CN102906257B

CN102906257B - 经修饰家族5纤维素酶及其用途

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Publication number: CN102906257B
Application number: CN201180012934.1A
Authority: CN
Inventors: 纳比尔·马斯里; 帕特里克·圣-皮埃尔; 桑德拉·莫蒂默; 克里斯·希尔
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2031-03-11
Also published as: MX2012009847A; WO2011109905A1; CA2790778A1; CA2790778C; EP2545168A1; MX342664B; CN102906257A; PL2545168T3; EP2545168A4; US8609388B2; US20130095554A1; EP2545168B1; DK2545168T3

Abstract

本发明涉及经修饰家族5纤维素酶，其包含非天然丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换，所述位置通过经修饰家族5纤维素酶与SEQ ID NO：1所示里氏木霉Cel5A氨基酸序列的71至397位氨基酸之间的比对来确定，本发明还涉及包含所述家族5纤维素酶的酶混合物。本发明还提供了包含编码所述经修饰家族5纤维素酶的核酸序列的遗传构建体，以及包含所述遗传构建体的经遗传修饰的微生物。本发明还提供了用于生产所述经修饰家族5纤维素酶的方法。

Description

经修饰家族5纤维素酶及其用途

技术领域

本发明涉及经修饰的纤维素酶及其用途，尤其涉及用于处理含纤维素之制品的经修饰家族5纤维素酶。

背景技术

纤维素酶被广泛用于改善含纤维素之织物的外观和柔软度。纤维素酶的一个常见应用是用于处理牛仔布(denim)织物以赋予它们“石磨水洗”外观。这种方法在业内被称为“生物打磨(bio-stoning)”。纤维素酶在很大程度上已取代了石子用于生产消费者所期望的柔软的褪色牛仔布。纤维素酶的第二个广泛应用是除去织物中或织物上的棉花绒毛和疏松的表面纤维。这种方法(称为“脱绒毛(depilling)”或“生物抛光”)使织物表面光滑，进而改善其柔软度和外观。纤维素酶处理还有助于防止随后形成使服装看上去变旧的纤维绒球(pill)。

真菌例如木霉属(Trichoderma)分泌大量不同的纤维素酶(本文也称作“酶混合物”)，其各自被称为组分。这些酶组分中较为常见的包括纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)、内切葡聚糖酶(endoglucanase，EG)和β-葡糖苷酶。纤维素酶组分通常包含纤维素结合结构域(cellulose binding domain，CBD)和催化结构域。这两个结构域之间的区域(称为“接头”)充当CBD和催化结构域之间的柔性间隔物。

纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)组分可进一步分成糖基水解酶家族(Davies和Henrissat，1995)，其中一些已被鉴定为有助于改善织物的外观和手感。里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种已经进行过广泛研究并且对于纤维素酶生产而言具有工业重要性的真菌。它产生至少六种基因上不同的纤维素酶：两种纤维二糖水解酶(Cel7A和Cel6A，以前分别称为CBH I和CBH II)和至少四种内切葡聚糖酶(Cel7B、Cel5A、Cel12A和Cel45A，之前分别称为EGI、EGII、EGIII和EGV)。

已经通过改变分泌的酶混合物中纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶组分的相对比例(与天然混合物相比)来尝试改善用于纺织应用的纤维素酶混合物的特性。例如，WO 92/17574公开了一种方法，其涉及改变EG型组分相对于CBH I型组分(Cel7A)的量以使其蛋白重量比大于5∶1。与含较大量CBH I型(Cel7A)组分的织物相比，用这种组合物处理的含棉织物在纺织加工期间表现出更低的强度损失。

也已通过增加酶混合物中单一组分的含量来实现脱绒毛和生物打磨的改善。美国专利No.5,858,767公开了木霉纤维素酶制备物，其在其他方面背景正常的纤维素酶组合物中富含CBHII纤维二糖水解酶(Cel6A)。发现这样的组合物在脱绒毛应用中改善织物的外观。美国专利No.5,874,293公开了富含EGII内切葡聚糖酶(Cel5A)的纤维素酶混合物，其显示出在生物打磨应用方面的改善。EP 866165公开了在脱绒毛应用方面具有改善的富含EGII(Cel5A)的酶组合物。

但是，尽管进行了这些努力，但是仍然需要在织物处理或纤维素酶常规使用的其他领域中更有效的改进纤维素酶及其组合物。尤其是，仍然需要催化效率更高的纤维素酶，以改善方法的经济性。可通过改善酶混合物中组分的比活性来满足这样的需要。通过提供更有活性的纤维素酶，可使得所需要的酶减少，进而能够显著减少加工成本。

研究者已通过蛋白质工程对家族5纤维素酶(本文也称作“Cel5”)进行了修饰，其目的是改善在生物质产生乙醇的过程中将纤维素有效转化为葡萄糖的活性。在解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)Cel5A(SEQID NO：13，AcCel5A)中，Y245G突变提高了酶对经稀酸预处理的黄杨锯屑的活性(Baker等，2005)。活性的提高主要是由于纤维二糖抑制的减少。

使用羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)作为底物，携带多个催化结构域和CBD突变的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(菌株BME-15)Cel5A(SEQ ID NO：14，BsCel5A)变体表现出比活性提高为高达2.68倍(Lin等，2008)。但是，最佳突变体达到的活性水平为4.88U/mg，而所报道的木霉EGII对相同底物的活性为39.9U/mg(Xiao等，2002)。

此外，已研究了遗传修饰对里氏木霉Cel5A(TrCel5A，SEQ ID NO：1)在高于其最适范围的pH值下活性的影响。来自里氏木霉的市售内切葡聚糖酶在4至6的pH范围中具有最佳活性。这些研究的目的是提高在更高pH值的酶活性，使得其能够用于在中性或碱性条件下运行的工业生产方法中。

通过定向进化，在成熟TrCel5A纤维素酶(无分泌信号)中鉴定到突变N321T使所述酶的最适pH比野生型酶增加0.6至0.8个pH单位(Wang等，2005)。该位置的定点饱和(site-saturation)表明将N替换为R使得最适pH的改变最大，增加约1.4个pH单位(Qin等，2008a)。然而，与野生型相比，这种变体的比活性大大降低。依次进行易错PCR和DNA改组(DNAshuffling)步骤之后，分离了变体Q139R/L218H/W276R/N342T(相当于SEQ ID：1中的Q118R/L197H/W255R/N321T)，其最适pH增加1.4个单位而比活性无显著降低(Qin等，2008b)。

对来自解纤维芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)的家族5嗜碱性纤维素酶NK1(SEQ ID NO：15；BcNK1)(之前称为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)N-4)的研究表明，催化结构域的C端部分对于酶的嗜碱性是关键的，特别是残基S287和A296(Nakamura等，1991；Park等，1993)。将这些残基突变为枯草芽孢杆菌中性纤维素酶(Bacillus subtilis neutralcellulase，BSC)中的相同残基使得解纤维芽孢杆菌NK1的pH谱与枯草芽孢杆菌的pH谱非常相似。在这两种突变中，相比于A296S，S287N对pH谱产生更大的影响。

发明内容

本发明的一个目的是提供经修饰家族5纤维素酶。

本发明涉及经修饰家族5纤维素酶及包含它的酶混合物。本发明还涉及包含编码经修饰家族5纤维素酶之核酸序列的基因构建体，用于从宿主菌株中产生经修饰家族5纤维素酶的方法，以及经修饰家族5纤维素酶在纺织处理(包括但不限于脱绒毛和生物打磨)中的用途。

本发明提供了经修饰家族5纤维素酶，其包含丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换。通常，363位的替换氨基酸是非天然的。例如，这意指经修饰家族5纤维素酶所来源的亲本或野生型纤维素酶在363位上不是丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。如下文所述，氨基酸替换的位置通过经修饰家族5纤维素酶与SEQ ID NO：1所示里氏木霉Cel5A氨基酸序列的比对来确定。本发明还涉及包含上面定义的经修饰家族5纤维素酶的酶混合物。

经修饰家族5纤维素酶和包含它的酶混合物可用于处理含纤维素的制品。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于生物打磨的方法，其包括使牛仔布织物或牛仔布服装与酶混合物或经修饰家族5纤维素酶相接触的步骤。此外，本发明还涉及一种用于脱绒毛的方法，其包括使含纤维素的制品与经修饰家族5纤维素酶相接触的步骤。在本发明的一个实例中，在接触步骤中，含纤维素的制品是织物或服装。

本发明还提供了包含经修饰家族5纤维素酶的去污剂组合物。

此外，本发明提供了包含编码经修饰家族5纤维素酶的核酸序列的遗传构建体。本发明还提供了包含所述遗传构建体的经遗传修饰微生物。本发明还涉及一种用于产生经修饰家族5纤维素酶的方法，其包括以下步骤：在诱导表达和分泌经修饰家族5纤维素酶的条件下在培养基中培养经遗传修饰微生物，以及从培养基中回收包含经修饰家族5纤维素酶的酶混合物。

本发明还提供了包含经修饰里氏木霉Cel5A酶的酶混合物，所述经修饰里氏木霉Cel5A酶具有至少363位从甘氨酸到丙氨酸的替换。本发明还提供了包含经修饰里氏木霉Cel5A酶的酶混合物，所述经修饰里氏木霉Cel5A酶分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19所示具有G363A、S或T氨基酸替换。

本发明还涉及经修饰家族5纤维素酶，其包含丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换，并且相对于亲本家族5纤维素酶或相应的野生型家族5纤维素酶，所述经修饰家族5纤维素酶表现出比活性提高为至少1.2倍。

在本发明前述实施方案中任何一个的特征中，经修饰家族5纤维素酶衍生自真菌家族5纤维素酶。在本发明前述实施方案中任何一个的另一特征中，替换后的363位氨基酸替换为丙氨酸。在本发明前述实施方案中任何一个的又一个特征中，363位的丙氨酸是非天然的。

相对于亲本或野生型酶，本发明的经修饰家族5纤维素酶表现出比活性的改善。表现出这种比活性改善的家族5纤维素酶在以下产业中具有潜在价值，即用于处理含纤维素的制品(例如脱绒毛或生物打磨)或者在生物燃料、生物气体或其他化学品的生产中用于生产可发酵糖。

附图说明

图1示出从糖基水解酶(GH)家族5中选择的15种纤维素酶之间的氨基酸序列比对，每种氨基酸序列与TrCel5A(SEQ ID NO：1)的71位至397位氨基酸的序列同一性百分比，以及15种所选择的家族5纤维素酶之间比对的每一位置出现共有氨基酸的频率图示。对于具有纤维素结合结构域的纤维素酶，只显示催化核心序列。用箭头标出等同于TrCel5A中218位和329位之位置处的催化残基。用星号标出等同于TrCel5A中130位、174位、217位、288位和290位之位置处的保守残基。

