CN103012367A

CN103012367A - 一种喹啉衍生物

Info

Publication number: CN103012367A
Application number: CN2011102829608A
Authority: CN
Inventors: 易崇勤; 王振国; 任爱国; 陶晶; 林松文; 钟学超; 邓小兵; 崔畅
Original assignee: Peking University Founder Group Co Ltd; PKU International Healthcare Group Co Ltd; PKUCare Pharmaceutical R&D Center
Current assignee: Peking University Founder Group Co Ltd; PKU International Healthcare Group Co Ltd; PKUCare Pharmaceutical R&D Center
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2013-04-03

Abstract

公开了式(I)化合物及其制备方法与用途

Description

一种喹啉衍生物

领域

本申请涉及药物化学领域。

背景

目前许多由细胞增殖调控异常引起的疾病如牛皮癣和癌症的方案利用了抑制DNA合成和细胞增殖的化合物。迄今，用于该治疗的化合物通常具有细胞毒性，但是它们对于快速分化细胞如癌细胞具有较强作用，该作用是有利的。目前已开发了可替换这些细胞毒抗肿瘤药的方法，例如细胞信号途径的选择性抑制剂。这些类型的抑制剂可显示增强选择性作用于抗肿瘤细胞的潜力，并因此可降低质量所具有的不良副作用的几率。

众所周知，许多酪氨酸激酶突变为组成型活性形式和/或在被过度表达后导致各种人类细胞转化。激酶的这些突变或过度表达形式在占很大比例的人类肿瘤中都存在。由于酪氨酸激酶在各种组织的增殖和分化中具有重要作用，有很多开发新型抗癌疗法的研究都集中在这些酶上。该家族酶分为两组：受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶，分别为例如EGF受体和SRC家族，从大量研究(包括人类基因组计划)的结果来看，在人类基因组中已经识别出约90种酪氨酸激酶，其中58种为受体型，而32种为非受体型。它们可以划分为20种受体酪氨酸激酶和10种非受体酪氨酸激酶亚家族。

概述

一方面，本申请涉及式(I)所示的化合物，

另一方面，本申请涉及式(II)所示的式(I)化合物的中间体，

又一方面，本申请涉及式(III)所示的式(I)化合物的中间体，

再一方面，本申请涉及包含式(I)所示的化合物以及药物可接受的载体的药物组合物。

另一方面，本申请涉及制备式(II)化合物的方法，

其包括：将4-氯-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基-乙酸乙酯与2-氟-3-氯苯胺反应，得到式(II)化合物。

又一方面，本申请涉及制备式(III)化合物的方法，

其包括：将(II)化合物与碱反应，得到式(III)化合物。

再一方面，本申请涉及制备式(I)化合物的方法，

其包括：

(1)将式(III)化合物与4-甲磺酰氧基-N-叔丁氧羰基哌啶反应，得到叔丁基4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-1-羧酸酯；

(2)将叔丁基4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-1-羧酸酯进行脱保护反应得到4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-3-甲腈；以及

(3)将4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-3-甲腈与N-甲基-卤代乙酰胺反应得到式(I)化合物。

其他方面，本申请涉及式(I)化合物在制备用于治疗和/或预防与蛋白酪氨酸激酶有关疾病或疾病状态的药物中的用途，

详述

以下的描述包括某些具体细节以便透彻理解各种公开的实施方案。然而，相关领域技术人员应当理解，可以无需一种或多种这些具体细节，或者可以使用其它方法、成分、材料等实践实施方案。

除非上下文另有要求，在以下的说明书及权利要求书中，术语“包含”及其同义词“包括”应解释为开放式的、包括的含义，即应解释为“包括，但不限于”。

整个说明书中所提及的“一实施方案”，或“实施方案”，或“在另一实施方案中”，或“某些实施方案”，或“在某些实施方案中”是指与所述实施方案相关的所描述的具体涉及的特征、结构或者特性被包括在至少一实施方案中。因此，在整个本说明书中的各个地方出现的短语“在一实施方案中”、“在实施方案中”、“在另一实施方案中”或者“在某些实施方案中”不必均指相同的实施方案。此外，具体特征、结构或者特性可以在一种或多种实施方案中以任何适当的方式相结合。

