CN102973609A - 用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物、制备方法及在生产肠溶片中的应用 - Google Patents

Abstract

用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物、制备方法及在生产肠溶片中的应用，涉及从动植物，特别是从蜂胶中提取有效物质合并蜂王浆制备肠溶片的工艺技术领域。先将蜂胶冷冻、粉碎除杂，再以常压常温乙醇重复浸泡三次后，冷冻离心除去固体杂质，取乙醇上清溶液，最后，在1～5℃的环境温度下分离出分子量为4000D以下的蜂胶乙醇提取物，经乙醇蒸馏回收得到干粉，将蜂胶粉与蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉等混合制防治酒精性脂肪肝蜂胶肠溶片，本发明对于防治酒精性脂肪肝效果显著，且无副作用，而且费用低廉，简单易行。

Description

用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物、制备方法及在生产肠溶片中的应用

技术领域

本发明涉及从动植物及其分泌物，特别是从蜂胶中提取活性物质的工艺技术领域。

背景技术

经WHO统计我国长期饮酒者近2亿人，因酒精的毒性作用而致肝脏损害，嗜酒者中约2／3可发展为酒精性肝病（ALD），其包括酒精性肝损伤、脂肪肝（AFL）、肝炎、肝纤维化和肝硬化，是顺序渐进的过程，发病机制较复杂，中药对AFL治疗效果尚可。酒精性肝病是临床上常见的肝病之一，主要是患者长期大量饮酒所致的肝损害。据西方研究，酒精性肝病是导致肝硬化的主要病因，几乎50％的肝硬化患者都有长期饮酒的习惯。

近年来，随着我国人民生活水平提高，生活方式和饮食习惯改变，酒精性肝病发病率明显上升，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，并且逐渐向女性化、少年化发展。酒精性肝病在临床上已属多发病和常见病，所以，对酒精性肝病的临床研究引起了广泛的关注。酒精性肝病的好发年龄为3O-50岁，其发病率逐年增加，且有年轻化和女性化的倾向。通过研究发现酒精性肝病患者年龄越大，饮酒史越长，饮酒量越大，肝功能损害就越重；酒精性肝病除与饮酒时间和饮酒量有关外，还和患者所饮酒类的质量及患者的饮酒习惯密切相关，酒类质量越差，其患病率越高；空腹饮用白酒或混合饮用多种酒类，患病率也会明显增加；其次，虽然男性患者多于女性患者，但如果男女饮相同量的酒，女性较男性更容易患酒精性肝病，且临床症状较男性严重。由于受自身体质量、脂肪以及胃排空时间等因素的影响，女性的酒精性肝损害有高易感性。

目前各种各样的应酬越来越多，由于酗酒所引起的各种肝脏疾病的发病率逐年提高，酒精性脂肪肝已经成为影响现代人生活质量的重要问题，社会迫切需要新型廉价的天然防治新产品的出现，而纯天然的蜂产品具有很强的防治酒精性脂肪肝的作用，推广使用意义重大。

酗酒可导致实质器官的微血管改变和脂肪变性，进而发展为器官的萎缩和硬化，最初可出现在肝脏、肺、心脏和脑；肥胖可使体内游离脂肪酸（FFAs）增加，后者除本身引起的脂毒性外，还可抑制葡萄糖的氧化、抑制糖原合成、影响胰岛β细胞功能，加速甘油三酯在肝细胞内蓄积等。酒精和肥胖可使上述所有病理变化加重外，还可诱发脂肪性肝炎，并能促进活性氧和活性乙醛-4-羟基乙醛基产生并增加，使酒精性脂肪肝（ASH）和非酒精性脂肪肝（NASH）都处在高水平的氧化应激状态，促使炎症和纤维化不断升级。糖脂代谢异常和酗酒还可以表现在对胰岛素抵抗（IR）的协同作用，IR是肥胖和超重人群代谢综合征的一个重要标志，同时也是FFAs在肝脏聚集的标志，肝细胞中的FFAs可以作为非TG代谢物的载体，加速组织破坏和炎症浸润及纤维化；酒精可以介导周围型IR并刺激肝脏脂肪酸代谢，还可以在乙醇脱氢酶介导乙醇氧化成乙醛过程中，由于NAD⁺向NADH转化使NAD⁺消耗增加，促进FFAs合成，抑制脂质分解，最终导致TG在肝细胞内蓄积。另外，与传统饮酒者导致明显的营养缺乏和体重降低不同，狂饮者可能会食欲增加，更多的摄入纤维、高脂等食物，使酒精中获得的额外能量不能通过减少食物摄入量来抵消，最终导致体重增加及肥胖。

在慢性酗酒、糖尿病和肥胖条件下，粘膜损伤导致的肠道渗透性增强，使肠道细菌分解产生的巨大分子物质如病原体相关的分子进入肠内循环，并通过门脉系统进人肝脏，激活肝星状细胞表达TLRs。在TLRs配体刺激后，纤维原细胞激活MAP信号途径，激活NF-κB，促使胶原肌纤维原细胞分泌大量前炎症细胞因子及化学因子，使血管周围产生炎症反应和纤维化。尤其是肿瘤坏死因子-α、白介素-6、血清内毒素／脂多糖和血浆胶原激活抑制剂-1等可以作为儿童NAFLD向NASH转化的重要生物标记物。

长期过度饮酒，可使肝细胞发生脂肪变性、坏死和再生，导致酒精性肝病（ALD）；在组织病理学上主要表现为三种形式：酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化，这三种形式可单独也可混合存在。随着生活条件的改善，酗酒有增多趋势。由于我国肝病主要由肝炎病毒引起，肝炎病毒携带者的数量更多，可能掩盖了实际上是酒精作为病因的肝病。因此，正确认识酒精引起的肝损害，及时诊断和防治具有重要的意义。