图2A是YEp352/PGKxylss-Cel5A的载体图，该载体用于从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达天然TrCel5A以及进行定点饱和诱变。

图2B是YEp352/PGKxylss-Cel5A-G363A的载体图，该载体用于从酿酒酵母中表达TrCel5A-G363A。

图3A是转化载体p^EG2-hph-TV3的载体图，该载体用于从里氏木霉中缺失内源性cel5a基因以产生菌株P285-6。

图3B是转化载体Pc/x-Cel5A-G363A-pyr4-TV的载体图。

图4是琼脂糖凝胶，其示出来自经遗传修饰里氏木霉菌株基因组DNA的已整合TrCel5A-G363A表达盒的PCR扩增。将来自亲本菌株BTR213aux和P285-6aux和TrCel5A-G363A表达载体的DNA用作对照。模板DNA的来源在每个泳道的顶端标明，每个DNA标志物的大小在每幅图的左侧标明。

图5示出TrCel5A的浓度，其表示为该组分占总分泌蛋白质级分的质量百分比，总分泌蛋白质来自在14L发酵中培养的BTR213、P285-6和过表达TrCel5A-G363A的其转化体里氏木霉菌株。菌株名称在每个柱下示出。

图6示出在14L发酵中培养的BTR213、P285-6和过表达TrCel5A-G363A的其转化体里氏木霉菌株所产生的纤维素酶混合物中，主要的木霉纤维素酶组分Cel5A、Cel7B、Cel6A和Cel7A的组成。菌株名称在每个柱下示出。

图7示出亲本和经修饰的TrCel5A(G363A)纤维素酶的丰度，以及由表达亲本或经修饰TrCel5A纤维素酶的菌株所产生的纤维素酶混合物的相对脱绒毛活性。白色柱表明由14L发酵中培养的不同里氏木霉菌株所产生的经修饰TrCel5A加上亲本的丰度(以总蛋白质的％表示)(值在每个柱的中间标明)。标明每个菌株中TrCel5A的量。交叉阴影线(cross-hatched)的柱表明纤维素酶混合物的相对脱绒毛活性。活性表示为每单位蛋白质的比活性并相对于对照纤维素酶混合物的脱绒毛活性进行归一化，所述对照纤维素酶混合物只包含亲本TrCel5A，并且值在每个柱顶端标明。菌株名称在每个柱下示出。

图8示出作为pH之函数的TrCel5A、TrCel5A-G363A和TrCel5A-G363S对酸膨胀纤维素(acid swollen cellulose，ASC)的活性，其通过测量30分钟内释放的还原糖(描述为以μM为单位的葡萄糖当量)来测定。

图9示出作为pH之函数的TrCel5A、TrCel5A-G363A和TrCel5A-G363T对羟乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose，HEC)的活性，其通过测量粘度随时间的变化率(-Δη/Δt)来测定。

图10示出作为酶剂量(以mg酶/g底物为单位)之函数的TrCel5A和TrCel5A-G363A的脱绒毛效力，其通过棉织法兰绒(flannelette)的重量损失百分比所测定。

发明详述

以下描述是一个优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。术语例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。

经修饰家族5纤维素酶

已阐明了真菌和细菌来源的大量天然家族5纤维素酶的氨基酸序列(Wang等，1993)。在大多数家族5纤维素酶中，家族5纤维素酶区域是非常保守的，这允许对家族成员的催化结构域的部分进行比对(Wang等，前述)。

下表表1包括15种已知的家族5纤维素酶的代表性列表，并且图1示出该表中提供的纤维素酶之间的氨基酸序列比对。

表1：已知的家族5纤维素酶的实例

SEQ ID NO：	缩写名称	生物
			1	TrCel5A	里氏木霉
2	PjEgl2	微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)
			3	MpEgl2	菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)
4	CfEgl1	黄隐球酵母(Cryptococcus flavus)
			5	AnEglA	构巢曲霉(Aspergillus nidulans)
6	AkCel5A	白曲霉(Aspergillus kawachii)
			7	MpEgl1	菜豆壳球孢菌
8	VvEG1	草菇(Volvariella volvacea)
			9	TaEg1	嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)
10	AaCel1	棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)
			11	HiCMC3	特异腐质霉(Humicola insolens)
12	OjCelB29	瘤胃真菌(Orpinomyces joyonii)
			13	AcCel5A	解纤维热酸菌
14	BsCel5A	枯草芽孢杆菌
			15	BcNK1	解纤维芽孢杆菌

本文使用的术语“TrCel5A编号”意指通过与野生型木霉(本文也称作“TrCel5A”)比对确定的氨基酸序列中氨基酸的位置，所述野生型木霉的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中提供。氨基酸编号以成熟的分泌蛋白质的序列为基础。通过氨基酸比对以使纤维素酶的家族5催化结构域之间的序列相似性最佳，并且通过使用TrCel5A的氨基酸编号来作为编号基础，可以确定其他家族5纤维素酶中的氨基酸相对于TrCel5A的位置。

参照图1，家族5纤维素酶之间的某些氨基酸残基具有特别高的保守性。如该图所示，这15种家族5纤维素酶氨基酸序列(表1)之间的多重比对表明大多数天然家族5纤维素酶具有保守的R130、H174、E217、E218、H288、Y290和E329残基(如“TrCel5A编号”所确定)(也参见Wang等，1993)。

本文使用的术语“家族5纤维素酶”或“Cel5”涵盖碳水化合物活性纤维素酶，其含有分类为EC 3.2.1.4的糖原水解酶(GH)家族5催化结构域。该术语还包括表现出至少水解(1→4)-β-D-糖苷键的任何碳水化合物活性酶，其包括那些具有保守的R130、H174、N217、E218、H288、Y290和E329残基(如上述“TrCel5A编号”所确定)的酶。

家族5的酶具有共有的(β/α)8-桶状折叠(8-barrel fold)和催化机制，其导致端基糖构象的净保留。糖基水解酶催化是由在天冬氨酸和/或谷氨酸残基的侧链上存在的两个羧酸所驱动的(Ly和Withers，1999)。在使用保留机制(retaining mechanism)的酶中，第一步中，首先被去质子化的一个残基充当亲核试剂进攻糖苷键。这形成糖基-酶复合体(specie)，其在第二步中分解。其他的催化残基充当酸/碱催化剂，其为离去的游离糖提供质子。在第二步中，该残基使水分子去质子化，然后破坏底物-酶复合物中的共价键以完成水解过程。然后，产物被释放，而催化残基回到其初始的质子化状态。在家族5的酶中，两个催化残基都是谷氨酸(URL cazy.org/)(Cantarel等，2008)。在TrCel5A中，残基E329和E218分别是亲核试剂和酸/碱(Macarron等，1993)。如先前提到的，这两个残基在家族成员中高度保守(Wang等，1993)。

许多家族5纤维素酶(包括木霉Cel5A酶(TrCel5A))包含三个结构域(Stahlberg等，1988)。对于木霉来说，N端区域(SEQ ID NO：1的1至36位残基)是纤维素结合结构域(CBD)，其属于CBM(碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module))家族1(URLcazy.org/)(Cantarel等，2008)。C端结构域(SEQ ID NO：1的71位至397位残基)是负责催化活性的糖原水解酶(GH)家族5催化域。这两个结构域之间的区域(SEQ ID NO：1的37位至70位残基)是富含脯氨酸和羟基氨基酸(丝氨酸和苏氨酸)的接头，其充当CBD和催化结构域之间的柔性间隔物。

“经修饰家族5纤维素酶”意指含有通过分子生物学技术引入的一个或更多个基因变化的家族5纤维素酶。这些技术包括但不限于定点诱变、盒式诱变、随机诱变(包括对分离的DNA进行的或者通过将微生物暴露于诱变剂(例如紫外光)进行的技术)、合成寡核苷酸构建、克隆、亚克隆、PCR扩增、体外合成和其他的基因工程技术(Eijsink等，2005)。应理解的是，经修饰家族5纤维素酶可衍生自任何合适的家族5纤维素酶。即它可以衍生自天然或“野生型”家族5纤维素酶，或者衍生自已包含其他氨基酸替换、缺失或插入的家族5纤维素酶。例如，家族5纤维素酶可衍生自下文定义的亲本家族5纤维素酶。

术语“分离的”意指这样的家族5纤维素酶，其存在于与其天然存在环境不同的环境中，或者与其天然组成不同。例如，分离的家族5纤维素酶可以是例如在下述发酵过程中由微生物分泌的一组纤维素酶中的一种。发酵之后，可直接使用含经修饰家族5纤维素酶的发酵液，或者可例如通过过滤或离心，将经修饰家族5纤维素酶与真菌细胞分离。

术语“野生型家族5纤维素酶”意指不包含通过分子生物学技术(例如上文所述的)引入的任何遗传变化的家族5纤维素酶。

术语“亲本家族5纤维素酶”意指这样的家族5纤维素酶，其与本发明的经修饰家族5纤维素酶相同，只是不包含根据本发明引入的氨基酸替换。例如，亲本家族5纤维素酶可不包含G363X，其中X是丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。与野生型酶相比，本发明的亲本家族5纤维素酶和经修饰家族5纤维素酶在其序列中可包含其他氨基酸修饰，只要其序列除了本发明氨基酸替换之外是相同的即可。

术语“相应野生型家族5纤维素酶”意指本发明的经修饰家族5纤维素酶所来源的野生型家族5纤维素酶。

本发明的经修饰家族5纤维素酶包含至少363位的突变，其突变为丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。通常，在363位引入的氨基酸是“非天然的”，意指并非天然存在于所衍生自的野生型家族5纤维素酶序列对应的位置。通过与野生型里氏木霉(Trichoderma reesei)家族5酶的比对来确定363位突变的位置，在本文称为TrCel5A编号。

可很容易地通过两个序列的氨基酸比对(使用手动比对或者使用本领域技术人员已知的任何序列比对算法)来确定序列同一性，例如但不限于，BLAST算法(BLAST和BLAST2.0；Altschul等，1997；和Altschul等，1990)，由Smith和Waterman在1981年公开的算法，Needleman和Wunsch，1970年的同源性比对算法，Pearson和Lipman在1988年的寻找相似性方法，这些算法的计算机化形式(Wisconsin Genetics Software Package(GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者手动比对和目测(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编1995supplement))。对于进行纤维素酶的BLAST比对和序列同一性而言，仅考虑包含催化结构域的氨基酸序列。

可将另外的突变引入经修饰家族5纤维素酶，只要此类突变没有显著地危害所述酶的结构和功能。如本领域技术人员所理解的，但是不以任何方式限制于此，可将另外的突变引入家族5纤维素酶中低序列保守性的区域中。图1中家族5纤维素酶的比对包含序列下方的柱状图，其显示了在所选的家族成员中每个位置上每个共有氨基酸的出现频率。当在363位以外引入另外的突变残基时，图1所包含的序列信息可被本领域技术人员用作指导。例如，如与图1所提供的氨基酸序列组的比对所确定的，可在相对于共有残基(SEQ ID NO：16)保守性少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸位置上引入氨基酸替换。

