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CN103033629A - 一种脂蛋白磷脂酶a2的测定试剂及试剂的制备方法 - Google Patents

一种脂蛋白磷脂酶a2的测定试剂及试剂的制备方法 Download PDF

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CN103033629A
CN103033629A CN201210556884XA CN201210556884A CN103033629A CN 103033629 A CN103033629 A CN 103033629A CN 201210556884X A CN201210556884X A CN 201210556884XA CN 201210556884 A CN201210556884 A CN 201210556884A CN 103033629 A CN103033629 A CN 103033629A
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Abstract

本发明涉及一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂及其制备方法。目的是提供的提供的试剂具有准确度高的特点；提供的制备方法具有制作方便的特点。技术方案是：一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份：a、脂蛋白磷脂酶A2试剂1；b、脂蛋白磷脂酶A2试剂2；c、液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品；其制备方法：1）脂蛋白磷脂酶A2试剂1：均匀混合；2）脂蛋白磷脂酶A2试剂2：（1）取悬浮液；（2）混合物反应；（3）得悬浮液；（4）调整浓度；（5）取（3）中的悬浮液加入（4）中；（6）反应；（7）加入乙醇胺；（8）离心处理；3）液体型LP-PLA2参考校准品：按配方量混合，按含量排列或在混合液中加入纯品。

Description

一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂及试剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂及试剂的制备方法，特别是采用乳胶增强免疫比浊法检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术
脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)又被称为血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor-AH，PAF-AH)，属于磷脂酶家族中PLA2的一种，是丝氨酸依赖的磷脂酶。人血浆Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、肝细胞等分泌生成，并受炎性介质的调节；Lp-PLA2的主要作用是产生二十烷酸类炎性介质、参与磷脂重建及生物膜的稳定平衡、脂蛋白的代谢、细胞信号传递、宿主反应、促进机体坏死组织自体消失等。Lp-PLA2是反映血管炎症的特异性标记物，在低密度脂蛋白的氧化、促进动脉粥样硬化以及冠心病和卒中的形成等方面发挥重要作用。Lp-PLA2水平升高是预测冠心病和卒中风险的一种独立危险因子。其水平的增加被认为是增加患心脏病或脑卒中的机会。目前已经研制出多种Lp-PLA2抑制剂，有试验结果表明服用高剂量的抑制剂患者病灶处Lp-PLA2降低了80％，服用低剂量的患者Lp-PLA2降低了52％，提示降低其含量和活性可能会阻断或延缓斑块炎症的进程。从而提供给临床医生预防和治疗心脑血管事件的新靶点，为临床疾病的早期干预、临床应用治疗提供新思路新方向。
目前检测Lp-PLA2常用的实验室方法有放射免疫学分析法（RIA）、化学发光免疫分析法(CLIA)、酶联免疫法（ELISA），放射免疫学分析法（RIA）法检测耗时长(19～22h)，而且有放射性元素的污染，标记物稳定性差，废弃物难以处理而使其受到限制。化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定LP-PLA2的浓度。目前市场上有管式和板式两种试剂盒，但此法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定，这种直接标记法属于瞬间发光型，很难保证测试结果的稳定性和重复性，而且需要特殊的检测仪器。不便于常规实验室开展。而利用生物素-亲和素系统检测LP-PLA2的电化学发光免疫试剂盒，需要配套昂贵的全自动电化学发光检测仪，常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。酶联免疫法（ELISA）自动化程度不高，且受人为因素影响较大，重复性差，整个反应测定时间也很长（至少需要40分钟）。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种脂蛋白磷脂酶A2(Cholyglycine,LP-PLA2)的检测试剂；所提供的试剂应具有准确度高、测定时间短（最多只需要10分钟，甚至更短）、重复性好，操作简单、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点；所提供的试剂制备方法应具有制作方便以及成本不高的特点。
本发明提供的技术方案是：
一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份：
a、脂蛋白磷脂酶A2试剂1
Figure BDA00002616517100021
其余是纯化水
该试剂1的pH值为7.0-8.0；
b、脂蛋白磷脂酶A2试剂2
其余是纯化水；
所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒，其中的羧基胶乳微球的粒径为20-500nm；
c、液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品
Figure BDA00002616517100023
其余是纯化水；
所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品包括5份形成LP-PLA2系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的LP-PLA2含量由低到高分别为1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml；或者，
所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品是单点高浓度的LP-PLA2参考校准品。
所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸（TAPS）缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸（MOPSO）缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
所述试剂1中的缓冲液浓度20-200mmol/L，pH值7.0-8.0。
所述反应加速剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖（DS-50）。
所述反应加速剂浓度优选0.05-30g/L。
所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。
所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质。
所述电解质优选阳离子中的氯化钠（NaCl），浓度为50-200mmol/L。
所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。