一方面，本申请涉及式(I)所示的化合物，

另一方面，本申请涉及式(II)所示的式(I)化合物的中间体，

又一方面，本申请涉及式(III)所示的式(I)化合物的中间体，

药物可接受的载体包括本身并不诱导对产生对接受所述组合物的个体有害的抗体的药剂，并且可以给药而不会有不适当的毒性。

能够用于本申请的示例性的载体包括但不限于微粒；液体，例如水、盐水、甘油和乙醇等；气雾剂。

另一方面，本申请涉及制备式(II)化合物的方法，

在某些实施方案中，制备式(II)化合物的方法在醇类的胺溶液中进行。

能够用于本申请的示例性的醇类包括但不限于异丙醇。在某些实施方案中，制备式(II)化合物的方法在异丙醇的胺溶液中进行。

能够用于本申请的示例性的胺包括但不限于三乙胺。在某些实施方案中，制备式(II)化合物的方法在醇类的三乙胺溶液中进行。

在某些实施方案中，制备式(II)化合物的方法在异丙醇的三乙胺溶液中进行。

在某些实施方案中，制备式(II)化合物的方法在醇类的胺溶液中以吡啶盐酸盐为助剂下进行。

在某些实施方案中，制备式(II)化合物的方法在醇类的胺溶液中进行，反应温度为65-100℃。

在某些实施方案中，制备式(II)化合物的方法在醇类的胺溶液中进行，反应温度为65-100℃，在惰性气体保护下进行1.5-6小时。

能够用于本申请的示例性的惰性气体包括但不限于氩气和氮气。

又一方面，本申请涉及制备式(III)化合物的方法，

其包括：将(II)化合物与碱反应，得到式(III)化合物。

能够用于本申请的制备式(III)化合物的示例性的碱包括但不限于氨水。

再一方面，本申请涉及制备式(I)化合物的方法，

其包括：

(3)将4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-3-甲腈与N-甲基-卤代酰胺反应得到式(I)化合物。

在某些实施方案中，叔丁基4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-1-羧酸酯的脱保护反应在有机溶剂和碱溶液中进行。

能够用于本申请的示例性有机溶剂包括但不限于二氯甲烷和三氟乙酸的混合物。在某些实施方案中，叔丁基4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-1-羧酸酯的脱保护反应在二氯甲烷和三氟乙酸的混合物和碱溶液中进行。

在某些实施方案中，能够用于本申请的示例性碱溶液包括但不限于碳酸氢钠。在某些实施方案中，叔丁基4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-1-羧酸酯的脱保护反应在有机溶剂和碳酸氢钠溶液中进行。

在某些实施方案中，4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-3-甲腈与N-甲基-卤代乙酰胺的反应在无水碳酸钠和碘化钾的混合溶液中进行。

在某些实施方案中，制备式(I)化合物的方法还包括：(4)用二氯甲烷和水的混合溶液萃取4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-3-甲腈与N-甲基-卤代乙酰胺反应得到式(I)化合物。

在某些实施方案中，制备式(I)化合物的方法还包括：(5)使用色谱柱分离萃取后得到的式(I)化合物。在某些实施方案中，色谱柱的条件为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1。

能够用于本申请的示例性的N-甲基-卤代乙酰胺包括但不限于N-甲基-氯乙酰胺和N-甲基-溴乙酰胺。

在某些实施方案中，制备式(I)化合物的方法包括：

在某些实施方案中，能够使用本申请式(I)化合物治疗和/或预防的与蛋白酪氨酸激酶有关疾病或疾病状态为与表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态。

在某些实施方案中，能够使用本申请式(I)化合物治疗和/或预防的与表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态为与人表皮生长因子受体2蛋白酪氨酸激酶有关的疾病。

在某些实施方案中，能够使用本申请式(I)化合物治疗和/或预防的与蛋白酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态为实体瘤。

能够使用本申请式(I)化合物治疗和/或预防的示例性实体瘤包括但不限于非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌和大细胞肺癌。

在某些实施方案中，与酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态选自非小细胞肺癌和乳腺癌。

其他方面，本申请涉及治疗和/或预防与蛋白酪氨酸激酶有关疾病或疾病状态的方法，其包括向需要所述方法的个体给予治疗有效量的式(I)化合物，

“个体”是指作为治疗、观察或试验的对象的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎和无脊椎动物，例如鱼、甲壳类动物、爬行动物，以及特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬、猫、绵羊、山羊、母牛、马、灵长类，例如猴、黑猩猩和猿，以及特别是人。

