CN103031335A - 直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及诱导产生多巴胺样神经元的方法，尤其涉及直接将人的成纤维细胞转变成能产生神经递质多巴胺的神经元样细胞的方法及其用途。本方法包括步骤：选择诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子及其组合；构建携带转录因子病毒载体及介导转录因子转移；构建的病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定。本发明方法可以绕过现有技术中所涉及的多能干细胞的环节，直接从来源于自体的成纤维细胞诱导能产生多巴胺的神经细胞；直接诱导得到的神经细胞用于帕金森氏病大鼠动物模型，可以明显减轻帕金森氏病大鼠的运动障碍。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及诱导产生多巴胺样神经元的方法，尤其涉及直接将人的成纤维细胞转变成能产生神经递质多巴胺的神经元样细胞的方法及其用途。
背景技术
现有技术公开了神经递质多巴胺在维持人的正常运动和动作协调方面起重要作用，当产生多巴胺的神经元发生凋亡时，多巴胺的产生减少，患者将出现肌肉震颤，动作不协调甚至运动障碍，医学上称为帕金森氏病。目前还没有有效的药物能治疗帕金森氏病。有人尝试移植能产生多巴胺的神经元，可以明显减轻患者的症状。本领域公知，由于神经元是终末分化细胞，不能通过细胞分裂增殖的方法获得，因此，移植细胞来源于其他个体，如因外伤或疾病死亡的捐献者或胎儿。这类细胞很难获得，即使能够得到，由于来自其他个体，会引发免疫排斥反应，最终仍将导致移植细胞凋亡或死亡，治疗失败。因此，能从患者自体来源的细胞诱导出能产生多巴胺的神经细胞的方法显得非常重要。
如何从自体来源的细胞诱导出能产生多巴胺的神经细胞？有关研究通常尝试以下方法：一是从来源于自体的神经干细胞诱导产生，由于从自体获得神经干细胞也是非常困难的，因此，实际应用价值不大；二是从自体来源的成纤维细胞诱导产生多能干细胞，再诱导多能干细胞向多巴胺神经元分化。然而，目前的方法还不能完全诱导多能干细胞定向分化，值得注意的是，未完全分化的干细胞有产生畸胎瘤的危险！实际应用也存在限制。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷与不足，提供一种诱导产生多巴胺样神经元的方法，尤其涉及直接将人成纤维细胞转变成能产生神经递质多巴胺的神经元样细胞的方法。
本发明的另一目的是提供所述方法获得的神经元样细胞在制备减轻帕金森氏病大鼠的运动障碍制剂中的用途。
本发明的方法，可以绕过现有技术中所涉及的多能干细胞的环节，直接从来源于自体的成纤维细胞诱导能产生多巴胺的神经细胞，该直接诱导得到的神经细胞用于帕金森氏病大鼠动物模型，可以明显减轻帕金森氏病大鼠的运动障碍。
具体而言，本发明的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，其包括：
1)选择诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子及其组合，
本发明中，可以参与直接将人的成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的8个转录因子，它们是：Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B和EN1，本发明中，优选Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3的组合，更优选Mash1，Ngn2或Sox2转录因子或及其与其他因子的组合。
表1是八种参与诱导人成纤维细胞转变成多巴胺神经细胞的转录因子。
表1
2)构建相关的载体及介导转录因子转移，
构建携带Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B或EN1编码基因的慢病毒载体；构建携带Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1或Pitx3编码基因的腺病毒载体后，介导转录因子转移。所述的相关病毒载体构建示意图如图1所示；
3)病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定，
首先使用上述携带8个转录因子的慢病毒感染人成纤维细胞，然后将感染过的人成纤维细胞接种到由失活的小鼠成纤维细胞组成的饲养层细胞上(经过10GyX-射线照射)，10-20天后可见存活的人成纤维细胞变长，并发出突起，实验方法和步骤如图2所示；
免疫荧光染色结果显示，上述细胞开始表达神经元标志物Tuj1以及与多巴胺产生有关的酶，包括，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)，多巴脱羧酶(dopa decarboxylase，DDC)，多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)。但是，五羟色胺(serotonin)及乙酰胆碱(CHAT)，染色阴性。
