CN102998468B

CN102998468B - 25-羟基维生素d3检测试剂盒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102998468B
Application number: CN201210351495.3A
Authority: CN
Inventors: 华权高; 沈鹤霄; 许可; 闫彩霞; 常向博; 舒芹; 余箭翔
Original assignee: CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Current assignee: CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2012-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2032-09-20
Also published as: CN102998468A

Abstract

本发明公开了一种检测25-羟基维生素D3含量的试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：25-羟基维生素D3-BSA偶联物、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、助悬剂、防腐剂、封闭剂、稳定剂和水。本发明试剂盒检测灵敏度高，特异性强，定量准确，线性范围宽，尤其适用于25-羟基维生素D3含量极低样品的检测。此外，本发明试剂盒在检测过程中不需对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、检测成本低，适用于各种全自动生化分析仪。

Description

25-羟基维生素D3检测试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种检测人体内25-羟基维生素D3含量的试剂盒及其制备方法，本发明还涉及该25-羟基维生素D3测定试剂盒在检测人体内25-羟基维生素D3含量的使用方法，属于25-羟基维生素D3含量的检测领域。

背景技术

25-羟基维生素D3是人体内存储维生素D的主要形式之一，它是人体正常代谢活动不可或缺的物质之一。总体而言，全球三分之二的人缺乏维生素D，其中，在儿童、老人和孕妇中更容易出现维生素D缺乏的现象。体内维生素D的缺乏，使儿童患佝偻病和老人患骨质疏松症的可能性大大增加。近年来大量研究表明，维生素D的缺乏直接影响到人体内肿瘤的发生，特别是结肠癌、乳腺癌和前列腺癌；目前，维生素D的缺乏已被证实为判别腺癌发生的重要标志物，在临床诊断上将成为一项重要的指标。此外，维生素D的缺乏还与自身免疫性疾病、感染性疾病和心血管疾病等的发生有着密切的关系。目前，临床上对维生素D的定量检测已成为常规检测项目和体检项目。为此，建立一种快速、简便、灵敏、准确可靠的检测维生素D水平的方法尤为重要。

近几年来，25-羟基维生素D3的定量检测主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验方法主要有液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）；免疫学方法主要有放射免疫法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）。液相色谱-质谱联用（LC-MS）的检测方法虽然灵敏度高，但是存在仪器昂贵、样品前处理复杂、操作繁琐、检测时间长等诸多弊端。放射免疫法虽然存在操作简单、特异性强、灵敏度高等优势，但是同样存在着辐射污染以及稳定性差等方面的缺陷。酶联免疫吸附法（ELISA）虽然准确、灵敏度高，但是存在操作要求严格且费时等缺陷，不适用于急诊和临床病人及时诊断和治疗的需要。

迄今为止，尚缺乏一种操作简单快速、定量准确、敏感度高或特异性强的用于检测人体内25-羟基维生素D3含量的试剂盒。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种25-羟基维生素D3检测试剂盒；

本发明的目的之二是提供一种制备所述25-羟基维生素D3检测试剂盒的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种检测25-羟基维生素D3含量的试剂盒，由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：25-羟基维生素D3-BSA偶联物、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂和水；

试剂Ⅱ的组分包括：包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、助悬剂、防腐剂、封闭剂、稳定剂和水。

本发明发现，试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中各组分的用量对于检测的准确度、灵敏度及特异性均有着非常显著的影响；本发明通过大量的优选试验最终筛选到了试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中各组分的最佳用量，采用下述这些优选的用量能够有效提高检测结果的准确度、灵敏度及特异性：

每1升试剂Ⅰ中各组分的用量优选为：25-羟基维生素D3-BSA偶联物0.05-50mg，生物缓冲剂1-100g，螯合剂0.1-10g，表面活性剂0.1-5mL，防腐剂0.1-10g，稳定剂1-50g，促凝剂1-50g，余量为水；

进一步优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：25-羟基维生素D3-BSA偶联物0.1-30mg，生物缓冲剂5-50g，螯合剂0.5-5g，表面活性剂0.5-4mL，防腐剂0.5-5g，稳定剂10-40g，促凝剂10-40g，余量为水；

