CN102906111A - 特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原的人抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供特异性结合HBV表面抗原(HBsAg)的抗体，其可有效预防和治疗乙型肝炎。
Description
技术领域
本发明涉及特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科中的一员，它会引发急性和慢性肝炎。世界人口中大约3.5亿人，尤其在韩国和中国5-8%的人口是慢性HBV患者，而且HBV是肝病和肝癌的主因。虽然抗HBV疫苗的发展使预防乙型肝炎成为可能，但仍有很多人由于HBV感染而患上慢性肝炎。HBV感染会引起肝炎、肝硬化和肝癌，而且在慢性肝炎患者中肝癌的发生率比正常人高300倍，WHO(世界卫生组织)透露大约80%的肝癌是通过HBV感染由慢性乙型肝炎引起的。
目前可用的乙型肝炎治疗药物包括核苷酸类似物，如拉米夫定(lamivudine)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)以及其它核苷酸类似物，已知它们能够抑制HBV的DNA聚合酶。但是，施用该类药物三年后，在75%的患者中出现了抗性病毒，导致疗效降低，因此将它们与乙型肝炎抗体制剂联合应用以预防垂直传播和肝移植后的感染。
目前应用的乙型肝炎抗体制剂是采用高技术纯化和病毒灭活的方法，以具有抗-HBV抗体的人血为来源制备的，但由于具有高抗-HBV抗体的昂贵人血浆可用性低以及灭活似乎可行的人血浆来源的病毒成本高，这种方法不能满足日益增长的需要。
尽管
和Milstein(1975)建立了制备单克隆抗体(mAb)的方法，源于小鼠的单克隆抗体已主要用于诊断或一些治疗。然而，由于以治疗目的施用于人体时，可能产生人抗鼠抗体(HAMA)，该鼠抗体不能施用。为了解决HAMA的问题，已经开发出了嵌合的和人源化的抗体。嵌合抗体含有鼠mAb的可变区(Fv片段)，其构成了整个抗体分子的约30%。相比之下，人源化抗体含有鼠mAb的CDRs(互补决定区)，其构成了整个抗体的约10%。虽然这类嵌合的和人源化的抗体明显降低了HAMA反应，但在治疗需要长期和持续施用的慢性病如慢性肝炎时，采用人抗体可能更好。
本发明致力于开发新的改进抗体(improved antibodies)，并发现这类抗体可通过结合HBV表面抗原而用于灭活HBV。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原的新抗体。
本发明的另一个目的是提供分别编码所述抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA，以及包括其的表达载体。
本发明的再一个目的是提供用所述表达载体转化的细胞系。
本发明的又一个目的是提供用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物，其包括所述抗体。
根据本发明的一个方面，本发明提供特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体，其包括：a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区；b)具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的轻链可变区；c)重链恒定区；以及d)轻链恒定区。
根据本发明的另一个方面，本发明提供编码具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区或具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的轻链可变区的DNA，以及包括其的表达载体。
根据本发明的再一个方面，本发明提供用所述表达载体转化的细胞系。
根据本发明的又一个的方面，本发明提供用于预防或治疗乙型肝炎的药物组合物，其包括所述抗体。
附图说明
结合附图从本发明下面的描述中，本发明的上述和其它目的及特性将更加明显，图中分别显示如下：
图1：电泳(1%琼脂糖凝胶)分析的图像结果，显示PCR合成的分别编码本发明的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的DNA；
图2：包括本发明抗体的重链可变区和轻链可变区的噬菌体展示载体pKS4H的图谱；
图3：说明利用淘选技术(the panning technique)从抗体库筛选抗体过程的简图；
图4：从抗体库筛选出的本发明抗体的单链可变片段(scFv)的氨基酸序列；
图5：表达本发明的人抗体的重链HB48-33-重-pRC13、HB48-35-重-pRC13或HB48-59-重-pRC13的表达载体的图谱；
