CN103031283B - 甜叶菊酶vi及莱鲍迪苷a转化为莱鲍迪苷d的方法 - Google Patents
甜叶菊酶vi及莱鲍迪苷a转化为莱鲍迪苷d的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及属食品化工领域，具体涉及以RA为原料，由RA转化为RD的方法，其关键在于催化剂甜叶菊酶VI及其制备方法。本发明转化方法为：A、将纯度为＞90％的RA按1∶6～1∶10m/v的重量体积比加水溶解；B、按下述重量配比加入UDP-Glu，RA∶UDP-Glu＝15∶5～15∶9；C、按下述重量配比加入甜叶菊酶VI，RA∶甜叶菊酶VI＝800-1200∶1(优选1000∶1)，然后在40～60℃、pH 6～8下反应3～7h；D、过滤反应液，干燥即得含有RD的固形物。RA转化为RD的转化率≥70％，固形物中RD含量为60％-70％，进一步分离纯化后可达80％，甚至可大于90％。
Description
技术领域
本发明涉及属食品化工领域，具体涉及以莱鲍迪苷A为原料，由莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其关键在于催化剂甜叶菊酶VI及其制备方法。
背景技术
甜菊糖苷是对甜叶菊提取物的一个总称，其甜味成分包括甜菊苷(Stevioside)，莱鲍迪苷A、B、C、D、E(ebaudioside A/B/C/D/E)，甜菊双糖苷(Steviolbioside)，杜克苷A(DulcosideA)等。甜叶菊源产于南美洲，已经有几百年的使用历史。甜菊糖苷甜度高，热量低的特点正好符合了现代人生活的需要。我国卫生部1985年6月5日(85)卫防字第37号文，批准甜菊糖苷列为新增食品添加剂品种。世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JointFAO/WHO Expert Committee on Food AdditVIes，JECFA)也已经确认了其安全性。
但传统甜菊糖苷由于成分复杂，杂质多，使其具有后苦味，这影响了它的广泛使用和市场空间。研究表明，甜菊糖苷中不同糖苷成分的口感存在较为明显的差异，表1中列举了其不同糖苷的相对甜度及相对甜质值。(Pure&Appl.Chem.，Vol.69，No.4，pp.675-683，1997.)
表1甜菊糖苷成分相对甜度及相对甜质
莱鲍迪苷A，Rebaudioside A(以下简称RA)是一种在传统甜菊糖苷基础上进一步纯化得到的甜味剂，既有甜度高、口感好、安全性佳的特点。RA分子结构式见式1。但RA与蔗糖相比，口感上还是有所差异，RA有微弱的后苦味，起甜速度和回甜速度与蔗糖也有差别。
式1RA结构式
莱鲍迪苷D，Rebaudioside D(以下简称RD)和RA有相同的母核结构(甜菊醇)，但RD较RA在19位侧链上多连接了一个葡萄糖分子。RD分子结构式见式2。实验中发现，RD在口感上非常接近于蔗糖，没有后苦味。但是RD在甜菊糖苷中的含量远远小于1％，如果通过纯化甜菊糖苷来生产RD，其成本很高，难以大量生产和推广使用。
式2RD结构式
迄今为止，还没有以RA为原料，通过酶生物转化、超滤等技术方法生产RD的报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种以莱鲍迪苷A为原料，由莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法。
具体地，本发明转化方法是由下述步骤完成：
A、将纯度为＞90％的莱鲍迪苷A按1∶6～1∶10m/v的重量体积比加水溶解；
B、按下述重量配比加入尿嘧啶二磷酸葡萄糖，莱鲍迪苷A∶尿嘧啶二磷酸葡萄糖＝15∶5～15∶9；
C、按下述重量配比加入甜叶菊酶VI，莱鲍迪苷A∶甜叶菊酶VI＝800-1200∶1(优选1000∶1)，然后在40～60℃、pH 6～8下反应3～7h；
D、过滤反应液，干燥即得含有莱鲍迪苷D的固形物。固形物中莱鲍迪苷D含量为60％-70％。
具体的，步骤D过滤反应液，干燥即得含有莱鲍迪苷D的固形物：可以先将反应液浓缩后，再采用常见方法干燥获得含有莱鲍迪苷D的固形物。
为了提高固形物中莱鲍迪苷D的含量和纯度，分离其中的甜叶菊酶VI，在步骤D过滤反应液时采用8-12kD超滤膜过滤，其目的是分离反应液中的莱鲍迪苷D和甜叶菊酶VI，由于甜叶菊酶VI分子量为50～56kD，故甜叶菊酶VI不会通过超滤膜。经超滤膜过滤得到超滤透过液经浓缩处理后，可采用常规干燥方法即可获得莱鲍迪苷D纯度较高的固形物。
为了进一步分离、纯化得到高纯度的莱鲍迪苷D，超滤膜过滤宜将跨膜压力控制在0.5～1.5MPa。而浓缩超滤透过液时，宜控制在60-80℃，避免温度过高而影响莱鲍迪苷D的得率。固形物中莱鲍迪苷D含量为70％-80％。
