CN102888351B - 一种灵菌红素高产菌株及其生产方法 - Google Patents
一种灵菌红素高产菌株及其生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种灵菌红素高产菌株及其生产方法。本发明所述灵菌红素高产菌株名称为Serratiamarcescenszl3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M201209，保藏日期为2012年4月4日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学。本发明灵菌红素高产菌株具有生长速度快、灵菌红素稳定合成且表达量高的优点，在50L发酵罐上以1%-5%花生粉培养基25-30℃培养30-40h，灵菌红素的产量达6-8g/L，纯度大于98%。本发明提供的分批发酵、流加发酵工艺参数、以及优化的搅拌浸提、层析精制纯化工艺可以指导工业规模灵菌红素的生产，可以用于生物制药以及医药化工领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种灵菌红素高产菌株及其生产方法。
背景技术
灵菌红素族（Prodigiosins）是一类具有甲氧基吡咯环结构的天然红色素的总称，可由多种放线菌和细菌产生。包括灵菌红素（Prodigiosin）及其相似物和衍生物，如Prodigiosin25-C，metacyclo Prodigiosin，Prodigiosen，cycloProdigiosin，desmethoxy prodigiosin和undecyl prodigiosin等。灵菌红素及其衍生物能用于纺织品的染色、杀灭引起赤潮和水华的藻类，还具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性。目前人们最感兴趣的是此物质所具有的免疫抑制活性和引起的肿瘤细胞凋亡作用。如2007年美国Gemin X制药公司开发的灵菌红素类抗癌专利药物GX15-070已经进入临床II期研究，该小分子药物有望成为新型诱导凋亡的药物。灵菌红素类似物或衍生物在医药工业中有广泛的应用前景，正成为抗肿瘤、免疫抑制类药物研究的热点。
20世纪60年代，Rapoport等建立了Prodigiosin化学合成的全过程，1996年Alessio等提出了新的制备方法，但由于合成过程复杂、成本高，大规模化学合成Prodigiosin一直未能实施。研究人员围绕灵菌红素的微生物代谢展开了一系列的研究。尽管灵菌红素具有多种生物活性，但是其体内细胞毒性和药理活性仍然缺乏有效数据。目前制约灵菌红素进一步开发利用的是缺少适合工业化生产的灵菌红素高产菌株和制备方法。已发现的产灵菌红素微生物大多存在发酵时间长（主发酵时间2-3 d），产量较低（大多低于3 g/L）、色素产生不稳定等原因。使得后续的化学修饰、药物制剂、药理活性等研究存在瓶颈。Wei等通过改进培养基，并添加脯氨酸作为前体物质，使十一烷基灵菌红素(undecyl prodigiosin)产量可达到2.5 g/L。Cang等从土壤中获得了一株以乙醇为唯一碳源的沙雷氏菌，灵菌红素产量达2.95 g/L。Giri等在摇瓶培养基中添加花生粉，灵菌红素达到目前报道的最高产量38.75 g/L，但是并没有对提取物中灵菌红素的纯度进行说明。
作为灵菌红素的生产菌株，必须有稳定的色素合成能力。我们曾经采用LiCL/DES结合紫外线育种的方法进一步提高灵菌红素的产量。但是经多轮筛选的高产菌株，经过10代以上的培养，发现其色素合成能力不稳定或下降。灵菌红素合成的稳定性也是筛选灵菌红素高产工业微生物的关键。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供从焦化废水中筛选灵菌红素高产菌株Serratia marcescens ZL3的方法，以及使用该菌株生产高纯度灵菌红素的方法。菌株Serratia marcescens ZL3在30-40 h的培养时间内，灵菌红素的产量可以达到6-8 g/L。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种灵菌红素高产菌株，名称为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens） zl3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012096，保藏日期为2012年4月4日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学。
本发明灵菌红素高产菌株的生产方法包括如下步骤：
（1）取5 mL污水接种于45 mL含苯酚富集培养基中，30℃、130 r/min培养72 h。取经过驯化的菌液各1mL涂布在含苯酚的无机盐培养基平板上30℃培养72 h，苯酚终浓度分别为100 mg/L, 300 mg/L, 500 mg/L, 700 mg/L, 1000 mg/L。挑取生长情况良好的菌落在富集培养基平板上划线分离，30℃培养72 h ，在含苯酚1000 mg/L的无机盐培养基上进一步培养筛选能产生红色素的菌落；
所述富集培养基的组分为(g/L)：胰蛋白胨 10、酵母浸出物 5、NaCl 7.5、苯酚100 mg 、pH 7. 0；
所述无机盐培养基的组分为(g/L):硝酸铵1、磷酸二氢钠 0. 5、磷酸氢二钾 0. 5、硫酸镁 0.2、氯化钙 0.1、氯化钠0.2、pH 7.0；
