定，除每反应使用0.5X的测定外。制备不同的反应管，所述反应管组合地或单独地包含下列PCR阻断剂：(1)无鱼胶(FG)或BSA;(2)仅0.5%FG;(3)仅800ng/μl BSA;(4)0.5%FG+800ng/ul BSA。随后将下列PCR抑制剂掺入不同的反应:(1)水(对照);(2)40μM血色素(SigmaH3281);(3)0.04U/rxn肝素(Sigma H3393);(4)10ng/μL腐殖酸(Fluka53680);(5)7.2μg/rxn EDTA(Ambion AM9262);(6)6.5mM柠檬酸钠(从Sigma S4641制备的两个批次)和(7)0.825μg/rxn免疫球蛋白G(IgG)(Sigma I8640)。以4个技术重复运行每一种反应制剂。在下列热条件下在7900HT快速实时PCR系统(Life Technologies,Foster City,CA)上进行RT-PCR：50°C进行5分钟，95°C进行20秒，40个循环(95°C进行3秒，60°C进行30秒)。基于Ct和扩增产物的存在评估结果，如使用4%琼脂糖e-凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)通过凝胶电泳检测的。
无FG或BSA:
如图8中显示的，在不存在任何PCR抑制剂阻断剂的情况下，RT-PCR反应被血色素、肝素和腐殖酸完全抑制，如由为40的Ct值显示的。对于所测试的具体的反应制剂，RT-PCR被柠檬酸钠(批1和批2)和IgG部分抑制，如通过与在对照反应的情况下约21的Ct值相比较，分别为约24和23的Ct值的增加所显示的。在该具体的实验中，对于所测试的任何反应条件，EDTA(在7.2μg/rxn上)似乎未表现抑制性，从而未进行进一步评估。
仅有FG:
如图8中所示，RT-PCR反应，即使在存在0.5%的鱼胶的情况下，也被血色素和腐殖酸完全抑制。对于所有其它抑制剂，当与对照反应比较时，观察到Ct值的减小，这表示通过添加单独的鱼胶产生的不同程度的对不同抑制剂的耐受性。
仅有BSA:
如图8中显示的，800ng/μL BSA的存在部分地降低了所测试的大多数抑制剂的抑制作用，并且完全解除了IgG的抑制。对于所有测试的抑制剂(除肝素外)，BSA似乎也比FG更有效，如与包含单独的FG的反应相比较包含单独的BSA的反应的更低的Ct值所显示的。
FG和BSA:
如图8中所示，包含FG和BSA的组合的反应赋予与包含单独的FG或BSA的反应相当的对柠檬酸钠和IgG的耐受性，如由具有单独的FG、单独的BSA或FG+BSA的反应的相似的Ct值所显示的。对于其它抑制剂，FG与BSA的组合比使用单独的FG或BSA更有效。当在反应中使用FG+BSA的组合时，与测试的所有其它反应制剂相比较，观察到最低的Ct值。
图9还描述了当一起使用时FG和BSA对血色素、肝素和腐殖酸抑制剂的作用。如所显示的，在每一个实例中，FG+BSA的使用降低了此类抑制剂对RT-PCR的抑制水平，如通过利用凝胶电泳对扩增的产物的检测所显示的。
实施例7
使用在单个反应中包含逆转录酶和聚合酶的预混合物进行DNA或RNA模板的核酸合成的可行性
使用上述示例性预混合物在1X20μL反应中进行核酸合成测定(TaqMan Gene Expression Assays Hs99999903_m1(ACTB)PN4331182,Life Technologies,Foster City,CA)、定制的RNA病毒测定(Custommade RNA Virus assay)(EV1)(参见,Noble,等人,Appl EnvironMicrobiol. 72:1604-1612(2006))、定制的DNA病毒测定(ADV)(Jothikumar等人，Applied and Enviromental Mircobiology,71:3131-3136(2005))、定制的RNA测定(BTV-PN4415207,VetMaxBTV Reagents,Life Technologies,Austin,TX)、定制的RNA测定(VLA-A)和定制的对照测定(XenoIPC)。在表1中指定的不同拷贝数或浓度上分析3个非病毒RNA靶测定(ACTB、GPX4和Xeno)、4个病毒RNA靶测定(EV1-脊髓灰质炎病毒、BTV-蓝舌病毒、VLA-A–甲型流感病毒)和1个病毒DNA靶测定(ADV–腺病毒)。按照制造商的说明书(或利用本文中指定的任何其它改变)，使用下列测定条件进行测定:
ACTB:0.5X;
EV1[F/R/Pb]:400nM,400nM,200nM;
ADV[F/R/Pb]:400nM,400nM,200nM;
BTV:1X;
VLA-A[F/R/Pb]:400nM,400nM,200nM;和
Xeno[F/R/Pb]:400nM,400nM,200nM
稀释的次数取决于可获得的模板原液的浓度。使用下列热循环条件在7900HT上于384板格式中进行测定：50°C进行5分钟，95°C进行20秒，40个循环(95°C进行3秒，60°C进行30秒)。
如图10中所示，在所有测试的样品和测定中观察到一致的PCR效率(如通过在不同模板输入上的线性描述的)，这表明包含逆转录酶和聚合酶的反应混合物对于RNA和DNA靶的扩增同样强劲。