图6、7和8：分别为表达本发明的人抗体的轻链HB48-33-轻-pKC12、HB48-35-轻-pKC12和HB48-59-轻-pKC12的表达载体的图谱；
图9：从转化子表达的重链和轻链的SDS-PAGE分析；
图10：人抗体(HB48-33、HB48-35和HB48-59)对HBV表面抗原的相对亲和力；
图11：通过插入HBV DNA序列而由pcDNA3.1制备的载体pHBV1.3-MBRI的图谱，该载体用于制备急性乙型肝炎小鼠模型；
图12：显示本发明人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59的中和能力的曲线图，HB48-33、HB48-35和HB48-59是利用急性乙型肝炎小鼠模型通过体内效力试验筛选出的。已证实注射图11的质粒24小时后表达了HBV表面抗原(HBsAg)，经施用本发明抗体后表面抗原减少。表面抗原采用Genedia HBsAg ELISA 3.0(Green Cross MS,韩国)测定。
发明详述
以下将详述本发明。
本发明提供一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体，其包括：a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区；b)具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的轻链可变区；c)重链恒定区；以及d)轻链恒定区。本发明的抗体的特征在于，通过特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原以灭活HBV，有效预防或治疗乙型肝炎。
特异性结合HBV表面抗原的抗体可通过改良的噬菌体展示方法(a phage display method)(Smith,科学(Science),228,1315-1317,1985；以及Hoogenboom&Chames,今日免疫学(Immunol Today),21,371-378,2000)而优选地筛选。在噬菌体展示方法中，编码丝状噬菌体(如M13、Fd或F1)表面蛋白的基因(基因III)与编码目标抗体的基因融合，以生成具有以抗体-噬菌体形式暴露在表面的融合抗体(afused antibody)的病毒颗粒。随后，通过生物淘选技术，利用该抗体的高特异性和亲和性以及该噬菌体的高感染性可从噬菌体库中筛选目标抗体(Burton&Barbas,免疫学前沿(Adv.Immunol.),57,191-280,1994；Winter等,免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.),12,433-455,1994；以及Hoogenboom等，免疫技术(Imunotechnology),4,1-20,1998；Kim等,Hybrid Hybridomics,21,385-392,2002)。噬菌体展示载体可以为pKS4H(见韩国专利No.0635370)或pCANTAB5E，优选pKS4H。
本发明人已经从噬菌体库中筛选出三种人抗体(HB48-33、HB48-35和HB48-59)，并检测了抗体的亲和力和对于HBV表面抗原的中和能力(图10和11)。另外，还分析了重链和轻链可变区的氨基酸序列，并分别证实所有重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:2、3和4所示的氨基酸序列。
本发明抗体的重链和轻链恒定区与人抗体的重链和轻链恒定区相同。
本发明提供编码具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗体重链可变区的DNA。优选地，该DNA可以包括编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的多聚核苷酸。
本发明提供编码具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的抗体轻链可变区的DNA。优选地，该DNA可以包括编码SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列的具有SEQ ID NO：6、7和8所示核苷酸序列中任何一个或多个的多聚核苷酸。
本发明提供表达特异性结合HBV表面抗原的抗体的重链可变区的表达载体，其包括编码该抗体的重链可变区的DNA。优选地，所述表达载体可以为“HB48-33-重-pRC13”、“HB48-35-重-pRC13”或“HB48-59-重-pRC13”，其图谱如图5所示。
具体地，该载体可以通过将用淘选法筛选出的抗体的VH片段(HB48VH)插入到合适的载体，如pRC13载体(保藏编号No.KCLRF-BP-00054；韩国专利No.523732)来制备。
