CN103014053B - 集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具体涉及集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用。集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。本发明还公开该集胞藻高效双同源重组载体的构建方法与应用。本发明所述集胞藻高效双同源重组载体在集胞藻PCC6803中过表达集胞藻PCC6803Delta 15、Delta15和Delta 6脂肪酸去饱和酶基因可明显提高集胞藻中十八碳四烯酸的含量。
Description
技术领域
本发明涉及具体涉及集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用，特别涉及一种集胞藻PCC6803遗传转化高效双同源重组载体及其构建方法与在集胞藻PCC6803脂肪酸合成中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
蓝藻(cyanobacteria)又称蓝细菌，是一类能进行光合作用的原核生物。蓝藻细胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包含体，并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.strainPCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核生物反应器大规模生产，是很好的蓝藻基因工程受体。
鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化、不含毒素、藻细胞培养成本低且不容易污染等的优点，随着藻类基因工程的发展，使利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产药物等高附加值产品成为可能。
蓝藻基因改造大体分为三个阶段：第一，外源DNA通过基因转移系统进入宿主细胞；第二，外源DNA在宿主细胞中稳定复制并得以表达；第三，外源DNA与宿主细胞染色体或内源质粒结合，或者在宿主细胞中进行自主复制。外源DNA进入蓝藻细胞在以下几种情况下可以稳定存在：首先，外源基因重组进宿主染色体；其次，外源基因重组进宿主内源质粒；第三，外源基因以质粒形式存在并且能自主复制。
同源重组分单交换形式和双交换两种类型。其中同源重组双交换载体是在外源基因两侧均有一段与宿主细胞染色体同源的片段，当重组质粒进入宿主细胞后，载体上外源基因两端的同源序列分别与宿主细胞内染色体的相应部位发生交换。这样，重组载体上的外源基因就随着同源序列进而整合进宿主细胞染色体上，载体上其余片段没有进入宿主细胞染色体中。所以，外源基因在外源基因的表达单元自带的调控元件的作用下表达或者在宿主染色体调控下表达。因为同源重组载体中不含蓝藻中复制的起始位点，所以在宿主细胞内会因为无法复制继而渐渐丢失。
同源重组整合载体上没有能在藻细胞中自主复制的复制子，不能独立复制，但含有与宿主染色体同源序列，质粒载体进入宿主细胞以后，可通过与宿主细胞染色体同源序列发生同源重组单交换或者双交换，进而将外源基因整合到宿主细胞染色体上，以低拷贝数基因存在并表达。
目前集胞藻PCC6803遗传转化方法已经很成熟，而其双同源重组载体构建方法种类繁多，但国内外对同源重组载体启动子兼做的上游臂且高效表达外源基因的报道很少。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种集胞藻PCC6803遗传转化高效双同源重组载体及其构建方法与在集胞藻PCC6803脂肪酸合成中的应用。
本发明技术方案如下：
集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。
上述集胞藻高效双同源重组载体的构建方法，步骤如下：
（1）PCR扩增集胞藻PCC 6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段作为psbA2启动子基因片段、Genbank登录号为X13547.1的集胞藻PCC 6803的psbA2ORF基因片段、Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌终止子T1T2基因片段、Genbank登录号为D13780.1的集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸脱氢酶基因片段和Genbank登录号为L11421.1的集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段；
（2）将步骤（1）获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤（1）制得的集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸脱氢酶基因片段和集胞藻PCC6803 Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta 6；
（3）将步骤（1）制得的大肠杆菌终止子T1T2基因片段用PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接，得到质粒pBluescript SK T1T2；
然后将步骤（1）制得的psbA2ORF基因片段用SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescript SK T1T2连接，得到质粒pBluescript SK T1T2-downstream；
对质粒pBluescript SK T1T2-downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescript SK T1T2-downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接，得到质粒pBluescript SK T1T2-npt-downstream；