图10显示对于ACTB观察到一致PCR效率，如通过从0.0001ng至10ng的RNA输入/反应的稀释点的线性所显示的；对于GPX4从0.01ng至100ng的RNA输入/反应；对于EV1从0.01ng至100ng的RNA输入/反应；对于ADV从0.0001X至1X的DNA输入/反应；对于Xeno从50个拷贝至5,000,000拷贝的RNA/反应；对于BTV从72个拷贝至720,000个拷贝的RNA/反应；以及对于VLA从10个拷贝至10,000个拷贝的RNA/反应。
表1.分析的不同核酸模板的浓度/拷贝数
实施例8
使用在单个反应中包含逆转录酶和聚合酶的预混合物进行多重扩增的可行性
使用上述示例性预混合物在1X20μL反应中进行RT-PCR测定(TaqMan NA和EU PRRSV试剂,PN4405547,和XenoRNA对照,PN4405548,Life Technologies,Austin,TX)。按照制造商的说明书或利用下文中指定的任何另外的变化进行测定。以三重分析RNA病毒靶PRRSV(猪生殖和呼吸综合征病毒)。测试包括利用FAM和VIC受体染料标记的2个靶(分别地NA和EU)和NED受体染料标记的1个外源IPC靶(Xeno)的引物和探针。通过用水稀释来制备NA和EU模板的7种稀释度(从10,000,000个拷贝至10个拷贝/反应)。将1000个拷贝的Xeno IPC模板掺入每一个反应。在下列条件下在7900HT上于384格式中运行RT-PCR：50°C进行5分钟，95°C进行20秒，40个循环(95°C进行3秒，60°C进行30秒)。
如图11中所示，对于两个靶在不同模板输入观察到线性扩增而不影响外源IPC的一致性。NA和EU模板在从10,000,000个拷贝降至1000个拷贝的模板/反应的范围内都显示线性扩增。对于低于1000个拷贝/反应的浓度的NA模板未记录Ct值。跨不同靶模板浓度的Xeno Ct值的标准差是恒定的，具有仅约0.125的标准差，平均Ct值为32.44。
实施例9
病毒核酸的检测
使用常规旋转柱法纯化人乳头瘤病毒(HPV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、乙型和丙型肝炎病毒(HBV和HCV)的核酸测试对照，使用4X示例性预混合物(在本文中表示为“FVMM”)在系列稀释物中扩增纯化的样品以基于Cq(其等于Ct)、线性和效率评估灵敏性。将常见的PCR抑制剂(包括肝素、EDTA、血色素和腐殖酸)掺入反应以基于掺入抑制剂的样品与对照样品之间的delta Cq(ΔCq)来评估系统的耐受性。
使用下列热循环条件利用20μL反应体积进行所有RT-PCR：50°C进行5分钟，95°C进行20秒，40个循环(95°C进行3秒，60°C进行30秒)。样品反应设置如下(所有体积为每一个反应的体积):
样品体积可以大至反应所允许的最大体积(反应体积(即,20μL)减去FVMM+PPMix的体积之和)。
来自核酸测试(NAT)对照的HBV和HCV的纯化的样品和EBV和HPV的未纯化的NAT对照获自AcroMetrix(Benicia,CA)。使用常规旋转法，利用200μL的样品输入和60μL的洗脱体积纯化未纯化的EBV和HPV对照。随后扩增纯化的样品的系列稀释物。估计检测限值、PCR效率和线性(R2)。测定获自Applied Biosystems(Foster City,CA)。
在下列仪器上进行不同核酸的扩增：Applied Biosystems7900HT(HBV),Applied Biosystems7500Fast(HCV)和AppliedBiosystems ViiATM7(EBV和HPV)。表2显示每一种测试的核酸样品的浓度和拷贝数。
表2:分析的不同核酸模板的浓度/拷贝数
^对于EBV所列的拷贝数/rxn假定从纯化回收100%的DNA。稀释度5通过数字PCR被测定为10-25个拷贝/rxn。10个拷贝/rxn的保守估计被假定为EBV的检测限值。
*每反应使用5μL的样品。由于HPV模板的可变拷贝数，因而不能利用数字PCR测定实际拷贝数。
如表2中所示，FVMM制剂显示约100%PCR效率，R2值接近1。
腺病毒(ADV)1型的未纯化的NAT对照获自ZeptoMetrix(Buffalo,NY)，使用常规旋转柱法，利用500μL的样品输入和50μL的洗脱体积进行纯化。就可产生约35的Cq的稀释因子预筛选纯化的样品，将不同量的常见PCR抑制剂掺入反应。ADV测定序列获自文献(Gu等人J.Clin.Microbiol.41:4636-4641(2003)，通过引用整体并入本文)。抑制的作用通过计算掺入抑制剂的样品与水对照样品之间的ΔCq来进行评估。也利用RNA内部阳性对照(IPC)样品(靶向约29的Cq)作为参照来进行相同的抑制剂测试。
如图12中所示，对于每一个抑制剂-浓度组合，对4个技术重复的每一个重复运行4个单独的反应设置。如下计算ΔCq：掺有抑制剂的反应的Ct减去水对照反应的Ct。ΔCq越高，则样品被抑制得越厉害。虽然ΔCq值在16个重复间有些变化，但它们全都在|1Ct|内，这表明掺杂的样品与对照之间不存在显著差异。
通过使用与对于图12所述相同的设置和评估，RNA IPC测定显示比ADV测定更高的对抑制的灵敏性(参见图13)；然而，ΔCqs仍然在|1Cq|内，表明FVMM制剂在测试的浓度上耐受所述4种抑制剂。