本发明的经修饰家族5纤维素酶可包含“基本上由363位的氨基酸替换所组成”的氨基酸替换。其意为相对于相应野生型家族5纤维素酶，经修饰家族5纤维素酶在其序列中包含不多于20个其他氨基酸替换。在本发明的另一个实例中，经修饰家族5纤维素酶在其序列中包含不多于15个其他氨基酸替换、不多于10个其他氨基酸替换或者不多于5个其他氨基酸替换。如前述，此类另外的氨基酸替换可被引入到氨基酸序列的非保守位置。在另一些实施方案中，相对于相应野生型家族5纤维素酶，经修饰家族5纤维素酶在其序列中包含1～20个或1～10个氨基酸替换。

可通过标准分子生物学技术引入另外的氨基酸替换，所述技术如随机突变、定点突变或定向进化。

尽管CBD不是家族5纤维素酶的活性所必需的，但是它的存在可使该酶的催化效率更高(Stahlberg等，1988；Ito等，2004)。与野生型酶相比，用里氏木霉Cel7A和Cel6A CBD代替天然的TrCel5A CBD将活性提高为约1.7倍(Ito等，2004)。类似地，通过靶向两个CBD残基的组合文库，发现了具有与纤维素结合和对羧甲基纤维素活性增加的CBD突变(Fukuda等，2006)。在本发明的一个实例中，家族5纤维素酶功能性连接至对结晶纤维素有高亲和力的纤维素结合结构域。

但是，本发明的经修饰家族5纤维素酶不一定包含CBD。事实上，众所周知，用于脱绒毛应用的纤维素酶可以是“核心酶(cored)”，意思是该酶不包含CBD或者不包含接头和CBD。美国专利No.5,700,686和No.5,916,799(其通过引入并入本文)描述了通过蛋白酶处理移除纤维素结合结构域的方法，但是缺乏CBD的纤维素酶也可通过遗传修饰而产生。

在野生型序列的363位(TrCel5A编号)上不包含丙氨酸并且可根据本发明进行修饰的家族5纤维素酶的代表性实例包括来自以下属的酶种类：木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、青霉属(Penicillium)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、壳球孢属(Macrophomina)、曲霉属(Aspergillus)、Orpinomyces、热酸菌属(Acidothermus)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、毁丝霉属(Myceliophthora)、金孢属(Chrysosporium)和木杆菌属(Xylella)。在本发明的一个实例中，经修饰家族5纤维素酶来源于以下物种：里氏木霉(SEQ ID NO：1)、绿色木霉(Trichoderma viride)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)(SEQ ID NO：2)、富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)(MpEgl2，SEQ ID NO：3)、白曲霉(Aspergilluskawachii)(SEQ ID NO：6)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(SEQ ID NO：10)、瘤胃真菌(Orpinomyces joyonii)(SEQ IDNO：12)和解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)(SEQ ID NO：13)。这些家族5纤维素酶每一个的序列都是公开可获取的。换言之，本领域技术人员可以从公共数据库中容易地得到它们。

本发明的经修饰家族5纤维素酶可具有保守的R130、H174、N217、E218、H288、Y290和E329残基(由TrCel5A编号确定)并与TrCel5A催化结构域(SEQ ID NO：1的71～397位氨基酸)表现出大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性。

在本发明的另一个实施方案中，经修饰家族5纤维素酶与TrCel5A催化结构域(SEQID NO：1的71～397位氨基酸)具有大于约40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性。

经修饰家族5纤维素酶的比活性的测量

本发明的经修饰家族5纤维素酶显示出比活性方面的改善。如上所定义的，可相对于亲本家族5纤维素酶或相对于相应野生型家族5纤维素酶来测量比活性的改善。

可通过测量纤维素或其他合适的纤维素酶底物的降解来确定本发明的经修饰家族5纤维素酶之比活性的增加。有若干已知的测定可用于测量经修饰家族5纤维素酶和亲本家族5纤维素酶的纤维素酶活性。但是，应理解，本发明的实施不受到评估经修饰家族5纤维素酶的活性之方法的限制。

例如，可通过测量还原糖的酶依赖性产生来监测家族5活性，在随后的本领域技术人员已知的化学测定或化学酶测定中对所述还原糖定量。还可通过对酶所释放的可溶性单糖、二糖和寡糖进行分离和定量的层析法来监测多糖的水解。可使用的另一个方法包括随着酶作用于底物测定粘性随时间的改变。另外，可将可溶性比色底物掺入琼脂培养基中，在所述培养基上培养表达和分泌亲本家族5纤维素酶或经修饰家族5纤维素酶的宿主微生物。在此类琼脂板测定中，以表达和分泌活性纤维素酶的各个微生物菌落周围的有色或无色晕环的形式来检测纤维素酶的活性。

实施例10和11提供了可用于测量相对于亲本家族5纤维素酶或野生型家族5纤维素酶的经修饰家族5纤维素酶活性之测定的非限制性实例。例如，可通过测量从纤维素释放的还原端(以葡萄糖当量衡量)来对经修饰家族5纤维素酶相对于参照家族5纤维素酶的活性进行定量(实施例10)。此类方法通常涉及用酶处理多糖，所述酶切割多糖亚基之间的糖苷键。从该键释放出来的异头碳被称作还原端，这是由于它可作为还原测定试剂从而产生可测量信号的物质。因为每个葡萄糖分子具有一个异头碳并由此具有一个还原端，因此葡萄糖的分子数目和还原端数目相同，所以可使用葡萄糖来产生此类反应的标准曲线。实施例11提供了对家族5纤维素酶活性进行定量的粘度测定。如其中所述，将酶添加至纤维素底物(在该例中为纤维素衍生物)，随测定的时间进程记录粘度(以厘泊计)。内切葡聚糖酶(如Cel5)可水解整个纤维素链(而不仅是末端)中的糖苷键，所以它们的作用可快速降低纤维素链样品的平均长度。降低纤维素链的分子量导致溶液的粘度减小。

通过测量经修饰家族5纤维素酶的活性来确定其比活性，通常以每单位时间释放的葡萄糖量除以酶的重量为单位。例如，可以以每分钟每毫克酶产生的葡萄糖微摩尔数为单位确定比活性。

相对于亲本家族5纤维素酶或野生型家族5纤维素酶，经修饰家族5纤维素酶活性的改善可以是约1.2倍至约10倍、约1.2倍至约5倍、或约1.2倍至约4倍、或约1.2倍至约3倍或约1.2倍至约2倍或约1.2倍至约1.9倍或约1.2倍至约1.8倍或约1.2倍至约1.7倍或约1.2倍至约1.5倍。

如本领域技术人员应领会的，通过比较在相同反应条件下的活性来确定经修饰家族5纤维素酶相对于参照家族5纤维素酶的比活性的改善。

测量最适pH的提高

本发明的经修饰家族5纤维素酶相对于亲本家族5纤维素酶或野生型家族5纤维素酶可表现出其最适pH的提高。可通过已知的技术提高经修饰家族5纤维素酶的最适pH，所述技术包括但不限于，随机突变、定点突变或定向进化。通过此类已知的方法所产生的经修饰家族5纤维素酶的最适pH可使用包括前述的已知方法来确定。

如前所述，家族5纤维素酶的糖基水解酶催化由存在于两个谷氨酸残基的侧链上的两个羧酸所驱动(Ly和Withers，1999)。这些氨基酸具有两个pKa：分别为羧酸和胺的pK_a1和pK_a2。可通过使用本领域技术人员已知的技术确定在活性位置的谷氨酸残基的pK_a1和/或pK_a2来测量本发明的经修饰家族5纤维素酶的最适pH相对于亲本家族5纤维素酶或野生型家族5纤维素酶的移动。

还可通过测量酶的最大有效pH来确定家族5纤维素酶的最适pH相对于参照家族5纤维素酶(例如亲本家族5纤维素酶或野生型家族5纤维素酶)的提高。最大有效pH是纤维素酶表现出最佳活性至少80％时的最高的pH。确定为最佳(最大)活性至少80％的pH范围，最高pH就是最大有效pH。

编码经修饰家族5纤维素酶的遗传构建体

本发明还涉及包含编码经修饰家族5纤维素酶之核酸序列的遗传构建体。编码经修饰家族5纤维素酶的核酸序列可有效地连接至指导经修饰家族5纤维素酶在宿主微生物中表达和分泌的调控核酸序列。“调控核酸序列”意指启动子和编码分泌信号肽的核酸序列。在本发明的一个实施方案中，调控核酸序列来源于在工业发酵条件下宿主微生物中高表达和分泌的基因。不作为限制的，调控序列可来源于一种或更多种里氏木霉纤维素酶或半纤维素酶基因。

遗传构建体还可包含选择标记基因，以使得能够如本领域技术人员公知的那样分离转化有构建体的经遗传修饰微生物。一般地，选择标记基因赋予了(i)抗生素的抗性，或(ii)在对宿主生物来说缺乏特定营养物的培养基上生长的能力，否则其无法在选择性条件下生长。然而本发明不限于选择特定的选择标记基因，并且本领域技术人员可很容易地确定合适的标记基因。在本发明的一个实施方案中，选择标记基因赋予了对潮霉素、腐草霉素、卡那霉素、遗传霉素或G418的抗性；回补了宿主微生物中trp、arg、leu、pyr、ura、his或ade基因之一的缺陷；或者赋予了在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的能力。

本领域技术人员应领会，遗传构建体还可包含其他核酸序列，例如转录终止子、编码肽标签的核酸序列、用于将多个核酸序列连接在一起的合成序列、复制起点等。

产生经修饰家族5纤维素酶的经遗传修饰微生物

经修饰家族5纤维素酶由经遗传修饰微生物表达和分泌，所述经遗传修饰微生物包含编码经修饰家族5纤维素酶的遗传构建体。所述经修饰家族5纤维素酶可以是含有其他由宿主微生物分泌的纤维素酶的酶混合物的一部分。

术语“酶混合物”意指包含除经修饰家族5纤维素酶之外的酶的任何混合物。例如，酶混合物可包含由宿主微生物分泌的纤维素酶，所述宿主微生物包括但不限于真菌宿主菌株。

宿主微生物可以是任何合适的酵母或丝状真菌，如子囊菌(Ascomycota)门成员的那些微生物。用作表达本发明的经修饰家族5纤维素酶之宿主微生物的酵母类物种的属包括酵母属(Saccharomyces spp)、毕赤酵母属(Pichia spp)、汉逊酵母属(Hansenula spp)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces spp)、亚罗酵母属(Yarrowia spp)和Arxula spp。用作表达本发明的经修饰家族5纤维素酶之宿主微生物的真菌的属包括木霉属(Trichoderma spp)、肉座菌属(Hypocrea spp)、曲霉属(Aspergillus spp)、镰刀菌属(Fusarium spp)、腐殖霉属(Humicola spp)、脉孢菌属(Neurospora spp)和青霉属(Penicillium spp)。在一个最优选的实施方案中，宿主微生物是里氏木霉工业菌株。

