CN102888375B - 具有分泌吲哚乙酸iaa功能的分枝杆菌、其制备方法及应用 - Google Patents
具有分泌吲哚乙酸iaa功能的分枝杆菌、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株能促进兰花组培苗生长及种子萌发的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，该分枝杆菌的制备方法以及该菌种在兰花种子萌发及组培苗生长中的应用。该株具有分泌IAA功能的分枝杆菌<i>Mycobacterium？avium</i>？？Mya-zh01保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国·武汉·武汉大学，邮编430074，保藏日期：2012-3-28，保藏编号：CCTCC？NO：M2012092；所述分枝杆菌<i>Mycobacterium？avium</i>？？Mya-zh01来源于蝴蝶兰花梗，经分离、纯化获得；本发明菌株可分泌吲哚乙酸（Indole-3-acetic？acid，IAA），具有促进兰花组培苗生长及种子萌发的能力，这对于生长较为缓慢的兰花组织培养及工厂化生产组培苗具有重要意义。本发明可应用于兰花栽培技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一株分枝杆菌，尤其涉及一株具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，该分枝杆菌能促进兰花组培苗生长及种子萌发。本发明还涉及了该株分枝杆菌的制备方法及其在兰花组培苗生长及种子萌发中的应用。
背景技术
兰科植物(Orchidaceae)俗称兰花（Orchid），是单子叶植物，多年生草本，地生、附生或腐生，是被子植物中最大的科之一。兰花的经济价值很高，其中多数种是著名观赏花卉和名贵药用植物。兰花的繁殖主要有分株、扦插、组织培养和种子无菌播种等。在自然条件下，种子不能正常萌发，根也不能满足植物体对水分和营养物质的需求，使兰科植物的人工栽培相当困难。组织快繁技术已应用于兰科植物，实现了兰科植物的工厂化育苗，但组培苗移栽成活率很低、生长缓慢、开花延迟、甚至不开花。
近年来，兰科植物内生菌的发现及其对兰花生长的促进作用为兰科植物人工栽培提供了新思路。最初的研究报道是在20世纪80年代，澳大利亚科学家从地生兰的根基部分离出内生细菌，由此解开了兰花内生细菌研究的序幕。国外科学家在对卷萼兜兰(Paphiopedilumapple-tonianum)和节茎石仙桃(Pholidotaarticulata)的相关细菌进行研究时发现，部分兰科植物的相关细菌具有不同程度的分泌IAA的能力，并能促进植物种子萌发。这一发现提醒我们，兰科植物与其微生态系统中的细菌之间存在着密切关系。国内对于兰花内生细菌的研究正处于起步阶段，2009～2010年分别有研究报道了从春兰根部分离得到可分泌IAA的内生细菌，这些内生细菌种类具有丰富的多样性。
分枝杆菌（Mycobacterium）主要包括结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌等。据报道分枝杆菌属中的某种菌TZh51对降解土壤中的多环芳烃(如菲、荧葸和芘)，对受污染的土壤有一定修复作用。另有分枝杆菌对废水和污泥中的苯系化合物、对汽车燃油中的噻吩硫有降解能力，由此揭示了某些分枝杆菌具有对人类有益的一面。该菌在植物生长方面的作用尚未见详细报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能促进兰花组培苗生长及种子萌发的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌。
本发明还提供了上述分枝杆菌的制备方法以及该菌种在兰花种子萌发及组培苗生长中的应用。
本发明具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌所采用的技术方案是：一种具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，其分类命名为分枝杆菌MycobacteriumaviumMya-zh01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年3月28日，保藏编号为CCTCCNO：M2012092。
该菌株具有以下特性：该菌株在固体培养基中呈橙黄色颗粒状，生长缓慢，在罗-琴培养基中需2～3周形成菌落，菌体形态呈棒杆状，无芽孢，好氧，革兰氏染色阳性，有荚膜。
所述分枝杆菌为鸟-胞内分枝杆菌。
所述分枝杆菌的16SrDNA序列如下，其序列编号为SEQIDNO：3，
