CN102960369B - 粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法，其包括如下步骤：准备菌株、制备菌种、第一次发酵、第二次发酵和造粒，所述方法中采用的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水。通过对淡紫拟青霉生物杀线虫剂制备方法中各种工艺条件的选择，提供一种可大规模生产淡紫拟青霉生物杀线虫剂的方法，获得的淡紫拟青霉生物杀线虫剂的袍子产量高、生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物杀线虫剂的制备方法，特别是淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法，属于淡紫拟青霉生物杀线虫剂制备领域。
背景技术
在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1000亿美元，其中根结线虫（Meloidogyne spp.）是危害最大的一类植物寄生线虫，每年仅对世界上重要的经济作物造成的经济损失就高达数百亿美元。在根结线虫属（Meloidogyne）内，以南方根结线虫（M.incognita）、花生根结线虫（M.arenaria）、爪哇根结线虫（M.javanica）和北方根结线虫（M.hapla）四个种的根结线虫病害发生最为普遍，对大多数的粮食作物、油料作物、纤维作物、烟草、茶叶、果树、蔬菜、药材和花卉等均可造成严重损失。
在控制该类病害的方法中，由于根结线虫通常存活于土壤中和植物根内，所以一般化学农药难以控制其危害，剧毒农药又对农产品生产的安全性构成严重威胁，而化学杀线虫剂只能在短期内控制线虫数量，同时还存在成本高、持效短和抗药性等问题。此外，一些传统的防治方法，如轮作、种植抗病品种等虽可起到一定的防治作用，但在实际生产中能够轮作的作物并不多，对根结线虫具有抗性的作物品种十分有限。因此，传统控制方法并不能解决该类病害。
杀线虫生物农药由于其安全和高效而逐渐引起关注，具有非常广阔的应用价值和市场前景。其中，淡紫拟青霉（P.lilacinus）是目前防治植物寄生线虫的最有前途的天敌真菌之一，具有广泛的研究和开发价值。淡紫拟青霉属真菌门半知菌纲丛梗孢目，可寄生许多植物病原线虫的卵及雌虫，包括危害最为严重的根结线虫（Meloidogyne spp.）和胞囊线虫（Heterodera spp.），国际马铃薯中心昆虫系Jatala博士1979年首次报道，淡紫拟青霉对南方根结线虫的卵寄生率高达60%-70%。淡紫拟青霉菌株可在作物根际定殖，抵抗根际有害线虫侵染，对作物根际土壤微生物菌群产生一定影响，利于植物生长发育。
虽然淡紫拟青霉的培养方法已经有较多研究，如中国专利CN101845398A中公开了一种淡紫拟青霉的培养方法，中国专利CN102286421A中公开了一种淡紫拟青霉的液体发酵培养方法，中国专利CN101671210A中公开了一种淡紫拟青霉生物肥药的制备方法，CN101165016A中公开了一种防治线虫危害的生物有机肥制备方法，CN1756482A中公开了一种粒状杀线虫剂的制造方法。但这些方法限于少量生产制备，规模化生产则受到限制。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，通过对淡紫拟青霉生物杀线虫剂制备方法中各种工艺条件的选择，提供一种可大规模生产淡紫拟青霉生物杀线虫剂的方法，获得的淡紫拟青霉生物杀线虫剂的袍子产量高、生产成本低。
本发明通过如下技术方案实现：
一种粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法，其包括如下步骤：准备菌株、制备菌种、第一次发酵、第二次发酵和造粒，其特征在于，所述制备菌种中采用的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水；所述第一次发酵中的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水；所述第二次发酵中的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水。
如上所述制备方法，所述制备菌种中采用摇瓶培养，其摇瓶装量≤150ml/500ml瓶、摇床转速为150rpm、培养温度为29～30°C、时间为72h。
如上所述制备方法，所述第一次发酵中的发酵罐的接种量为4%体积比，发酵罐的装罐系数为0.6-0.7、温度为27-29°C、搅拌速度为200-300rpm，发酵周期为45-54小时。
如上所述制备方法，所述第二次发酵中的发酵罐的接种量为4%体积比，发酵罐的装罐系数为0.6-0.7、温度为27-29°C、搅拌速度为200-300rpm，发酵周期为42-50小时。