可通过本领域技术人员已知的许多方法将遗传构建体引入宿主微生物，所述方法包括但不限于，用CaCl₂处理细胞、电穿孔、生物射弹轰击和PEG介导的原生质体转化(例如White等，WO 2005/093072)。

根据本发明的一个实施方案，本发明的经修饰家族5纤维素酶由宿主微生物过表达。过表达可通过将包含编码经修饰家族5纤维素酶之基因的遗传构建体引入至宿主微生物而实现。成熟的家族5纤维素酶可与驱动蛋白质表达和分泌的调控序列有效连接，所述序列包括：i)编码来自天然、同源或异源分泌蛋白质的分泌信号肽的序列；和ii)来源于在工业发酵条件下于宿主细胞中高表达之基因的组成型启动子或可调节启动子。另外，可添加翻译增强子以增加蛋白质翻译。此外，可将包含编码经修饰家族5纤维素酶的基因之遗传构建体的多个拷贝引入所述微生物，从而增加表达水平。

遗传构建体可包含这样的序列，其使得基因构建体与宿主微生物基因组中的序列重组从而使其整合至宿主基因组。遗传构建体也可在没有任何可与其重组的特定序列的情况下进行整合。例如，构建体可通过经由非同源末端连接和重组的随机插入来整合。或者，构建体可以非整合的形式保留在宿主中，在这种情况下，它独立于宿主微生物的基因组而复制。

构建体可在宿主微生物的基因组内的任何合适的基因座上整合。在本发明的一个实施方案中，宿主微生物具有被破坏的cel5基因并且遗传构建体被插入至与野生型cel5基因不同的基因座。因为微生物在产生相应的野生型家族5纤维素酶上有缺陷，所以所述微生物只分泌经修饰家族5纤维素酶。此类微生物菌株的非限制性实施例为图4～6的P976转化株。这些微生物菌株是有利的，因为分泌自微生物的经修饰家族5纤维素酶的活性没有被较低活性的野生型家族5纤维素酶所稀释。但是，应了解，本发明还包括由还表达一种或更多种野生型家族5纤维素酶基因的宿主微生物表达经修饰家族5纤维素酶。(参见，例如，图4～6的P998菌株，其从内源性野生型基因表达TrCel5A，并表达经修饰的TrCel5A)。或者，遗传构建体被插入至微生物基因组的内源性家族5纤维素酶基因座，以替换野生型基因。

应了解，本发明还包括，相对于对应的未修饰宿主(亲本宿主)，改变其他纤维素酶组分的表达水平。换言之，包含本发明的经修饰家族5纤维素酶的酶混合物可获自经遗传修饰从而过表达、欠表达或不表达一种或更多种其他纤维素酶组分的宿主菌株。除上述的过表达技术之外，还可通过下列方法增加其他纤维素酶组分的表达水平：引入相应纤维素酶组分的额外拷贝，或者通过在天然基因上游引入启动子(所述启动子使得天然基因的表达水平相比内源性水平增加)。还可通过诱变和选择具有期望表达水平的菌株来实现表达的改变。可使用本领域技术人员已知的技术通过产生特定纤维素酶组分生产缺陷的菌株来实现欠表达。

另外，表达水平可通过调整发酵条件来调节，如通过改变进料的组成，或者通过改变发酵的pH和温度。调整纤维素酶表达水平的另一种方法涉及修饰纤维素酶分泌途径或者修饰纤维素酶转录和/或转录调控系统和/或翻译后蛋白质成熟机制(例如转录因子、蛋白伴侣)。

在选择表达经修饰家族5纤维素酶的重组宿主菌株之后，可在诱导表达经修饰家族5纤维素酶的条件下于浸没液体发酵中对其进行培养。根据本发明的一个实例，经修饰家族5纤维素酶由在浸没液体培养发酵中培养的经遗传修饰微生物所分泌并且在发酵结束时与细胞分离。细胞可通过过滤、离心或其他本领域技术人员熟悉的过程进行分离。之后，包含无细胞经修饰家族5纤维素酶的级分在使用前可被浓缩(例如，通过超滤)、保存和/或稳定化。

经修饰家族5纤维素酶的生产

本发明的经修饰家族5纤维素酶可使用经遗传修饰微生物在发酵过程中(例如，在浸没液体培养发酵中)产生，该经遗传修饰微生物包含编码经修饰家族5纤维素酶的遗传构建体。

微生物(如木霉和相关的丝状真菌)的浸没液体发酵通常以分批、补料-分批或连续方式进行。在分批过程中，将所有必需材料(除了用于需氧过程的氧)在操作开始时置于反应器中，使发酵进行直到完成，此时收获产物。用于生产本发明经修饰家族5纤维素酶的分批过程可在摇瓶或生物反应器中进行。

在补料分批过程中，在不移出培养物流体的情况下将一种或更多种培养基组分连续地或依次地添加至培养物。在连续过程中，以体积上相等的速率连续地供应新鲜培养基和移出培养物流体，从而将培养物维持在恒定的生长速率。

发酵培养基包含碳源、氮源和其他营养物、维生素和矿物质，可以将它们添加到发酵介质中以改善经遗传修饰微生物的生长和酶生产。这些其他培养基组分可在接种经遗传修饰微生物之前、同时或之后添加。

在生产本发明的经修饰家族5纤维素酶时，碳源可以包含将诱导由经遗传修饰微生物中的遗传构建体表达经修饰家族5纤维素酶的碳水化合物。例如，如果经遗传修饰微生物是木霉菌株，那么碳源可以包含以下中的一种或更多种：纤维素、纤维二糖、槐糖，以及已知在木霉中诱导纤维素酶和β-葡糖苷酶表达的相关寡糖或多糖。

在分批发酵的情况下，碳源可以在接种之前或与之同时添加到发酵培养基中。在补料分批或连续运行的情况下，也可以在发酵过程中连续地或间歇地提供碳源。例如，当经遗传修饰微生物是木霉菌株时，碳的加料速率为每小时约0.2至4.0g碳/L培养物或其间任意量。

本发明的经修饰家族5纤维素酶的生产过程可以在约20℃至约50℃或其间任意温度下进行，例如约25℃至约37℃或其间任意温度，或者从20、22、25、26、27、28、29、30、32、35、37、40、45或50℃或其间任意温度。

本发明的经修饰家族5纤维素酶的生产过程可以在pH为约3.0至6.5或其间任意pH下进行，例如约pH 3.5至pH 5.5或其间任意pH，例如约pH 3.0、3.2、3.4、3.5、3.7、3.8、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.5、5.7、5.8、6.0、6.2、6.5或其间任意pH。

发酵之后，包含经修饰家族5纤维素酶的发酵液可直接使用，或者可以将经修饰家族5纤维素酶与真菌细胞分离，例如通过过滤或离心。低分子量溶质(如发酵培养基中未消耗的成分)可以通过超滤移除。例如可以通过蒸发、沉淀、沉降或过滤来浓缩经修饰的家族5纤维素酶。可以添加化学品如甘油、蔗糖、山梨醇等以稳定纤维素酶。可以向纤维素酶中添加另一些化学品如苯甲酸钠或山梨酸钾，以防止微生物污染物生长。

可以通过基于亲和的纯化技术纯化经修饰家族5纤维素酶。这样的技术在本领域中是公知的并且包括基于高特异性生物相互作用(如抗原与抗体之间或者酶与底物之间)使生物混合物的组分选择性结合固相支持体的任何合适方法。此外，纯化可以包括分级分离，其包括选择性沉淀如硫酸铵沉淀、等电沉淀、选择性热变性或选择性地沉淀纤维素酶组分的任何其他合适方法。在另一实施例中，纯化方法可以包括色谱法，其包括凝胶过滤、尺寸排阻、阴离子交换、阳离子交换、凝胶电泳或用于物理地分离蛋白的本领域中已知的其他色谱分离方法。

采用经修饰家族5纤维素酶处理含纤维素的制品

本发明的经修饰家族5纤维素酶可以用于处理“含纤维素的制品”。这些处理包括“脱绒毛”或“生物打磨”。

术语“含纤维素的制品”是织物，其为布匹或缝制成服装或纱的制品，所述织物包含含棉或不含棉的纤维。含纤维素的制品可以在染色之前或之后用本发明的经修饰家族5纤维素酶处理，以及进行或不进行树脂抛光(resinous finish)处理。该术语涵盖天然纤维素和人造纤维素。含人造纤维素的织物包括本领域中公知的再生织物，如人造纤维(rayon)。

如本文中所使用的，术语“脱绒毛”是指在纤维素纤维受控水解中使用本发明的经修饰家族5纤维素酶，使得以通过减少起毛来清理表面结构的方式修整棉制品的表面。该处理能够防止起毛，改善织物手感如柔软度和光滑度，其可以使得颜色鲜明和/或提高吸湿性和染色性。

脱绒毛处理可以在织物生产过程中或之后的服装洗涤过程中进行。在任一种情况下，通常都是通过将棉制品添加到旋转式水平或垂直滚筒喷射式染色机、洗衣机或其他装置中来进行。该处理通常为织物(包括疏松纤维)提供搅拌和剪切。除了纤维素酶和织物，可以在脱绒毛过程中添加其他组分，包括水、缓冲液、去污剂或表面活性剂。处理之后，将织物从机器或装置中移出并干燥。

当脱绒毛发生在常规生产过程中时，处理时间可以为约15至约120分钟；处理温度可以为约35℃至约60℃；液体与织物的比率可以为按重量计约2.5∶1至约10∶1；以及pH可以为约4.0至约6.0。当脱绒毛发生在常规服装洗涤中时，处理时间为约10至约60分钟；处理温度为约20℃至约70℃；液体与织物的比率为按重量计约2.5∶1至约10∶1；以及pH为约4.0至约9.5或约4.0至约6.0。

用于脱绒毛的纤维素酶混合物的量取决于纤维素酶混合物中活性蛋白的浓度、被处理的棉制品的量、所需脱绒毛程度、处理时间和本领域技术人员公知的其他参数。当用于在常规生产过程中脱绒毛时，纤维素酶用量的实例是每千克织物约0.1g至约7g酶蛋白，更优选每千克织物约0.5g至约4g酶蛋白。当用于在常规服装洗涤中脱绒毛时，纤维素酶的优选量一般为每千克织物约0.01g至约3g酶蛋白，更优选每千克织物约0.05g至约2.5g酶蛋白。