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本发明具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌的制备方法所采用的技术方案是：所述分枝杆菌来源于蝴蝶兰花梗，经分离、纯化获得。
该方法包括以下步骤：
（1）分枝杆菌Mya-zh01的分离，剪取蝴蝶兰新鲜的花梗，用自来水冲洗掉花梗上的灰尘等杂物，在超净工作台上进行表面消毒，用无菌吸水纸吸干花梗表面的水分，用无菌的剪刀或手术刀剪切长为4cm的花梗小段，将花梗放置于MS培养基上，25℃条件下培养；1-2个月后，将花梗上长出的小芽切下，接种培养在罗-琴培养基上，1个月之后即可看到丛生芽或小苗周围出现橙黄色的菌株，即为Mya-zh01菌株；
（2）分枝杆菌Mya-zh01的纯化培养，将从蝴蝶兰外植体上分离出的Mya-zh01菌按照纯化菌株的常规方法，在罗-琴固体培养基上进行划线，置于30℃恒温培养箱培养1个月，挑取培养基上长出的单菌落，即可得到多株纯菌株。
本发明还给出了上述具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌在兰花种子萌发及组培苗生长中的应用。在该应用中，所述分枝杆菌Mya-zh01利用外源色氨酸，分泌植物生长素IAA。在兰花组培苗生长的应用如下：将分枝杆菌Mya-zh01接种于兰花组培苗基部，其预培养在MS培养基上，24-25℃条件下培养，兰花组培苗的生长良好，其中，兰花品种为蝴蝶兰或石斛兰；在兰花种子萌发中的应用如下：将兰花种子浸泡于分枝杆菌Mya-zh01菌液中一段时间，再播种于通用的兰花组织培养基上，24-25℃条件下培养，兰花种子萌发并出根长叶，所述兰花品种为蝴蝶兰或石斛兰。
本发明的有益效果是：本发明用于促进兰花组培苗生长时，将一定浓度的分枝杆菌Mya-zh01接种于组培苗基部，按兰花组织培养条件培养；用于促进兰花种子萌发时，将兰花种子经本领域常规方法消毒后，浸泡于适宜浓度的分枝杆菌Mya-zh01菌液一段时间，再播种于兰花种子萌发培养基（MS培养基）中，按照兰花组织培养适宜条件进行培养，本发明菌株可有效的促进兰花组培苗生长及种子萌发，这对于生长较为缓慢的兰花组织培养及工厂化生产组培苗具有重要意义。
附图说明
图1是分枝杆菌Mya-zh01革兰氏染色的显微镜照片；
图2是分枝杆菌Mya-zh01在罗-琴培养基上的生长情况；
图3是实施例三中分枝杆菌Mya-zh01在不同培养基中分泌IAA能力情况对比表；
图4是分枝杆菌Mya-zh01对蝴蝶兰组培苗生长的影响对比图，其中a图为未接种分枝杆菌Mya-zh01的对照苗生长图；b图为接种了分枝杆菌Mya-zh01（细菌浓度108cfu／mL）的组培苗生长图；c图为接种了10倍稀释液（细菌浓度107cfu／mL）的分枝杆菌Mya-zh01菌液的组培苗的生长图；d图为接种了102倍稀释液（细菌浓度106cfu／mL）的分枝杆菌Mya-zh01菌液的组培苗的生长图；e图为接种了104倍稀释液（细菌浓度104cfu／mL）的分枝杆菌Mya-zh01菌液的组培苗的生长图。
具体实施方式
本发明具体公开了一种具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌，该菌株在固体培养基中呈橙黄色颗粒状，生长缓慢，在罗-琴培养基中需2-3周形成菌落。菌体形态呈棒杆状，无芽孢，好氧，革兰氏染色阳性（染色显微镜照片见图1），有荚膜。其生理生化特征如表1所示。
表1：分枝杆菌Mya-zh01的生理生化特征
附注：“+”表示能利用或反应阳性；“”表示不能利用或反应阴性。
所述分枝杆菌Mya-zh01（CCTCCM2012092）的16SrDNA序列如序列编号为SEQIDNO：3所示。
本发明所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌Mya-zh01在兰花组培苗生长及种子萌发方面的应用有重要的意义。下面，结合具体实施例来对所述分枝杆菌Mya-zh01的分离、培养、制备菌液及具体应用作详细的介绍。
实施例一：分枝杆菌Mya-zh01的分离及纯化培养
1.Mya-zh01的分离
分枝杆菌Mya-zh01是从蝴蝶兰（商品名：巨宝红玫瑰，Dtps.JiuhbaoRedRose）中分离和纯化得到的一株革兰氏阳性菌。具体步骤如下：
在兰花温室剪取蝴蝶兰新鲜的花梗，带回实验室，用自来水冲洗掉花梗上的灰尘等杂物。在超净工作台上进行表面消毒，先用75%酒精浸泡花梗1min，捞出花梗用无菌水清洗2次，再用10%次氯酸钠溶液消毒15-20min，用无菌水清洗5-6次。用无菌吸水纸吸干花梗表面的水分，用无菌的剪刀或手术刀剪切为长4cm左右的花梗小段。将花梗放置于MS培养基（培养基构成详见表2）上，25℃条件下培养。