所述非离子表面活性剂是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。
所述表面活性剂浓度优选0.5-1g/L。
所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒的浓度为0.002-0.01ml/ml。
一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂的制备方法，按照以下步骤进行：
1）脂蛋白磷脂酶A2试剂1：
按配方量将缓冲液、电解质、表面活性剂、反应加速剂、防腐剂、稳定剂以及纯化水混合均匀，调pH值至7.0-8.0；
2）脂蛋白磷脂酶A2试剂2：
（1）取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成浓度为0.01mg/ml的悬浮液；
（2）按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDAC羧基活化剂）和40mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHS）的比例，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
（3）用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，使其浓度为0.01mg/ml；
（4）将抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于缓冲溶液中，使抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为0.25mg/ml；
（5）取步骤（3）中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤（4）中的抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、0.125mg/ml、25mmol/L；
（6）将混合物在37℃反应3小时，不断搅拌；
（7）按1ml反应混合物加2.5μl的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应10-30分钟，不断搅拌；
（8）离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用缓冲液稀释，使抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度为0.002-0.01ml/ml，然后加入稳定剂、防腐剂溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶A2试剂2；
3）液体型LP-PLA2参考校准品
先按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合并分成5份混合液，然后按照需要的LP-PLA2参考校准品浓度，将相应量的1000ng/ml的LP-PLA2纯品分别加入上述混合液中，获得形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的LP-PLA2含量由低到高分别为1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml；或者，
按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定量的1000ng/ml的LP-PLA2纯品，获得单点高浓度的LP-PLA2参考校准品。例如，该参考校准品中的LP-PLA2含量为100.0ng/ml或500.0ng/ml；使用时再用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；这里没有特别的限制，只要制得的LP-PLA2参考校准品能与样品比较，能够测定样品中LP-PLA2的含量即可。
所述离心处理采用离心机，离心机转速为15000转/分。
本发明所提供的抗人LP-PLA2测定试剂的反应原理是：样品中的抗人LP-PLA2与试剂中的抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，在一定范围内反应液浊度与样品中抗原的量呈线性关系，可使用生化分析仪或其它光学检测仪器在20-6O0nm波长处测定反应液吸光度值，反应液吸光度值与所测PCT浓度成正比。
本发明的有益效果是：所提供的采用乳胶增强免疫比浊法的抗人脂蛋白磷脂酶A2检测试剂，通过将抗人LP-PLA2抗体与羧基胶乳微球结合，放大了抗人LP-PLA2抗原和抗体反应的表面积，具有准确性高（与化学发光免疫分析法的相关性R2为0.9935-0.9997）、重复性好、检测快速（从测定开始到得出结果最多只需要10分钟，甚至更短）的特点，能够在常规生化仪上进行大批量样本测定，大大提高了检测工作效率。该试剂的制备方法操作简便，原料易得（全部选用外购原料），成本不高，适合各类医学研究单位以及常规实验室应用。
附图说明
图1显示实施例1中通过本发明方法所得LP-PLA2试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的LP-PLA2测得值的相互关系。经回归分析：y=1.0012x+5.7593；R2=0.9935,显示出本实施例1与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
图2显示实施例2中通过本发明方法所得LP-PLA2试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的LP-PLA2测得值的相互关系。经回归分析：y=0.9999x+6.7481；R2=0.9982显示出本实施例2与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
图3显示实施例3中通过本发明方法所得LP-PLA2试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的LP-PLA2测得值的相互关系。经回归分析：y=1.0096x+9.5773；R2=0.9996显示出本实施例3与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
图4显示实施例4中通过本发明方法所得LP-PLA2试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的LP-PLA2测得值的相互关系。经回归分析：y=1.0037x+2.8437；R2=0.9997,显示出本实施例4与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
具体实施方式
本发明检测试剂及校准品所需主要原料：
1、抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体，有许多商品化的抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体可供选择，如芬兰Dako公司、日本UNF公司；该抗体仅与人脂蛋白磷脂酶A2反应，与其它抗原无免疫交叉反应，可以是多克隆抗体或单克隆抗体，这里没有特别限制，只要能与胶乳微球偶联即可。其抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体可以是羊抗（即羊抗人脂蛋白磷脂酶A2；以下同）、也可以是兔抗、鸡抗或鼠抗。只要采用已知的免疫电泳法测定，该抗体只与人LP-PLA2之间呈现单一的沉定线，抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的滴度大于或等于1.0mg/ml。