控制酶作用的一个非限制性选择是在处理之后通过加热溶液、添加化学品以破坏酶活性或者通过干燥棉制品来破坏酶。

预期可以将经修饰家族5纤维素酶合并入去污剂组合物中。该去污剂组合物可以是本领域中已知的任何形式。其包括作为液体稀释剂、颗粒、乳液、凝胶或膏。当采用固体去污剂组合物时，通常将经修饰家族5纤维素酶制备为颗粒。

如本文中所使用的，织物的“生物打磨”意指在处理织物或服装(特别是牛仔布)中使用酶作为浮石(pumice stone)的代替或补充。

生物打磨通常有三个步骤：退浆(desizing)、磨损和后处理。退浆涉及除去通常施加于经纱(warp yarn)以防止织造过程中损坏的淀粉浆或其他上浆剂。α-淀粉酶可以用于该目的。磨损可以用本发明的经修饰家族5纤维素酶进行。采用机械作用除去染料，并且处理通常在洗衣机(如滚筒洗衣机)中进行。该处理产生了“磨砂水洗”或“做旧”外观。由于除去了不均匀染色，所以染色区域与染色已被除去的区域之间形成对比。

采用本发明的经修饰家族5纤维素酶的磨损处理可以单独进行或者与浮石一起(当期望得到更强的磨损整理时)进行。

磨损后一般进行后处理，其包括洗涤和漂洗步骤，在后处理过程中，可以使用去污剂、光学增艳剂、漂白剂或柔软剂。可以通过高温度和/或pH失活终止酶处理。

在生物打磨过程中，有时采用中性至碱性条件，以得到牛仔布的特定磨损程度或色彩，而同时使处理酸如酸性缓冲液的花费最小化。在本发明的一些实施方案中，在生物打磨过程中采用了相对于亲本家族5纤维酶的最适pH提高的经修饰家族5纤维素酶。可用于生物打磨过程的pH范围的实例是5-8。

用于为织物赋予磨洗外观的合适的酶用量取决于所需结果、处理方法和酶产物活性。合适的酶用量的实例是经处理织物的重量的约0.05％至5％，或者约0.5％至2％。应理解酶用量在很大程度上取决于织物类型和机械加工条件。

磨损反应的温度范围可以是约30℃至80℃，优选约50℃至60℃。液比(液体体积与织物重量的比)范围可以是约3∶1至20∶1，优选5∶1至10∶1。处理时间的范围是15分钟至90分钟，优选30分钟至60分钟。

经修饰家族5纤维素酶的另一些工业应用

本发明的经修饰家族5纤维素酶还可用于生产生物燃料或沼气。纤维素酶混合物可用于将纤维素转化为葡萄糖，葡萄糖随后转化成生物燃料或沼气。葡萄糖随后发酵成生物燃料如乙醇或丁醇或者沼气如甲烷。

包含本发明的经修饰家族5纤维素酶的酶混合物还可用于提高动物饲料的品质，其中在喂养之前或喂养过程中用酶处理植物材料。

现在将在以下实施例中对本发明进行进一步说明。但是，应当理解，这些实施例仅为示例性目的，并且不应被用于以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1描述了用于后续实施例中的菌株和载体。实施例2和3描述了克隆里氏木霉Cel5A基因(在下文中称为“trcel5a”或“trcel5a基因”)、将该基因转化入酵母中以及产生TrCel5A的位点饱和诱变文库。实施例4和5涉及从微量培养物表达经修饰的TrCel5A和高通量筛选以鉴定比活性增加的经修饰家族5纤维素酶。实施例6和7描述了在里氏木霉中克隆和表达比活性增加的经修饰家族5纤维素酶。实施例8示出从大规模培养物表达和制备TrCel5A和经修饰的TrCel5A。实施例9和10给出了用于测量TrCel5A酶活性的测定。在实施例11中，在用TrCel5A和经修饰的TrCel5A纤维素酶处理之后，测定织物的重量损失。

实施例1：菌株和载体

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株YNL219C BY4742[11993](MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Δalg9)得自ATCC(目录号：4011993)。大肠杆菌菌株DH5α(F-φ80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169recA1 endA1 hsdR17(rk-，mk+)phoA supE44thi-1 gyrA96 relA1λ-)得自Invitrogen(目录号：18265-017)。YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体描述于共同未决且共同拥有的美国专利No.2008/0076152中。

用于过表达TrCel5A-G363A的宿主里氏木酶菌株是BTR213aux。该菌株分离自菌株RutC30(ATCC目录号：56765)。RutC30菌株作为前体菌株QM6A的纤维素酶高产出衍生物而被分离(Montenecourt等，1979)。通过随机突变和/或选择从RutC30产生纤维素酶高产出菌株。基于能够在含有1％酸溶胀纤维素和4g/L 2-脱氧葡萄糖的基本培养基琼脂上产生比RutC30更大的透明区的能力，分离了称为M2C38的菌株。然后，进一步对M2C38进行随机诱变并通过在含有0.2μg/mL多菌灵的乳糖培养基上进行选择来分离BTR213菌株。通过选择对0.15％w/v 5-氟乳清酸(FOA)具有自主抗性的突变体获得尿苷营养缺陷型BTR213——BTR213aux。

实施例2：将trcel5a基因克隆入YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss并在酵母中转化

为了分离里氏木霉M2C38基因组DNA，利用无菌接种环，将收集自马铃薯葡萄糖琼脂平板的里氏木霉M2C38孢子接种于50mL马铃薯葡萄糖培养液(Difco)。将培养物在28℃下以200rpm振荡2-3天。将菌丝体过滤到GFA级的玻璃微纤维过滤器(Whatman)上并用冷去离子水洗涤。在液氮中冷冻真菌滤饼并用预冷的研钵及研杵碾成粉末。随后，将0.5g粉末状生物质重悬于5mL的100mM Tris，50mM EDTA(pH 7.5)加上1％十二烷基硫酸钠(SDS)中。将裂解物离心(5000×g，20分钟，4℃)以沉淀细胞碎片。用1倍体积缓冲液(10mM Tris，1mMEDTA，pH 8.0)饱和的苯酚萃取上清液，接着用1倍体积缓冲液饱和的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)进行萃取以除去可溶蛋白。通过添加0.1倍体积的3M乙酸纳(pH 5.2)和2.5倍体积的冷95％乙醇以从溶液中析出DNA沉淀。在-20℃下孵育至少1小时之后，通过离心(5000×g，20分钟，4℃)沉淀DNA，用10mL 70％乙醇冲洗，风干并重悬于1mL的10mM Tris，1mM EDTA(pH8.0)中。通过添加核糖核酸酶A(Roche Diagnostics)(加至终浓度为0.1mg/mL)并在37℃下孵育1小时来消化RNA。通过用以下溶液依次萃取来除去DNA溶液中的核糖核酸酶，所述溶液为1倍体积缓冲液饱和的苯酚和1倍体积缓冲液饱和苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)。用0.1倍体积的3M乙酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的冷95％乙醇再次析出DNA，通过离心沉淀，用70％乙醇润洗，风干并重悬于50μL的10mM Tris，1mM EDTA(pH 8.0)中。通过测量溶液在260nm处的吸光度值来确定DNA浓度(Sambrook等，1989中的p.C1，其通过引用并入本文)。

采用trcel5a特异性引物和经纯化的基因组DNA作为模板，通过两步PCR扩增并修饰里氏木霉cel5a基因-trcel5a以除去其内含子。在第一轮PCR中，用引物5’-EG2Nhe(SEQID NO：20)和3’EG2-Delint(SEQ IDNO：21)扩增trcel5a的第一外显子(编码DNA片段)，而用引物5’EG2-Delint(SEQ ID NO：22)和3’-EG2Kpn(SEQ ID NO：23)扩增第二部分。这两个扩增子独立地产生并具有用引物3’EG2-Delint(SEQ IDNO：21)和5’-EG2Delint(SEQ ID NO：22)引入的同源序列。在第二轮PCR中，将两个产物连接在一起并用引物5’-EG2Nhe和3’-EG2Kpn扩增以产生不含内含子的完整trcel5a基因。最终的扩增子还在该基因的上游和下游包含NheI和KpnI限制性位点以允许克隆到酵母载体中。NheI位点的引入具有改变成熟蛋白的前两个氨基酸以产生Q1A和Q2S突变的作用。

用于从trcel5a基因除去内含子的引物：

5’-EG2Nhe 5’GAG CTA GCA CTG TCT GGG GCC AGT GTG G(SEQ ID NO：20)

3’EG2-Delint 5’GGT AAC GCA AGT GCC ATC TGT GGT ACA GCCAAA G(SEQ IDNO：21)

5’EG2-Delint 5’TGG CAC TTG CGT TAC C(SEQ ID NO：22)

3’-EG2Kpn 5’GAG GTA CCC TAC TTT CTT GCG AGA CAC GAG(SEQ ID NO：23)

用NheI和KpnI消化酿酒酵母/大肠杆菌载体YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2以释放其trcel6a插入片段。在琼脂糖凝胶上分离该片段并采用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中纯化～7.1kb线性化载体片段。用NheI和KpnI消化最终的trcel5a PCR扩增子，与空载体片段连接，然后转化入大肠杆菌菌株DH5α化学感受态细胞中。将所得载体称为YEp352/PGKxylss-Cel5A(图2A)，并采用由Gietz，R.D.和Woods，R.A.(2002)描述的方法转化入酵母菌株YNL219CBY4742[11993]中。

实施例3：产生TrCel5A-G363X位点饱和诱变文库

采用YEp352/PGKxylss-Cel5A载体(图2A)作为模板，通过两步PCR产生成熟天然TrCel5A蛋白的第363位甘氨酸的位点饱和文库。在第一轮PCR中，用引物XylSS(SEQ ID NO：24)和3’E2-G363X(SEQ IDNO：25)扩增N-末端区域，而用引物5’E2-G363X(SEQ ID NO：26)和3’PGK-term(SEQ ID NO：27)扩增C-末端区域。这两个扩增子独立产生并且具有用引物3’E2-G363X(SEQ ID NO：25)和5’E2-G363X(SEQ IDNO：26)引入的同源序列。在第二轮PCR中，将两个产物连接在一起并用引物XylSS(SEQ ID NO：24)和3’PGK-term(SEQ ID NO：27)扩增以产生在363位氨基酸饱和的完整trcel5a基因。

用于位点-饱和诱变的引物：

XylSS 5’GAT CGT CGA CAT GGT CTC CTT CAC CTC CCT C(SEQ ID NO：24)

3’E2-G363X 5’AAA TGA TCC GGC VNN CCA ACC AAC ATA(SEQ IDNO：25)