1-2个月后，将花梗上长出的小芽切下，接种培养在罗-琴培养基上，1个月左右即可看到丛生芽或小苗周围出现橙黄色的Mya-zh01菌株。
表2：MS培养基
2、Mya-zh01的纯化培养
将从蝴蝶兰外植体上分离出的Mya-zh01菌按照纯化菌株的常规方法，在罗-琴固体培养基上进行划线，置于30℃恒温培养箱培养1个月左右，挑取培养基上长出的单菌落，即可得到多株纯菌株。制备该菌的菌液时，挑取纯化的Mya-zh01单菌落，接种于罗-琴+椰汁的液体培养基中，置于30℃振荡培养箱培养即可。
培养基构成如下：
罗-琴：磷酸二氢钾2.4g；硫酸镁0.24g；枸橼酸镁(或枸橼酸钠)0.6g；天门冬素3.6g；2％孔雀绿水溶液20ml；蒸馏水600ml；马铃薯淀粉30g；甘油12ml；新鲜鸡蛋液1000ml。
罗-琴+椰汁：磷酸二氢钾2.4g；硫酸镁0.24g；枸橼酸镁(或枸橼酸钠)0.6g；天门冬素3.6g；2％孔雀绿水溶液20ml；蒸馏水600ml；马铃薯淀粉30g；甘油12ml；椰汁1000ml。
实施例二：Mya-zh01的16SrDNA鉴定
采用煮沸法（从平板中直接挑取单菌落，加入100μL无菌重蒸H2O中，旋涡混匀后，沸水浴2min，12000r/min离心5min，取上清液）提取Mya-zh0116SrDNA，用于PCR扩增，正向引物和反向引物的序列分别如下：
正向引物为27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，其中M=CorA，序列编号SEQIDNO：1；
反向引物为1492R：5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3',其中Y=CorT，序列编号SEQIDNO：2。
PCR反应程序设定为：95℃预变性5min；94℃变性1min，41.2℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序（上海英骏）。
通过Blast分析发现，Mya-zh01的16SrDNA与鸟-胞内分枝杆菌（Mycobacteriumavium）同源性高达99%，结合该菌的生理生化特性，确定Mya-zh01菌为鸟-胞内分枝杆菌（Mycobacteriumavium）。
实施例三：分枝杆菌Mya-zh01分泌IAA的检测
将分枝杆菌Mya-zh01接种于罗-琴+椰汁液体培养基中进行培养，在液体培养基中加入色氨酸，30℃培养42天时，该菌分泌IAA的能力最强。具体实施步骤如下：
将分枝杆菌Mya-zh01分别接种于罗-琴+椰汁、罗-琴+椰汁+色氨酸的液体培养基中，在30℃恒温培养箱培养，一定时间后取出测菌液浓度（OD600值），以及菌液中IAA含量（530nm处），结果如图3和表3所示。
表3分枝杆菌Mya-zh01分泌IAA的情况
表3结果显示，分枝杆菌Mya-zh01在罗-琴+椰汁+色氨酸的液体培养基中培养时，随着时间的增加，IAA含量随着增加，在培养至42天时菌液中IAA含量最高，培养至47天反而下降了。可见，Mya-zh01在添加了色氨酸的罗-琴+椰汁培养到42天时产生IAA能力最强。
实施例四：分枝杆菌Mya-zh01对蝴蝶兰组培苗生长的作用
以蝴蝶兰组培苗为材料，实施接种不同浓度的分枝杆菌Mya-zh01菌液对蝴蝶兰组培苗生长的影响，结果发现该菌能较好的促进蝴蝶兰组培苗的生长，且菌液稀释102倍后促生效果最佳。具体实施步骤如下：
挑取生长较为一致（株高约2cm、带2-3片叶、未长根）的蝴蝶兰组培苗，培养于MS培养基（培养基配方同表2）上，在25℃条件下培养备用。挑取新鲜的分枝杆菌Mya-zh01菌落，接种于罗-琴+椰汁液体培养基，在30℃恒温培养箱培养至菌液OD600为1.0（细菌浓度108cfu／mL），分别制备用于侵染蝴蝶兰组培苗的菌液：原液（细菌浓度108cfu／mL）、10倍稀释液（细菌浓度107cfu／mL）、102倍稀释液（细菌浓度106cfu／mL）、104倍稀释液（细菌浓度104cfu／mL），备用。分别移取50ul上述不同浓度的菌液，接种于蝴蝶兰组培苗（株高约2cm、带2-3片叶、未长根）基部，不接种菌液的蝴蝶兰组培苗作为对照（CK），置于25℃的智能人工气候箱进行培养，培养2个月左右观察、记录组培苗生长状况。
表4Mya-zh01对蝴蝶兰组培苗生长的影响
表4结果表明，与对照相比，接种了分枝杆菌Mya-zh01的组培苗平均株高增加明显（增高1.5-2.8cm），叶片、根的生长情况整体较好。经102倍稀释液的Mya-zh01菌剂处理，蝴蝶兰组培苗的平均株高、叶片数、叶长、根长等生长指标表现最好，较低浓度或较高浓度的菌液处理组培苗效果次之，说明适宜浓度的分枝杆菌Mya-zh01对蝴蝶兰组培苗的生长有较好的促进作用。