利用RNA IPC在二重反应中扩增纯化的ADV DNA的系列稀释物(参见上文)，评估PCR效率和线性(R2)。如图14中所示，通过持续输入RNA IPC模板使纯ADV DNA的6-log系列稀释物变成双重。多重(multiplexing)不影响PCR效率或反应的线性。
Claims (87)
1.包含至少一种DNA聚合酶、至少一种逆转录酶(RT)和至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物，其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性。
2.权利要求1的组合物，其中所述逆转录酶为热稳定性的逆转录酶。
3.权利要求2的组合物，其中所述热稳定性的逆转录酶为M-MLV逆转录酶或其突变体、变体或衍生物。
4.权利要求3的组合物，其中所述MMLV RT包含选自Y64、R116、D124、H126、Y133、K152、Q190、T197、H204、V223、M289、T306或F309的一个或多个突变。
5.权利要求1的组合物，其中所述DNA聚合酶是热稳定性DNA聚合酶。
6.权利要求5的组合物，其中所述热稳定性DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶或其突变体、变体或衍生物。
7.权利要求1的组合物，其中所述PCR抑制剂阻断剂为蛋白质。
8.权利要求7的组合物，其中所述蛋白质为明胶。
9.权利要求8的组合物，其中所述明胶为鱼胶。
10.权利要求7的组合物，其中所述蛋白质为白蛋白。
11.权利要求10的组合物，其中所述白蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少鱼胶和BSA。
13.权利要求12的组合物，其中BSA的浓度是约500ng/μL至5000ng/μL。
14.权利要求12的组合物，其中所述鱼胶的浓度是约0.4%至4%。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20°C为液体或凝胶。
16.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20°C不为固体。
17.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20°C不冻结。
18.权利要求1的组合物，其中所述组合物在使用之前不需要解冻。
19.权利要求1的组合物，其中所述PCR抑制剂选自血色素、腐殖酸、肝素或EDTA。
20.权利要求1的组合物，还包含一种或多种核苷酸(dNTP)。
21.权利要求20的组合物，其中所述核苷酸选自dTTP、dATP、dCTP、dGTP或dUTP。
22.权利要求20的组合物，其中所述核苷酸的每一种的浓度为约0.5mM至5mM。
23.权利要求1的组合物，还包含甘油。
24.权利要求23的组合物，其中所述甘油的浓度为5%-50%。
25.权利要求1的组合物，还包含RNA酶抑制蛋白(RIP)。
26.权利要求25的组合物，其中所述RIP的浓度为0.1U/μL至1.0U/μL。
27.权利要求1的组合物，还包含去垢剂。
28.权利要求27的组合物，其中所述去垢剂为NP-40或TWEEN20。
29.权利要求27的组合物，其中所述去垢剂的浓度为0.005%至0.05%。
30.权利要求1的组合物，还包含被动参考对照。
31.权利要求30的组合物，其中所述被动参考对照为ROX染料。
32.权利要求1的组合物，其中所述组合物为浓缩原液。
33.权利要求32的组合物，其中所述浓缩原液为2X至5X原液。
34.权利要求1或32的组合物，其中所述组合物用于核酸合成、核酸扩增或RT-PCR法。
35.进行核酸样品的RT-PCR的方法，包括:
将组合物与：
a)核酸样品;
b)一种或多种标记的探针;
c)一种或多种引物混合，
所述组合物包含：
至少一种活性逆转录酶;
至少一种活性DNA聚合酶;和
至少一种PCR抑制剂阻断剂，其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性；和
对所述核酸样品进行RT-PCR。
36.权利要求35的方法，其中所述核酸样品获自包含PCR抑制剂的来源。
37.权利要求36的方法，其中所述核酸来源选自血液、汗、眼泪、土壤、唾液、尿和粪便。
38.权利要求35的方法，其中所述标记的探针为
探针。
39.权利要求35的方法，其中所述一种或多种PCR抑制剂选自血色素、腐殖酸和肝素。
40.权利要求35的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂的至少一种为鱼胶。
41.权利要求35的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂的至少一种为BSA。
42.权利要求35的方法，其中在单个管或反应中进行所述RT-PCR。
43.权利要求35的方法，其中在所述与a、b或c混合之前不解冻所述组合物。
44.权利要求34的方法，其中所述增强的耐受性通过Ct的减小来表示。
45.权利要求34的方法，其中所述增强的耐受性是：当与使用不含PCR抑制剂阻断剂的组合物的方法比较时增强至少10%。
46.权利要求44的方法，其中Ct减小至少1Ct。