5’E2-G363X 5’TAT GTT GGT TGG NNB GCC GGA TCA TTT(SEQ IDNO：26)

3’PGK-term 5’GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC(SEQ ID NO：27)V代表A，C或G，而B代表T，C或G。

为了在酵母表达载体中产生TrCel5A-G363X文库，用NheI和KpnI消化YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体，并如上所述纯化空载体片段。同时转化线性化片段和最终的trcel5a扩增子文库，并通过体内重组(Butler和Alcalde，2003)克隆入酵母菌株YNL219C BY4742[11993]中。

实施例4：从微孔板培养物分离和表达TrCel5A-G363X

本实施例描述了从酿酒酵母选择和表达TrCel5A-G363X，用于高通量筛选测定(实施例5)。

在30℃下，将来自实施例3的酿酒酵母转化体在含有合成完全培养基(SC：2％琼脂w/v、0.17％酵母氮源w/v、0.078％尿嘧啶缺失补充剂w/v、2％葡萄糖w/v、2％酪蛋白氨基酸w/v、0.5％硫酸铵w/v，pH 5.5)的平板上培养3天，所述合成完全培养基含有0.16％Azo-CMC(Megazyme)。

选择示出清晰可见晕圈的菌落，通过在每孔含有一个玻璃珠(1.5-2.0mm)的96孔微孔板中牙签接种150μL合成完全(SC)培养基(SC：0.17％酵母氮源w/v、0.078％尿嘧啶缺失补充剂w/v、2％葡萄糖w/v、2％酪蛋白氨基酸w/v、0.5％硫酸铵w/v，pH 5.5)用于液体培养基培养。在30℃下及300rpm下将预培养物过夜(16-18小时)培养至平台期。通过添加甘油至15％的终浓度制备甘油保存物并保存于-80℃。

通过使用10μL甘油保存物在每孔含有一个玻璃珠(1.5-2.0mm)的96孔板中接种150μL合成完全培养基(SC：0.17％酵母氮源w/v、0.078％尿嘧啶缺失(ura drop-out)补充剂w/v、2％葡萄糖w/v、2％酪蛋白氨基酸w/v、0.5％硫酸铵w/v，pH 5.5)，使用甘油保存物起始液体培养基预培养。将预培养物在30℃和300rpm下培养过夜(18-20小时)至平台期。对于接种培养物的表达，使用20μL预培养物在含有一个玻璃珠(1.5-2.0mm)的微量滴定板中接种0.2mL SC培养基。在湿度控制的情况下将表达培养物在30℃和250rpm下培养3天。将板以1600×g离心5分钟以沉淀细胞，并吸出上清液以进行筛选试验。

实施例5筛选里氏木霉Cel5A-G363X文库以得到比活性提高的经修饰家族5纤维素酶

本实施例描述了对已克隆进酿酒酵母的经修饰里氏木霉TrCel5A纤维素酶的筛选，以得到相对于亲本TrCel5A改善的比活性。

如实施例4所述，在6个80μL Azo-CMC(偶氮羧甲基纤维素)的活性测定(其各自为不同的pH)中测试来自酵母微培养物的经修饰TrCel5A纤维素酶。将来自各微培养物的上清液等分试样加入到用50mM柠檬酸盐/磷酸盐/缓冲的pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0和8.0的0.5％Azo-CMC(Megazyme)中，并且在50℃孵育10分钟。为了使反应停止，加入200μL的沉淀溶液(0.3M三水乙酸钠、0.02M无水乙酸锌、80％v/v无水乙醇)，将平板在2,844×g离心10分钟。将0.1mL的上清液等分试样转移到微平板中并且测定595nm的吸光度。在各个96孔平板中包含用于对比的6个平行的TrCel5A对照。

利用ELISA来确定酿酒酵母微培养物中TrCel5A纤维素酶的浓度。在pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)中，将微培养物的上清液稀释160倍，同时将纯化的组分标准品稀释至0.01-10μg/mL(基于总蛋白质)，在微滴定板(Costar EIA #9018)中于4℃孵育过夜。将这些板用含有0.1％Tween-20的PBS(PBS/Tween)清洗，然后在含有1％牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)中于室温孵育1小时。将封闭的微滴定孔用PBS/Tween清洗。将特异性针对TrCel5A的兔多克隆抗血清在PBS/BSA中稀释(1∶4000)，加入到封闭的微滴定板中并且在室温孵育2小时。清洗平板并且与结合了辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体(Sigma #A6154)(在PBS/BSA中稀释1∶2000)一起在室温孵育1小时。清洗之后，向各平板加入四甲基联苯胺并且在室温孵育30分钟。测定各孔的在360nm的吸光度，并且利用TrCel5A标准曲线转换成蛋白质浓度。

通过用吸光度值除以测定中经修饰的或亲本TrCel5A纤维素酶的量(如通过ELISA确定)来计算6个pH值的每个值下经修饰的或亲本TrCel5A纤维素酶的比活性。将亲本TrCel5A纤维素酶对照的比活性与以下模型拟合以确定pK_a2值：

方程式1

测量的参数A代表在特定组实验pH下的酶活性。A_max、pK_a1和pK_a2均为通过将模型与数据拟合后所确定的参数。A_max代表酶的最大活性，其出现于最佳pH下。pK_a1和pK_a2代表催化活性残基的质子化作用的pH依赖性。

确定pK_a2的95％置信区间，并且利用它计算pK_a2的标准偏差。将同一模型与各经修饰的TrCel5A的比活性拟合，以计算pK_a2。将各经修饰的TrCel5A的pK_a2与亲本TrCel5A对照的pK_a2进行比较，在95％置信水平利用t检验来选择阳性。为了确定比活性的提高，在对应于各酶的pK_a2的pH下，利用模型来计算的亲本和经修饰TrCel5A纤维素酶的比活性。在95％置信水平利用t检验来选择阳性。再次在微培养物中产生所有阳性的经修饰TrCel5A内切纤维素酶，并且再次筛选以减少假阳性的数量。

通过筛选，利用改进自Hoffman和Winston(1987)的方法来从酵母培养物中分离来自阳性克隆的质粒，转化进大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α，并且之后测序。测序之后，鉴定TrCel5A-G363A、TrCel5A-G363S和TrCel5AG363T经修饰纤维素酶，带有这些经修饰家族5纤维素酶的载体分别称作YEp352/PGKxylss-Cel5A-G363A(图2B)、YEp352/PGKxylss-Cel5A-G363S和YEp352/PGKxylss-Cel5A-G363T。

实施例6.TrCel5A-G363A在里氏木霉中的表达

实施例6.1用于TrCel5A-G363A过表达的宿主木霉菌株

用于过表达经修饰TrCel5A-G363A的宿主里氏木霉菌株为BTR213aux和P285-6aux。

如实施例1所述地分离BTR213aux。通过利用p^EG2-hph-TV3载体(图3A)转化BTR213aux来产生P285-6aux，其导致内源cel5a基因的缺失，如共同未决和共同拥有的WO2010/060188所述。

实施例6.2里氏木霉转化载体的构建

如下所述构建整合型里氏木霉转化载体Pc/x-Cel5A-G363A-pyr4-TV(图3B)。利用NheI和KpnI限制酶来消化具有经修饰trcel5a(实施例5所述)的酵母表达载体YEp352/PGKxylss-cel5A-G363A。在琼脂糖凝胶上分离DNA片段，并且利用SV Gel和PCRclean-up System(Promega)凝胶提取对应于成熟TrCel5A-G363A编码区的片段。通过NheI和KpnI限制酶的消化和连接来连接分离的片段，以产生木霉转化载体Pc/x-Cel5A-G363A-pyr4-TV，其有效连接成熟TrCel5A-G363A编码区与以下片段，所述片段包含与嵌合cel7A/xyn2启动子(美国专利No.6,015,703所述)和cel6a终止子连接的xyn2分泌信号编码序列。产生的木霉转化载体Pc/x-cel5A-G363A-pyr4-TV包含作为选择标记的N.crassa pyr4基因。将该构建体转化进化学感受态DH5α大肠杆菌细胞中。对所产生的转化载体中的TrCel5A-G363A编码区进行测序，以验证G363A突变的存在。为了产生足够的用于转化进木霉的DNA，将含有转化质粒的大肠杆菌细胞接种在补充有100μg/mL氨苄西林的50mL液体LB培养基中，在37℃摇动过夜培养。根据制造商所述方案利用Plus Midiprep试剂盒(Promega)分离用于木霉转化的质粒。

因为在TrCel5A-G363A表达盒中使用了无内含子的trcel5a基因，所以在最终Pc/x-cel5A-G363A-pyr4-TV表达载体中的trcel5a-G363A基因比天然基因组里氏木霉trcel5a基因短179个核苷酸(即内含子的大小)。

实施例6.3在里氏木霉中的转化

通过以下方式产生TrCel5A-G363A过表达菌株：利用SspI使载体Pc/x-cel5A-G363A-pyr4-TV线性化，并且利用聚乙二醇介导的原生质体转化将载体转化到木霉菌株BTR213aux和P285-6aux中。在缺少尿苷的基本培养基平板上选择转化体，以对BTR213aux和P285-6aux中的pyr4营养缺陷型的回补进行选择。

通过以下程序来进行木霉的转化。将BTR213和P285-6营养缺陷型的5x10⁶个孢子铺板于补充有5mM尿苷的马铃薯葡萄糖琼脂上的无菌玻璃纸上，并且在30℃孵育20小时以促进孢子产生和菌丝生长。之后将具有菌丝体的玻璃纸片转移到10mL促原生质体生成溶液中，所述促原生质体生成溶液含有在50mM磷酸钾缓冲液(缓冲液P)中的7.5g/L崩溃酶(driselase)和4g/Lβ葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，Cat.No分别为0465-1和0439-2)，所述磷酸钾缓冲液pH为6.5，含有0.6M硫酸铵。将真菌菌丝体在60rpm轻微振荡消化5小时。通过无菌No.30MIRACLOTH^TM过滤将原生质体与未消化的菌丝体分离，并且收集在无菌的50ml圆底离心管中，通过在室温1000至1500×g离心10分钟来回收。用5mL缓冲液P清洗原生质体并且再次在室温1000至1500×g离心10分钟。使原生质体重悬在1mL STC缓冲液中(1.2M山梨醇、10mMCaCl₂、10mM Tris-HCL，pH 7.5)。为了转化，将0.1mM重悬原生质体与10μg载体DNA和0.025mL PEG溶液(25％PEG 3350、50mMCaCl₂、10mM Tris-HCl，pH 7.5)合并。在冰水浴中孵育30分钟，之后加入1mL PEG溶液，并且将混合物在室温孵育5分钟。将转化混合物用2mL STC缓冲液稀释，将整个混合物加入到冷却至约47℃的50mL熔融MMSS琼脂培养基(下表2)中，分成两份，并且倾倒在MMSS琼脂上。将平板在30℃孵育，直到可以观察到菌落的生长。将转化体转移到含有MM琼脂(表2)的单独平板中，并且允许形成孢子。收集孢子并且以高稀释度在MM琼脂上铺板，以分离同核体转化体，之后将其在PDA上铺板使其生长并形成孢子。