实施例五：分枝杆菌Mya-zh01对石斛兰种子萌发的作用
以石斛兰种子为材料，实施Mya-zh01对石斛兰种子萌发的影响，结果发现，Mya-zh01菌液对石斛兰种子的萌发有较好的促进作用。具体实施步骤如下：
挑取Mya-zh01新鲜单菌落，接种于罗-琴+椰汁的液体培养基中培养至菌液浓度OD600为1（细菌浓度108cfu／mL），并制成102倍稀释液（细菌浓度106cfu／mL）备用。将成熟未开裂的石斛兰果实，清洗干净后，用75％酒精表面消毒1min，无菌水冲洗一次，再用10％（v/v）次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，无菌水冲洗3～4次。取出果实，用无菌吸水纸吸干，无菌操作切开果实，将种子取出浸泡于上述新鲜制备的Mya-zh01菌液（102倍稀释液）中，10分钟后将种子捞出，播种于石斛兰种子萌发培养基（MS基本培养基，附加20g/L蔗糖，1g/L活性炭，8g/L琼脂粉，pH5.4），未经Mya-zh01菌液浸泡的种子作为空白对照（CK），置于24℃的智能人工气候箱进行培养，定期观察记录石斛兰种子萌发和生长状况。
表5Mya-zh01对石斛兰种子萌发的影响
注：0-4分别表示石斛兰种子生长达到的不同生长阶段，具体为：0:种子未变绿未膨大；1：种子变绿膨大；2：长出第1片叶片；3：长出第2、3片叶；4：长根。
表5结果表明，种子培养至30天仍未膨大变绿，至90天时，仍未见长出根，整体生长较为缓慢。与对照相比，经Mya-zh01菌液浸泡的种子播种在同样的MS培养基上，培养至30天即可膨大变绿，小部分种子已长出1片叶；培养至60天种子均长出叶片，部分种子已出根；培养90天后全部出根。
综上所述，本发明可应用于兰花栽培技术领域。
SEQUENCELISTING
<110>珠海市农业科学研究中心
<120>具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌、其制备方法及应用
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
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<213>人工序列
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<223>分枝杆菌Mya-zh01的16SrDNA序列
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gtcggtaacacccgaagccagtggcctaacccttgggagggagctgtcgaaggtgggatc1440
ggcgattgggacg1453
Claims (5)
1.一种具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌Mya-zh01，其分类命名为分枝杆菌Mycobacteriumavium，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年3月28日，保藏编号为CCTCCNO：M2012092。
2.一种如权利要求1所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝杆菌Mya-zh01在兰花种子萌发及组培苗生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述分枝杆菌Mya-zh01利用外源色氨酸，分泌植物生长素IAA。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用如下：将分枝杆菌Mya-zh01接种于兰花组培苗基部，其预培养在MS培养基上，24-25℃条件下培养，兰花组培苗的生长良好，其中，兰花品种为蝴蝶兰或石斛兰。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用如下：将兰花种子浸泡于分枝杆菌Mya-zh01菌液中10分钟，再播种于兰花组织培养基上，24-25℃条件下培养，兰花种子萌发并出根长叶，其中，兰花品种为蝴蝶兰或石斛兰；兰花组织培养基为MS基本培养基，附加20g/L蔗糖，1g/L活性炭，8g/L琼脂粉，pH为5.4。
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| 春兰根中可分泌吲哚乙酸的内生细菌多样性;刘琳等;《生物多样性》;20101231;第18卷(第2期);195-200 * |
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