据研究，酒精性肝病的病因是乙醇的过量摄入，摄入的乙醇主要在十二指肠和上段回肠通过单纯扩散吸收，胃也能缓慢吸收少量的乙醇，进入血液循环中的乙醇随着血流迅速扩散，在肝、肺及脑等血管分布较多的器官很快达到平衡。乙醇不能储存，必须被代谢，肝脏是体内乙醇代谢的最主要器官，其中90～95%在肝脏通过乙醇脱氢酶（ADH）和微粒体乙醇氧化酶系统（MEOs）进行氧化代谢，长期大量饮酒在加重肝脏负担的同时，很大程度上对肝脏造成损伤。乙醇代谢后的主要产物是乙醛，同时还产生氧应激产物，乙醛随后又被乙醛脱氢酶（ALDH）氧化代谢最终的产物是二氧化碳和水。戒酒是ALD治疗关键的措施之一，戒酒可明显提高ALD患者的生存质量。戒酒后可使ALD的肝功能异常迅速好转，明显提高生存率；对于轻微ALD，戒酒后可不继续发展；肝硬化已充分形成，且有门脉高压和食管静脉曲张者，戒酒也难以逆转，但可改善活动进程，减少并发症的发生。酒精性肝病患者通常合并热量／蛋白质缺乏性营养不良，而营养不良又可加剧酒精性肝损伤。因此，酒精性肝病患者宜给予富含优质蛋白和维生素B类、高热量的低脂软食，必要时适当补充支链氨基酸为主的复方氨基酸制剂。严重的酒精性肝病应执行卧床休息，疾病的稳定阶段应做肌肉锻炼，如非剧烈运动、体操、游泳，家庭中简单易行的身体锻炼同样有效。

目前，有关酒精性脂肪肝的确切发生机制尚未完全明了；一般认为长期饮酒可使体内乙醛生成量增加，NADH/NAD的平衡改变而导致脂肪代谢和转运紊乱，酒精性脂肪肝是由于乙醇削弱了正常肝细胞的代谢及肝细胞膜的稳定性。①乙醇中间产物乙醛及乙酸，可使还原性辅酶I与辅酶Ⅱ的比值升高，从而抑制线粒体三羧酸循环，使肝内脂肪酸代谢发生障碍。②酒精有特异性地增加胆碱需要量的作用，磷脂的不足影响了脂蛋白的合成，从而使运出发生障碍。③大量饮酒致胃肠功能紊乱，影响微量元素的吸收，使体内氧化磷酸化和脂肪酸β氧化受损，血中游离脂肪酸增多，促进脂肪肝形成，大量乙醇刺激肾上腺及垂体-肾上腺轴，增加脂肪组织分解率，使甘油三脂合成增加并堆积。④长期饮酒可诱导肝微粒体中细胞色素P450的活性，其活性增加更加重乙醇及代谢产物对肝脏的毒性作用。酒精中毒引起的肝损伤的机理比较复杂，除了乙醇的直接毒性作用外，乙醇代谢过程中，产生大量的氧自由基，引起肝脏脂质过氧化，是形成肝脏损伤的一个原因。

从防治效果看，戒酒对酒精性肝病的治疗预后非常重要，戒酒为终生治疗，仅此一项即可改变肝病进程。加强社会宣传教育、改变生活方式、减少烈性酒精耗量、早期诊治酒精肝及提高戒酒成功率等，可逐步减少酒精性肝病的发病率。

研究表明双环醇有良好的保肝降酶作用，从ALT、AST、ALP和GGT的恢复速度和程度明显优于多烯磷脂酰胆碱组，其机理可能是诱导体内抗氧化物谷胱甘肽-s-转移酶（GST）和还原型谷胱甘肽（GSH），提高肝细胞抗氧化能力，提高肝细胞线粒体内GSH水平，双环醇还能保护肝线粒体结构，对抗各类肝损伤负效应；双环醇不是抑制剂，而是通过清除氧自由基，保护肝细胞膜，使肝细胞核DNA免受损伤及减少细胞凋亡的发生而起到保肝作用；双环醇可减轻酒精引起的脂质过氧化招致的肝损伤，从而改善炎症坏死，表明双环醇为一种治疗酒精性脂肪肝的较好药物选择。

由于脂肪肝并非为独立性病种，通过引发肝功能的损伤，引起血液生化指标和酶值的变化。在反应肝细胞损伤的检测项目中，以血清酶值最常见，如谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）等。当肝脏发生脂肪变时，由于肝细胞受到损害，细胞变性、坏死，细胞膜破碎或细胞膜的通透性增加，肝细胞中所含的ALT就会被释放到血液中，使血中ALT活性增加。由于ALT主要存在于肝细胞中，当其明显升高时常提示有肝损伤；肝脏发生脂肪变时，多以ALT升高为主。谷丙转氨酶（ALT）是诊断肝细胞实质损害的主要项目，其高低往往与病情轻重相平行。

有人把脂肪肝和冠心病比喻成高脂血症一根绳上的两个蚂蚱，因为肥胖、高脂血症、糖尿病和酗酒是脂肪肝的常见病因，而这些因素也同样与动脉粥样硬化和冠心病关系密切。有明显心肌损伤和血流动力学紊乱，T细胞免疫功能下降，肝活检研究显示，这些病例中91.4%有肝细胞脂肪变性。一般而言，酒精脂肪肝属可逆性疾病，早期诊断并及时治疗常可恢复正常。长期食用高脂食物或大量饮酒，酒精会直接毒害肝细胞，影响其结构及功能；许多人就是因为饮酒过度才患上酒精性肝炎、脂肪肝致使肝脏受损。而肝损伤可导致甘油三酯（TG）下降，甘油三酯是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，是体内能量的主要来源。脂肪肝会导致食入的大量脂肪吸收减少，胆汁分泌不足，不能分解吃进去的脂肪，脂肪在肝脏形成脂肪滴从而加重病情。

蜂胶是蜜蜂采集胶源植物的幼芽或愈伤组织分泌的树脂状物质，并混合自身腺体的分泌物、花粉和蜂蜡等混合而成的一种具有黏性的胶状物质。蜂胶富含多种生物活性物质，尤其是含有大量的黄酮类物质，具有多种医疗保健功效，被誉为“紫色黄金”。蜂胶在采收过程中不可避免的会混入木屑、蜂尸、杂草、沙石等杂质，在用于食品、药品等之前，必须经提纯净化，否则不能够服用。