本发明提供表达特异性结合HBV表面抗原的抗体的轻链可变区的表达载体，其包括编码抗体轻链可变区的DNA。优选地，该表达载体可以为其图谱如图6所示出的“HB48-33-轻-pKC13”、其图谱如图7所示出的“HB48-35-轻-pKC13”或其图谱如图8所示出的“HB48-59-轻-pKC13”。
具体地，该载体可以通过将用淘选法筛选出的抗体的各VL片段(HB48-33VL、HB48-35VL或HB48-59VL)插入到合适的载体，如pKC12载体(保藏编号No.KCLRF-BP-00054；韩国专利No.523732)来制备。
本发明提供一种用表达本发明抗体的重链和轻链可变区的表达载体转化的动物细胞系。该动物细胞系可以是CHO(中国仓鼠卵巢)、HEK 293或NSO细胞系，优选CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系。
本发明的抗体可通过将重链和轻链的可变区相互连接来制备。
可通过诸如竞争性ELISA法(Kim等,Hybridoma,20,265-272,2001)测定本发明抗体对抗原的亲和力。如图10所示，在本发明的人抗体中，HB48-35的亲和力最高，而HB48-59和HB48-33的亲和力分别比HB48-35低约1.3倍和4倍。此外，通过将HBV DNA高压水注射至C57BL6小鼠以诱导乙型肝炎样症状(高压水注射(Hydrodynamic injection)；Liu等,基因治疗(Gene Therapy),6,1258-1266,1999)而制备HBV小鼠模型，在该HBV小鼠模型中，HB48-33、HB48-35和HB48-59抗体显示出对HBV的中和能力，其中小鼠血液中抗体将HBV的表面抗原降低到基准水平(图12)。因此，本发明的抗体可通过结合HBV表面抗原来灭活HBV，用于预防或治疗乙型肝炎。
考虑到该结果，本发明提供一种预防或治疗乙型肝炎的药物组合物，其包括所述抗体。本发明的药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中，优选将抗体与载体混合或用载体稀释，或装入容器形式的载体中。当载体作为稀释剂时，其可以为固体、半固体或液体，用作用于抗体的囊泡、赋形剂或培养基。因此，制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、袋装剂、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软和硬明胶胶囊、注射用无菌溶液、无菌粉剂等形式。合适的载体、赋形剂或稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。制剂还可以包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。本发明的抗体组合物还可以进一步包括与抗体协同作用的干扰剂、抗-HBV单克隆抗体、抗-HBV多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA制剂或用作抗病毒剂的治疗用疫苗。
通过向包括人的哺乳动物施用本发明组合物，可预防或治疗HBV感染和HBV相关疾病。组合物中抗体的剂量取决于对象、病症严重程度、施用频率和医生的决定。作为有效成分的抗体可以每天以约0.001-10mg/kg体重，优选0.005-1mg/kg体重的有效剂量，通过非肠道途径单剂量或分剂量地施用于哺乳动物。在某些情况下，相对于上述剂量，小剂量或大剂量可能是合适的，而大剂量可以每天分为小剂量施用。
以下实施例仅用于说明目的，而非旨在限制本发明的范围。
实施例1：RNA的分离
为筛选出特异性结合HBV表面抗原的抗体，建立了人抗体库。采用来自人骨髓、人胸腺、人脾脏和人类B细胞的RNA混合物。除了人类B细胞RNA外，其它RNA均购自Clontech(美国)，人类B细胞RNA按如下分离：
将取自健康成人的50mL血液通过与50mL PBS混合进行稀释。将3mL Ficoll-Paque PLUS(通用医疗集团(GE Healthcare),美国)放入15mL试管中，并向其中加入4mL稀释的血液。将混合物在3000rpm离心以分离白血球。将2mL分离的白血球与6mL PBS混合，以100×g离心10分钟。将100μL白血球与1mL三唑(Trizole)(生命科技公司(Life Technology),美国)混合以分离RNA。
同时，分离的RNA用蒸馏水稀释，测定260nm处的吸收度来计算其数量(1.8μg/μL;Ultraspec 2000UV-VIS分光光度计,GE,美国)。详细过程如下：
将1mL三唑(trizole)加入到100μL白血球中，充分摇匀，室温(15℃-30℃)放置5分钟。然后加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。随后，将混合物在2~8℃的条件下，15,000rpm离心15分钟，上清液转移至新的试管。加入500μL异丙醇，混匀，室温放置10分钟。随后，将混合物在2~8℃的条件下，15,000rpm离心5分钟以去除上清液。向其中加入1mL 75%乙醇，将混合物在2~8℃的条件下，15,000rpm离心5分钟以除去乙醇，将RNA团块在室温干燥5分钟，向其中加入150μL蒸馏水以悬浮RNA团块，在260nm处测定悬浮液的吸收度。剩余物在-20℃保存。