2、胶乳微球，有许多商品化的纳米微球可供选择，如德国Merck公司、日本UNF公司、日本JSR公司和Thermo公司；其基本材质是聚苯乙烯或共聚苯乙烯，表面用羧基基团（COOH）修饰，也可不用作任何修饰，这里要根据选择抗体和微球的结合方法不同而选择不同的微球。如选择化学交联法（也可以采用物理吸附法），则用表面经羧基、氨基、醛基等修饰的微球。本法优选羧基基团修饰的胶乳微球（羧基胶乳微球的粒径进一步优选为80nm-300nm）。
3、脂蛋白磷脂酶A2：购自芬兰DaKo公司，用于制备本试剂所需参考校准品，可以是天然脂蛋白磷脂酶A2蛋白，也可以是基因重组脂蛋白磷脂酶A2蛋白。
本发明提供的LP-PLA2测定试剂的反应原理是：样品中的LP-PLA2与试剂中的抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，在一定范围内反应液浊度与样品中抗原的量呈线性关系，可使用生化分析仪或其它光学检测仪器在540-600nm波长处测定反应液吸光度值，反应液吸光度值与所测LP-PLA2浓度成正比。
下面将结合实施例详细说明本发明试剂，但这些实施例不应认为是限制本发明的定义。
实施例一
一）脂蛋白磷脂酶A2试剂1
Figure BDA00002616517100061
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1000ml，然后用盐酸或氢氧化钠调PH至7.2。
二）脂蛋白磷脂酶A2试剂2
1.取80nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液稀释成0.01mg/ml的悬浮液；
2.按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC和40mg的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐）的比例，加入EDAC和NHS并立即混匀后在室温将混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
3.用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度为0.01mg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；
4.将羊抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于50mmol/L、PH8.5的HEPES缓冲溶液中，使羊抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为0.25mg/ml；
5.取步骤（3）中羧基胶乳微球悬浮液1ml，立即加入步骤（4）中羊抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体1ml；此时该混合液中羧基胶乳微球、羊抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、0.125mg/ml、25mmol/L；
6.将混合物在37℃反应3小时，不断搅拌；
7.按1ml反应混合物加2.5μl乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应20分钟，不断搅拌；
8.用15000转/分离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH7.2的MOPS缓冲液稀释，使抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度为0.01ml/ml；然后加入牛血清白蛋白(稳定剂)3mmol/L、3mmol/L叠氮钠(防腐剂)溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶A2试剂2。
三）液体型LP-PLA2参考校准品
Figure BDA00002616517100062
Figure BDA00002616517100071
按照需要的LP-PLA2参考校准品浓度将相应的LP-PLA2纯品2000ng/ml加入上述缓冲液中，制备得形成系列浓度的5个参考校准品；5个参考校准品中LP-PLA2含量由低到高分别为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml。
样本检测（与化学发光免疫法分别对比检测30个样本）：
按照实验操作步骤，向10μL样品中加入240μL的LP-PLA2试剂1，在37℃孵育3分钟，加入60μL LP-PLA2试剂2，37℃孵育10秒后在波长600nm读取吸光度A1，反应至5分钟时读取吸光度A2，计算两次吸光度变化值△A=A2-A1。通过与同样处理的校准液比较，计算出样品中的LP-PLA2浓度。从表1和图1（根据表1数据制图）结果可看出，该方法操作简单，所需时间在10分钟以内，与化学发光免疫法显示非常良好的相关性（相关性R2达到0.9935）。
表1
实施例二
一）脂蛋白磷脂酶A2试剂1
Figure BDA00002616517100081
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1000ml，然后用氢氧化钠调PH至8.0。
二）脂蛋白磷脂酶A2试剂2
1.取150nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液稀释成0.01mg/ml的悬浮液；
2.按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC和40mg NHS的比例加入EDAC和NHS，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
3.用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度为0.01mg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；
4.将兔抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于50mmol/L、PH8.5的硼酸盐缓冲溶液中，使兔抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为0.25mg/ml；
5.取步骤（3）中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤（4）中的兔抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、兔抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、0.125mg/ml、25mmol/L；
6.将混合物在37℃反应3小时，不断搅拌；
7.按1ml反应混合物加2.5μl乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应30分钟，不断搅拌；
8.用15000转/分离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH7.4的MOPSO缓冲液稀释，使兔抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度为0.006ml/ml，然后加入牛血清白蛋白(稳定剂)4mmol/L、3mmol/L叠氮钠(防腐剂)溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶A2试剂2。
三）液体型LP-PLA2参考校准品
Figure BDA00002616517100082
Figure BDA00002616517100091
其余是纯化水；
按照需要的LP-PLA2参考校准品浓度，将相应的LP-PLA2纯品2000ng/ml加入上述缓冲液中，制备得形成系列浓度的5个参考校准品；5个参考校准品中LP-PLA2含量由低到高分别为75ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml。
样本检测（与化学发光免疫法分别对比检测30个样本）：