（4）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+Delta15，或者，基因片段Promotor+Delta15和基因片段Promotor+Delta6插入步骤（3）制得的质粒pBluescript SKT1T2-npt-downstream中，制得重组载体；
（5）将步骤（4）制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻；
（6）将步骤（5）制得的转基因集胞藻在20～30℃条件下通气培养8～12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为：
Promotor-F:5’-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’；
Promotor-R：5’-CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA2ORF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为：
psbA2-F：5’-CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’；
psbA2-R：5’-AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸脱氢酶基因的引物为：
Sy15-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’；
Sy15-R：5’-CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，PCR扩增花生硫脂酶基因Delta6的引物为：
Sy6-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG-3’；
Sy6-R：5’-GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中集胞藻PCC 6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，集胞藻PCC6803psbA2ORF基因psbA2的核苷酸序列SEQ ID NO.2所示，集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸脱氢酶基因Sy15的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸脱氢酶基因Sy6的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
根据本发明优选的，所述步骤（3）中质粒pBluescript SK T1T2的制备方法，具体如下：
扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2（购自Clontech公司），在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为：
T1T2-F：5’—ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’；
T1T2-R：5’—TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存；获得的片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接，得到质粒pBluescript SK T1T2。
上述集胞藻高效双同源重组载体在制备二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）中的应用。
本发明通过对集胞藻PCC6803psbA2基因ATG前510bp片段作为同源重组载体启动子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段为下游臂，将集胞藻PCC6803脂肪酸代谢相关的基因Delta15和Delta6脂肪酸脱氢酶基因进行过量表达，增强集胞藻PCC6803中Delta15和Delta6脂肪酸脱氢酶基因的表达，转花生硫脂酶基因的集胞藻PCC6803中脂肪酸含量有明显变化，并具有较强的低温耐受性。
本发明人根据先前登陆Genbank的集胞藻PCC6803脂肪酸脱氢酶基因序列（Delta15：D13780.1；DeltaDelta6：L11421.1），通过PCR方法，扩增两类集胞藻PCC6803脂肪酸脱氢酶基因编码区全长序列，其中Delta15基因全长序列为1080个碱基，编码359个氨基酸，Delta6基因全长序列为1080个碱基，编码359个氨基酸。分别将克隆Delta15脂肪酸脱氢酶基因（Delta15）及Delta 15和Delta 6脂肪酸脱氢酶基因连接在构建好的双同源重组表达载体pBluescript SK T1T2-npt-downstream上，并转化至集胞藻PCC6803中，得到转基因集胞藻。在转基因集胞藻中油酸含量明显高于野生型。
本发明用于构建双同源重组表达载体的集胞藻PCC6803脂肪酸脱氢酶基因的光诱导启动子psbA2基因序列如SEQ ID NO：1所示；下游臂psbA2ORF序列如SEQ ID NO：2所示；大肠杆菌T1T2终止子序列如SEQ ID NO：3所示；Delta15的cDNA序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；Delta6的cDNA序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
有益效果