实施例2：抗体基因的扩增
将1μg实施例1分离的RNA和1μL pd(T)12-18(0.5μg/μL)与蒸馏水混合使终体积为12.5μL。使混合物在70℃反应2分钟并在冰中冷却。然后，向其中加入5X反应缓冲液、10mM dNTP mix、重组RNase抑制剂和MMLV逆转录酶(Clontech,美国)，使终体积为20μL，随后在42℃反应1小时并在95℃反应5分钟以合成cDNA。用LiquiMix QM Premix,Magenta(Neurotics Inc,韩国)进行PCR反应，4μL cDNA为模板，19μL蒸馏水，以及1μL(25pmol/μL)引物设计为scFv区、重链可变区和轻链可变区(κ(kappa)和λ(lambda))分别为：[ScFv:SEQ ID NO:9(正向)，10(反向-κ)和11(反向-λ)；重链可变区：SEQ IDNO:12(正向-VH1)，13(正向-VH2)，14(正向-VH3)，15(正向-VH4)，16(正向-VH5)，17(正向-VH6)，18(正向-VH7)，19(反向)；轻链可变区κ链：SEQ ID NO：20(正向-VK1/3A)，21(正向-VK1/3B)，22(正向-VK2)，23(正向-VK4)，24(正向-VK5)，25(正向-VK6)，26(反向-JK-A)，27(反向-JK-B)和28(反向-JK-C)；轻链可变区λ链：SEQ IDNO：29(正向-VL1~3-A)，30(正向-VL1~3-B)，31(正向-VL4)，32(正向-VL5)，33(正向-VL6)，34(正向-VL7)，35(正向-VL8)，36(正向-VL9)，37(正向-VL10)，38(反向-JL-A)和39(反向-JL-B)。
PCR反应条件为：95℃5分钟，95℃1分钟，55℃2分钟，72℃2分钟，30个循环，最后72℃15分钟。
通过在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳来鉴定扩增的抗体DNA(图1)，采用Qiagen试剂盒(Qiagen,德国)进行纯化。如图1所示，获得了对应于重链和轻链可变区(κ和λ)的350bp DNA带。图1中，M是指分子量标记(size marker)，VH：重链可变区(1道：I型重链可变区；2道：II型重链可变区；3道：III型重链可变区；4道：VI型重链可变区；5道：V型重链可变区；6道:VI型重链可变区；以及7道：VII型重链可变区)，而VL是指轻链可变区(9道：1/3κ轻链可变区；10道：2κ轻链可变区；11道：4κ轻链可变区；12道：5κ轻链可变区；13道：6κ轻链可变区；15道：1~3λ轻链可变区；16道：4λ轻链可变区：17道：5λ轻链可变区；18道：6λ轻链可变区；19道：7λ轻链可变区；20道：8λ轻链可变区；21道：9λ轻链可变区；以及22道：10λ轻链可变区)。
实施例3：抗体DNA的限制性酶切
分别用限制性内切酶SfiI/BspEI和BspEI/NotI对实施例2制备的VH和VL(κ和λ)进行酶切，酶切片段从1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，采用Qiagen试剂盒纯化。
实施例4：抗体DNA的连接(Ligation)和库的制备
采用限制性内切酶SfiI/BspEI酶切噬菌体展示载体pKS4H(株式会社绿十字(Green cross Corp.)，韩国，见韩国专利No.0635370)，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，随后采用Qiagen试剂盒纯化。将40μgpKS4H与10μg实施例3制备的VH混合，向其中加入T4DNA连接酶(ligase)(New England BioLabs,美国)，随后在25℃反应过夜。连接混合物采用Qiagen试剂盒纯化，并通过电穿孔法转化到大肠杆菌(E.coli)XL1-blue(Stratagene,美国)中，转化体在100mL培养基中培养过夜，并分离质粒。该质粒被命名为“pKS4H-VH-ΔVL”。
用限制性内切酶BspEI/NotI对质粒pKS4H-VH-ΔVL进行酶切，并如上所述进行纯化。然后，将40μg pKS4H-VH-ΔVL质粒与10μg实施例3制备的VL PCR DNA以及T4DNA连接酶(New EnglandBioLabs,美国)混合，在25℃反应过夜。连接混合物采用Qiagen试剂盒纯化，并通过电穿孔法转化到大肠杆菌(E.coli)XL1-blue(Stratagene,美国)中。转化体在100mL含有羧苄青霉素和四环素的培养基中在37℃培养2小时。随后，如Engberg等人(Mol.Biotechnol.,6,287-310,1995)的报道，将M13辅助噬菌体(Stratagene,美国)接种到培养基中并培养16小时以制备噬菌体库。同时，从大肠杆菌分离质粒并命名为“pKS4H-VH-VL”，该质粒图谱在图2示出。