更进一步优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：25-羟基维生素D3-BSA偶联物0.5-20mg，生物缓冲剂10-20g，螯合剂0.7-2g，表面活性剂0.7-2mL，防腐剂0.6-1.5g，稳定剂15-30g，促凝剂12-30g，余量为水；

最优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：25-羟基维生素D3-BSA偶联物5mg，生物缓冲剂12g，螯合剂1g，表面活性剂0.5mL，防腐剂1g，稳定剂20g，促凝剂15g，余量为水；

每1升试剂Ⅱ中各组分的用量优选为：包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒0.1-10g，生物缓冲剂1-100g，螯合剂0.1-10g，表面活性剂0.1-10mL，防腐剂0.1-10g，助悬剂5-50mL，封闭剂5-50g，稳定剂50-150g，余量为水。

进一步优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被25-羟基维生素D3抗体胶乳颗粒0.5-5g，生物缓冲剂5-40g，螯合剂0.5-5g，表面活性剂1-7mL，防腐剂0.5-5g，助悬剂10-40mL，封闭剂6-30g，稳定剂80-140g，余量为水。

更进一步优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被25-羟基维生素D3抗体胶乳颗粒0.8-3g，生物缓冲剂8-15g，螯合剂1-3g，表面活性剂1-4mL，防腐剂0.7-2g，助悬剂15-30mL，封闭剂8-15g，稳定剂90-120g，余量为水。

最优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被25-羟基维生素D3抗体胶乳颗粒1.8g，生物缓冲剂10.5g，螯合剂2g，表面活性剂3mL，防腐剂1g，助悬剂20mL，封闭剂10g，稳定剂100g，余量为水。

为了实现更好的检测效果，试剂Ⅰ的pH值的范围优选为7.0-8.0，试剂Ⅱ的pH值的范围优选为6.5-7.5。

本发明试剂Ⅱ中所述的“包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒”是在磷酸盐缓冲液中将25-羟基维生素D3抗体通过物理吸附或化学交联等方法结合到羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，再经过离心、洗涤后所得；其中，所述的25-羟基维生素D3抗体可以是25-羟基维生素D3单克隆抗体或多克隆抗体。

可以通过物理吸附或化学交联的方法将25-羟基维生素D3抗体结合聚苯乙烯胶乳颗粒的表面。物理吸附的抗体在长时间放置后，抗体蛋白容易解吸附，导致检测灵敏度降低，重复性较差。本发明优选采用通过化学交联的方法将25-羟基维生素D3抗体结合到羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，这样能够使结合的抗体更加稳定。

优选的，一种制备包被25-羟基维生素D3单克隆抗体或多克隆抗体胶乳颗粒的方法，包括以下步骤：

①将聚苯乙烯胶乳颗粒用磷酸盐缓冲液分散，再加入6-氨基己酸溶液和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），搅拌均匀后，离心弃上清；再用磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳得到羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液；

②将25-羟基维生素D3单克隆抗体或多克隆抗体冻干品用去离子水溶解，制成抗体溶液；

③取抗体溶液，用磷酸盐缓冲液稀释后，加入步骤①所制备的羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，再加入EDC，在0-4℃搅拌反应，加入甘氨酸缓冲液搅拌，终止反应，离心弃上清，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，得到包被25-羟基维生素D3抗体胶乳颗粒。

试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂主要是起到中和酸碱的作用，所以能够起到中和酸碱作用的各种缓冲剂均能够适用于本发明的生物缓冲剂，例如可以是三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三羟甲基甲胺基乙磺酸（TES）、2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）、三羟甲基甲胺基丙磺酸（TAPS）、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸（POPSO）、3-（N-吗啉）丙磺酸(MOPS)等各种常用生物缓冲液，为了达到更好的检测效果，试剂Ⅰ中所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷，试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂优选为3-（N-吗啉）丙磺酸。

试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的螯合剂所起到的作用是络合检测样本中的金属离子，以减少金属离子造成的干扰；因此，能够络合金属离子的各种螯合剂均能够作为本发明试剂盒中的螯合剂，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等均可作为本发明试剂盒中的螯合剂；为了达到更好的检测效果，本发明优选乙二胺四乙酸二钠（EDTA）作为试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的螯合剂。