（1）本发明提供了一种集胞藻PCC6803双同源重组载体及其构建方法与应用，该重组载体利用集胞藻PCC6803中psbA2基因ATG前510bp片段作为启动子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段为下游臂，将集胞藻PCC6803脂肪酸代谢相关的基因Delta15和Delta6脂肪酸脱氢酶基因进行过量表达，结果表明，在集胞藻PCC6803中过表达集胞藻PCC6803Delta 15、Delta15和Delta 6脂肪酸去饱和酶基因可明显提高集胞藻中十八碳四烯酸的含量；
（2）本发明首次在集胞藻PCC6803中过表达Delta15和Delta6脂肪酸脱氢酶基因，对于提高集胞藻PCC6803总脂肪酸含量、增强其生物量具有重要意义，为集胞藻PCC6803中多不饱和脂肪酸的研究提供了理论支持；
（3）本发明中应用的基因可以为微藻及植物脂肪酸研究提供支持，为进行大规模生产EPA和DHA提供理论依据和实验方案。
附图说明
图1为集胞藻PCC6803双同源重组载体结构图；
图2为30℃混养条件下Delta15脂肪酸脱氢酶基因在转基因集胞藻PCC6803中的Western blot电泳图；
其中：1、野生型集胞藻PCC6803；2、转基因藻pSDSy15；
图3为20℃混养条件下Delta15脂肪酸脱氢酶基因在转基因集胞藻PCC6803中的Western blot电泳图；
其中：1、野生型集胞藻PCC6803；2、转基因藻pSDSy15；
图4为30℃混养条件下Delta15脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸脱氢酶基因在转基因集胞藻PCC6803中表达的Western blot电泳图；
其中：1：野生型集胞藻PCC6803；2：转基因藻pSDSy15Sy6；
图5为30℃混养条件下Delta15脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸脱氢酶基因在转基因集胞藻PCC6803中表达的Western blot电泳图；
其中：1：野生型集胞藻PCC6803；2：转基因藻pSDSy15Sy6；
图6为30℃混养条件下Delta15脂肪酸脱氢酶基因在转Delta15脂肪酸脱氢酶基因集胞藻PCC6803中的表达分析；
图7为20℃混养条件下Delta15脂肪酸脱氢酶基因在转Delta15脂肪酸脱氢酶基因集胞藻PCC6803中的表达分析；
图8为30℃混养条件下转集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸脱氢酶基因在转Delta15和Delta6脂肪酸脱氢酶基因集胞藻PCC6803中的表达分析；
图9为20℃混养条件下转集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸脱氢酶基因在转Delta15和Delta6脂肪酸脱氢酶基因集胞藻PCC6803中的表达分析；
图10为30℃混养条件下转集胞藻Delta15脂肪酸去饱和酶基因藻株脂肪酸成分气相色谱分析；
图11为20℃混养条件下转集胞藻Delta15脂肪酸去饱和酶基因藻株脂肪酸成分气相色谱分析；
图12为30℃混养条件下转集胞藻Delta15脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸去饱和酶基因藻株脂肪酸成分气相色谱分析；
图13为20℃混养条件下转集胞藻Delta15脂肪酸去饱和酶基因和Delta6脂肪酸去饱和酶基因藻株脂肪酸成分气相色谱分析。
具体实施方式
下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实验材料来源：
大肠杆菌菌株（Escherichia coli）DH5α及T3载体购自北京全式金生物技术有限公 司；
野生型集胞藻PCC6803购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库；
质粒pKK233-2购自Clontech公司；
质粒pSDpbluescript SK购自天津博美科生物技术有限公司；
质粒PUC4k购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；
其它所使用的酶、试剂及试剂盒等均为市售产品。
实施例1
分离克隆用于构建转集胞藻PCC6803表达载体的集胞藻Delta15脂肪酸去饱和酶基因Delta15和Delta6脂肪酸去饱和酶基因Delta6的cDNA片段、双同源重组片段psbA2启动子、psbA2ORF cDNA片段和大肠杆菌终止子T1T2cDNA片段。
集胞藻PCC 6803的psbA2启动子基因片段克隆：
根据GenBank登陆的集胞藻PCC 6803（登录号：BA000022，AP012205）中psbA2ORF前端序列设计引物，将psbA2ORF前500bp作为启动子序列（序列如SEQ ID NO：1，Synchocystis sp.PCC6803所示），设计PCR引物:
Promotor-F:5’-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’，
Promotor-R：5’-CATTTGGTTATAATTCCTT ATGTAT-3’，
扩增程序如下:94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序，获得集胞藻PCC 6803的psbA2启动子基因片段。
集胞藻PCC6803psbA2ORF基因片段克隆：
根据GenBank登陆的集胞藻PCC6803（登录号：BA000022，AP012205，序列如SEQ ID NO：2，Synchocystis sp.PCC6803所示）中psbA2ORF cDNA序列设计引物：
psbA2-F：5’-CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’；
psbA2-R：5’-AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得集胞藻PCC6803psbA2ORF基因片段。
大肠杆菌T1T2终止子片段克隆：
根据GenBank登陆的大肠杆菌T1T2（U02439.1）片段序列（序列如SEQ ID NO：3，）设计引物：