蜂胶提取方法不同所得的有效成分也不相同，目前常用提取方法有：乙醇提取法、水提取法、超临界提取法、超声波辅助提取法、酶提取法、硼高分子电解质法、微波辅助提取法。通过研究发现不同提取方法、不同提取溶媒会表现不同的药理药效，表现出提取方式与药理药效具有明显的相关性。通过比较，超临界CO₂萃取法，不但设备昂贵、操作条件不易掌握，而且提取物得率低且抑菌能力较乙醇浸提法低，但该方法萃取物安全、无残留、无污染，有一定的开发前景，目前主要还是用于实验室研究。有机溶剂浸提法常用的有机溶剂有乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等，其中乙醇最为常用。乙醇浸提法所需设备简单，试剂容易购得，操作也十分方便，用乙醇作为提取溶剂，可以很容易使蜂胶脱蜡，并且可以保护一些多酚类物质，从而获得富含多酚类物质的精制蜂胶，故乙醇是最常用的提取溶剂，特别是70 ％和80％的乙醇。虽然有时也用95％的乙醇进行提取，但与水醇溶液相比，水醇溶液提取可以使蜂蜡更快地游离出来，同时提取液中还富含大量的多酚类物质。用不同浓度的乙醇对蜂胶进行提取，并测定不同浓度提取液中黄酮类物质的吸收光谱，结果显示在290nm处，80％乙醇提取的蜂胶提取液中有最高的吸收峰，这也就意味着其中含有最多的黄酮类物质，主要是莰菲醇、刺槐黄素和异樱花素。但是，用60％的乙醇提取出的最多的黄酮类物质是异樱花素、槲皮素和莰非醇，70％的乙醇可以提取出最多的乔松素和樱花素；用纯水可以提取出一些易溶于水的多酚类物质，甲醇、正己烷、氯仿有时也被作为提取剂使用。国内外对有机溶剂浸提蜂胶总黄酮的研究主要围绕其影响因素（如乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度）以及其他处理辅助措施（如微波处理、超声波处理）等方面展开。超声波辅助提取可以大大缩短提取时间，近年来已成为蜂胶总黄酮提取工艺研究的热点。以往大多围绕超声波处理时间、超声波功率等方面进行研究，关于超声波频率变化对蜂胶总黄酮提取影响的研究报道较少，且研究也不够深入。我们经过多年研究发现了蜂胶中还存在一类具有解酒和防治酒精性脂肪肝功能的物质，但是采用目前常用蜂胶乙醇提取方法得率较低，因而效果不显著，或者大剂量使用目前市场有售的蜂胶产品才可能达到目的，为此我们提出该发明申请，本发明使用的蜂胶剂量与现行的服用剂量一致。

蜂王浆是5至15日龄工蜂舌腺和上腭腺所分泌的乳白色或淡黄色乳状液体，是蜂王幼虫整个发育期和雄蜂幼虫前期的唯一食物，类似于哺乳动物的乳汁，又称蜂皇浆、王浆、蜂乳。对蜂王浆的重视和注意，首先是发现了喂饲蜂蜜的幼蜂只能长成工蜂，寿命一般 3 0～4 0天，最长 7—8个 月，而喂饲蜂王浆的幼蜂能够长成蜂王，寿命长达 3～5年，这一现象提示人们利用蜂王浆作为延年益寿的食品，但对其性质和作用机理并不了解。到1 8 8 8年，德国化学家A Von Planta才第一个对蜂王浆的组分进行一般性研究，至此人们开始了探讨蜂王浆的奥妙，但对蜂王浆进行包括生物学、化学药理和临床实验的全面研究，还是最近几十年才开始的，至今人们对蜂王浆中的一些微量生物 活性物质还未完全研究清楚。目前，已确定的功能因子约 9大类：它们是肽和蛋白质类；功能性甜味剂；功能性油脂；自由基清除剂；维生素；微量活性元素；活性多糖；黄酮类化合物及微生态因子如乳酸菌等。根据人们的研究发现，蜂王浆中含有这些丰富的功能因子，对人类有极强的营养保健功能和医疗作用。

现代研究表明：蜂王浆可减轻 ALD病程中肝细胞的损伤作用，对损伤后的肝脏组织有促进再生的作用，其作用机制可能是通过降低或抑制COX-2的生成，避免过度的炎性反应，达到减轻线粒体及脂质过氧化损伤，从而降低血清AST和ALT的水平；蜂王浆降低了TNF-α在肝细胞中的表达，而TNF-α作为炎性因子，介导了肝细胞的炎性反应，免疫反应、肝细胞凋亡和扩增肝纤维化等多种病理和生理活动。分析蜂王浆TNF-α降低的原因可能是蜂王浆是天然的氧自由基清除剂，可以减少ROS引起的核转录因子的活化，从而减少受其调控的TNF-α基因的表达。蜂王浆在酒精性肝病的形成过程中能够抑COX -2和 TNF-α的表达，对酒精性肝损伤有一定的保护作用。 蜂王浆还对CC14 肝纤维化大鼠的肝脏纤维化血清学指标及肝脏病理形态学均具有显著的改善作用，但对已经形成肝纤维化后的肝组织纤维化改善不明显，其可能的机制为蜂王浆能改善肝组织的炎症、减少ECM的合成和抑制TNF-α的分泌。过去已经研究出蜂王浆和蜂胶具有天然的功能协调和一致性，二者结合使用效果会更好。

肠溶片，是一类在胃中不溶、在肠液中可溶解的物质为主要包衣材料进行包衣而制成的片剂。片剂包肠溶衣是由药物性质和用药目的决定的：①为了防止酸性及酶对某些药物的破坏或防止药物对胃的强烈刺激性；②为了使药物如驱虫药、肠道消毒药等在肠内发生作用，③希望某些药物在肠道吸收或需要在肠道保护较长时间以延长药物作用。包上肠溶衣后，能在胃中保持完整而在肠道中释放出药物。

人们在大量饮酒的同时也摄取了大量的食物，特别是高油高脂性食物使人胃呈高饱腹状态，其胃容物的排空一般需要2小时左右，如果同时服用解酒的药物，由于服用量与胃容物相比相差太悬殊，很难发挥作用而失效，但如果采用大剂量的解酒药物，又会受到胃容量的限制而无法实施，所以饭后使用的解酒药物必须采用胃不溶性的处理方式，这就是我们为什么要开发肠溶片的主要原因。

发明内容

本发明第一目的在于发明一种能高效地从根本上防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物。

本发明为采用乙醇从蜂胶中提取的分子量小于4000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。

发明人经试验证明，从蜂胶中提取的分子量小于4000D的乙醇溶解的生物活性物质具有较好的防治酒精性脂肪肝的效果。

本发明另一目的是提出上述用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物的制备方法。

包括以下步骤：

1）将蜂胶置于-18℃的环境温度条件下冷冻20～40小时后粉碎；

2）常温常压下将体积浓度为50%～90%的食用酒精与粉碎后的蜂胶按1～6︰1的重量比混合，于10～40℃的温度条件下密闭浸泡1～2天；

3）将浸泡后的液体再次加入粉碎后的蜂胶，并重复两至三次，取得最后一次浸泡液，以8000～12000转冷冻离心10～12分钟除去固体杂质，取乙醇溶解蜂胶的上清液；

4）将上清液在室温下以4000D分子筛超滤分离，取得分子量小于4000D的蜂胶乙醇提取物；

5）将上述分子量小于4000D的蜂胶乙醇提取物置于乙醇蒸馏回收器中，蒸去食用酒精，得到分子量小于4000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。