试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明；为了达到更好的检测效果，优选的，本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中所述的防腐剂为叠氮化钠。

试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂主要起到促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的溶解，达到减少样本浊度对测定结果的影响的作用；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂，例如，吐温20、吐温40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等均可作为本发明试剂盒中的螯合剂。为了达到更好的效果，试剂Ⅰ中所述的表面活性剂优选为曲拉通X-100。

试剂Ⅱ中优选将曲拉通X-100和吐温20组合在一起使用作为表面活性剂，其中，每1升试剂Ⅱ中曲拉通X-100的用量为0.05～2.5mL，优选为0.15～2mL，再次优选为0.5-1mL，最优选为0.5mL；每1升试剂Ⅱ中吐温20的用量为0.5～5mL，优选为1～4mL，再次优选为2-3mL，最优选为2.5mL。

试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的稳定剂主要作用是保持试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架寿命。常用的稳定剂为不含蛋白的纯化学物质，如氯化钠、氯化钾、蔗糖等纯化学物质，本发明中的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的稳定剂优选为蔗糖。

试剂Ⅰ中所述的促凝剂是为了促进血液样本中干扰物质的快速凝集，减少对检测结果的干扰，检测试剂盒中常用的促凝剂常用的为聚乙二醇6000或聚乙二醇8000，本发明的检测试剂盒中这两种成分均可以选用。

试剂Ⅱ中所述的助悬剂的主要作用是维持体系中各物质的均匀分布，减少试剂不均匀而导致的测定结果误差，常用的助悬剂有乙二醇、丙三醇、乳糖和麦芽糖等，本发明试剂Ⅱ中的助悬剂优选为乙二醇。

试剂Ⅱ中所述的封闭剂的主要作用是为了避免非特异性反应的发生，减少检测过程中的假阳性干扰，本发明试剂Ⅱ中的封闭剂选自牛血清白蛋白（BSA）。

本发明检测试剂盒中所用到的每种组分均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。

本发明的另外一个目的是提供一种制备所述检测25-羟基维生素D3试剂盒的方法，包括：

（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；（2）制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。

本发明的又一目的是提供所述25-羟基维生素D3检测试剂盒检测样品中25-羟基维生素D3含量的检测方法，该方法包括以下步骤：

向2μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中加入125μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入25μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，5分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A1-A2。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。

本发明检测试剂盒采用双试剂模式有效地避免了非特异性反应的干扰，保证了测定结果的稳定可靠。该检测试剂盒采用胶乳免疫比浊法作为检测原理，具有操作简单、快速、定量准确、敏感度高、特异性强等优点，可满足门急诊等检测的需要，在临床上有着越来越广泛的用途。

附图说明

图1是5-羟基维生素D3标准工作曲线。

图2是本发明试剂盒与酶联免疫分析法测值的相关性试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

预备实施例125-羟基维生素D3-BSA偶联物的制备

①称取2.0mg的25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯（购于上海汉尊生物公司）、0.8mg的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和2.0mg的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入装有1mL无水三氯甲烷的圆底烧瓶中，后在室温、氮气保护下搅拌反应2h;

②反应终止后，向圆底烧瓶中加入1mL3mg/mL BSA溶液，于室温、氮气保护下搅拌反应过夜；

③上述反应液用0.01mol/L pH7.2的PBS4℃透析48小时，中间换液6次，每隔8小时换液1次，收集透析物，用葡聚糖凝胶HiTrap^TMDesalting过柱脱盐纯化2次，真空冷冻干燥，即制得25-羟基维生素D3-BSA偶联物25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA。

预备实施例225-羟基维生素D3多克隆抗体的制备

①用25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA免疫3月龄，体重1.5kg的雄性日本大耳白兔，首次免疫用无菌的PBS溶液溶解25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA并与等量的弗氏完全佐剂（FCA）混合充分乳化，免疫剂用量为1mg（0.5mL）/只，于背部皮下分4-6个部位注射；