“治疗”和“治疗的”不一定意指总体治疗或消除疾病或疾病状态。在任何程度上，任何不期望病症或者疾病或疾病状态的症状的任何缓解都能够被认为是治疗。此外，治疗可以包括使患者整体的舒适感或征兆恶化的行为。

“治疗有效量”用于表示活性化合物或药物制剂的量，所述量引起指定的生物学反应或药物反应。例如，化合物的治疗有效量能够是预防、缓解或改善疾病症状或延长被治疗个体的存活所需要的量。该反应可以在组织、系统、动物或人中发生，并包括改善被治疗疾病的症状。治疗有效量的测定在本领域技术人员的能力以内，尤其是根据本申请提供的详细内容。作为剂量所需的本申请公开化合物的治疗有效量取决于考虑中的给药途径、被治疗的包括人在内的动物类型和具体动物的身体特征。能够定制剂量以实现期望效果，但会取决于诸如以下的因素：体重、饮食、联合用药和医药领域技术人员公认的其它因素。

本申请公开的式(I)化合物及其中间体式(II)、式(III)化合物的合成方法简便易行。

此外，本申请的式(I)化合物不仅能够治疗和/或预防与蛋白酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态，并且还能够治疗和/或预防与表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态，如实体瘤。式(I)化合物在治疗和/或预防非小细胞肺癌和乳腺癌上具有优良的效果。

下文中，本申请将通过如下实施例进行详细解释以便更好地理解本申请的各个方面及优点。但是，应当理解，以下的实施例是非限制性的而且仅用于说明本申请的某些实施方案。

实施例

实施例1

4-氯-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基-乙酸乙酯的制备

3-苄氧基-4-甲氧基苯甲酸甲酯(化合物2)的制备

将化合物1即3-羟基-4-甲氧基苯甲酸甲酯(9.11g，50mmol)，溴苄(9.41g，55mmol)和碳酸钾(7.60g，55mmol)加到200mL乙腈中，回流4h，趁热抽滤，蒸去乙腈，以乙酸乙酯重结晶得到化合物2，即：3-苄氧基-4-甲氧基苯甲酸甲酯，共12.12g，产率89％。

3-羟基-4-甲氧基苯甲酸甲酯购自上海西亚试剂公司，溴苄、乙腈和碳酸钾均购自北京化工厂。

化合物2的鉴定

对化合物2进行核磁共振和质谱检测，结果如下：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.68(dd，J＝8.4，2.0Hz，1H)，7.61(d，J＝2.0Hz，1H)，7.47(d，J＝7.2Hz，2H)，7.43-7.27(m，3H)，6.90(d，J＝8.4Hz，1H)，5.17(s，2H)，3.93(s，3H)，3.87(s，3H)。MS(ESI+)m/z 273.1[M+H]⁺。

5-苄氧基-4-甲氧基-2-硝基-苯甲酸甲酯(化合物3)的制备

将化合物2，即：3-苄氧基-4-甲氧基苯甲酸甲酯(0.82g，3mmol)加到7.5mL冰醋酸中，搅拌成悬浊液，再加入1.5mL浓硝酸，50℃下反应2.5h，冷却，加入50mL冰水，搅拌后抽滤，水洗至中性，烘干，得黄色固体5-苄氧基-4-甲氧基-2-硝基-苯甲酸甲酯，即化合物3，0.82g，产率82％。

化合物3的鉴定

对化合物3进行核磁共振和质谱检测，检测结果如下：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.57-7.31(m，6H)，7.15(s，1H)，5.21(s，2H)，3.97(s，3H)，3.89(s，3H)。MS(ESI+)m/z 317.9[M+H]⁺。

5-苄氧基-4-甲氧基-2-氨基苯甲酸甲酯(化合物4)的制备

将5-苄氧基-4-甲氧基-2-硝基-苯甲酸甲酯，即化合物3(0.32g，1mmol)溶于10mL乙醇中，加入水合氯化亚锡(0.90g，4mmol)，50℃下反应3h，减压蒸去乙醇，加入20mL乙酸乙酯和20mL水，用氢氧化钠溶液碱化至PH为8～9，抽滤，分液，水层以乙酸乙酯萃取(20mL×2)，合并有机相，饱和食盐水洗(30mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，闪柱(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1→1∶1)分离得5-苄氧基-4-甲氧基-2-氨基-苯甲酸甲酯，即化合物4，共0.24g，产率84％。