目前研究发现影响蜂胶提取活性的因素主要有温度、pH值、提取次数、溶剂种类、溶剂浓度、浸泡时间、提取时间等。不同的提取工艺及溶媒提取的蜂胶，其有效成分会有所不同，提取方法不同，提取的成分、含量、溶剂都可能影响其机能发挥，造成种种差异，进而出现不同的药理作用。

本发明将蜂胶冷冻后使蜂胶变脆，确保粉碎蜂胶时做到细度均匀，便于有效成分的提取；蜂胶与乙醇的合适比例混合是为了确保蜂胶中有效乙醇溶性物质能够得到最大化的溶解；通过浸泡利于蜂胶中有效的生物活性物质的分离、溶解和保持活性，密闭是为了防止蜂胶中活性成分被空气中氧分子氧化失去活性，防止蜂胶中挥发性成分的损失；多次浸泡的工艺是确保乙醇溶液中提取分离出的蜂胶中防治酒精性脂肪肝的物质保持活性和含量；冷冻离心是确保离心分离时的温度较低，保证蜂胶乙醇提液中蜂蜡更好地析出，使提取出来的蜂胶更纯，利于下一步超滤时得到足够多的有效物质；经过研究发现分子量4000D以下的蜂胶乙醇溶性物质均具有较强的防治酒精性脂肪肝的作用，通过4000D的分子筛，确保提取液纯清、透明，使提取物纯净，控制提取温度是确保乙醇溶性物质纯洁性的最关键措施之一；通过乙醇蒸馏回收器回收乙醇得到蜂胶固形物含量大于90%的干燥物，除去乙醇是为了便于下一步的应用。

综上，本发明采用改良乙醇提取法，提取效率更高，速度更快，特别是能够显著提高蜂胶中防治酒精性脂肪肝有效的成分，显示出很强的防治酒精性脂肪肝的作用。

本发明的第三个目的是提出用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物在生产肠溶片中的应用。

以所述用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉制成用于制备防治酒精性脂肪肝的蜂胶肠溶片；所述蜂胶乙醇提取物、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉分别占肠溶片总质量的20～30%、10～20%、50～68%、0.2～0.6%、1～3%。

经试验，利用蜂胶乙醇提取物合并蜂王浆防治酒精性脂肪肝效果显著，且无副作用，而且费用低廉，简单易行。蜂胶是蜜蜂采集胶源植物的幼芽或愈伤组织分泌的树脂状物质，并混合自身腺体的分泌物、花粉和蜂蜡等混合而成的一种具有黏性的胶状物质。蜂胶富含多种生物活性物质，尤其是含有大量的黄酮类物质，具有多种医疗保健功效，被誉为“紫色黄金”。蜂王浆是 5-1 5日龄工蜂舌腺和上腭腺所分泌的乳白色或淡黄色乳状液体，是蜂王幼虫整个发育期和雄蜂幼虫前期的食物，类似于哺乳动物的乳汁，又称蜂皇浆、王浆、蜂乳。研究发现，蜂王浆中含有丰富的功能因子，对人类有极强的营养保健功能和医疗作用。蜂胶乙醇提取物合并蜂王浆能够在基因水平上发挥防治酒精性脂肪肝的药理作用，但对蜂胶和蜂王浆中是何物质起作用目前研究不多，对其防治酒精性脂肪肝的分子机理不完全清楚。

但是本发明已经基本解决了蜂胶合并蜂王浆防治酒精性脂肪肝的分子机理，为此，提出申请本发明专利。本发明就是利用乙醇提取的方法从蜂胶中分离出对防治酒精性脂肪肝有治疗效果的成份，合并蜂王浆生产防治酒精性脂肪肝的肠溶片。

作为肠溶片的优点是使用方便、吸收快，直接吸收进入肝脏解酒效果好、价格低廉；饮酒后胃内呈饱腹状态，会对解酒效果产生不利影响，而制作成肠溶片可以很好地克服这一不良情况，肠溶片可作为防治酒精性脂肪肝产品使用，价廉物美。 

经过研究发现，蜂王浆和蜂胶乙醇提取物中有许多生物活性物质在胃中易被胃酸破坏，所以制作肠溶片可以更好地保护生物活性物质免遭破坏，提高产品的使用效果。

附图说明

图1为自然健康组肝脏组织切片图。

图2为自然健康组肾脏组织切片图。

图3为酒精性脂肪肝模型组肝脏组织切片图。

图4为酒精性脂肪肝模型组肾脏组织切片图。

图5为灌胃本发明肠溶片组肝脏组织切片图。

图6为灌胃本发明肠溶片组肾脏组织切片图。

具体实施方式

一、制备防治酒精性脂肪肝乙醇提取物干粉：

1、将蜂胶置于-18℃的环境温度条件下冷冻20～40小时后粉碎。

2、常温常压下将体积浓度为50%～90%的食用酒精与粉碎后的蜂胶按1～6︰1的重量比混合，于10～40℃的温度条件下密闭浸泡1～2天。

3、以第一次浸泡后的浸泡液再次继续浸泡新的粉碎后蜂胶，等浸泡结束后，再次浸泡新的粉碎后蜂胶。

4、取重复第三次浸泡后的浸泡液以8000～12000转冷冻离心10～12分钟除去固体杂质，取乙醇溶解蜂胶的上清液。

5、将上清液在室温下以4000D分子筛超滤分离，取得分子量小于4000D的蜂胶乙醇提取物。

6、将上述分子量小于4000D的蜂胶乙醇提取物置于乙醇蒸馏回收器中，蒸去食用酒精，得到分子量小于4000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。

二、制备蜂胶防治酒精性脂肪肝的肠溶片：

1、典型的几种质量配比表：（单位：kg）

	蜂胶粉	蜂王浆冻干粉	异麦芽糖	硬脂酸镁	包衣粉
						配比1	30	15	51.5	0.5	3
配比2	25	10	62.6	0.4	2
						配比3	20	10	66.6	0.4	3

2、制粒工艺：沸腾锅预热到40～60℃后，先将蜂胶乙醇提取物干粉、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇加入沸腾锅内，按照下表参数设置，打开蠕动泵喷纯化水进行一步制粒。制粒结束后低温干燥，过筛，加入硬脂酸镁混合均匀。工艺参数：

参数	进风温度	出风温度	引风频率	蠕动泵	雾化压力
						喷浆时	60-80℃	40-60℃	40Hz	150rpm	0.2MPa
喷浆后	70-80℃	50-60℃	35Hz	150rpm	0.2MPa