相应的固体培养基加入2%的琼脂粉，含苯酚培养基则加入适量苯酚。
（2）在富集培养基上培养24～72 h观察划线平板，菌落由起初的淡红色逐渐变为鲜红色，表面光滑 ，粘稠状。
本发明灵菌红素高产菌株生产灵菌红素的方法包括如下步骤：
（1）一级摇瓶培养（250 mL三角瓶）：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L、装液量50 mL，摇速130 rpm，pH为6，30℃培养20-24 h；
（2）二级摇瓶培养（2 L三角瓶）：1%-5%花生粉培养基，装液量50 mL，摇速130 rpm，pH为6，30℃培养20-24 h；
（3）三级发酵培养（50 L发酵罐）：1%-5%花生粉培养基，装料系数0.6，搅拌转速200 r/min，溶氧20%-40%，pH为6,5%接种量，25-30℃培养30-40 h。灵菌红素的产量达6-8 g/L；
（4）纯化方法：发酵液离心后收集菌体，按湿菌体质量的5-20倍加入酸性无水乙醇，搅拌提取，提取液经0.5 μm滤膜过滤后，旋转蒸发浓缩得到色素粗品，回收溶剂，色素粗品用乙醇复溶，用石油醚：乙酸乙酯= 1：1-10:1进行硅胶柱层析洗脱，收集橙色组分，旋转蒸发浓缩后用乙醇复溶，经Sephadex LH-20柱层析进一步纯化，收集535 nm洗脱峰，浓缩后干燥获得纯度>98%灵菌红素产品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）灵菌红素产生微生物的生产特性，包括生长速度、色素合成稳定性以及色素的表达量是选择灵菌红素生产工业微生物的关键因素。现有产生灵菌红素微生物大都存在生长时间长（主发酵时间2d以上）、表达量低（大多低于3 g/L）、色素合成稳定性不明确等问题。我们采用梯度苯酚无机盐培养基，从焦化废水中筛选的粘质沙雷氏菌有很好的生产特性。主要表现在：
a 色素合成稳定。将粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ZL3在LB固体培养基上连续传代20次，观察菌落形态、细胞形态并测定色素合成能力。经20代传代培养，粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ZL3均能稳定的合成红色素。转接到LB液体培养基，培养24 h后浊度法测定红色素含量不发生明显变化。而我们采用LiCL/DES结合紫外线育种的方法筛选的多株灵菌红素高产粘质沙雷氏菌，经过10代以上的培养，发现其色素合成能力不稳定或下降。
b 生长速度快、灵菌红素表达量高。在50 L机械搅拌发酵罐中，5-10 h菌体浓度可以达到对数中期，经过2-3d培养（主发酵时间30-40 h），灵菌红素的产量达6-8 g/L。培养条件：1%-5%花生粉培养基，装料系数0.6，搅拌转速200 r/min，溶氧20%-40%，pH为6,5%接种量，25-30℃培养。
（2）基于摇瓶水平的研究和薄层层析等制备方法对于实现灵菌红素的应用是必不可少的,但是要指导工业化的生产或者中试研究,一般需要达到30-50 L的发酵规模。我们在50 L发酵罐中进行了分批培养、流加培养等多种发酵培养方式的研究，获得的工艺参数能够指导工业规模的发酵生产。
（3）本发明在提取灵菌红素时，采用乙醇代替了常用的甲醇，减少了对环境和操作人员的不利影响。采用搅拌提取方式在最大提取色素的同时，可以减少超声破碎、细胞匀浆等方式增加的设备成本，并减少能耗和噪音。通过硅胶柱层析进行初步分离，除去大部分的杂质，再通过制备型HPLC进行纯化，可以获得纯度>98%的灵菌红素。所获产品可以用于药理活性、药物制剂、化学修饰等的研究。
（4）目前制约灵菌红素产业化应用的主要瓶颈是缺少适合于工业规模生产的微生物以及灵菌红素的制备方法。本发明提供的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens zl3以及灵菌红素生产方法，为工业规模的灵菌红素生产提供了有效的解决方案。
附图说明
图1为粘质沙雷氏菌的划线生长平板；
图2为粘质沙雷氏菌的显微形态；
图3为灵菌红素的色谱洗脱曲线；
图4为灵菌红素的紫外可见光吸收光谱（PDA检测器）；
图5为灵菌红素的红外吸收光谱；
图6为灵菌红素的质谱碎片。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
菌株的分离鉴定
1)富集培养基(g/L) : 胰蛋白胨10、酵母浸出物5、NaCl 7.5、苯酚100 mg 、pH 7. 0; 无机盐培养基(g/L): 硝酸铵1、磷酸二氢钠0. 5、磷酸氢二钾0. 5、硫酸镁0.2、氯化钙0.1、氯化钠0.2、pH 7.0。相应的固体培养基加入2%的琼脂粉，含苯酚培养基则加入适量的苯酚。
2)取5 mL污水接种于45 mL含苯酚富集培养基中，30℃、130 r/min培养72 h。取经过驯化的菌液各1mL涂布在含苯酚的无机盐培养基平板上30℃培养72 h，苯酚终浓度分别为100 mg/L, 300 mg/L, 500 mg/L, 700 mg/L, 1000 mg/L。挑取生长情况良好的菌落在富集培养基平板上划线分离，30℃培养72 h ，在含苯酚1000 mg/L的无机盐培养基上进一步培养筛选能产生红色素的菌落。
3)在富集培养基上培养24～72 h观察划线平板，菌落由起初的淡红色逐渐变为鲜红色，表面光滑 ，粘稠状（图1）。