按照实验操作步骤，向10μL样品中加入240μL的LP-PLA2试剂1，在37℃孵育3分钟，加入60μL LP-PLA2试剂2，37℃孵育10秒后在波长600nm读取吸光度A1，反应至5分钟时读取吸光度A2，计算两次吸光度变化值△A=A2-A1。通过与同样处理的校准液比较，计算出样品中的LP-PLA2浓度。从表2和图2（根据表2数据制图）结果可看出，该方法操作简单，所需时间在10分钟以内，与化学发光免疫法显示非常良好的相关性（相关性R2达到0.9982）。
表2
Figure BDA00002616517100092
实施例三
一）脂蛋白磷脂酶A2试剂1
Figure BDA00002616517100093
Figure BDA00002616517100101
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1000ml，然后用氢氧化钠调PH至8.0。
二）脂蛋白磷脂酶A2试剂2
1.取300nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液稀释成0.01mg/ml的悬浮液；
2.按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC和40mg NHS的比例加入EDAC和NHS，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
3.用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度0.01mg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；
4.将鼠抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于50mmol/L、PH8.5的TAPS盐缓冲溶液中，使鼠抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为0.25mg/ml；
5.取步骤（3）中的羧基胶乳微球悬浮液1ml，立即加入步骤（4）中的鼠抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、鼠抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、0.125mg/ml、25mmol/L；
6.将混合物在37℃反应3小时，不断搅拌；
7.按1ml反应混合物加2.5μl乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应10分钟，不断搅拌；
8.用15000转/分离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH8.0的Tris缓冲液稀释，使鼠抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度0.002ml/ml；然后加入牛血清白蛋白(稳定剂)3mmol/L、4mmol/L叠氮钠(防腐剂)溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶A2试剂2。
三）液体型LP-PLA2参考校准品
其余是纯化水；
按照需要的LP-PLA2参考校准品浓度将相应的LP-PLA2纯品2000ng/ml加入上述缓冲液中，制得形成系列浓度的5个参考校准品；5个参考校准品中LP-PLA2含量由低到高分别为20ng/ml、60ng/ml、180ng/ml、540ng/ml、1200ng/ml。
样本检测（与化学发光免疫法分别对比检测30个样本）：
按照实验操作步骤，向10μL样品中加入240μL的LP-PLA2试剂1，在37℃孵育3分钟，加入60μLLP-PLA2试剂2，37℃孵育10秒后在波长600nm读取吸光度A1，反应至5分钟时读取吸光度A2，计算两次吸光度变化值△A=A2-A1。通过与同样处理的校准液比较，计算出样品中的LP-PLA2浓度。从表3和图3（根据表3数据制图）结果可看出，该方法操作简单，所需时间在10分钟以内，与化学发光免疫法显示非常良好的相关性（相关性R2达到0.9996）。
表3
Figure BDA00002616517100111
实施例四
一）脂蛋白磷脂酶A2试剂1
Figure BDA00002616517100112
Figure BDA00002616517100121
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1000ml，然后用盐酸或氢氧化钠调PH至7.6。
二）脂蛋白磷脂酶A2试剂2
1.取220nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液稀释成0.01mg/ml的悬浮液；
2.按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC和40mg的NHS的比例加入EDAC和NHS，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
3.用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度为0.01mg/ml羧基胶乳微球悬浮液；
4.将鸡抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于50mmol/L、PH8.5的HEPES缓冲溶液中，使鸡抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为0.25mg/ml；
5.取步骤（3）中的羧基胶乳微球悬浮液1ml，立即加入步骤（4）中的鸡抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、鸡抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、0.125mg/ml、25mmol/L；
6.将混合物在37℃反应3小时，不断搅拌；
7.按1ml反应混合物加2.5μl乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应15分钟，不断搅拌；
8.用15000转/分离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH7.6的HEPES缓冲液稀释，使鸡抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度0.004ml/ml；然后加入牛血清白蛋白(稳定剂)5mmol/L、1.5mmol/L叠氮钠(防腐剂)溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶A2试剂2。
三）液体型LP-PLA2参考校准品
其余是纯化水
按照需要的LP-PLA2参考校准品浓度将相应的LP-PLA2纯品2000ng/ml加入上述缓冲液中，制得形成系列浓度的5个参考校准品；5个参考校准品中LP-PLA2含量由低到高分别为20ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml。
样本检测（与化学发光免疫法分别对比检测30个样本）：
按照实验操作步骤，向10μL样品中加入240μL的LP-PLA2试剂1，在37℃孵育3分钟，加入60μL LP-PLA2试剂2，37℃孵育10秒后在波长600nm读取吸光度A1，反应至5分钟时读取吸光度A2，计算两次吸光度变化值△A=A2-A1。通过与同样处理的校准液比较，计算出样品中的LP-PLA2浓度。从表4和图4结果（根据表4数据制图）可看出，该方法操作简单，所需时间在10分钟以内，与化学发光免疫法显示非常良好的相关性（相关性R2达到0.9997）。
表4
Figure BDA00002616517100131
以下是本发明LP-PLA2试剂测定操作步骤及在全自动生化分析仪上具体分析参数：
测定步骤
Figure BDA00002616517100132