3、压片工艺：采用ZP1100压片机（29冲）进行压片实验，工艺参数：转速30～40转/分；工作压力7～15kN；片重0.4～0.6g。

4、包衣工艺：包衣粉采用肠溶性包衣粉，包衣参数如下表。

包衣浆浓度	50%
		热风温度	60-90℃
滚筒转速	5-8转/分
		负压	-0.5KPa
片剂增重	1-3%

三、应用：

（一）试验对象：

灌胃22周龄的Wistar清洁级雄性大鼠，体重344.43±38.49。

模型组大鼠每天按体重0.5%灌胃二锅头和体重0.5%灌胃猪油制模型。

灌胃肠溶片实验组：大鼠每天按体重0.5%灌胃二锅头和体重0.5%灌胃猪油8小时后采用空腹灌胃蜂胶蜂王浆肠溶片的方式进行实验。

（二）肠溶片的灌胃使用剂量：

50～100mg/天，连接服用30～60天。

（三）对比结果：

1、试验组大鼠肝脏和肾脏组织切片结果比较：

（1）将自然对照组肝脏和肾脏组织切片，见图1、2。

从图1、2可见雄性大白鼠肝脏肝细胞结构清晰呈多边形，肝血窦明显，肝细胞索排列整齐，肝细胞中没有明显的脂肪空泡；肾脏组切片中肾小球结构清楚，肾小球囊间隙明显、适中，没有明显损伤。

（2）将酒精性脂肪肝模型组肝脏和肾脏组织切片，见图3、4。

从图3、4可见肝细胞边界不清，变圆内有空泡，肝血窦受压变窄，肝索排列紊乱，有一定纤维化的征兆；肾小球结构不清楚，损伤严重，肾小球囊变形。

（3）灌胃肠溶片肝脏和肾脏组织切片，见图5、6。

从图5、6可见肝脏肝小叶结构清晰, 肝血窦分布均匀，肝细胞呈多边形,排列整齐；肾脏肾小球结构明显改善，肾小球囊间隙明显，存在明显肾小球修复过的痕迹。

2、蜂胶蜂王浆肠溶片干预后对试验组大鼠主要血液生化指标比较分析：

采用麻醉大鼠腹主动脉采血，取血清后由东芝全自动血液生化检测仪检测主要血液生化指标。

比较分析如下表：

组别	自然组	模型组	灌胃肠溶片组
				ALT	73.0±16.67	81.8±14.81	55.5±28.69
ALP	102.50±11.90	179.40±32.39	103.25±24.72
				GRE	55.78±2.97	48.02±4.44	50.73±3.53
CHO	1.23±0.08	1.57±0.18	1.03±0.07
				TG	1.25±0.18	1.46±0.31	1.11±0.21

经SPSS统计，模型组ALT与灌胃肠溶片差异极显著；转氨酶广泛存在组织细胞内，尤以肝、心肌、脑、肾等组织中活性最强，正常时血浆含量很低，ALT主要存在于肝脏，当肝组织病损时ALT大量释放入血可引起血中转氨酶升高。本实验灌胃肠溶片组血清转氨酶活力很低，说明肠溶片对肝脏的修复作用效果很强。

健康人血清ALP主要来自肝脏和骨骼，肝脏中的ALP与物质的转运和排泄有关。而2型糖尿病患者由于胰岛素分泌障碍或胰岛素抵抗，造成糖代谢障碍，同时也导致脂类代谢的障碍及在肝内沉积，甚至形成脂肪肝，而使肝脏受损引起血清ALP水平的升高。经SPSS统计，模型组碱性磷酸酶与其它二实验组差异极显著；说明本发明肠溶片能够改善肝细胞损伤，降低碱性磷酸酶水平，碱性磷酸酶（ALP）的上升与肝细胞的损伤密切相关，说明本实验模型组酗酒并高脂饮食对肝细胞伤害很严重，而灌胃肠溶片后能够改善长期酗酒并高脂饮食引起的不良反应。

经SPSS统计，模型组肌酐（GRE）与自然对照组差异极显著，说明本实验条件下酗酒并高脂饮食会使机体对外源性蛋白质的利用下降，而灌胃本发明肠溶片能够改善机体对外源性蛋白质的利用，肌酐水平有所上升。

2型糖尿病是以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍为主要特征的一类疾病，其中胰岛β细胞的丢失和功能障碍在疾病的发生和发展中起决定性作用。近年来的研究表明，胆固醇代谢与胰岛β细胞功能密切相关。正常情况下，胰岛β细胞可以通过其表面表达的一系列受体和转运分子来控制细胞内胆固醇的摄入和流出，使得细胞内胆固醇的含量维持在一个动态平衡。胰岛β细胞内胆固醇代谢出现紊乱后，可以通过多种途径影响β细胞的糖代谢，最终诱导β细胞凋亡。因此，胆固醇代谢紊乱可能是导致2型糖尿病患者β细胞功能障碍的一个新机制。经SPSS统计，模型组胆固醇与自然对照组和灌胃肠溶片组差异极显著，自然对照组CHO与灌胃肠溶片组差异显著；说明在调控胆固醇代谢方面，灌胃本发明肠溶片能够显著下调由于酗酒引起的胆固醇水平升高，其调控效果甚至优于自然对照组，服用本发明肠溶片对预防由于长期酗酒诱发2型糖尿病的发生有重要意义。

近年来高甘油三酯（HTG）所致的脂毒性已引起广泛关注，其可引起并加重胰岛素抵抗（IR），使胰岛素的生物学效应降低。肝脏通过参与糖原合成、糖原分解和糖异生在维持血糖稳定中起着直接而重要的作用，特别是葡萄糖-6-磷酸酶在肝糖生成中起关键作用，肝脏胰岛素抵抗还表现为脂代谢异常，如甘油三酯释放增加和肝脏脂肪变性。经SPSS统计，模型组甘油三酯与灌胃肠溶片组差异显著；从实验情况，模型组出现血清高甘油三酯水平，说明长期酗酒会生产高甘油三酯血症，是诱发2型糖尿病的致病因素之一；而服用本发明肠溶片对由于酗酒并高脂饮食诱发的甘油三酯代谢异常具有很好的调控作用。

以上结果表明：本发明肠溶片对由于酗酒并高脂饮食引起的大鼠肝脏脂肪变有相当大的治疗作用，从血液生化指标和肝脏组织切片来看，本发明肠溶片的改善作用是非常明确的，而且对损伤的肾脏组织也具有修复作用。