T1T2-F：5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；
T1T2-R：5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存；
基因片段Promotor+Delta15克隆：
根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803Delta15序列（登录号为：D13780.1）设计扩增引物，所用引物为：
Sy15-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’；
Sy15-R：5’-CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得集胞藻PCC6803的Delta15基因片段。
分别取psbA 2启动子基因片段和Delta15基因片段2μl为模板，进行融合PCR反应，扩增程序为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃5min，2个循环；加入引物Promotor-F和Delta15-R各0.5μl，进行如下扩增程序：94℃30s，55℃30s，72℃3min，25个循环；72℃10min，4℃保存。连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得基因片段Promotor+Delta15。
基因片段Promotor+Delta6克隆：
根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803含有Delta6序列（登录号为：L11421.1）设计扩增引物，所用引物为：
Sy6-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG-3’；
Sy6-R：5’-GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得集胞藻PCC6803的Delta6基因片段。
分别取psbA 2启动子和Delta6基因片段2μl为模板，进行融合PCR反应，所用程序为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃5min，2个循环；加入引物Promotor-F和Delta15-R各0.5μl，进行如下扩增程序：94℃30s，55℃30s，72℃3min，25个循环，72℃10min，4℃保存。连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得基因片段Promotor+Delta6。
实施例2
转集胞藻PCC6803双同源重组表达载体的构建及转化
通过过表达技术使在集胞藻PCC6803中过量表达集胞藻PCC6803的Delta15基因片段和Delta6基因片段，根据转基因阳性集胞藻的表型和脂肪酸组成研究集胞藻PCC6803双同源从组载体的构建方法及在脂肪酸合成中的应用。
质粒pBluscript SK plus-T1T2的制备：
扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2（购自Clontech公司），在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为：
T1T2-F：5’—ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’；
T1T2-R：5’—TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存；获得基因片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接，得到质粒pBluescript SK T1T2。
转集胞藻PCC6803表达载体的构建方法如下：
将实施例1制得的psbA2ORF阳性克隆（含psbA2ORF基因片段）用SacII和SacI双酶切，回收psbA2ORF基因片段；用同样的方法双酶切质粒pBluescript SK T1T2回收载体片段1。用回收的psbA2ORF基因片段和载体片段1做连接反应，转化大肠杆菌DH5α。通过筛选阳性克隆，获得前期载体，命名为pBluescript SK T1T2-downstream。
将质粒PUC4k用BamHI单酶切，回收卡那霉素抗性npt片段，质粒pBluescript SKT1T2-downstream用BamHI单酶切，回收载体片段2。用回收的npt片段和载体片段2做连 接反应，转化大肠杆菌DH5α，通过酶切筛选阳性克隆，获得卡那霉素抗性载体，命名为pBluescript SK T1T2-npt-downstream。
将实施例1中得到的阳性克隆Promotor+Delta15、Promotor+Delta6质粒DNA分别用SalI酶切，回收基因片段Promotor+Delta15和基因片段Promotor+Delta6。同样，对含有T1T2终止子且具有卡那霉素抗性的质粒pBluescript SK T1T2-npt-downstream进行Sal I单酶切，回收载体片段3。分别将基因片段Promotor+Delta15和基因片段Promotor+Delta6和载体片段3做连接反应，转化大肠杆菌DH5α。通过酶切筛选阳性克隆，获得集胞藻PCC6803原核表达载体，分别命名为表达载体pSDSy15（见图1A）、表达载体pSDSy6。将pSDSy6质粒经NdeI和SacII双酶切后，分别连入经相同双酶切的pSDSy15质粒，得到串联表达的pSDSy15Sy6质粒（见图1B）。
通过自然转化方法（Williams,J.G.K.(1988)Construction of specific mutationsin photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods inSynechocystis 6803.Methods Enzymol.167:766-778.）将构建好的载体导入集胞藻PCC6803中，经抗生素筛选，鉴定得到转基因阳性集胞藻。