水合氯化亚锡购自北京化工厂。

化合物4的鉴定

对化合物4进行核磁共振和质谱检测，检测结果如下：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.50-7.26(m，6H)，6.15(s，1H)，5.62(br s，2H)，5.02(s，2H)，3.85(s，3H)，3.82(s，3H)。MS(ESI+)m/z 288.1[M+H]⁺。

6-苄氧基-4-羟基-7-甲氧基喹啉-3-甲腈(化合物5)的制备

将化合物4，5-苄氧基-4-甲氧基-2-氨基-苯甲酸甲酯(4.77g，15mmol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(3.57g，30mmol)于110℃下回流3h，然后减压蒸干，所得中间体不经纯化直接使用。氮气保护，-78℃，将36.4mL 1.6M的正丁基锂加到50mL四氢呋喃，15min内滴加3.02mL乙腈的四氢呋喃溶液(50mL)，保温反应20min后，滴加中间体的四氢呋喃溶液(50mL)，继续保温反应30min，升温至-40℃反应1h，加入7.68mL醋酸，升至室温反应30min，加入200mL水，搅拌后抽滤，滤饼甲醇洗涤，晾干，所得粗品以200mL甲醇回流30min，抽滤，甲醇洗涤，烘干，得产品6-苄氧基-4-羟基-7-甲氧基喹啉-3-甲腈，即化合物5，共计7.12g，产率87.81％。

N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛购自武汉嘉凯隆科技发展有限公司，正丁基锂购自北京偶合科技有限公司，四氢呋喃购自北京化工厂。

化合物5的鉴定

对化合物5进行核磁共振和质谱检测，检测结果如下：¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ12.59(s，1H)，8.60(s，1H)，7.57(s，1H)，7.53-7.29(m，5H)，7.08(s，1H)，5.21(s，2H)，3.90(s，3H)。MS(ESI+)m/z307.1[M+H]⁺。

4，6-二羟基-7-甲氢基喹啉-3-甲腈喹啉(化合物6)的制备

将化合物5，即6-苄氧基-4-羟基-7-甲氧基喹啉-3-甲腈(1.00g，3.26mmol)溶于150mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入Pd/C(10％含量，0.50g)，4 atm H₂，50℃下催化氢化3h。抽滤，减压蒸干，加入25mL丙酮，超声，回流，抽滤，得4，6-二羟基-7-甲氧基喹啉-3-甲腈喹啉，即化合物6，产物0.65g，产率92％。

钯碳购自陕西开达有限公司。

化合物6的鉴定

对化合物6进行核磁共振和质谱检测，检测结果如下：¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.36(s，1H)，7.40(s，1H)，7.01(s，1H)，3.86(s，3H)。MS(ESI+)m/z 217.1[M+H]⁺。

3-甲腈-4-羟基-7-甲氧基喹啉-6-乙酸乙酯(化合物7)的制备

将化合物6，即4，6-二羟基-7-甲氧基喹啉-3-甲腈喹啉(2.14g，10mmol)和2mL吡啶加到16mL醋酐中，100℃下反应2.5h，冷却，倒入100mL冰水中，搅拌0.5h，抽滤，水洗，丙酮洗，烘干，得3-甲腈-4-羟基-7-甲氧基喹啉-6-乙酸乙酯，即化合物7，该化合物为黄色固体，2.28g，产率89％。

化合物7的鉴定

对化合物7进行核磁共振和质谱检测，检测结果如下：¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ12.71(s，1H)，8.70(s，1H)，7.77(s，1H)，7.16(s，1H)，3.90(s，3H)，2.30(s，3H)。MS(ESI+)：m/z 259.1[M+H]⁺。

3-甲腈-4-氯-7-甲氧基喹啉-6-乙酸乙酯(化合物8)的制备

将化合物7，即：3-甲腈-4-羟基-7-甲氧基喹啉-6-乙酸乙酯(2.44g，10mmol)置于100mL茄形瓶中，加入25mL氯化亚砜和0.5mL N，N-二甲基甲酰胺，回流4h，然后减压蒸去氯化亚砜，再以甲苯旋蒸除去残留的氯化亚砜(25mL×2)，得到化合物8。

化合物8的鉴定

对化合物8进行核磁共振和质谱检测，检测结果如下：¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.13(s，1H)，8.05(s，1H)，7.72(s，1H)，4.03(s，3H)，2.37(s，3H)。MS(ESI+)：m/z 277.1[M+H]⁺。