3、本发明肠溶片干预后对酒精性脂肪肝试验组大鼠肝脏代谢中主要基因表达变化比较分析：

通过基因芯片技术研究发现长期酗酒并高脂饮食的模型组大鼠肝脏表达基因中许多影响重要代谢途径（比如与解酒相关基因、脂肪代谢相关基因、肝脏损伤修复基因）关键基因的表达均表现出不利于机体正常代谢的状况，而灌胃本发明肠溶片干预后这种基因表达的变化得到了很好的修正，从下例表中我们不难发现这种类似于“纠错”表达的能力正体现出灌胃本发明肠溶片对由于长期酗酒并高脂饮食形成的肝脏代谢障碍、肝脏组织损伤的修复具有很强的改善作用，通过我们的研究从基因水平发现灌胃本发明肠溶片能够有效地解酒，改善肝脏的代谢机能，防治酒精性脂肪肝的发生。

3.1灌胃肠溶片后对酒精性脂肪肝内与脂代谢相关的关键基因表达的影响

组别	Fasn	LpL	Scd	Scd1
					模型组/自然组	↑4.17	↓3.12	↑6.76	↑6.47
肠溶片组/模型组	↓2.33	↑2.19	↓13.28	↓12.86

    注：表中，↑4.17表示Fasn基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比上调4.17倍，↓ 2.33表示Fasn基因灌胃肠溶片组与模型组的表达比下调2.33倍。

3.1.1  Fasn：脂肪酸合成酶，参与脂肪酸生物合成。哺乳动物中，脂肪酸合成酶在脂肪酸合成中起着至关重要的作用，负责乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A从头合成一种长链软脂酸（棕榈酸酯）的所有催化步骤，基因的表达直接影响着脂肪酸合成酶多寡对控制动物体脂沉积具有重要的意义。

本实验条件下模型组长期酗酒并高脂饮食使肝细胞中脂肪酸合成酶基因与自然对照组比表达上调4.17倍，说明：模型组能够使脂肪酸合成酶合成增加是导致肝细胞脂肪过量沉积的罪魁祸首，造成脂肪肝发生首要因素。

本实验条件下灌胃肠溶片组与模型组下调脂肪酸合成酶的基因表达2.33倍，说明：肠溶片组可以通过减少脂肪酸合成酶的合成，减少肝组织脂肪酸合成，对缓解肝脏脂肪变意义重大。

3.1.2  LpL：脂蛋白脂肪酶，参与脂肪酸代谢，是脂肪代谢的关键酶之一。LpL在实质细胞的粗面内质网合成，新合成的LpL无活性，经糖基化后，才转化成活性LpL。存在于细胞膜外表面的硫酸肝素糖蛋白使酶保持一种无活力的浓缩状态，由肝素刺激后血浆中得到活化的LpL，分布在含三酰甘油的脂蛋白中，主要是分解乳糜微粒和极低密度脂蛋白的三酰甘油，并结合和附着在这些脂蛋白残粒中，可能作为肝摄取这些颗粒的信号。LpL作用于脂蛋白，主要分解脂蛋白中的三酰甘油，是血浆中清除三酰甘油的限速酶，并促使脂蛋白转移胆固醇、磷脂和载脂蛋白。LpL还具有增加乳糜微粒结合到LP受体上的能力，促进乳糜微粒摄取。

本实验条件下模型组与自然对照组比下调脂蛋白脂肪酶基因表达3.12倍，说明：模型组会使脂蛋白脂肪酶含量下降，导致三酰甘油分解减少，加速模型组大鼠肝脏脂肪变。

本实验条件下灌胃肠溶片组与模型组比表达上调2.19倍，说明：肠溶片组能够使实验组大鼠肝细胞中脂蛋白脂肪酶合成增加，有利于肝细胞分解脂肪，减轻肝脏脂肪变。

3.1.3  Scd：固醇辅酶A脱饱和酶，参与脂肪酸生物合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)能在脂肪酸碳链cis-9位置引入双键，是催化乳脂cis-9，trans-11CLA和trans-7，cis-9 CLA合成的关键酶。

3.1.4  Scd1：固醇辅酶A脱饱和酶1，参与脂肪酸生物合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Scd -1）是单不饱和脂肪酸生物合成的限速酶，在脂肪酸代谢中起中心调节作用，也是瘦素（Leptin）作用的目的基因之一。瘦素与糖尿病、肥胖、脂肪肝有着密切关系，是近年来代谢性疾病的热点领域之一。2型糖尿病患者，常常伴有胰岛素抵抗、高瘦素血症，同时约50%的2型糖尿病患者存在脂肪肝。Scd -1是催化饱和脂肪酸向单不饱和脂肪酸转变的关键酶，与肥胖、脂肪性肝脏病变和胰岛素抵抗等一系列的代谢综合征的发生、发展密切相关，因而研究Scd -1的表达、调控可能为临床脂代谢紊乱相关疾病的诊断和治疗效果的监测提供了一个十分重要的实验室指标，在临床医学中有广阔的应用前景。因Scd -1主要存在于内质网膜，目前对体内Scd -1的检测主要采用测定血脂不饱和指数（不饱和脂肪酸／饱和脂肪酸比值）或通过分子生物学方法对细胞内Scd -1mRNA表达水平进行检测。综上所述，Scd -1在能量代谢中起了重要的作用。通过对Scd -1和能量代谢关系的研究，可以更清楚的了解Scd -1在能量代谢中的机制，从而为临床靶向调节能量代谢和避免脂毒性，预防或治疗肥胖、脂肪性肝脏病变及糖尿病等一系列代谢综合症提供基础。

本实验条件下长期酗酒并高脂饮食的模型组与自然对照组比上调固醇辅酶A脱饱和酶（Scd）基因表达6.76倍、固醇辅酶A脱饱和酶1（SCD-1）上调6.47倍，说明：二基因表达上调是造成酒精性脂肪变的最主要分子机理之一，防治酒精性脂肪肝的发生是解酒过程中最关键的病理指标，处理方式有效性就在于是否能够控制脂肪肝，模型组上调了二基因，而模型组肝脏切片显示模型组大鼠出现了严重的脂肪肝，甚至达到肝纤维化的状态。

本实验条件下灌胃本发明肠溶片组与模型组比下调固醇辅酶A脱饱和酶（Scd）基因表达13.28倍，下调固醇辅酶A脱饱和酶1（Scd-1）基因表达12.86倍，说明：肠溶片组对长期酗酒并高脂饮食的不良习惯所形成的酒精性脂肪肝具有显著的改善作用，并且与肝脏切片的结果一致，这一改变是本发明肠溶片防治酒精性脂肪肝主要的分子机理之一。

3.2灌胃肠溶片后对肝脏内与肝损伤、修复及代谢相关的关键基因表达的影响

组别	Cd2	Il7r	Pla2g2a	Tnfrsf10b
					模型组/自然组	↑29.6	↓2.76	↓2.47	↑4.14
肠溶片组/模型组	↓32.89	↑2.36	↑3.91	↓3.94