如上所述制备方法，所述制备菌种中的培养基的组成为蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，ZnSO4·7H2O 10mg和蒸馏水1000ml。所述培养基的pH优选为6.5。
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本发明的有益效果：本发明的方法每批次可获得杀线虫剂（微球制剂）250kg以上，每克微球制剂中有效成分含量≥107CFU/g制剂菌落数，微球制剂颗粒大小范围为4±1mm，千粒微球重量范围为10-15克，且生产成本低，可以大规模的生产粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂。
具体实施方式
根据本发明的制备方法，其中菌株为淡紫拟青霉菌株，是可以购买得到的，也可以通过以下方法培养得到：
采用马铃薯琼脂培养基（PDA），通过本领域技术人员已知的方法获得，所述培养中具体的参数选择如下：菌株生长的温度范围为8-38°C，最佳为25-30°C；菌株生长的pH为2-11，优选pH值为5-9。所述培养基的制备方法为：马铃薯去皮后切成块，200g煮沸20min，纱布过滤后，向滤液中加葡萄糖20g，琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1000ml，分装，高压蒸汽灭菌20分钟后备用。
所述菌株可通过以下方法保存：将上述获得的菌株采用普通试管PDA培养基块法，即切取生长在PDA培养基上生长良好的菌块放置在1毫升无菌离心管中，低温下（4°C）至少保存1年。
根据本发明的制备方法，所述菌种的制备方法包括：
（1）菌种活化
将低温保存的菌种转接至PDA培养基斜面上，28～30°C条件下培养3～4天，实现菌种的充分活化。活化培养后的菌种可接种摇瓶进行种子培养。
（2）制备摇瓶菌种
采用液体培养基，其组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水。所述培养基可以使用如下的配方：蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，ZnSO4·7H2O 10mg，蒸馏水1000ml，pH=6.5。
摇瓶培养的参数如下：摇瓶装量≤150ml/500ml瓶，摇床转速为150rpm，培养温度为29～30°C，时间为约72h。
接种时采用培养基块直接接种摇瓶即可，具体而言，接入直径0.5mm培养基块4块到一个摇瓶即可。
所得的菌种在PDA培养基上颜色正常，镜检无其他杂菌孢子存在，无细菌菌脓等杂质，无酸性气味存在。
根据本发明的制备方法，所述第一次发酵（也称为种子罐发酵）具体为：
采用液体培养基，其组成为：蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水。所述培养基具体可以采用以下配方：蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，ZnSO4·7H2O 10mg，蒸馏水1000ml，pH=6.5。
第一次发酵即种子罐发酵，其种子罐灭菌、接种量和接种温度具体为：121°C灭菌30min，此时pH范围在6.0～6.5；发酵液按一级种子罐装量的4%体积比接种，接种温度为30°C以下。
发酵控制及发酵时间具体为：装罐系数0.6-0.7，28±1°C，搅拌速度为200-300rpm，取样间隔时间为4小时；发酵时间为18-24小时。发酵周期45～54小时。
所得种子液（即菌液）呈土黄色至深褐色，较为粘稠，孢子含量达到8×107/ml以上。
根据本发明的制备方法，所述第二次发酵（也称为生产罐发酵）具体为：
采用液体培养基，其组成为：蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水。所述培养基具体可以采用以下配方：蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，ZnSO4·7H2O 10mg，蒸馏水1000ml，pH=6.5。
第二次发酵即生产罐发酵，其生产罐灭菌、接种量和接种温度具体为：培养液经121°C灭菌30min，接种量4%体积比，接种温度为30°C以下。
发酵控制及发酵时间具体为：装罐系数0.6-0.7，发酵温度28±1°C，搅拌速度为200-300rpm，不需调节pH值；取样间隔时间为3小时；发酵周期为42～50小时。
所得菌液呈土黄色至深褐色，较为粘稠，发酵液中液生孢子含量在4×108/ml以上，菌体干重在1.5%以上。
根据本发明的制备方法，所述造粒具体为：