具体步骤：取对数培养期（OD730=0.6）的集胞藻PCC680330ml于室温，4500g离心8min，弃上清；加新鲜BG-11液体培养基洗涤一次后，加新鲜BG-11液体培养基至终浓度OD730=4.8，并立刻用来转化；将收集的藻液分装到到1.5ml EP管中（每管400μl），每管加5-10μg质粒，弱光条件下光照温育6小时，期间摇晃一次。将混合物涂到含有卡那抗生素（12μg/ml）的BG-11平板培养基上。约10天可见转化子。制得含表达载体pSDSy15的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDSy15Sy6的转基因集胞藻PCC6803。
实施例3
转基因集胞藻阳性植株中Delta15和Delta6基因表达量水平检测
以含表达载体pSDSy15的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDSy15Sy6的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取总RNA进行Real time quantitative PCR分析。具体方法如下：
采用TRIZOL试剂（购自Invitrogen公司）并利用液氮研磨法从Delta15和Delta15+Delta6基因的集胞藻和野生型集胞藻中提取总RNA。具体操作步骤如下：取50mlOD=1.8的蓝藻，4℃，5000rpm离心10min收集藻细胞，液氮中研磨至细粉面状后加入1.5ml离心管中，迅速加入1ml TRIZOL（购自Invitrogen公司），颠倒混匀，室温静置5min，4℃，11900rpm离心10min，取上清液至新的1.5ml离心管中，加入200μl三氯甲烷，用手剧烈震荡15s，静置3～5min，4℃，11900rpm离心10～15min。取上清到新的1.5ml离心管中，加入500ml异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。4℃，11900rpm离心10min。去上清，加入1ml 75%乙醇（v/v），颠倒振荡几次，4℃，7500rpm离心10min。弃上清，室温下敞口晾干至沉淀透明，加入适量DEPC-H2O溶解沉淀，制得Delta15基因片段和Delta15+Delta6基因片段的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803总RNA。
以上述制得的Delta15基因片段和Delta15+Delta6基因片段的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803总RNA为模板，用TaKaRa公司生产的PrimeScriptTM RT-PCRKit反转录成cDNA。具体操作步骤如下：
依次加入1μl Oligo dT Primers（2.5μM）、1μl dNTP Mixture（10mM）、2μg总RNA和DEPC-H2O至10μl。于PCR仪上65℃，5min进行变性退火反应，离心20s秒钟，依次加入4μl 5×PrimeScript Buffer、0.5μl RNase Inhibitor(40U/μl)、0.5μl PrimeScript RTase(for 2step)和5μl RNase Free ddH2O，42℃30min后95℃5min，即获得第一链cDNA；以获得的第一链cDNA为模板，以集胞藻PCC6803rnpB基因为内参基因，以TaKaTa公司PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）进行Real-time quantitative PCR检测。其中集胞藻PCC6803rnpB内参基引物序列为：
上游P1：5’-GTGAGGACAGTGCCACAGAA-3’；
下游P2：5’-TGCACCCTTACCCTTTTCAG-3’；
Delta15基因的Real-time quantitative PCR引物序列为：
上游P3：5’-CGTACTCACCATGCCAACAC-3’；
下游P4：5’-AGGCGATCAGAGGCAAGTAA-3’；
Delta6基因的Real-time quantitative PCR引物序列为：
上游P5：5’-CTGGGCATGACCTACGATTT-3’；
下游P6：5’-ATACGTACTGCGCCATCTCC-3’。
Real-time quantitative PCR具体操作步骤如下：
依次加入12.5μl 2×SYBR premix Ex Taq（TM)、上下游引物各1.0μl、cDNA模板2.0μl和8.5μl ddH2O。95℃预变性1min；95℃10s，60℃30s，72℃30s，42个循环；95℃10s，58℃30s，72℃5min；55℃1s，81个循环，每隔0.5s检测一次。
实施例4
转基因集胞藻阳性植株中Delta15和Delta6蛋白水平检测
以含表达载体pBluscrip-SD-Delta15的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pBluscrip-SD-Delta15+Delta6的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取藻总蛋白，利用Western blot方法检测转基因阳性集胞藻中Delta15和Delta6蛋白质水平。具体方法如下：