表2是多巴胺神经元的鉴定指标。
表2
本发明中，采用RT-PCR方法证实了在转化后与多巴胺合成转运相关基因的表达可以增加500-1100倍；
本发明中，还采用所述的Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3的五个因子组合，在没有饲养层细胞的情况下仍然能够使人成纤维细胞转变成产生多巴胺的神经细胞，如图3所示。
本发明试验结果表明，不同转录因子在诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的意义和作用不同，在Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3(简称五因子组合)组合中，Mash1，Ngn2和Sox2三个因子是必不可少的，缺乏其中任何一个因子，无法产生多巴胺神经细胞；所述的Mash1是其中最重要的，缺乏Mash1不仅不能产生多巴胺神经细胞，甚至神经元标志物Tuj1染色呈阴性，表明甚至没有向神经元转变。然而，另外二个因子Nurr1和Pitx1单独缺乏或联合缺乏不影响形态转变细胞的数量或效率，但是，影响形态转化细胞伸出突起的数量，提示这二个因子主要在功能上影响转化细胞的成熟程度。
本发明试验结果表明，人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞是不依赖细胞增殖和干细胞转化的；本发明中，通过细胞增生、细胞凋亡等的检测，结果表明，人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞是不依赖细胞增殖和干细胞转化的，是一个直接的过程，如图4所示。
本发明中，试验了源自离体的人皮肤、肺等组织器官的成纤维细胞，通过上述五因子组合转导方法均可以成功转变为能产生多巴胺的神经细胞，结果表明，多种人来源的离体的成纤维细胞可以通过五因子组合转导方法，转变成能产生多巴胺的神经细胞。
本发明试验结果还表明，由人成纤维细胞转变成的多巴胺神经细胞，能摄入经过3H标记的多巴胺，高压液相分析，也能产生多巴胺；本发明中，经全细胞电生理记录表明这些细胞有伏特门依赖的钠通道激活；采用竞争性多巴胺受体拮抗剂raclopride，可诱发更大的动作电位，表明转化细胞产生大量的多巴胺，如图5所示。
本发明中，采用6-hydroxydopamin(6-OHDA)按常规方法制备Sprague-Dawley大鼠帕金森氏病动物模型，将上述由人成纤维细胞转变获得的多巴胺神经细胞用于病变大鼠的帕金森氏病动物模型中脑黑质区，与生理盐水的对照相比，结果显示，大鼠旋转行为障碍明显减轻，如图6所示；结果证实，本发明的由直接从人成纤维细胞诱导产生的多巴胺神经细胞能明显减轻多巴胺大鼠动物模型的运动障碍等症状。
本发明的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法的优点有：
1，可以绕过现有技术中所涉及的多能干细胞的环节，直接从来源于自体的成纤维细胞诱导能产生多巴胺的神经细胞；
2，直接诱导得到的神经细胞用于帕金森氏病大鼠动物模型，可以明显减轻帕金森氏病大鼠的运动障碍。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的方法进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1：携带转录因子的病毒载体构建示意图。
图2：诱导人成纤维细胞转变成多巴胺样神经元的方法示意图。
图3：经过五因子方法诱导的形态转变后的人成纤维细胞免疫荧光染色鉴定。
图4：人成纤维细胞转变成的多巴胺神经细胞不依赖细胞增殖和干细胞转化。
图5：人成纤维细胞转变成的多巴胺神经细胞的电生理特征。
图6：由人成纤维细胞转变成的多巴胺神经细胞能明显减轻多巴胺大鼠动物模型的运动障碍等症状。
具体实施方式
实施例1
1)选择转录因子：Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B和EN1及其组合，为诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子，所述转录因子其基因名称及基因编号如表1所示，
本发明中，可以参与直接将人的成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的8个转录因子，它们是：Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B和EN1，本发明中，优选Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3的组合，更优选Mash1，Ngn2或Sox2转录因子或及其与其他因子的组合。
表1
2)构建慢病毒载体，
构建携带Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B或EN1编码基因的慢病毒载体；构建携带Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1或Pitx3编码基因的腺病毒载体后，介导转录因子转移。所述的病毒载体构建示意图如图1所示；