Figure BDA00002616517100141
分析参数（以日立7080生化仪的参数为例）
方法：两点终点法，反应温度：37℃
主波长：520-600nm    副波长：800nm（可不选）
样品量：10μL，试剂1量/试剂2量：240μL/60μL
反应方向：正向（上升），定标方式：多点非线性
读点时间：分别为5点和21点（总反应时间相当420秒）
以日立7080生化仪的参数为例
仪器自动完成定标后即可进行脂蛋白磷脂酶A2的测定，仪器通过自动计算出相应的LP-PLA2浓度。
以上所述的仅是本发明的优选实施方案，对于本技术领城的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作为若干的改进和调整，这些改进的调整也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份：
a、脂蛋白磷脂酶A2试剂1
其余是纯化水
该试剂1的pH值为7.0-8.0；
b、脂蛋白磷脂酶A2试剂2
Figure FDA00002616517000012
其余是纯化水；
所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒，其中的羧基胶乳微球的粒径为20-500nm；
c、液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品
Figure FDA00002616517000013
其余是纯化水；
所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品包括5份形成LP-PLA2系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的LP-PLA2含量由低到高分别为1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml；或者，
所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品是单点浓度的LP-PLA2参考校准品。
2.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂,其特征在于所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸（TAPS）缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸（MOPSO）缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
3.根据权利要求2所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂,其特征在于所述试剂1中的缓冲液浓度20-200mmol/L，pH值7.0-8.0。
4.根据权利要求3所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂,其特征在于所述反应加速剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖。
5.根据权利要求4所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂,其特征在于所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质。
6.根据权利要求5所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂,其特征在于所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。
7.根据权利要求6所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂,其特征在于所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。
8.根据权利要求7所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂,其特征在于所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒的浓度为0.002-0.01ml/ml。
9.权利要求1所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂的制备方法，按照以下步骤进行：
1）脂蛋白磷脂酶A2试剂1：
按配方量将缓冲液、电解质、表面活性剂、反应加速剂、防腐剂、稳定剂以及纯化水混合均匀，调pH值至7.0-8.0；
2）脂蛋白磷脂酶A2试剂2：
（1）取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成浓度为0.01mg/ml的悬浮液；
（2）按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDAC羧基活化剂）和40mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHS）的比例，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
（3）用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，使其浓度为0.01mg/ml；
（4）将抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于缓冲溶液中，使抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为0.25mg/ml；
（5）取步骤（3）中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤（4）中的抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、0.125mg/ml、25mmol/L；
（6）将混合物在37℃反应3小时，不断搅拌；
（7）按1ml反应混合物加2.5μl的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应10-30分钟，不断搅拌；
（8）离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用缓冲液稀释，使抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒浓度为0.002-0.01ml/ml，然后加入稳定剂、防腐剂溶解混匀后即得脂蛋白磷脂酶A2试剂2；
3）液体型LP-PLA2参考校准品
先按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合并分成5份混合液，然后按照需要的LP-PLA2参考校准品浓度，将相应量的1000ng/ml的LP-PLA2纯品分别加入上述混合液中，获得形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的LP-PLA2含量由低到高分别为1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml；或者，
按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定量的1000ng/ml的LP-PLA2纯品，获得单点高浓度的LP-PLA2参考校准品，其LP-PLA2含量为50.0ng/ml或100.0ng/ml。
10.根据权利要求9所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂的制备方法，其特征在于所述离心处理采用离心机，离心机转速为15000转/分。
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