淡紫拟青霉菌在上述生产罐发酵完成后，在发酵罐中经过充分搅拌，分散菌丝以及孢子，制备成菌悬液备用。将已经充分溶解好的海藻酸钠溶液与罐内菌悬液按照1:1比例在搅拌罐中彻底搅拌混匀，随即加入无菌硅藻土，混合均匀成为矿土溶液。将该矿土溶液加入准备好的微球发生器内，液滴自小孔滴出，形成海藻酸钠微球。微球用无菌水冲洗，室温条件下阴干，干燥至微球制剂含水量降至2％以下后包装使用。
每克微球制剂中有效成分含量≥107CFU/g制剂菌落数，微球制剂颗粒大小范围为4±1mm，千粒微球重量范围为10-15克。
根据本发明的制备方法，所述制剂通过以下步骤包装、储存：
采用塑料袋抽真空保存，本制剂在室温条件下存放6个月后，制剂有效成分仍然保持活力。
本发明的有益效果：本发明的方法每批次可获得杀线虫剂（微球制剂）250kg以上，优选在280-360kg，每克微球制剂中有效成分含量≥107CFU/g制剂菌落数，微球制剂颗粒大小范围为4±1mm，千粒微球重量范围为10-15克，且生产成本低，可以大规模的生产粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。
一、培养基及其配方
1、马铃薯琼脂培养基（PDA）
马铃薯去皮后切成块，200g煮沸20min，纱布过滤后，向滤液中加葡萄糖20g，琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1000ml，分装，高压蒸汽灭菌20分钟后备用。
2、液体培养基
蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，ZnSO4·7H2O 10mg，蒸馏水1000ml，pH=6.5。
二、菌株的培养和保存
1、马铃薯琼脂培养基（PDA）
马铃薯去皮后切成块，200g煮沸20min，纱布过滤后，向滤液中加葡萄糖20g，琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1000ml，分装，高压蒸汽灭菌20分钟后备用。
2、菌株培养
该菌株生长的温度范围为8-38°C，最佳为25-30°C。该菌株在pH 2-11之间均可以生长，适宜pH值为5-9。
（1）在上述马铃薯琼脂培养基中，菌株的具体培养条件为：温度25°C，pH=6.5，所得菌株编号为A1。
（2）在上述马铃薯琼脂培养基中，菌株的具体培养条件为：温度30°C，pH=7，所得菌株编号为A2。
（3）在上述马铃薯琼脂培养基中，菌株的具体培养条件为：温度28°C，pH=9，所得菌株编号为A3。
3、菌种保存
将上述获得的菌株采用普通试管PDA培养基块法（切取生长在PDA培养基上生长良好的菌块放置在1毫升无菌离心管中），低温下（4°C）保存。
三、制备菌种
1、活化菌种
（1）将上述低温保存的菌株A1转接至PDA培养基斜面上，28℃条件下培养3天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A11）。
（2）将上述低温保存的菌株A1转接至PDA培养基斜面上，28℃条件下培养4天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A12）。
（3）将上述低温保存的菌株A1转接至PDA培养基斜面上，30℃条件下培养3天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A13）。
（4）将上述低温保存的菌株A2转接至PDA培养基斜面上，28℃条件下培养3天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A21）。
（5）将上述低温保存的菌株A2转接至PDA培养基斜面上，28℃条件下培养4天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A22）。
（6）将上述低温保存的菌株A2转接至PDA培养基斜面上，30℃条件下培养3天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A23）。
（7）将上述低温保存的菌株A3转接至PDA培养基斜面上，28℃条件下培养3天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A31）。
（8）将上述低温保存的菌株A3转接至PDA培养基斜面上，28℃条件下培养4天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A32）。
（9）将上述低温保存的菌株A3转接至PDA培养基斜面上，30℃条件下培养3天，可用于接种摇瓶进行种子培养（记为A33）。
2、制备摇瓶菌种
（1）摇瓶培养基
液体培养基：蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，ZnSO4·7H2O10mg，蒸馏水1000ml，pH=6.5。
（2）摇瓶培养