②首次免疫2周后，同样用无菌的PBS溶液溶解25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA并与等量的不完全佐剂（FIA）混合充分乳化免疫兔子，免疫剂量为500μg（0.5mL）/只，注射部位同前。

③所有的兔子共免疫6次，每次间隔2周，第4次免疫后采用间接ELSIA和间接竞争ELSIA测定兔抗血清效价和特异性，第6次免疫通过腹腔注射加强免疫，最后一次免疫7天后，心脏采血，得到大量的兔抗血清。将兔多抗血清经过亲和层析柱分离纯化即可得到25-羟基维生素D3多克隆抗体。

预备实施例3包被25-羟基维生素D3多克隆抗体胶乳颗粒的制备

①称取1.0g聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）干燥物，加入100mL0.12M磷酸盐缓冲液（pH7.5）分散，再加入20mL的0.01M的6-氨基己酸溶液及40mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），在室温下搅拌3小时，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，制成接有氨基己酸手臂的羧化聚苯乙烯胶乳，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳得到羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液；

②将250μg25-羟基维生素D3多克隆抗体冻干品用0.5mL去离子水溶解，得到抗体溶液；

③将步骤②所制的抗体溶液用25mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释后，加入25mL步骤①所制的胶乳溶液，再加入10mg EDC，在5℃搅拌反应8小时，加入1mL0.15M甘氨酸缓冲液搅拌40分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，得到包被25-羟基维生素D3多克隆抗体的胶乳颗粒。

实施例125-羟基维生素D3检测试剂盒的制备：

1、试剂Ⅰ的制备：

按所述用量取各组分：

将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。

2、试剂Ⅱ的制备：

按所述用量取各组分：

包被25-羟基维生素D3多克隆抗体的胶乳颗粒2.0g

实施例225-羟基维生素D3检测试剂盒的制备

1、试剂Ⅰ的制备：

按所述用量取各组分：

2、试剂Ⅱ的制备：

按所述用量取各组分：

实施例325-羟基维生素D3检测试剂盒的制备：

1、试剂Ⅰ的制备：

按所述用量取各组分：

2、试剂Ⅱ的制备：

按所述用量取各组分：

实施例425-羟基维生素D3检测试剂盒的制备

1、试剂Ⅰ的制备：

按所述用量取各组分：

2、试剂Ⅱ的制备：

按所述用量取各组分：

实施例525-羟基维生素D3检测试剂盒的制备：

1、试剂Ⅰ的制备：

按所述用量取各组分：

2、试剂Ⅱ的制备：

按所述用量取各组分：

实施例625-羟基维生素D3检测试剂盒的制备

1、试剂Ⅰ的制备：

按所述用量取各组分：

2、试剂Ⅱ的制备：

按所述用量取各组分：

实施例725-羟基维生素D3检测试剂盒的制备

1、试剂Ⅰ的制备：

按所述用量取各组分：

2、试剂Ⅱ的制备：

按所述用量取各组分：

实施例825-羟基维生素D3检测试剂盒的制备

1、试剂Ⅰ的制备：

按所述用量取各组分：

2、试剂Ⅱ的制备：

按所述用量取各组分：

试验例1本发明检测试剂盒的线性范围检测试验

1、供试试剂盒：实施例1-8所制备的试剂盒

配制5μg/L，20μg/L，40μg/L，80μg/L，100μg/L的25-羟基维生素D3标准溶液，用本发明实施例1-6所制备25-羟基维生素D3测定试剂盒，绘制其标准工作曲线，结果见图1。

本发明试剂盒检测样品中25-羟基维生素D3含量，包括以下步骤：向2μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中加入125μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入25μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，5分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A1-A2。以吸光度差值ΔA为纵坐标，标准品浓度为纵坐标，制作“浓度-吸光度差值”标准工作曲线，见图1。

试验例2本发明试剂盒准确度及精确度检测试验

1、供试试剂盒：实施例1-6所制备的试剂盒；

2、试验方法及结果

准确度和精确度是反应检测试剂盒测量结果的准确程度与可信程度。本试验以英国IDS公司的25-羟基维生素D校准品作为测试对象，评价本发明检测试剂盒的准确度和精确度，试验结果见表1。