实施例5：筛选结合HBV表面抗原的抗体
结合HBV表面抗原的抗体通过改良的淘选技术(Engberg等,Mol.Biotechnol.,6,287-310,1996；以及Kim等,基因(Gene),241,19-25,2000)来筛选。具体地，将HBV表面抗原(株式会社绿十字(Green crossCorp.),韩国)用PBS稀释，并用稀释的抗原包被每个免疫管(NUNC,丹麦)。然后将实施例4制备的噬菌体库加入到包被的免疫管，并在37℃孵育2小时。采用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.0)洗提结合HBV的噬菌体。随后，用噬菌体感染大肠杆菌(E.coli)XL1-blue并加入辅助噬菌体。将该大肠杆菌孵育过夜并向其中加入PEG溶液(20%PEG8,000和15%NaCl)。然后，收集沉淀的噬菌体(噬菌体挽救(phagerescue))，并使噬菌体与HBV表面抗原包被的免疫管再次进行反应，上述过程重复4次。从该过程中筛选出三个结合HBV表面抗原的人抗体，并命名为HB48-33、HB48-35和HB48-59。图3说明了采用噬菌体展示库筛选人抗体的过程。
根据常规方法(Kim等,基因(Gene),241,19-25,2000)，使来自第4次淘选的各个菌落在2mL培养基中生长，通过IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside))处理以诱导抗体表达。通过ELISA法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酶联免疫吸附检测)采用包被HBV表面抗原的96孔板测定抗体的表达。
实施例6：筛选出的抗体的序列分析
将分泌实施例5筛选出的人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59的菌落在含有50μg/mL羧苄青霉素的10mLLB培养基中生长过夜，并采用Qiagen质粒微型试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,美国)从中分离质粒。将质粒用SfiI/NotI酶切，并在琼脂糖凝胶中电泳以鉴定抗体片段的插入。分析插入质粒中的scFv的DNA序列，用Genotech(Daejeon,韩国)的SEQ ID NO:40所示的测序引物p033分析scFv的核苷酸序列。
采用基于网络的程序(www.expasy.org:DNA-蛋白质翻译工具(DNA to Protein translate tool))将人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59的scFv的DNA序列翻译成氨基酸。翻译的氨基酸序列见图4。如图4所示，人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59具有以相同氨基酸序列表示的重链可变区和不同氨基酸序列表示的轻链可变区。
实施例7：表达载体的构建
为了将抗体片段转化为完整的免疫球蛋白，采用抗体表达载体pRC13和pKC12(见韩国专利No.523732；保藏号：KCLRF-BP-00054)。
重链表达载体pRC13是其中抗体的VH片段易于插入HindIII和ApaI位点的载体。如图5的示例，采用SEQ ID NO:41(正向)和42(反向)所示的引物在95℃1分钟、55℃2分钟、72℃2分钟的条件下，通过PCR扩增编码人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59的重链可变区的DNA，用HindIII/ApaI酶切，并插入至经相同限制性内切酶酶切的pRC13中。重组载体被命名为“HB48-33-重-pRC13”、“HB48-35-重-pRC13”或“HB48-59-重-pRC13”(见图5)。
同时，轻链表达载体pKC12是其中抗体的VL片段易于插入NheI和ApaI位点的载体。如图6、7和8的示例，采用SEQ ID NO:43(正向)和44(反向)所示的引物在95℃1分钟、55℃2分钟、72℃2分钟的条件下，通过PCR扩增编码人抗体HB48-35和HB48-59的κ轻链可变区的DNA，采用SEQ ID NO:43(正向)和45(反向)所示的引物在95℃1分钟、55℃2分钟、72℃2分钟的条件下，通过PCR扩增编码人抗体HB48-33的λ轻链可变区的DNA。用NheI/ApaI酶切扩增的DNA，并插入至经相同限制性内切酶酶切的pKC12中。重组载体被分别命名为“HB48-33-轻-pKC12”,“HB48-35-轻-pKC12”和“HB48-33-轻-pKC12”(见图6、7和8)。