3)病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定，
使用上述携带8个转录因子的慢病毒感染人成纤维细胞，然后将感染过的人成纤维细胞接种到由失活的小鼠成纤维细胞组成的饲养层细胞上(经过10GyX-射线照射)，10-20天后可见存活的人成纤维细胞变长，并发出突起；
实验方法和步骤包括：
(1)制备离体人成纤维细胞：携带有8个转录因子的慢病毒感染的人成纤维细胞；
(2)接种和基因转导期：将感染过的人成纤维细胞接种到由失活的小鼠成纤维细胞(经10GyX-射线照射)组成的饲养层细胞上，培养2天；
(3)换液和细胞转变期：步骤2后改用神经元特异培养基更换细胞培养液，每间隔2天一次，连续6次；
(4)鉴定：10-20天后，存活的人成纤维细胞变长，并有突起，经免疫荧光染色法结果显示，上述细胞表达神经元标志物Tuj1以及与多巴胺产生有关的酶，包括，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)，多巴脱羧酶(dopadecarboxylase，DDC)，多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)。但是，五羟色胺(serotonin)及乙酰胆碱(CHAT)，染色阴性。多巴胺神经元的鉴定指标如表2所示。
表2
采用RT-PCR方法证实了在转化后与多巴胺合成转运相关基因的表达可以增加500-1100倍；
本试验通过细胞增生、细胞凋亡等的检测，结果表明，人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞是不依赖细胞增殖和干细胞转化的；本发明中，，结果表明，人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞是不依赖细胞增殖和干细胞转化的，是一个直接的过程。
本发明试验结果还表明，由人成纤维细胞转变成的多巴胺神经细胞，能摄入经过3H标记的多巴胺，高压液相分析，也能产生多巴胺；本发明中，经全细胞电生理记录表明这些细胞有伏特门依赖的钠通道激活；采用竞争性多巴胺受体拮抗剂raclopride，可诱发更大的动作电位，表明转化细胞产生大量的多巴胺，如图5所示。
实施例2
1)选择转录因子：Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3的组合为诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子，所述转录因子其基因名称及基因编号如表1所示，
表1
2)构建腺病毒载体，
构建携带Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1或Pitx3编码基因的腺病毒载体后，介导转录因子转移。所述的病毒载体构建示意图如图1所示；
3)病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定，
使用上述携带5个转录因子的腺病毒感染人成纤维细胞，然后将感染过的人成纤维细胞接种到由失活的小鼠成纤维细胞组成的饲养层细胞上(经过10GyX-射线照射)，10-20天后可见存活的人成纤维细胞变长，并发出突起；
实验方法和步骤包括：
(2)制备离体人成纤维细胞：携带有5个转录因子的腺病毒感染的人成纤维细胞；
(2)接种和基因转导期：将感染过的人成纤维细胞接种到由失活的小鼠成纤维细胞(经10GyX-射线照射)组成的饲养层细胞上，培养2天；
(3)换液和细胞转变期：步骤2后改用神经元特异培养基更换细胞培养液，每间隔2天一次，连续6次；
(4)鉴定：10-20天后，存活的人成纤维细胞变长，并有突起，经免疫荧光染色法结果显示，上述细胞表达神经元标志物Tuj 1以及与多巴胺产生有关的酶，包括，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)，多巴脱羧酶(dopadecarboxylase，DDC)，多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)。但是，五羟色胺(serotonin)及乙酰胆碱(CHAT)，染色阴性。多巴胺神经元的鉴定指标如表2所示。
表2
本试验采用RT-PCR方法证实了在转化后与多巴胺合成转运相关基因的表达可以增加500-1100倍；
本试验通过细胞增生、细胞凋亡等的检测，结果表明，人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞是不依赖细胞增殖和干细胞转化的，是一个直接的过程。
本发明试验结果还表明，由人成纤维细胞转变成的多巴胺神经细胞，能摄入经过3H标记的多巴胺，高压液相分析，也能产生多巴胺；本发明中，经全细胞电生理记录表明这些细胞有伏特门依赖的钠通道激活；采用竞争性多巴胺受体拮抗剂raclopride，可诱发更大的动作电位，表明转化细胞产生大量的多巴胺，如图5所示。
实施例3