取藻细胞离心收集后用5mL 40mM的Tris-Cl（pH8.0）悬浮，然后加入适量的直径为0.17mm左右的玻璃珠（购自sigma公司）至玻璃珠界面上方有0.5mL的悬浮液。通过涡旋振荡器以最大速率震荡1min，然后置于冰上1min，如此重复5次。在4000rpm低速离心10min收集上清，再将所收集的上清用较高转速6000rpm进行离心10min，收集上清。即得到藻细胞总蛋白。取适量样品，加等体积的2×BSA，沸水中煮10分钟。离心后放-20℃存放。取少量样品，稀释一定倍数（5×、10×、20×），以40mM Tris-Cl （pH8.0）为参照空白，测蛋白质浓度。利用10%SDS-PAGE进行蛋白质电泳，每个上样孔50μg蛋白。电泳结束后，通过印记法转移到PVDF（Millipore，Billlerica，MA）。然后按照何庆芳等人的方法进行免疫化学分析，检测Delta15和Delta6蛋白质水平（Qingfang He等，Eur.J.Bilchem.，1999，263,561-570）。结果表明，转基因集胞藻中，均检测出Delta15和Delta6蛋白质水平，而野生型中则没有信号，见图2，3，4，5。
实施例5
转基因集胞藻阳性植株中脂肪酸成分分析
在30℃，30μE.m-2.s-1持续光照下，取含表达载体pSDSy15的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDSy15Sy6的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻，离心后收集菌体，40℃干燥，经甲酯化后进行气象色谱分析；具体步骤如下：
（1）称取适量样品于厌氧培养管中。
（2）加入氯乙酰甲醇4mL。氯乙酰:甲醇=1:10（体积比）。
（3）精确加入1mL含有C19:0内标的正己烷溶液。内标浓度为1mg/mL。
（4）盖紧管盖，80℃水浴两小时。取出冷却至室温。
（5）加入7％的碳酸钾溶液5mL，振荡均匀，静置10min，1,000rpm离心5min分层。
（6）吸取上层液相，由中国农大农业部饲料研究中心进行气相色谱分析。
与对照野生型集胞藻PCC6803相比，在30℃及20℃混养条件下含表达载体pSDSy15的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDSy15Sy6的转基因集胞藻PCC6803脂肪酸含量变化见表1和表2。
表1
表2
结果分析
在集胞藻PCC6803中过表达集胞藻PCC6803中Delta15脂肪酸去饱和酶基因降低了集胞藻的总脂肪酸含量。30℃混养条件下，野生型集胞藻PCC6803总脂肪酸产量为75.201mg/g（干重，下同），转基因菌株pSDSy15总脂肪酸含量50.755mg/g，比野生型集胞藻PCC6803降低了32.5%。而20℃混养条件下，转基因菌株pSDSy15总脂肪酸含量60.760mg/g，比野生型集胞藻PCC6803增加了19.1%。
30℃混养条件下，野生型集胞藻PCC6803中C18:1含量7.07%，C18:2含量为13.59%，C18:3n6为16.26%，C18:3n3含量为1.45%，C18:4含量为1.20%。而20℃混养条件下，其含量则分别为3.94%、16.75%、14.72%、2.23%和1.54%。在集胞藻PCC6803中过量表达集胞藻Delta15脂肪酸去饱和酶基因对这几种脂肪酸的影响截然不同。
在集胞藻PCC6803中过表达集胞藻PCC6803Delta15脂肪酸去饱和酶基因显著降低了C18:1、C18:2和C18:3n6的含量（表1）。在30℃混养条件下，pSDSy15-11中C18:1、C18:2和C18:3n6含量分别降低为2.73%、2.80%和0.30%。而20℃混养条件下，C18:1、C18:2和C18:3n6含量则分别降低为3.27%、1.94%和0.23%。
在集胞藻PCC6803中过量表达集胞藻PCC6803中Delta15脂肪酸过饱和酶基因显著提高了C18:3n3和C18:4的含量（表1，图10，图11）。在30℃混养条件下，pSDSy15中C18:3n3和C18:4含量分别增加为17.52%和9.11%，与野生型相比分别增加了近11倍和7倍。而20 ℃混养条件下，分别增加为23.05%和10.77%，增长了近8倍和6倍。
在集胞藻PCC6803中串联表达集胞藻PCC6803Delta15和Delta6脂肪酸去饱和酶基因同样降低了集胞藻的总脂肪酸含量。30℃混养条件下，转基因菌株pSDSy15Sy6中总脂肪酸含量为63.071mg/g，比野生型集胞藻PCC6803降低了16.1%。而20℃混养条件下，转基因菌株pSDSy15Sy6总脂肪酸含量57.130mg/g，比野生型集胞藻PCC6803降低了6.0%。
在集胞藻PCC6803中串联表达集胞藻PCC6803Delta15和Delta6脂肪酸去饱和酶基因显著降低了C18:1、C18:2和C18:3n6的含量（表2）。在30℃混养条件下，pSDSy15Sy6中C18:1、C18:2和C18:3n6含量分别降低为4.10%、2.57%和0.21%。而20℃混养条件下，C18:1、C18:2和C18:3n6含量则分别降低为2.28%、1.30%和0.19%。
在集胞藻PCC6803中串联表达集胞藻PCC6803Delta15和Delta6脂肪酸去饱和酶基因显著提高了C18:3n3和C18:4的含量（表2，图12，图13）。在30℃混养条件下，pSDSy15Sy6中C18:3n3和C18:4含量分别增加为23.64%和7.76%，与野生型相比分别增加了近15倍和6倍。而20℃混养条件下，分别增加为16.35%和13.12%，增长了近6倍和8倍。
从表1和2可以看出，与转基因集胞藻pSDSy15相比，在集胞藻PCC6803中表达Delta15脂肪酸去饱和酶基因和串联表达集胞藻PCC6803Delta15和Delta6脂肪酸去饱和酶基因对藻株脂肪酸成分的影响大部分是相同的，却又有所不同。相同之处在于而者都能提高C18:3n3和C18:4的含量，都能降低C18:1、C18:2和C18:3n6含量。不同之处是对C18:3n3和C18:4的影响不同，在30℃混养条件下转基因藻pSDSy15Sy6中C18:3n3含量比pSDSy15高34.9%，但C18:4含量则比pSDSy15低17.4%；而在20℃混养条件下转基因藻pSDSy15Sy6中C18:3n3含量比pSDSy15低41.0%，但C18:4含量则比pSDSy15高21.8%。
Claims (2)
1.集胞藻高效双同源重组载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。