实施例8：分泌抗体的动物细胞系的构建
在转染前，在5%CO2、37℃的孵育箱中，使2×105CHO(中国仓鼠卵巢)细胞在装有包括10%FBS(生命科技公司(LifeTechnologies)，美国)的α-MEM培养基(生命科技公司，美国)的T-25瓶(NUNC,丹麦)中生长24小时，直至达到50%融合(confluency)。然后，将30μg脂质体(lipofectin)(生命科技公司，美国)加入至1.5mL的opti-MEM(生命科技公司，美国)并在室温静置90分钟。同时将8μgHB48-33-重-pRC13&7μgHB48-33-轻-pKC12、8μgHB48-35-重-pRC13&7μgHB48-35-轻-pKC12和8μgHB48-59-重-pRC13&7μgHB48-59-轻-pKC12分别混合，加入到15mL opti-MEM中，然后室温静置90分钟。90分钟后，将含有脂质体的培养基与含有HB48-33-重-pRC13&HB48-33-轻-pKC12、HB48-35-重-pRC13&HB48-35-轻-pKC12和HB48-59-重-pRC13&HB48-59-轻-pKC12的培养基分别混合，室温孵育15分钟。反应过程中，将培养基从细胞中移除，将细胞用PBS冲洗三次用于转染。将反应混合物加入至洗过的细胞中并孵育6小时。6小时后，移除反应混合物，加入α-MEM培养基并孵育48小时。然后用胰蛋白酶(trypsin)(生命科技公司，美国)处理该细胞以脱离烧瓶，用α-MEM培养基稀释并在96-孔板(NUNC,丹麦)进行次培养。此时，α-MEM培养基不含核糖核苷和脱氧核糖核苷，但包含10%透析的FBS(生命科技公司，美国)和550μg/mL G418(Sigma,美国)。每两天用新鲜培养基替换该培养基。收集培养物上清液形成的菌落进行ELISA分析，将筛选的细胞转移至12孔板。当细胞在12孔板长好后，将细胞转移至6孔板，当细胞在6孔板也长好后，用甲氨蝶呤(MTX,Choongwae Pharma Corporation,韩国)处理细胞。MTX的初始浓度为20nM，然后依据细胞的适应能力增加到80nM，320nM和1μM。筛选出在1μM的浓度存活的并具有大量抗体分泌物的细胞系。筛选的细胞系用转瓶和无血清培养基在孵育箱中，以65rpm、5%CO2和37℃大量培养。在装有100mL无血清培养基的250mL烧瓶中培养108细胞，当细胞数量变成初始接种的两倍，以1,000rpm离心5分钟收集细胞。将收集的细胞再在装有200mL培养基的500mL烧瓶中培养，当细胞数量变成初始接种的两倍，以1,000rpm离心5分钟收集细胞，并转移到装有1L培养基的3L转瓶中。向其中加入丁酸钠(Aldrich,美国)直至终浓度为2mM，将细胞培养5天，从培养基中收集上清液。从转瓶收集的上清液中采用蛋白A-琼脂糖柱(protein A-agarose column)(Amersham Pharmacia Biotech,美国)纯化抗体并用SDS-PAGE分析。
如图9所示，观测到约50kDa的重链带和25kDa的轻链带，显示抗体已正确合成。
实施例9：抗体亲和力的测量
采用竞争性ELISA法(Kim等,Hybridoma,20,265-272,2001)测定实施例8得到的抗体对HBV表面抗原的亲和力，结果如图10所示，简要过程如下：
(1)抗体最佳浓度的确定
A.板的准备
将以PBS稀释的100μL 2μg/mL HBV表面抗原(株式会社绿十字(Green cross Corp.),韩国)加入酶标板(ELISA plate)的各孔并在4℃孵育过夜。板上的各孔均用PBST冲洗一次，向各孔中均加入300μL 1%BSA-PBS溶液，并在室温孵育1小时。
B.第一次反应
向板上的每个孔中加入100μL各纯化的抗体(0.5μg/mL)，在室温孵育2小时，并用PBST冲洗四次。
C.第二次反应
将在1%BSA-PBS中以1:5000稀释的100μL羊抗人IgG(Fab特异的)-过氧化物酶标记物(perxoidase conjugate)(Sigma)加入各孔，在室温孵育1小时，并用PBST冲洗四次。
D.底物反应
将100μL TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，微孔过氧化物底物系统(Microwell peroxidase substrate system)(KPL,MD,美国)加入到各孔中并在405nm处检测O.D.值。产生半最大结合值时的抗体浓度确定为最佳抗体浓度。
(2)竞争性ELISA
A.板的准备
将以PBS稀释的100μL 2μg/mL HBV表面抗原(株式会社绿十字，韩国)加入到酶标板的各孔中并在4℃孵育过夜。每个孔均用PBST冲洗一次，向每个孔中均加入300μL 1%BSA-PBS溶液，并在室温孵育1小时。
B.第一次反应
将2μg HBV表面抗原连续经两倍稀释，10μL该稀释的HBsAg加入到板的各孔中。然后，将90μL稀释至上述(1)中确定的最佳浓度的抗体加入到各孔中，在室温孵育2小时，并用PBST冲洗四次。