1)选择转录因子：Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3的组合为诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子，所述转录因子其基因名称及基因编号如表1所示，
2)构建腺病毒载体，
构建携带Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1或Pitx3编码基因的腺病毒载体后，介导转录因子转移；在没有饲养层细胞的情况下，仍然能够使人成纤维细胞转变成产生多巴胺的神经细胞，10-20天后可见存活的人成纤维细胞变长，并发出突起；如图3所示。
实验方法和步骤包括：
(1)制备离体人成纤维细胞：携带有5个转录因子的腺病毒感染的人成纤维细胞；
(2)接种和基因转导期：将感染过的人成纤维细胞接种到细胞培养液，培养2天；
(3)换液和细胞转变期：步骤2后改用神经元特异培养基更换细胞培养液，每间隔2天一次，连续6次；
(4)鉴定：10-20天后，存活的人成纤维细胞变长，并有突起，经免疫荧光染色法结果显示，上述细胞表达神经元标志物Tuj1以及与多巴胺产生有关的酶，包括，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)，多巴脱羧酶(dopadecarboxylase，DDC)，多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)。但是，五羟色胺(serotonin)及乙酰胆碱(CHAT)，染色阴性。多巴胺神经元的鉴定指标如表2所示。
本试验采用RT-PCR方法证实了在转化后与多巴胺合成转运相关基因的表达可以增加500-1100倍；
本试验通过细胞增生、细胞凋亡等的检测，结果表明，人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞是不依赖细胞增殖和干细胞转化的，是一个直接的过程。
实施例4
采用6-hydroxydopamin(6-OHDA)按常规方法制备Sprague-Dawley大鼠帕金森氏病动物模型，将上述实施例中由人成纤维细胞转变获得的多巴胺神经细胞用于病变大鼠的帕金森氏病动物模型中脑黑质区，与生理盐水的对照相比，结果显示，大鼠旋转行为障碍明显减轻，如图6所示；结果证实，本发明的由直接从人成纤维细胞诱导产生的多巴胺神经细胞能明显减轻多巴胺大鼠动物模型的运动障碍等症状。
Claims (7)
1.直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，其包括步骤：
1)选择诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子及其组合；
2)构建携带转录因子病毒载体及介导转录因子转移；
3)将步骤2)的病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定。
2.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤1)的转录因子及其组合是，Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B和EN1及其组合。
3.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤1)的转录因子及其组合是Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1和Pitx3的组合。
4.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤1)的转录因子及其组合是Mash1，Ngn2或Sox2转录因子或其与其他因子的组合。
5.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤2)的携带转录因子病毒载体是携带Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1，Pitx3，Lmx1A，Lmx1B或EN1编码基因的慢病毒载体，或携带Mash1，Ngn2，Sox2，Nurr1或Pitx3编码基因的腺病毒载体。
6.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤3)的病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定通过下述方法：
用构建的携带转录因子的病毒感染人离体成纤维细胞后，将感染过的人成纤维细胞接种到由失活的小鼠成纤维细胞组成的饲养层细胞上或细胞培养液培养，存活的人成纤维细胞，经免疫荧光染色法鉴定所述细胞表达神经元标志物Tuj1以及与多巴胺产生有关的酶。
7.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的与多巴胺产生有关的酶包括，酪氨酸羟化酶，多巴脱羧酶和多巴胺转运体。
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