实施例2

4-甲磺酰氧基-N-叔丁氧羰基哌啶的制备

4-羟基-N-叔丁氧羰基哌啶(化合物12)的制备

将4-羟基哌啶，即化合物11(1.01g，10mmol)和三乙胺(1.2g，12mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中，0℃下滴加二碳酸二叔丁酯的二氯甲烷溶液(2.58g，12mmol，溶于5mL)，再升至室温反应1h，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸去溶剂，得4-羟基-N-叔丁氧羰基哌啶的，即化合物12，1.92g，产率91％。

化合物12的鉴定

对化合物1 2进行核磁共振和质谱鉴定，¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ3.86-3.83(m，3H)，3.07-2.98(m，2H)，1.88-1.83(m，4H)，1.46(s，9H)。MS(ESI+)m/z 222.4[M+Na]⁺。

4-甲基磺酰氧基-N-叔丁氧羰基哌啶(化合物13)的制备

将4-羟基-N-叔丁氧羰基哌啶，即化合物12(2.01g，10mmol)和三乙胺(1.2g，12mmol)溶于四氢呋喃(15mL)中，0℃下滴加甲基磺酰氯(0.93mL，12mmol)并反应3h，加入50mL水，以乙酸乙酯萃取(50mL×2)，合并有机相，1N盐酸洗(30mL×2)，水洗(30mL×2)，饱和碳酸氢钠洗(30mL×2)，饱和食盐水洗(30mL×2)，过滤，蒸去溶剂，得甲基磺酰氧基-N-叔丁氧羰基哌啶，即化合物13，2.57g，产率92％。

化合物13的鉴定

对化合物13进行核磁共振和质谱鉴定，¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ4.88(tt，J＝7.7，3.8Hz，1H)，3.80-3.62(m，2H)，3.30(ddd，J＝12.2，8.0，3.8Hz，2H)，3.04(s，3H)，2.04-1.90(m，2H)，1.83(ddd，J＝13.3，8.7，4.2Hz，2H)，1.46(s，9H)。MS(ESI+)m/z 302.0[M+Na]⁺。

实施例3

4-((2-氟-3-氯苯基)-氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基乙酸乙酯(式(III) 化合物)的制备

将化合物8(825mg，3mmol)，2-氟-3-氯苯胺9(434mg，3mmol))，吡啶盐酸盐(103mg，0.9mmol)溶于70mL异丙醇中，氩气保护，85℃下回流3h。冷却至室温，抽滤，滤饼以异丙醇洗，乙醚洗，干燥得化合物10，即式(III)化合物，共990mg，产率86％。

式(III)化合物(化合物10)的鉴定

对化合物10进行核磁共振和质谱鉴定，¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：9.75(s，1H)，8.61，(s，1H)，8.26，(s，1H)，7.53-7.50(m，2H)，7.42(t，J＝7.5Hz，1H)，7.27(t，J＝8.1Hz，1H)，3.97(s，3H)，2.36(s，3H).MS(ESI+)m/z[M+H]⁺，386.0。

实施例4

式(I)化合物的制备

4-((2-氟-3-氯苯基)-氨基)-3-甲腈-7-甲氧基-6-羟基喹啉(化合物14)的制备

将1.14g化合物10溶于20mL甲醇中，加入6mL氨水，立即析出大量白色固体，捣碎，补加10mL甲醇，室温搅拌1h后体系变澄清，再过0.5h后又变浑浊，继续搅拌0.5h，滤出固体，水洗涤，烘干，得化合物14，0.7g，产率70％。

化合物14的鉴定

对化合物14进行核磁共振和质谱鉴定，¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.91(s，1H)，9.45(s，1H)，8.47，(s，1H)，7.66(s，1H)，7.45-7.20(m，4H)，3.99(s，3H)。MS(ESI+)m/z：[M+H]⁺，344.0。

叔丁基4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶 -1-羧酸酯(化合物15)的制备

将化合物14(1.2g，3.5mmol)，4-甲磺酰氧基-N-叔丁氧羰基哌啶13(1.6g，5.7mmol)，和碳酸铯(1.8g，5.5mmol)加入10mL N，N-二甲基乙酰胺中，氩气保护，100℃下搅拌2.5h，停止反应，旋除溶剂，加入乙酸乙酯，水洗，水相以乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，柱色谱(二氯甲烷∶甲醇＝100∶1)，乙酸乙酯重结晶得到叔丁基4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶-1-羧酸酯，即化合物15，1.1g，产率60％。