C.第二次反应
将在1%BSA-PBS中以1:5000稀释的100μL羊抗人IgG(Fab特异的)-过氧化物酶标记物(Sigma)加入到各孔中，在室温孵育1小时，并用PBST冲洗四次。
D.底物反应
将100μL TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，微孔过氧化物底物系统(KPL,MD,美国)加入到各孔中并在405nm处检测O.D.值。将抑制50%最大结合值(没有竞争EGFR存在的O.D.值)的HBsAg浓度确定为Kd。
如图10所示，在本发明的人抗体中，HB48-35的亲和力最高，而HB48-59和HB48-33的亲和力分别比HB48-35的低约1.3倍和4倍。
实施例10：采用急性乙型肝炎小鼠模型的体内效力试验
在C57BL6小鼠模型中比较HB48-33、HB48-35和HB48-59对HBsAg的中和能力，该小鼠模型通过高压水注射HBV DNA来表现乙型肝炎样症状。
20只四周龄、体重约20克的雌性C57BL6小鼠购自查尔斯河实验室(Charles Liver Laboratory)(MA,美国)，如表1所示，分成四组，每组5只。
<表1>
| 组 | 小鼠数量 | 试验材料和路线 | 剂量 |
| 对照组 | 5 | PBS，高压水注射 | 0.2mL |
| 实验组I | 5 | HB48-330.1mg，高压水注射 | 0.2mL |
| 实验组I | 5 | HB48-350.1mg，高压水注射 | 0.2mL |
| 实验组I | 5 | HB48-590.1mg，高压水注射 | 0.2mL |
将20μg通过将HBV DNA插入至pcDNA3.1(Invitrogen,美国)而构建的载体pHBV-MBRI(Shin等，病毒研究(Virus Research)119,146-153,2006;见图11)以重量体积浓度9.5%，0.3mL/min的速度经小鼠尾静脉注射所有小鼠以诱导急性肝炎。24小时后，将0.2mL表1所列的试验材料经小鼠尾静脉注射。在注射前(0小时)、注射后24小时和注射后48小时分离血清。分离的血清用山羊血清稀释10倍，然后采用Genedia HBsAg ELISA 3.0(Green Cross MS,韩国)测定HBsAg的血液浓度，结果见图12。如图12所示，在静脉注射PBS的对照组中，HBsAg的血液浓度维持最大值48小时。相较而言，在经0.1mg HB48-33(实验组I)、0.1mg HB48-35(实验组II)和0.1mgHB48-59(实验组III)处理的组中，在24小时到48小时，几乎没有检测到HBsAg的血液浓度。因此，证实本发明的抗体可非常有效地中和HBV表面抗原。
虽然以上述具体实施例描述了本发明，但应该认识到本领域技术人员可对发明做出各种修改和变化，其也应落入所附权利要求定义的本发明的范围内。
Claims (12)
1.一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的人抗体，包括：
a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的轻链可变区；
c)重链恒定区；以及
d)轻链恒定区。
2.一种编码具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗体重链可变区的DNA。
3.如权利要求2所述的DNA，其中所述DNA包括具有SEQ IDNO:5所示核苷酸序列的多聚核苷酸。
4.一种编码具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的抗体轻链可变区的DNA。
5.如权利要求4所述的DNA，其中所述DNA包括具有SEQ IDNO:6、7和8所示核苷酸序列中任何一个或多个的多聚核苷酸。
6.一种用于表达特异性结合HBV表面抗原的抗体的重链可变区的表达载体，其包括权利要求2所述的DNA。
7.如权利要求6所述的表达载体，其中所述载体为HB48-33-重-pRC13、HB48-35-重-pRC13或HB48-59-重-pRC13，其图谱如图5所示。
8.一种用于表达特异性结合HBV表面抗原的抗体的轻链可变区的表达载体，其包括权利要求4所述的DNA。
9.如权利要求8所述的表达载体，其中所述载体为图谱如图6所示的HB48-33-轻-pKC13、图谱如图7所示的HB48-35-轻-pKC13或图谱如图8所示的HB48-59-轻-pKC13。
10.一种用权利要求6所述表达载体和权利要求8所述表达载体转化的动物细胞系。
11.如权利要求10所述的动物细胞系，其中所述动物细胞系为CHO(中国仓鼠卵巢)、HEK 293或NSO细胞系。
12.一种预防或治疗乙型肝炎的药物组合物，其包括权利要求1所述的抗体。
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