表2.基本培养基(Minimal medium，MM)琼脂

*MMSS琼脂含有与MM琼脂相同的成分，外加1.2M山梨醇、6.6g/LYNB(不含氨基酸的酵母氮源，来自DIFCO，目录号291940)和1.92g/L氨基酸(-Ura DO Supplement，来自Sigma，目录号Y1501-20G)。

实施例6.4：里氏木霉转化体的表征

利用Extract-N-Amp^TM Seed PCR Kit(Sigma)以及引物XylSS(5’GAT CGT CGA CATGGT CTC CTT CAC CTC CCT C-3’；SEQ IDNO：24)和KW127(5’-GGA ACC ACA CCA TCG CACATC-3’；SEQ IDNO：28)进行PCR，以此来确认所分离的里氏木霉转化体中转化载体的染色体整合。根据厂商建议制备模板DNA以及进行PCR反应。从转化体中分离的全部DNA中扩增到含有trcel3a-G363A编码区的片段，但从这些转化体的亲本菌株分离的DNA中未扩增到上述片段(图4)。

为了测定经修饰TrCel5A-G363A纤维素酶的产生，使生长在PDA平板上的木霉转化体及其亲本菌株的孢子悬浮在无菌水中，并且将每mL约10⁴-10⁶个孢子用于接种24深孔平板中的每个微量培养物。微量培养的培养基中的成分在下表3中提供。

表3：微量培养的培养基组成

＊微量元素溶液包含5g/L FeSO₄·7H₂O、1.6g/L MnSO₄·H₂O、1.4g/LZnSO₄·7H₂O。

＊＊葡萄糖、Solka floc、乳糖、纤维二塘、槐糖、玉米糖浆或微晶纤维素。碳源可以作为pH 2至7的水溶液分别灭菌，并且在一开始或者在发酵过程中加入到其余的培养基成分中。

使培养物在30℃于250rpm摇动下生长6天。通过在12,000rpm离心来使真菌细胞与含有分泌蛋白质的生长培养基分离。利用Bio-Rad Protein Assay(目录编号500-0001)确定蛋白质浓度。利用ELISA确定TrCel5A纤维素酶(经修饰的和亲本的)的相对丰度(总分泌蛋白的重量％)。培养物上清液和纯化的组分标准品在pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释至0.01-10μg/mL，并且在微滴定平板(Costar EIA#9018)中于4℃孵育过夜。将这些平板用含有0.1％Tween-20的PBS(PBS/Tween)清洗，之后在含有1％牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)中于室温孵育一小时。将封闭的微滴定孔用PBS/Tween清洗。将特异性针对TrCel5A的兔多克隆抗血清在PBS/BSA中稀释，加入各个微滴定平板中并且在室温孵育2小时。清洗平板并且与结合了辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体(Sigma#A6154)(在PBS/BSA中稀释1∶2000)一起在室温孵育1小时。清洗之后，向各平板加入四甲基联苯胺并且在室温孵育30分钟。测定各孔的在360nm的吸光度，并且利用TrCel5A标准曲线转换成蛋白质浓度。总TrCel5A纤维素酶(经修饰的和亲本的)的浓度表示成作为总分泌蛋白质级分的成分质量百分比(图5)。选择若干产生最高量TrCel5A纤维素酶(经修饰的和亲本的)的菌株，用于在14L发酵(图6)和脱绒毛分析(图7)中进行进一步分析。

实施例7：14L发酵中的酶产生

使生长在PDA培养基上的菌株BTR213、P285-6和所选择的转化体的木霉孢子悬浮在无菌水中，并且转移到含有750mL液体Berkley培养基(pH 5.5)的2L有挡板的锥形瓶中，所述液体Berkley培养基补充有5.1g/L的玉米浆粉末和10g/L葡萄糖(表4)。利用以100rpm运行的轨道搅拌器(Model G-52 New Brunswick Scientific Co.)将瓶在28℃孵育3天。

表4.用在瓶中的Berkley培养基

＊微量元素溶液包含5g/L FeSO₄·7H₂O、1.6g/L MnSO₄·H₂O和1.4g/LZnSO₄·7H₂O。

将接种瓶的内容物转移到提供有10L Initial Pilot Media(pH 5.5)的14L中试规模的发酵容器(Model MF114 New Brunswick Scientific Co.)中。容器以分批模式运行，直到耗尽培养物中的葡萄糖。此时，连续从储存库中加入含有诱导纤维素酶之碳水化合物的碳源，所述储存库为35.5％w/v的溶解于水中的固体。使用蠕动泵来输送碳源，进料速率为每小时每升培养物0.4克碳。分批运行部分和补料-分批运行部分二者过程中的操作参数为：利用叶轮搅拌以500rpm混合，空气喷射为每分钟8标准升，温度为28℃。利用与在线pH探针和能够加入10％氢氧化铵溶液的泵连接的自动化控制器，将培养物的pH维持在：分批生长过程中pH为4.0-4.5，纤维素酶产生过程中pH为3.5。定期抽出培养液的100mL样品来进行生物量和蛋白质分析。

表5：补料-分批发酵的初始培养基

利用已经称重、通过玻璃纤维滤纸真空过滤并且在100℃烘干4至24小时的5至10mL等分试样来确定培养液中的真菌细胞的浓度。根据以下的方程式2确定真菌细胞的浓度。

利用BioRad蛋白质分析来确定培养物滤液的蛋白质浓度。利用分光光度计在595nm测定吸光度来定量考马斯亮蓝G-250染料的色度改变，其形成了该测定的基础。所使用的标准分析对照为已知组成和浓度的纤维素酶混合物。162至170小时后收集用于酶分析的最终滤液。

通过ELISA利用上述(实施例6.4)组分特异性抗体来确定四种纤维素酶成分(TrCel7A、TrCel6A、TrCel7B、总的经修饰TrCel5A和亲本TrCel5A)的相对浓度(在总分泌蛋白中的重量百分比)。在转化体和亲本菌株产生的纤维素酶混合物中，三种主要纤维素酶成分Cel7A、Cel6A和Cel7B的丰度是类似的。相比于亲本BTR213纤维素酶混合物，P998A、P998D、P1013C和P1013D纤维素酶混合物中的TrCel5A纤维素酶(经修饰的和亲本的)的丰度增加了约四倍，这是因为经修饰的TrCel5A-G363A纤维素酶的过表达(图6)。P285-6转化体P976F、P976G、P976I、P976J、P976L和P976M产生的纤维素酶混合物包含14％至25％的经修饰TrCel5A-G363A纤维素酶(图6)。

实施例8：由里氏木霉转化体产生的酶的脱绒毛活性

为了测定脱绒毛活性，从一片较大的织物上剪下若干直径约11.5cm的棉织法兰绒圆片并称重。之后将织物放置在具有螺口盖的塑料瓶中，并且放在具有橡胶管制成的垫圈的瓶底。之后，向各瓶加入90g直径0.5cm的铁滚珠。将酶稀释成向每瓶输送10至100单位的CMC活性(如Ghose等，1987所确定的)和1至10mg的总蛋白质。将稀释的酶加入到瓶中，以使得各瓶中的总液体为约15g。

之后将瓶用瓶盖密封瓶并且在摇床孵箱中于50℃以180rpm回旋振摇孵育2小时。孵育之后，向每瓶加入3滴10N NaOH以停止酶反应。之后利用真空歧管和垂直侧口瓶使各反应的液体部分通过预先称重的玻璃纤维滤器。再向仍含有固定的棉织法兰绒片的各瓶中加入200mL水，之后关闭并且用手摇动以释放滞留在织物内的所有细料。将滤纸在100℃烘箱中干燥最少4小时。测定滤纸和滞留细料的重量，并且用于计算底物损失的重量相对于各织物片的起始质量的百分比。

利用以下的方程式3计算织物重量的损失：

脱绒毛性表示为每单位蛋白质的脱绒毛比活性，并且相对于菌株BTR213所产生酶的脱绒毛活性归一化。

如图7所示，经修饰TrCel5A-G363A纤维素酶的过表达提高了由BTR213aux或P285-6aux转化体所产生的酶的脱绒毛活性。这些发现表明无论野生型TrCel5A纤维素酶存在(如在BTR213转化体中)还是不存在(如在P285-6转化体中)，都可以观察到在引入TrCel5A-G363A后活性改善。

实施例9：用于随后的活性测定的亲本和经修饰TrCel5A纤维素酶的表达和制备

TrCel5A、TrCel5A-G363A、TrCel5A-G363S和TrCel5A-G363T制备物得自以下给出的转化的酿酒酵母菌株，并且随后通过还原端测定和粘度测定(实施例10和11)来确定其各自的比活性。

在250mL体积的无菌SC＊-Ura培养基(0.77g/L-Ura缺失补充剂、1.7g/L酵母氮源、5g/L(NH₄)₂SO₄，20g/L酪蛋白氨基酸、20g/L葡萄糖)上接种10mL转化酿酒酵母的过夜培养物，其培养自从琼脂平板新挑取的细胞。之后将培养物在30℃以250rpm振摇孵育72小时。

孵育之后，将酵母培养物在3,300×g离心10分钟。利用移液器取出上清液并且保留，弃去酵母细胞沉淀。利用ELISA以及纯化TrCel5A的标准曲线来确定上清液中亲本或经修饰TrCel5A的浓度。此TrCel5A(亲本或经修饰)制备物没有进一步处理即用于粘度测定(实施例11)。

对于还原末端测定(实施例10)，将上清液浓缩并且脱盐，以减少测定的背景信号。将含有亲本或经修饰TrCel5A纤维素酶的酵母细胞培养物上清液利用plus-20 Biomax PES-5(Amicon)过滤装置交换到柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(5mM柠檬酸盐、5mM磷酸盐，pH 6.0)中。通过装置3个3450×g、10至15分钟的离心步骤，使上清液连续浓缩，来使装置的保留体积尽可能小。每个步骤后将流出物(flow-through)丢弃。将浓缩保留的酶溶液在缓冲液中重悬并且如上述进行离心。将流出物丢弃，将累积在膜上的蛋白质在10mL缓冲液中重悬并且转移到50mL Falcon^TM管中。加入缓冲液至40mL终体积。利用ELISA和纯化TrCel5A的标准曲线来确定与缓冲液交换的亲本或经修饰TrCel5A的浓度。