47.权利要求41的方法，其中所述BSA的浓度为至少500ng/μL。
48.权利要求46的方法，其中当至少40μM血色素存在于所述组合物中时观察到至少为8的Ct的减小，当至少10ng/μL腐殖酸存在于所述组合物中时，观察到至少为7的Ct的减小。
49.权利要求40的方法，其中鱼胶的所述浓度为至少1%。
50.权利要求46的方法，其中当至少10ng/μL腐殖酸存在于所述组合物中时观察到至少为3的Ct的减小，或当至少0.06U的肝素存在于所述组合物中时观察到至少为6的Ct的减小。
51.用于扩增核酸分子的方法，所述方法包括：
将核酸模板与包含一种或多种逆转录酶、一种或多种DNA聚合酶以及一种或多种PCR抑制剂阻断剂的组合物混合以形成反应混合物；和
在足以扩增与所述核酸模板的全部或部分互补的核酸分子的条件下温育所述反应混合物。
52.权利要求51的方法，其中所述核酸模板为RNA。
53.权利要求51的方法，其中所述核酸模板为DNA。
54.权利要求51的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂的至少一种为鱼胶。
55.权利要求51的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂的至少一种为BSA。
56.权利要求51的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性。
57.权利要求51的方法，其中所述PCR抑制剂的至少一种选自血色素、腐殖酸或肝素。
58.权利要求56的方法，其中所述耐受性的增加由Ct的减小来表示。
59.权利要求58的方法，其中所述Ct的减小是减小至少1Ct。
60.用于核酸合成的方法，所述方法包括：
将一种或多种第一核酸分子与一种或多种逆转录酶、一种或多种聚合酶和一种或多种PCR抑制剂阻断剂混合;和
在足以产生与所述一种或多种第一核酸分子的全部或部分互补的一种或多种第二核酸分子的条件下温育所述混合物。
61.权利要求60的方法，其中所述第一核酸分子为RNA。
62.权利要求60的方法，其中所述第一或第二核酸分子为DNA。
63.权利要求60的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂为鱼胶或BSA。
64.反应混合物，其包含:
至少一种逆转录酶;
至少一种聚合酶;
至少一种PCR抑制剂阻断剂;和
至少一种核苷酸。
65.权利要求64的反应混合物，还包含标记的探针。
66.权利要求65的反应混合物，其中所述探针为
探针。
67.权利要求64的反应混合物，还包含至少一种引物。
68.权利要求64的反应混合物，还包含核酸模板。
69.权利要求68的反应混合物，其中所述核酸模板为RNA。
70.权利要求68的反应混合物，其中所述核酸模板为DNA。
71.试剂盒，其在单个容器中包含含有至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶和至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物。
72.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物在-20°C为凝胶。
73.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物在-20°C不是固体。
74.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物在-20°C不冻结。
75.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物为4X浓缩原液。
76.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物用于RT-PCR法。
77.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物用于核酸合成方法。
78.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物用于核酸扩增方法。
79.权利要求71的试剂盒，还在至少一个其它容器中包含含有至少一种探针和/或至少一种引物的组合物。
80.权利要求79的试剂盒，其中所述探针为
探针。
81.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物还包括至少一种核苷酸。
82.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物还包含缓冲剂或盐溶液。
83.权利要求76-78的任一项的试剂盒，其中所述方法包括热循环。
84.权利要求83的试剂盒，其中所述热循环为快速热循环。
85.权利要求76-78的任一项的试剂盒，其中所述方法包括多路。
86.权利要求71的试剂盒，其中所述逆转录酶为M-MLV或其具有逆转录酶活性的任何突变体、变体或衍生物。
87.权利要求71的试剂盒，其中所述聚合酶为Taq DNA聚合酶或其具有DNA聚合酶活性的任何突变体、变体或衍生物。
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