为了避免原料浪费及利于环境保护，还可以将超滤分离后甜叶菊酶VI采用有机溶液变性沉淀、分子筛层析等方法就分离、回收。
UDP-Glc作为原料之一，由于其物理化学性质与莱鲍迪苷D差异较大，故反应后还可以采用柱层析和结晶等方式去除未反应的UDP-Glc以及反应后的UDP。当固形物中去除了UDP-Glc、UDP、甜叶菊酶VI后，固形物中莱鲍迪苷D含量为80-90％，甚至可大于90％。
本发明转化方法的关键之处在于：利用尿嘧啶二磷酸葡萄糖作为糖供体，由甜叶菊酶VI作为催化剂将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D。
作为本发明转化方法中的关键因子甜叶菊酶VI，它是从甜叶菊植株中提取得到的一种特异性UDP-Glu糖基转移酶。具体的，它是利用下述方法得到的：
(1)将甜叶菊叶片与pH值为7.0-9.0磷酸盐缓冲液按1∶2-1∶4m/v的重量体积比混合，于30-50℃浸泡0.5-1h后进行细胞壁破碎1-2h，得细胞浆；
(2)离心步骤(1)所得细胞浆，取上清液过超滤膜，超滤膜规格为8-12kD，跨膜压力控制在1.0-1.5MPa，收集截留液；
(3)使用葡聚糖凝胶按分子量对步骤(2)所得截留液分段，其中分子量在50～56kD的酶即为甜叶菊酶VI。
优选的，甜叶菊酶VI的制备方法如下：
(1)将甜叶菊叶片与pH值为8.0磷酸盐缓冲液按1∶3m/v的重量体积比混合，于40℃浸泡0.5h后进行细胞壁破碎1h，得细胞浆；
(2)离心步骤(1)所得细胞浆，取上清液过超滤膜，超滤膜规格为10kD，跨膜压力控制在1.5MPa，收集截留液；
(3)使用葡聚糖凝胶按分子量对步骤(2)所得截留液分段，其中分子量在50～56kD的酶即为甜叶菊酶VI。
应用上述酶催化及分离方法，以莱鲍迪苷A为原料得到莱鲍迪苷D的转化率≥70％，固形物中莱鲍迪苷D含量至少可达60％，进一步分离纯化后可达80％，甚至可＞90％，莱鲍迪苷D的口感无异味，与蔗糖非常相似，可单独作为甜味剂使用，以此方法生产RD成本低，易放大，适用于工业生产。
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。
在具体实施方式中，莱鲍迪苷A简称为RA，莱鲍迪苷D简称为RD，尿嘧啶二磷酸葡萄糖简称UDP-Glu。
以下是针对本发明转化方法中关键参数进行的筛选试验。
试验例1反应底物条件对RD转化的影响
实施例1～9为考察反应底物条件对RA生物转化的影响，以正交试验方法进行实验，分别将9份20g RA(95％)按表2条件(1∶6～1∶10m/v、10～40℃、搅拌速度60～120rpm、搅拌时间30～60min)进行反应底物准备。准备后，再按照RA干粉与UDP-Glu的比例15∶7，1000∶1m/m(RA干粉∶甜叶菊酶VI)的重量比量加入甜叶菊酶VI，在pH值7、50℃条件下保温5h的进行酶催化的生物转化。生物转化反应后将反应液过10kD规格超滤膜，跨膜压力控制在1.5MPa，并分别取透过液，采用国标GB8270-1999中的HPLC检测方法，检测RD的生成量，并计算RD转化率，结果见表2。
表2反应底物条件试验方案及结果分析
本发明不限于实施例中RD的特定转化率、纯度及溶解RA干粉的特定条件。
试验例2生物转化条件对RD转化的影响
实施例10～18为考察生物转化条件对RD转化率的影响，以生物转化条件因素进行正交实验。首先，别将9份20g RA(90％)按表3条件，将RA干粉与水的比例1∶8，搅拌时间45min，溶解温度25℃，搅拌速度90rpm进行反应底物准备。然后按RA∶甜叶菊酶VI＝1000∶1m/m加入甜叶菊酶VI，再按照表2条件(RA∶UDP-Glu＝15∶5～15∶9m/m、温度40～60℃、酸碱度pH 6～8、反应时间3～7h)进行生物转化的正交试验。生物转化反应后将反应液过10kD规格超滤膜，跨膜压力控制在1.5MPa，并分别取透过液，采用国标GB8270-1999中的HPLC检测方法，检测RD的生成量，并计算RD转化率，结果见表3。
表3生物转化条件对RD转化率的影响
本发明不限于实施例中RD的特定转化率、纯度及酶处理RA的特定条件。
试验例3考察超滤跨膜压力对甜叶菊酶VI回收的影响
为考察超滤跨膜压力对甜叶菊酶VI的回收，分三个梯度选择适宜超滤跨膜压力。用500g95％RA干粉与水的比例1∶10，40℃搅拌时间1h溶解，RA干粉与UDP-Glu的比例15∶7，按照1000∶1m/m(RA干粉∶甜叶菊酶VI)的重量比量加入甜叶菊酶VI，反应温度50℃，pH值7，反应时间7h的条件进行酶处理。将酶处理液过10kD规格超滤膜，跨膜压力分别控制在0.5MPa，1.0MPa，1.5MPa，并分别取截留液和透过液检测其固形物含量，考察超滤跨膜压力对甜叶菊酶VI回收的影响，结果见表4。