实施例10：对TrCel5A、TrCel5A-G363A或TrCel5A-G363S产生还原端的测定

利用本领域技术人员已知的方法从SigmaCell50(Sigma-Aldrich)生产酸溶胀纤维素(ASC)。使ASC在水中浆化至3.5g纤维素/L的浓度，并且利用探针直径为1cm的转子-定子匀浆器通过5个循环的“开启”1分钟接着“关闭”1分钟将其匀浆。然后将纤维素浆或“ASC浆”在真空中恒速搅拌脱气10分钟。

葡聚糖酶在纤维素中产生新的还原端，其中一些与不溶性底物结合，一些与短的已溶解的纤维糊精结合。可以通过将酶与底物在高pH(10或更高)(此时不发生纤维素的酶水解)的条件下混合，来直接测定酶处理前底物中还原端的数量和酶自身的还原势(共同称作非活性对照)。

通过移液器将含有125μLASC浆的等份试样分配到96孔(均为2mL体积)微孔板中。分配过程中将浆在搅拌板上混合，以确保均匀的底物分配。向各孔加入多种pH的等体积的100mM柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液。用铝密封带将平板密封，并且在50℃水浴中预热15分钟。打开平板的密封并且一式三份地向孔中加入125μL经缓冲液交换的TrCel5A、TrCel5A-G363A或TrCel5A-G363S(向各反应中加入0.4μg酶)。将平板重新密封并且放回50℃水浴中孵育30分钟。为了终止反应，打开平板的密封并且向所有样品中加入与样品体积相等的BCA工作溶液(0.971g/L2，2′-联喹啉-4，4′-二羧酸二钠、27.14g/L Na₂CO₃、12.1g/L NaHCO₃、0.624g/LCuSO₄·5H₂O、0.631g/L L-丝氨酸)。

同时产生各反应微孔板上的各pH测试的标准曲线，并且用于吸收信号向还原端浓度如葡萄糖当量的转化。使用了6个葡萄糖浓度作为标准溶液：0.1g/L、0.05g/L、0.025g/L、0.0125g/L、0.006g/L和0g/L。通过移液器将125μL标准溶液的等分试样加入到微孔平板中，同时还有等体积的pH缓冲液和TrCel5A。

在75℃进行BCA反应30分钟，以测定还原端(基于Zhang和Lynd，2005)。通过在室温的流动水中冷却密封平板来终止反应。将平板在2,750×g离心4分钟来使剩余的不溶性ASC沉淀。之后，从各孔中转移200μL上清液到96孔聚苯乙烯微孔板中，并且读取560nm的吸光度。利用标准曲线将读取的吸光度转换成葡萄糖当量，并且从具有活性酶和底物的孔的读数值中减去匹配的非活性对照。将校准的读数值转换成以每微克酶每分钟产生微摩尔葡萄糖为单位的比活性。

对于各pH点，用含有酶的样品的结果减去空载体对照的结果。对于对照样品，利用等体积的空载体上清液(来自对含有无TrCel5A基因之表达载体的酿酒酵母的培养)来代替TrCel5A制备体。通过使残差平方和最小化，将方程式1(见实施例5)与校正的数据拟合，并且确定pK_a1、pK_a2和A_max的最佳拟合值。

图8示出了作为pH函数的亲本和经修饰TrCel5A纤维素酶的活性，以及模型拟合。利用Motulsky的方法(2004)来确定pK_a1、pK_a2和A_max的95％置信区间的上限和下限。进行t检验，从而将TrCel5A-G363A和TrCel5A-G363S的A_max与野生型、亲本TrCel5A的A_max进行比较，并且计算P值以确定经修饰家族5纤维素酶的参数是否明显不同于野生型纤维素酶的参数(表6)。

表6：在酸溶胀纤维素上确定TrCel5A、TrCel5A-G363A和TrCel5A-G363S的A_max的P值

	A_max	标准偏差	P值
				TrCel5A	36.4	1.3
TrCel5A-G363A	62.8	2.3	1.4E-13
				TrCel5A-G363S	66.8	2.6	6.0E-14

这些结果表明经修饰TrCel5A-G363A和TrCel5A-G363S纤维素酶比亲本TrCel5A纤维素酶对酸溶胀纤维素的活性更高。

实施例11：TrCel5A和TrCel5A-G363A活度的粘性测定

制备羟乙基纤维素酶(HEC)储液，首先在加热板上将玻璃烧杯中的1L水加热至40℃。加热之后，缓慢加入50g HEC并且用搅拌棒剧烈搅拌。用塑料膜覆盖烧杯以防止蒸发，利用磁性搅拌棒在室温搅拌过夜使得纤维素能够溶解。

为了测定TrCel5A活性(经修饰和亲本)，在一次性金属取样杯中称量15g用于RVA-Super-4 viscometer(Newport Scientific)的HEC底物。向底物中加入5mL 400mM的柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液，将容器在装置中于50℃预热2分钟。接下来，向预热样品中加入2mLTrCel5A、TrCel5A-G363A或TrCel5A-G363T(无缓冲液交换)，并且使得反应进行2.5分钟，在这段时间中，自动记录每一秒的粘度(单位厘泊)。对于对照样品，利用等体积的空载体上清液(来自对含有无TrCel5A基因之表达载体的酿酒酵母的培养)代替含有亲本和/或经修饰TrCelA的制备物。

在酶溶液混合到缓冲底物中完成后(大约20秒后)，计算作为时间函数的粘度图的斜率，并且仅计算数据中明显为线性的部分。

对于各pH点，用酶样品的曲线斜率减去空载体的曲线斜率。通过最小化残差平方和将实施例5给出的方程式1与校准的数据拟合，确定pK_a1，pK_a2和A_max的最佳拟合值。将来自BCA测定(实施例10)的pK_a1值用于这些拟合。图9示出了作为pH函数的TrCel5A活性，以及模型拟合。利用Motulsky的方法(2004)来确定全部三个参数的95％置信区间的上限和下限。进行t检验，从而将TrCel5A-G363A和TrCel5A-G363T的A_max与TrCel5A的A_max进行比较，并且计算P值以确定经修饰家族5纤维素酶的参数是否明显不同于亲本纤维素酶的参数(表7)。

表7：对羟乙基纤维素测定TrCel5A、TrCel5A-G363A和TrCel5A-G363T之A_max的P值

	A_max	标准偏差	P值
				TrCel5A	0.59	0.04
TrCel5A-G363A	1.14	0.04	4.9E-14
				TrCel5A-G363S	1.03	0.03	2.1E-13

这些结果表明对于羟乙基纤维素，经修饰TrCel5A-G363A和TrCel5A-G363S纤维素酶比亲本TrCel5A纤维素酶的活性更高。

实施例12：表达自里氏木霉的TrCel5A和TrCel5A-G363A的纯化

如实施例7所述，在诱导纤维素产生的条件下，将里氏木霉的菌株在浸没液体发酵中进行培养。细胞将木霉蛋白质的粗混合物分泌到发酵液中。通过含有Harborlite滤层的玻璃纤维滤器的过滤从发酵液中去除真菌细胞。如Bhikhabhai等(1984)所述，通过利用DEAE-Sepharose柱的阴离子交换色谱来从粗滤液中分离TrCel5A或TrCel5A-G363A。利用搅拌超滤池(Amicon)和10kDa标称截留分子量的聚醚砜膜来浓缩纯化的TrCel5A或TrCel5A-G363A，并且缓冲交换到pH 5.0的50mM柠檬酸钠中。

实施例13：TrCel5A和TrCel5A-G363A的脱绒毛活性的测定

通过直接称量从织物中释放的不溶性纤维素，来测定酶去除来自织物的毛线小球(称作绒毛)的效力。

如实施例8所述进行脱绒毛测定。向6个瓶中以1mL的增量加入2至7mL的pH5.0的50mM柠檬酸中的纯TrCel5A或TrCel5A-G363A储液。再加入柠檬酸盐缓冲液至50mL的终体积。

通过测定，对于TrCel5A，图形的斜率为0.233％wt损失/(mg酶/g纤维素)，对于TrCel5A-G363A，为0.311％wt损失/(mg酶/g纤维素)，表明经修饰家族5纤维素酶的活性增加了34％。使用F检验来将具有2个斜率和单个截距的整体拟合与1个斜率和1个截距的模型、TrCel5A和TrCel5A-G363A具有相等活性的空模型(null model)进行了比较(Motulsky，2004)。通过F检验排除了这些空模型(p＝0.0002)。

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Claims

1.经修饰家族5纤维素酶，与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型家族5纤维素酶相比，其仅存在丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换，所述位置通过将所述经修饰家族5纤维素酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的71至397位氨基酸进行比对来确定。

2.根据权利要求1所述的经修饰家族5纤维素酶，其中所述经修饰家族5纤维素酶显示出提高的比活性，其为亲本家族5纤维素酶或相应野生型家族5纤维素酶的至少1.2倍。

3.根据权利要求1或2所述的经修饰家族5纤维素酶，其中替换到363位的氨基酸为丙氨酸。

4.酶混合物，其包含权利要求1至3中任一项所述的经修饰家族5纤维素酶。

5.一种用于生物打磨的方法，所述方法包括使牛仔布织物或牛仔布服装与经修饰家族5纤维素酶或其酶混合物相接触的步骤，所述经修饰家族5纤维素酶与氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的野生型家族5纤维素酶相比，其仅存在丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换，所述位置通过将所述经修饰家族5纤维素酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的71至397位氨基酸进行比对来确定。

6.一种用于脱绒毛的方法，所述方法包括使含纤维素的制品与经修饰家族5纤维素酶或其酶混合物相接触的步骤，所述经修饰家族5纤维素酶与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型家族5纤维素酶相比，其仅存在丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换，所述位置通过将所述经修饰家族5纤维素酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的71至397位氨基酸进行比对来确定。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在所述接触步骤中，所述含纤维素的制品为织物或服装。

8.去污剂组合物，其包含经修饰家族5纤维素酶或其酶混合物，所述经修饰家族5纤维素酶与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型家族5纤维素酶相比，其仅存在丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换，所述位置通过将所述经修饰家族5纤维素酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的71至397位氨基酸进行比对来确定。

9.遗传构建体，其包含编码权利要求1至3中任一项所述经修饰家族5纤维素酶的核酸序列。

10.经遗传修饰的微生物，其包含权利要求9所述的遗传构建体。

11.用于生产权利要求1至3中任一项所述经修饰家族5纤维素酶或权利要求4所述酶混合物的方法，其包括以下步骤：在培养基中于诱导所述经修饰家族5纤维素酶表达和分泌的条件下培养权利要求10所述经遗传修饰的微生物，以及从所述培养基中回收含有所述经修饰家族5纤维素酶的酶混合物。

12.酶混合物，其包含一种或更多种纤维素酶并包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的经修饰里氏木霉Cel5A酶。

13.根据权利要求12所述的酶混合物，其包含SEQ ID NO:17所示的经修饰里氏木霉Cel5A酶。