注：上表中，↑29.6表示Cd2基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比上调29.6倍，↓32.89表示Cd2基因灌胃肠溶片组与模型组的表达比下调32.89倍。

3.2.1  Cd2：Cd2分子，受体，蛋白结合，参与脂筏极性化，引导细胞凋亡，细胞表面受体连接信号转导，细胞附着，自然杀伤细胞激活，正调控枝状细胞激活，T细胞激活，调控T细胞分化。脂筏是指膜脂质双层内含有特殊脂质与蛋白质的微区，直径约为50～350nm，微区内陷可形成囊泡（胞膜窖或小窝），脂筏不仅存在于细胞质膜上，而且高尔基体膜上也有。不同脂筏有各自特异蛋白质，所含脂质也不完全相同，且有不同的功能。脂筏由鞘磷脂、神经节苷脂及胆固醇组成，由于鞘磷脂含有长链饱和脂肪酸，与胆固醇相互作用成一种有序脂质相，其相变温度（Tm）较高，使脂膜的流动性降低而稳定性增加，脂筏周围的膜区含有较多的不饱和脂肪酸，Tm温度较低，这样膜的脂筏区与非脂筏区就出现了分相。枝状细胞在人体中的功能就相当于一个预警器，作为人体免疫细胞系统中的中坚分子它们从病毒、细菌或是其他器官中发现外来的入侵者(抗原)，然后发出警告信息。它们摇动抗原作为一种信号，使T细胞可以及时的进入并驱散入侵者。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组上调Cd2基因29.6倍，说明：模型组通过上调Cd2基因，激活枝状细胞，促使免疫细胞过度激活，引起过度的免疫反应，诱发肝细胞炎症和纤维化。

本实验条件下肠溶片组与模型组比下调Cd2基因32.89倍，说明：肠溶片干预后可以通过下调Cd2基因表达，缓解免疫细胞过度激活，防止由于过度的免疫反应诱发肝细胞炎症和纤维化。

3.2.2  Il7r：白细胞介素7，受体，参与调控DNA重组，免疫应答，细胞表面受体信号连接传导，抗微生物体液应答。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组下调了白细胞介素7基因2.76倍，说明：模型组大鼠由于长期酗酒并高脂饮食会导致肝细胞免疫应答水平上升，通过下调白细胞介素7基因的表达，加重肝细胞的炎症反应，促进肝细胞脂肪变和纤维化的进程。

本实验条件下肠溶片组与模型组比上调白细胞介素7基因2.36倍，说明：本发明肠溶片干预后，通过上调白细胞介素7基因的表达，抗肝细胞的免疫应答，缓解肝脏炎症反应，对防治酒精性脂肪肝和纤维化有积极意义。

3.2.3  Pla2g2a：磷脂酶A2，基2A，钙依赖，参与脂分解代谢。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Pla2g2a基因的表达下调了2.47倍，说明：模型组长期酗酒并高脂饮食通过下调Pla2g2a基因的表达，减少对肝细胞内脂肪的分解代谢，加重脂肪肝的进程。

本实验条件下以本发明肠溶片干预后实验组大鼠与干预前酒精性脂肪肝模型组比，Pla2g2a基因的表达上调了3.91倍，说明：本发明肠溶片通过上调了该基因的表达，促进肝细胞内脂肪的分解代谢，对防治酒精性脂肪肝有利。

3.2.4  Tnfrsf10b：肿瘤坏死因子受体超族，成员10b，胱冬酶激活因子，TRAIL结合，参与胱冬酶激活，信号转导，激活NF-κB引导激酶，调控细胞凋亡，正调控NF-κB级联。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Tnfrsf10b基因的表达上调了4.14倍，说明：模型组通过上调Tnfrsf10b基因的表达激活NF-κB级联，促进肝细胞脂质过氧化和炎症反应，加重肝脏脂肪变和纤维化。

本实验条件下以肠溶片干预后实验组与干预前酒精性脂肪肝模型组比，Tnfrsf10b基因的表达下调了3.94倍，说明：本发明肠溶片能够通过下调Tnfrsf10b基因表达，抑制大鼠肝细胞内NF-κB的活化，减轻脂质过氧化和炎症反应，实现保护肝组织的目标。

从以上基因表达情况不难分析，酒精性脂肪肝模型组大鼠由于长期酗酒并高脂饮食，会加重肝细胞损伤，促进肝细胞炎症反应，对肝脏的损伤及修复极其不利；而灌胃本发明肠溶片后以上这些基因的表达出现相反的情况，对肝脏组织的修复，防治脂肪肝和肝纤维化具有积极意义。

3.3  肠溶片干预后对肝脏内与控制正常活动相关的关键基因表达的影响

组别	Adh4	Hspb1	Igfbp2	Igfbp6	Srd5a1
						模型组/自然组	↓2.05	↓2.65	↓6.24	↓3.97	↑2.6
肠溶片组/模型组	↑2.18	↑3.45	↑3.89	↑3.15	↓2.81

注：上表中，↓2.05表示Adh4基因在肝细胞mRNA中模型组与自然对照组的表达比下调2.05倍， ↑2.18表示Adh4基因灌胃肠溶片组与模型组的表达比上调2.18倍。

3.3.1  Adh4：醇脱氢酶4，参与乙醇代谢和醛代谢，乙醇氧化分解。它在乙醇高浓度时才起作用，免疫学上与其他Adh不同，并有不同的底物特异性。Adh4还参与视黄醇的代谢，具有明显降解肾上腺素和去甲肾上腺素的生理作用。

本实验条件下模型组与自然对照组比，醇脱氢酶4（Adh4）基因的表达下调了2.05倍，说明：长期酗酒并高脂饮食的模型组下调了醇脱氢酶4基因，减少该酶的表达就意味着模型组下调通过乙醇脱氢酶系统分解乙醇的途径，使肝脏通过乙醇脱氢酶系统解酒机能下降，是造成大鼠肝细胞乙醇代谢障碍的主要原因之一。

本实验条件下实验组以肠溶片干预后与酒精性脂肪肝模型组比，醇脱氢酶4（Adh4）的表达上调了2.18倍，说明：本发明肠溶片能够通过上调醇脱氢酶4（Adh4）基因表达，恢复肝细胞通过乙醇脱氢酶系统的解酒机能，达到提高解酒的目的，是本发明肠溶片具有解酒效果原因之一。