表1本发明试剂盒准确度及精确度检测试验结果

从表1的试验结果可知，本发明的检测试剂盒测量英国IDS公司校准品所得的结果很准确，且测量的精确度很好。

试验例3本发明试剂盒与酶联免疫分析法(Elisa)测值的相关性试验

1、供试试剂盒：实施例1所制备的试剂盒

2、试验方法及结果

通过用本发明实施例1的试剂盒与酶联免疫分析方法测定EDTA抗凝血浆中25-羟基维生素D3的含量的测定值进行比较，试验结果为图2所示，并进行回归分析。从图2中可以看出本发明试剂盒与酶联免疫分析法在EDTA抗凝血浆25-羟基维生素D3测定方面具有良好的相关性。

Claims

1.一种检测25-羟基维生素D3含量的试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：25-羟基维生素D3-BSA偶联物、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、助悬剂、防腐剂、封闭剂、稳定剂和水；所述生物缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷或3-(N-吗啉)丙磺酸，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，所述表面活性剂为曲拉通X-100或吐温20，所述助悬剂为乙二醇，所述防腐剂为叠氮化钠，所述稳定剂为蔗糖，所述促凝剂为聚乙二醇6000，所述封闭剂为牛血清蛋白。

2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：25-羟基维生素D3-BSA偶联物0.05-50mg，生物缓冲剂1-100g，螯合剂0.1-10g，表面活性剂0.1-5mL，防腐剂0.1-10g，稳定剂1-50g，促凝剂1-50g，余量为水；

每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒0.1-10g，生物缓冲剂1-100g，螯合剂0.1-10g，表面活性剂0.1-10mL，防腐剂0.1-10g，助悬剂5-50mL，封闭剂5-50g，稳定剂50-150g，余量为水。

3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：25-羟基维生素D3-BSA偶联物0.1-30mg，生物缓冲剂5-50g，螯合剂0.5-5g，表面活性剂0.5-4mL，防腐剂0.5-5g，稳定剂10-50g，促凝剂10-40g，余量为水；

每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒0.5-5g，生物缓冲剂5-40g，螯合剂0.5-5g，表面活性剂0.5-5mL，防腐剂0.5-5g，助悬剂10-40mL，封闭剂6-30g，稳定剂80-140g，余量为水。

4.按照权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：25-羟基维生素D3-BSA偶联物0.5-20mg，生物缓冲剂10-20g，螯合剂0.7-2g，表面活性剂0.7-2mL，防腐剂0.6-1.5g，稳定剂15-30g，促凝剂12-30g，余量为水；

每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被25-羟基维生素D3抗体胶乳颗粒0.8-3g，生物缓冲剂8-15g，螯合剂1-3g，表面活性剂1-4mL，防腐剂0.7-2g，助悬剂15-30mL，封闭剂8-15g，稳定剂90-120g，余量为水。

5.按照权利要求1-4任何一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒通过以下方法制备得到：将25-羟基维生素D3抗体结合到聚苯乙烯胶乳颗粒的表面，再经过离心、洗涤，即得。

6.按照权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒通过以下方法制备得到：

①将聚苯乙烯胶乳颗粒用磷酸盐缓冲液分散，再加入6-氨基己酸溶液和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，搅拌均匀，离心弃上清；用磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳得到羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液；

②将25-羟基维生素D3单克隆抗体或多克隆抗体用水溶解，制成抗体溶液；

③取抗体溶液，用磷酸盐缓冲液稀释，加入步骤①所制备的羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，在0-4℃搅拌反应，加入甘氨酸缓冲液搅拌，终止反应，离心弃上清，洗涤沉淀，即得。

7.按照权利要求1-4任何一项所述的试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ的pH值的范围为7.0-8.0；试剂Ⅱ的pH值的范围为6.5-7.5。

8.一种制备权利要求1-4任何一项所述试剂盒的方法，包括：

(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水中，混合均匀；

(2)制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水中，混合均匀；

(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。

9.一种制备权利要求1-4任何一项所述试剂盒的方法，包括：

(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于双蒸水中，混合均匀；

(2)制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于双蒸水中，混合均匀；

(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。