控制摇瓶装量≤150ml/500ml瓶，摇床转速为150rpm，培养温度29～30°C，时间为约72h。
（3）接种
采用培养基块直接接种摇瓶即可，由于该菌可以产生大量分生孢子，因此接入直径0.5mm培养基块4块到一个摇瓶即可。
（4）获得菌种
以上获得的菌种在PDA培养基上颜色正常，镜检无其他杂菌孢子存在，无细菌菌脓等杂质，无酸性气味存在。
四、第一次发酵（种子罐发酵）
1、种子罐培养基
液体培养基：蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，ZnSO4·7H2O10mg，蒸馏水1000ml，pH=6.5。
2、种子罐灭菌、接种量和接种温度
121°C灭菌30min，此时pH范围在6.0～6.5。发酵液按一级种子罐装量的4%体积比接种，接种温度为30°C以下。
3、发酵控制及发酵时间
装罐系数0.6-0.7，28±1°C，搅拌速度为200-300rpm，取样间隔时间为4小时。发酵时间为18-24小时。发酵周期45～54小时。
4、获得种子液
获得的种子液（即菌液）呈土黄色至深褐色，较为粘稠，孢子含量达到8×107/ml以上。
五、第二次发酵（生产罐发酵）
1、生产罐培养基
液体培养基：蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，ZnSO4·7H2O10mg，蒸馏水1000ml，pH=6.5。
2、生产罐灭菌、接种量和接种温度
培养液经121°C灭菌30min，接种量4％体积比，接种温度为30°C以下。
3、发酵控制及发酵时间
装罐系数0.6-0.7，温度28±1°C，搅拌速度为200～300rpm，不需调节pH值。取样间隔时间为3小时，发酵周期为42～50小时。
4、获得菌液
获得的菌液呈土黄色至深褐色，较为粘稠，发酵液中液生孢子含量在4×108/ml以上，菌体干重在1.5%以上。
六、制剂及储存
1、发酵液的后处理
经生产罐发酵后的淡紫拟青霉菌在发酵罐中经过充分搅拌，分散菌丝以及孢子，制备成菌悬液备用。
2、混合物料
将已经充分溶解好的海藻酸钠溶液与罐内菌悬液按照1：1比例在搅拌罐中彻底搅拌混匀，随即加入无菌硅藻土，混合均匀成为矿土溶液。将该矿土溶液加入准备好的微球发生器内，液滴自小孔滴出，形成海藻酸钠微球。
3、制备成品
微球用无菌水冲洗，室温条件下阴干，干燥至微球制剂含水量降至2％以下后包装使用。
4、成品的质量
所得微球中，每克微球制剂中有效成分含量≥107CFU/g制剂菌落数，微球制剂颗粒大小范围为4±1mm，千粒微球重量范围为10-15克。
5、产品的储存
采用塑料袋抽真空保存，本制剂在室温条件下存放6个月后，制剂有效成分仍然保持活力。
具体的操作参数及产品参数见表1。
表1 操作参数及产品参数
Claims (1)
1.一种粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法，其包括如下步骤：准备菌株、制备菌种、第一次发酵、第二次发酵和造粒,所述第一次发酵也称种子罐发酵，所述第二次发酵也称生产罐发酵，其特征在于，所述制备菌种中采用的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水；所述第一次发酵中的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水；所述第二次发酵中的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水；
所述制备菌种中采用摇瓶培养，其摇瓶装量≤150ml/500ml瓶、摇床转速为150rpm、培养温度为29～30℃、时间为72h；
所述第一次发酵中的发酵罐的接种量为4%体积比，发酵罐的装罐系数为0.6-0.7、温度为27-29℃、搅拌速度为200-300rpm，发酵周期为45-54小时；
所述第二次发酵中的发酵罐的接种量为4%体积比，发酵罐的装罐系数为0.6-0.7、温度为27-29℃、搅拌速度为200-300rpm，发酵周期为42-50小时；
所述制备菌种中的培养基的组成为蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO40.5g，KCl0.5g，ZnSO4·7H2O10mg和蒸馏水1000ml；pH=6.5；
所述第一次发酵中的培养基的组成为蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO40.5g，KCl0.5g，ZnSO4·7H2O10mg和蒸馏水1000ml；pH=6.5；
所述第二次发酵中的培养基的组成为蔗糖15g，酵母6.12g，MgSO40.5g，KCl0.5g，ZnSO4·7H2O10mg和蒸馏水1000ml；pH=6.5。
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