3.3.2  Hspb1：许多研究表明，不论机体处于应激状态还是正常生理状态，都可参与复杂和重要的生物学过程。如sHSP与其它蛋白进行相互作用，阻止蛋白间不必要的相互作用，维持各种细胞蛋白稳定；进行膜的维护，并与膜脂的流动性有关；具有核内行驶功能，或调节分子过程，或保护蛋白；稳定细胞骨架，参与调节细胞的生长和分化，抑制细胞的凋亡；还具有免疫学等功能；在维持机体的生理状态以及某些疾病的病理生理过程中均发挥重要作用。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Hspb1基因的表达下调了2.65倍，说明：模型组通过下调Hspb1基因的表达，对损伤肝细胞的维护能力下降，不利于肝细胞的修复。

本实验条件下以肠溶片干预后实验组与干预前酒精性脂肪肝模型组比，Hspb1基因的表达上调3.45倍，说明：肠溶片干预后，通过上调Hspb1基因的表达提高肝细胞的维护能力，促进损伤肝细胞的修复。

3.3.3  Igfbp2：胰岛素样生长因子结合蛋白2，参与调控细胞生长。上调有利于Igf1发挥作用，促进新陈代谢，有利于糖脂代谢，对预防脂肪肝有利。

3.3.4  Igfbp6：胰岛素样生长因子结合蛋白6，调控细胞生长，信号转导，负调控细胞增殖。上调有利于Igf1发挥作用，对防治脂肪肝和肝脏纤维化有很好作用。

研究已证实，IGFs与肝纤维化、肝硬化的形成发展有关。目前已分离出两种IGFs即IGF-l和IGF-2。它们以自分泌、旁分泌和内分泌的方式作用于靶器官。几乎所有内分泌的IGF-l或IGF-2在体液中均与胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）形成相对分子质量为150kb或50kb的复合物。IGF-l是由70个氨基酸残基组成的单链多肽，主要在肝脏合成，是机体广泛存在的细胞有丝分裂和分化成熟的促进剂，影响许多器官内细胞的生长、分化及代谢的调节。IGF-l的上述功能是通过IGF-l受体（IGF-lR）介导的，IGF-l与IGF-lR结合的有效性受IGFBPs的调节。刘立新等研究显示，胰岛素样生长因子结合蛋白2，6（IGFBP2，6）在IGF-βl诱导活化的HSC-T6中表达明显增强，提示IGF及其受体参与肝纤维化的形成。由于IGFBPs与IGFs具有高亲和力且能够调节IGFs的生物活性，这些结合蛋白的诱导产生亦能影响肝纤维化的发生发展。然而另有研究表明，IGF-1具有体内抗肝纤维化的作用，可抑制HSC的活化，其可能与提高超氧化物歧化酶及过氧化氢酶的活性，提高肝细胞清除自由基的能力，减少HS活化的刺激因素等有关。

本实验条件下模型组与自然对照组比模型组大鼠下调了胰岛素样生长因子结合蛋白2基因6.24倍、胰岛素样生长因子结合蛋白6基因3.97倍，说明：模型组通过下调胰岛素样生长因子结合蛋白2、6二基因的表达，刺激肝细胞向纤维化方向转化，促进了肝细胞脂肪变和纤维化。

本实验条件下肠溶片组与模型组比上调胰岛素样生长因子结合蛋白2基因3.89倍、胰岛素样生长因子结合蛋白6基因3.15倍，说明：肠溶片干预后可以通过调控以上二基因的表达，减缓或防治肝细胞纤维化的进程，对防治酒精性脂肪肝有积极意义。

3.3.5  Srd5a1：类固醇5α还原酶，α肽1，分布内质网、微粒体，3-C-5α类固醇4脱氢酶，参与细胞信号转导，性别决定，细胞分化。能催化睾酮转化为另一种雄激素—二氢睾酮，故在性分化及雄激素生理中发挥重要作用，该酶具有Srd5a 1、2两个异构体。主要表达于皮肤和脂肪组织及肝脏，可催化绝大部分第4，5位碳原子上非饱和类固醇的还原反应，使有活性的糖皮质激素（GC）转化为无活性的代谢产物。研究发现，糖皮质激素作用不仅与血循环中GC水平相关，还与组织局部有生理活性的GC浓度密切相关。肝脏中增强的Srd5a1活性导致血清皮质醇（COR）清除率增加，进而代偿性下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）活性增强，COR分泌增加，进一步导致腹型肥胖及MS（MS指一系列代谢紊乱和心脑血管危险因素在同一个体上的聚集，即为肥胖、高血压、血脂异常及糖耐量异常等多种代谢异常临床体征的征候群）。

本实验条件下模型组与自然对照组比，Srd5a1基因的表达上调了2.6倍，说明：模型组通过提高Srd5a1基因表达增强Srd5a1活性导致血清皮质醇清除率增加，使得模型组出现MS，最终形成脂肪。

本实验条件下以肠溶片干预后与干预前酒精性脂肪肝模型组比，Srd5a1基因的表达下调了2.81倍，说明：本发明肠溶片能够通过下调该基因表达，改善由于酗酒并高脂饮食所带来的代谢综合征，这从另一方面解释了本发明肠溶片为什么可以防治代谢综合征的原因。

总之，通过以上试验表明：本发明产品能有效防治酒精性脂肪肝，防治酗酒并高脂饮食引起的肝脏脂肪变。

Claims (3)

1.用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物，为采用乙醇从蜂胶中提取的分子量小于4000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。

2.一种如权利要求1所述用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将蜂胶置于-18℃的环境温度条件下冷冻20～40小时后粉碎；

2）常温常压下将体积浓度为50%～90%的食用酒精与粉碎后的蜂胶按1～6︰1的重量比混合，于10～40℃的温度条件下密闭浸泡1～2天；

3）将浸泡后的液体再次加入粉碎后的蜂胶，并重复两至三次，取得最后一次浸泡液，以8000～12000转冷冻离心10～12分钟除去固体杂质，取乙醇溶解蜂胶的上清液；

4）将上清液在室温下以4000D分子筛超滤分离，取得分子量小于4000D的蜂胶乙醇提取物；

5）将上述分子量小于4000D的蜂胶乙醇提取物置于乙醇蒸馏回收器中，蒸去食用酒精，得到分子量小于4000D的固形物含量大于90%的生物活性干燥物。

3.一种如权利要求1所述用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物在生产肠溶片中的应用，其特征在于以所述用于防治酒精性脂肪肝的蜂胶乙醇提取物、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉制成用于制备防治酒精性脂肪肝的蜂胶肠溶片；所述蜂胶乙醇提取物、蜂王浆冻干粉、异麦芽糖醇、硬脂酸镁和包衣粉分别占肠溶片总质量的20～30%、10～20%、50～68%、0.2～0.6%、1～3%。

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