表4超滤跨膜压力对甜叶菊酶VI回收的影响
当超滤跨膜压力在0.5～15MPa时，酶改甜菊糖可以透过10kD规格超滤膜，起到甜叶菊酶VI与RD分离的效果，同时可以回收甜叶菊酶VI。
本发明不限于实施例中RD的特定转化率、醇度及超滤跨膜压力的特定条件。
实施例4考察过滤、浓缩法对固形物RD含量的影响
按照实施例1-18的转化方法得到反应液后，若采用滤纸过滤，干燥，得到固形物A；若采用10kD规格超滤膜超滤，干燥超滤透过液得到固形物B；若采用将超滤液再结晶后干燥得到固形物C，采用国标GB8270-1999中的HPLC检测方法检测RD，结果见表5。
表5
从表5可见，固形物A中莱鲍迪苷D含量至少可达60％，进一步精制后的固形物C红RD可达80％，甚至可大于90％。
综上，应用上述酶催化及分离方法，以莱鲍迪苷A为原料得到莱鲍迪苷D的转化率≥70％，固形物中莱鲍迪苷D含量至少可达60％，进一步分离纯化后可达80％，甚至可大于90％，莱鲍迪苷D的口感无异味，与蔗糖非常相似，可单独作为甜味剂使用，以此方法生产RD成本低，易放大，适用于工业生产。
Claims (9)
1.莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：其步骤如下：
A、将纯度为>90%的莱鲍迪苷A按1:6~1:10 m/v的重量体积比加水溶解；
B、按下述重量配比加入尿嘧啶二磷酸葡萄糖，莱鲍迪苷A:尿嘧啶二磷酸葡萄糖= 15:5~15:9；
C、按下述重量配比加入甜叶菊酶VI：莱鲍迪苷A 800-1200份、甜叶菊酶VI 1份，然后在40~60℃、pH 6~8下反应3~7h；
D、过滤反应液，干燥即得含有莱鲍迪苷D的固形物；
其中，甜叶菊酶VI是从甜叶菊的叶中提取得到，制备方法如下：
（1）将甜叶菊叶片与pH值为7.0-9.0磷酸盐缓冲液按1:2-1:4 m/v的重量体积比混合，于30-50℃浸泡0.5-1 h后进行细胞壁破碎1-2 h，得细胞浆；
（2）离心步骤（1）所得细胞浆，取上清液过超滤膜，超滤膜规格为8-12 kD，跨膜压力控制在1.0-1.5MPa，收集截留液；
（3）使用葡聚糖凝胶按分子量对步骤（2）所得截留液分段，其中分子量在50~56kD的酶即为甜叶菊酶VI。
2.根据权利要求1所述的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：步骤A中莱鲍迪苷A加水溶解时，水温控制在30~40℃。
3.根据权利要求1所述的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：步骤A中莱鲍迪苷A加水溶解后，以60~120rpm的速度搅拌30~60 min。
4.根据权利要求1所述的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：步骤D过滤反应液时采用8-12kD超滤膜过滤。
5.根据权利要求4所述的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：步骤D过滤反应液后，浓缩处理。
6.根据权利要求5所述的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：所述浓缩条件为在60-80℃浓缩反应液。
7.根据权利要求1所述的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：步骤C按下述重量配比加入甜叶菊酶VI：莱鲍迪苷A 1000份、甜叶菊酶VI 1份。
8.根据权利要求1所述的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：步骤D过滤时跨膜压力控制在0.5~1.5MPa。
9.根据权利要求1所述的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：甜叶菊酶VI是从甜叶菊的叶中提取得到，制备方法如下：
（1）将甜叶菊叶片与pH值为8.0磷酸盐缓冲液按1:3 m/v的重量体积比混合，于40℃浸泡0.5h后进行细胞壁破碎1h，得细胞浆；
（2）离心步骤（1）所得细胞浆，取上清液过超滤膜，超滤膜规格为10kD，跨膜压力控制在1.5MPa，收集截留液；
（3）使用葡聚糖凝胶按分子量对步骤（2）所得截留液分段，其中分子量在50~56kD的酶即为甜叶菊酶VI。
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