化合物15的鉴定

对化合物15进行核磁共振和质谱的鉴定，鉴定结果如下：¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.47(br s，1H)，8.50(s，1H)，8.65(t，1H)，7.75(s，1H)，7.53(dd，J＝2.5，6.6Hz，1H)，7.47(t，J＝9.0Hz，1H)，7.37(s，1H)，7.31-7.26(m，1H)，4.71-4.64(m，1H)，3.96(s，3H)，3.70-3.63(m，2H)，3.24-3.17(m，2H)，1.93-1.90(m，2H)，1.66-1.54(m，2H)，1.41(s，9H)。MS(ESI)m/z：[M+H]⁺，527.1。

4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶(化合物16)的制备

将化合物15(305mg，0.58mmol)溶入2.5mL二氯甲烷中，0℃下加入2.5mL三氟乙酸，搅拌5min后升至室温继续搅拌1h，加入二氯甲烷稀释，并加入饱和碳酸氢钠溶液和碳酸氢钠固体至水相PH呈弱碱性，饱和氯化钠洗至中性，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂得4-((4-(2-氟-3-氯苯基)氨基)-3-甲腈-7-甲氧基喹啉-6-基)-氧)哌啶，即化合物16，共计220mg，产率89％。

化合物16的鉴定

对化合物16进行核磁共振和质谱检测，测定结果如下：¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：9.96(br s，1H)，8.88(br s，1H)，8.49(s，1H)，8.12(s，1H)，7.54-7.40(m，3H)，7.27(t，J＝8.1Hz，1H)，4.96-4.91(m，1H)，3.97(s，3H)，3.29-3.24(m，2H)，3.17-3.09(m，2H)，2.24-2.14(m，2H)，1.97～1.88(m，2H).MS(ESI+)m/z 427.1[M+H]⁺。

式(I)化合物的制备

将化合物16(160mg，0.37mmol)，N-甲基-3-溴丙酰胺19(92mg，0.55mmol)，无水碳酸钾(62mg，0.45mmol)和碘化钾(20mg，0.12mmol)加到10mL乙腈中，80℃下回流1h，旋除溶剂，并加入20mL二氯甲烷和20mL水，分液，有机相用饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥，柱色谱分离(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得式(I)化合物，120mg，产率63％。

式(I)化合物的鉴定

对得到的式(I)化合物进行核磁共振和质谱分析，分析结果如下：¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：9.50(s，1H)，8.50(s，1H)，7.87-7.81(m，1H)，7.77(s，1H)，7.56-7.50(m，1H)，7.44-7.38(m，2H)，7.28(t，J＝8.2Hz，1H)，4.60-4.51(m，1H)，3.96(s，3H)，2.77-2.70(m，2H)，2.56(d，J＝4.6，4H)，2.31-2.18(m，2H)，2.05-1.94(m，2H)，1.73-1.62(m，2H)。MS(ESI⁺)m/z 512.2[M+H]⁺。

实施例5

N-甲基溴丙酰胺的制备

在3-溴丙酸(2.69g，20mmol)中加入2.36g氯化亚砜，80℃回流4.5h，旋除过量的氯化亚砜，以5mL二氯甲烷溶解，-20℃下滴加入30mL(20～25％)的甲胺水溶液，滴加完升至室温搅拌1h，用浓盐酸调PH至5，二氯甲烷萃取(30mL×2)，有机相以饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得黄色固体1.1g，柱色谱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶2)得N-甲基溴丙酰胺，即化合物19，白色固体0.8g，产率27.4％。

3-溴丙酸购自北京化工厂。

N-甲基溴丙酰胺的鉴定

将N-甲基溴丙酰胺进行核磁共振和质谱的鉴定，鉴定结果如下：

1H NMR(300MHz，CDCl₃)δ：3.65(t，J＝6.6，2H)，2.85(d，J＝4.8，3H)，2.76(t，J＝6.6，2H)。MS(ESI)m/z 168.0[M+H]⁺。