2.权利要求1所述集胞藻高效双同源重组载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：
（1）PCR扩增集胞藻 PCC 6803的psbA2 基因ATG前510bp基因片段作为psbA2 启动子基因片段、Genbank登录号为X13547.1的集胞藻 PCC 6803的psbA2 ORF基因片段、Genbank登录号为U02439.1的大肠杆菌终止子T1T2基因片段、Genbank登录号为D13780.1的集胞藻PCC6803 Delta15脂肪酸脱氢酶基因片段和Genbank登录号为 L11421.1的集胞藻PCC6803 Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段；
（2）将步骤（1）获得的psbA2 启动子基因片段分别与步骤（1）制得的集胞藻PCC6803 Delta15脂肪酸脱氢酶基因片段和集胞藻PCC6803 Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta 6；
（3）将步骤（1）制得的大肠杆菌终止子T1T2基因片段用PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接，得到质粒pBluescript SK T1T2；
然后将步骤（1）制得的psbA2 ORF基因片段用SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescript SK T1T2连接，得到质粒pBluescript SK T1T2-downstream；
对质粒pBluescript SK T1T2-downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescript SK T1T2-downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接，得到质粒pBluescript SK T1T2-npt-downstream；
（4）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+Delta15，或者，基因片段Promotor+Delta15和基因片段Promotor+Delta6插入步骤（3）制得的质粒pBluescript SK T1T2-npt-downstream中，制得重组载体；
所述步骤（1）中集胞藻PCC 6803的psbA2 基因ATG前510bp基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，集胞藻PCC6803 psbA2 ORF基因片段的核苷酸序列SEQ ID NO.2所示，大肠杆菌终止子T1T2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，集胞藻PCC6803 Delta15脂肪酸脱氢酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，集胞藻PCC6803 Delta6脂肪酸脱氢酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增psbA2 启动子基因片段的引物为：
Promotor-F: 5’-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’；
Promotor-R：5’-CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
4. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA2 ORF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为：
psbA2-F：5’-CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’；
psbA2-R：5’-AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
5. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803 Delta15脂肪酸脱氢酶基因的引物为：
Sy15-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’；
Sy15-R：5’-CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
6. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803 Delta6脂肪酸脱氢酶基因的引物为：
Sy6-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG-3’；
Sy6-R：5’-GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
7. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中质粒pBluescript SK T1T2的制备方法，具体如下：
扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为：
T1T2-F：5’—ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’；
T1T2-R：5’—TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存；获得的片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接，得到质粒pBluescript SK T1T2。
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