实施例6

本申请中所使用的阳性对照为：4-(3-氯-2-氟苯氨基)-6-{[1-(N-乙基氨基甲酰基甲基)哌啶-4-基]氧基}-7-甲氧基-3-腈基-喹啉

其制备方法如下：将2-氯-N-甲基-乙酰胺(51mg，0.47mmol)逐滴加入4-(3-氯-2，4-二氟苯氨基)-7-甲氧基-6-[(哌啶-4-基)氨基]-3-腈基-喹啉(0.47mmol)、碘化钾(79mg，0.47mmol)和碳酸钾(79mg，0.57mmol)在二甲基乙酰胺(5ml)的混合物中。于70℃加热该混合物1小时，冷却后过滤固体，滤液经制备HPLC-MS体系的HPLC柱纯化(C18，5微米，19mm直径，10mm长度)，使用包含2g/l甲酸铵水和乙腈混合物(梯度)洗脱生成所述对照化合物(46mg)，为白色固体。

1.式(I)化合物对酪氨酸激酶(EGFR)抑制作用

方法：使用从源于人鳞状上皮癌的A43 1细胞株中进行部分精制的EGF受体，改良了Linda J.Pike等的酪氨酸激酶活性测定法，并进行了活性测定，详细方法如下所示：

在含有牛仔血清(FBS)10％的达尔贝克变法EAGLE培养基(DMEM)中，在37℃，5％二氧化碳气体的条件下培养A431细胞，将该细胞在含有10mM的N-2-羟乙基哌啶子基-N’-2-乙磺酸(Hepes)缓冲液(pH7.4)、0.25M蔗糖、0.1mM EDTA的溶液中匀浆，然后以3000G离心5分钟，进而以100000G离心上清液30分钟，得到A431细胞膜部分，将其作为酶源的部分精制EGF受体供与活性测定。

溶解于上述A431细胞膜部分(10-15μg)、30mM Hepes缓冲液(pH7.7)、2mM MnCl₂、100mM Na₃VO₄和二甲基亚砜中的被测物的反应混合液(最终浓度1％DMSO)中添加100ng的EGF后，加入合成基质血管紧张素II(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)50μg，腺苷三磷酸(含有Y³²-P-标记体37KBq)最终浓度10mM，使反应开始。此时的容量为60μL。

在冰中反应30分钟，加入10mg/mL牛血清白蛋白6μL、20％三氯醋酸25μL，使反应停止，然后直接在冰水中放置30分钟。

然后，以5000G离心2分钟后，取上清液40μL，吸附P81磷纤维素纸上。将其浸渍在0.75％磷酸水溶液中5分钟，清洗，重复四次浸渍、清洗操作后，取出纸，通过闪烁扫描计数器测定³²P的计数，将该值设定为A。

同时也测定不添加被测物质的反应，被测物质和EGF都不添加的反应的计数，分别设定为B、C。

由这些值根据下式计算酪氨酸激酶抑制率。

抑制率(％)＝100-{(A-C)/(B-C)}*100

根据变化被测物质的添加浓度所得的抑制率，算出IC₅₀值(50％抑制浓度)

表1

化合物	IC₅₀
		式(I)化合物	1.6
阳性对照	2.1

2.式(I)化合物对人表皮生长因子受体2HER2酪氨酸激酶抑制作用

细胞使用通过将第659个缬氨酸取代为谷氨酸而具有稳定活性的变异c-erbB2进行变形的NIH3T3小鼠纤维母细胞株。以下记为A4细胞。利用添加10％FBS的DMEM/F12混合培养基(以下称为通用培养基)，以37℃培养2小时。用PBS将细胞清洗一次后，再次悬浊在溶胞缓冲液(60mM三羟甲基氨基甲烷Tris(pH6.8)，2％十二烷基硫酸钠SDS，10％甘油，5％β-巯基乙醇，0.001％溴酚蓝)中，用超声波处理，作为全细胞溶解产物用于西部蛋白质转移吸印法中。

将蛋白量25μg份的全细胞溶解产物用于7.5％SDS-聚丙烯酞胺电泳后，复制在PVDF膜上。将该膜封闭后，在添加0.1％吐温20的三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液中与磷酸酪氨酸、小鼠单克隆抗体进行孵化，然后，用HRP标记抗小鼠2次抗体处理。用化学试剂处理膜，用发光CCD摄相机进行化学发光摄像，记录在电子媒体中。用光密度计对所得的磷酸信号进行定量化，将不添加化合物时的信号设为100％抑制剂，背景信号设为0％，以％抑制来评价基于化合物的磷酸化抑制。

表2

化合物	％抑制(0.1μM)	％抑制(1μM)
			式(I)化合物	46	5
阳性对照	42	4

3.式(I)化合物对对体外抗肿瘤细胞增值IC ₅₀ 的测定

3.1实验目的

通过CCK-8检测试剂盒检测定式(I)化合物对SK-BR-3和A549细胞株的增殖半数抑制浓度IC₅₀。

3.2实验材料与方法

细胞株：

SK-BR-3人乳腺癌细胞株(来源：中科院细胞生物研究所)

A549人非小细胞肺癌细胞株(来源：中科院细胞生物研究所)3.3实验试剂和配制

试剂和耗材：

试剂盒CCK-8试剂盒，购自上海易利试剂盒专卖公司

96孔培养板(购自北京索莱宝科技有限公司)

澳大利亚血缘胎牛血清FBS(购自上海启发生物技术有限公司，产品型号10099-141)

培养基(购自上海浩然生物技术有限公司产品型号RPMI1640和DMEM)

台式酶标仪购自美国分子仪器公司中国办事处

侯选化合物：式(I)化合物，分子量为497.95，纯度＞95％，约为5mg，低温冷藏。

3.4实验步骤

1)试剂配制

培养基的配制

化合物的制备：

用DMSO稀释化合物使终浓度为10mM。

2)细胞培养

(1)收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，

(2)调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板，每孔接种100μl细胞悬液。

(3)细胞在37℃，100％相对湿度，5％ CO₂培养箱中孵育24小时。

3)IC₅₀实验

(a)收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(依照细胞密度优化试验结果确定)，接种96孔板，每孔加100μl细胞悬液。细胞在37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育24小时后。

(b)用培养基将待测化合物稀释至500μM后梯度稀释8次。按25μl/孔加入细胞。化合物终浓度从100μM至0μM，3倍稀释，共10个浓度点。

(c)细胞置于37℃，100％相对湿度，5％ CO2培养箱中孵育72小时。

(d)吸弃培养基，加入含10％CCK-8的完全培养基置于37℃培养箱中孵育2-4小时。

(e)轻轻震荡后在SpectraMax M5 Microplate Reader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。

(4)数据处理

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％

As：样品的OA(细胞+CCK-8+待测化合物)

Ac：阴性对照的OA(细胞+CCK-8+DMSO)

Ab：阳性对照的OA(培养基+CCK-8+DMSO)

3.5实验结果

归纳后的IC₅₀值详见表3

表3

从上表可以看出，式(I)化合物对人乳腺癌细胞株SK-BR-3和人非小细胞肺癌细胞株A549的IC₅₀值均低于阳性对照的IC₅₀值，表明它对肿瘤细胞SK-BR-3和A549的增殖抑制效果好于阳性对照。

从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本发明的具体实施方案，但是在不偏离本发明的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种变形或改进。这些变形或修改都应落入本申请所附权利要求的范围。

Claims

1.式(I)所示的化合物，

2.式(II)所示的式(I)化合物的中间体，

3.式(III)所示的式(I)化合物的中间体，

4.包含式(I)所示的化合物以及药物可接受的载体的药物组合物。

5.制备式(II)化合物的方法，

6.如权利要求5所述的方法，其中所述反应在醇类优选异丙醇的胺优选三乙胺溶液中进行，优选在吡啶盐酸盐为助剂下进行。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中反应温度为65-100℃，在惰性气体保护下进行1.5-6小时。

8.制备式(III)化合物的方法，

其包括：将(II)化合物与碱反应，得到式(III)化合物。

9.制备式(I)化合物的方法，

其包括：

10.如权利要求9所述的方法，其中所述的脱保护反应在有机溶剂和碱溶液中进行，优选所述有机溶剂为二氯甲烷和三氟乙酸的混合物，优选所述碱溶液为碳酸氢钠溶液。

11.如权利要求9所述的方法，其中步骤(3)的反应在无水碳酸钠和碘化钾的混合溶液中进行。

12.如权利要求9所述的方法，其中所述N-甲基-卤代乙酰胺为N-甲基-氯乙酰胺或N-甲基-溴乙酰胺。

13.式(I)化合物在制备用于治疗和/或预防与蛋白酪氨酸激酶有关疾病或疾病状态的药物中的用途，

14.如权利要求13所述的用途，其中所述与蛋白酪氨酸激酶有关疾病或疾病状态为与表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述与表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态为与人表皮生长因子受体2蛋白酪氨酸激酶有关的疾病。

16.如权利要求13所述的用途，其中所述与蛋白酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态为实体瘤。

17.如权利要求13所述的用途，其中所述与酪氨酸激酶有关的疾病或疾病状态选自非小细胞肺癌和乳腺癌。