4）采用100×10的油镜观察，菌体细胞呈短杆状，能快速运动（附图2）。革兰氏染色阴性。透射电镜观察菌体细胞大小约（0.9-1.0）μm～（0.6-1.0）μm，无芽孢、无荚膜、周生鞭毛。
5）菌株的生理生化特征
| 测试指标 | S.marcescens | 测试指标 | S.marcescens |
| 革兰氏染色 | - | 运动性 | + |
| 氧化酶 | - | 葡萄糖 | + |
| 乳糖 | - | 海藻糖 | + |
| 尿素 | - | 蔗糖 | + |
| 麦芽糖 | - | 纤维素 | + |
| 木糖 | - | β-半乳糖苷酶 | + |
| 鼠李糖 | - | 赖氨酸脱羧酶 | + |
| 淀粉 | - | 鸟氨酸脱羧酶 | + |
| 葡萄糖产气 | - | 葡萄糖产酸 | + |
“+”代表阳性，“-”代表阴性。
6）采用CTAB法提取细菌基因组DNA，细菌通用引物27f和1492r 扩增16S rDNA 序列并测序，提交到Genebank获得登录号为FJ715491。利用BLAST软件进行16S rRNA序列同源性比较，菌株与数据库中的Serratia sp. BSFC16（Accession No. FJ495145）及Serratia sp. PSB9（Accession No. FJ360761）等具有约99％的同源性。综合上述信息，该菌株鉴定为沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌。
7）菌株合成灵菌红素的稳定性
将粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ZL3在LB固体培养基上连续传代20次，观察菌落形态、细胞形态并测定色素合成能力。经20代传代培养，粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ZL3均能稳定的合成红色素。转接到LB液体培养基，培养24 h后浊度法测定红色素含量不发生明显变化。
实施例2 分批发酵方式
一级摇瓶培养（250 mL三角瓶）：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L、装液量50 mL，摇速130 rpm，pH为6，30℃培养20-24 h。
二级摇瓶培养（2 L三角瓶）：1%-5%花生粉培养基，装液量50 mL，摇速130 rpm，pH为6，30℃培养20-24 h。
三级发酵培养（50 L发酵罐）：1%-5%花生粉培养基，装料系数0.6，搅拌转速200 r/min，溶氧20%-40%，pH为6,5%接种量，25-30℃培养30-40 h。灵菌红素的产量达6-8 g/L。
实施例3 分批发酵方式
（1）斜面种子：取试管斜面或-80℃冻存的甘油种，接种到LB试管斜面，于30℃生化培养箱培养20-24 h。
（2）按5%接种量，采用三级培养方式进行放大培养。
一级摇瓶培养（250 mL三角瓶）：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L、装液量50 mL，摇速130 rpm，pH为6，30℃培养20-24 h。
二级摇瓶培养（2 L三角瓶）：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L、甘油5 g/L、装液量50 mL，摇速130 rpm，pH为6，30℃培养20-24 h。
三级发酵培养（50 L发酵罐）：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L、甘油10 g/L，装料系数0.7，搅拌转速200-300 r/min，溶氧20%-40%，pH为6,5%接种量，30℃培养40-50 h。灵菌红素的产量达3-5 g/L。
实施例4 流加发酵方式
（1）斜面种子：取试管斜面或-80℃冻存的甘油种，接种到LB试管斜面，于30℃生化培养箱培养20-24 h。
（2）按5%接种量，采用三级培养方式进行放大培养。
一级摇瓶培养（250 mL三角瓶）：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L、装液量50 mL，摇速130 rpm，pH为6，30℃培养20-24 h。
二级摇瓶培养（2 L三角瓶）：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L、甘油5 g/L、装液量50 mL，摇速130 rpm，pH为6，30℃培养20-24 h。
三级发酵培养（50 L发酵罐）：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L，装料系数0.7，搅拌转速200-300 r/min，溶氧20%-40%，pH为6,5%接种量，30℃培养40-50 h。从30 h开始流加甘油10 g/L。灵菌红素的产量达4-6 g/L。
实施例5 制备方法
发酵液离心后收集菌体，按湿菌体质量的5-20倍加入酸性无水乙醇，搅拌提取，提取液经0.5 μm滤膜过滤后，旋转蒸发浓缩得到色素粗品，回收溶剂。色素粗品用乙醇复溶，用石油醚：乙酸乙酯= 1：1-10:1进行硅胶柱层析洗脱，收集535 nm洗脱峰（橙色组分），旋转蒸发浓缩后用乙醇复溶，经Sephadex LH-20柱层析进一步纯化，收集535 nm洗脱峰，浓缩后干燥获得灵菌红素纯品。
实施例6 制备方法
发酵液离心后收集菌体，按湿菌体质量的5-20倍加入酸性无水乙醇，搅拌提取，提取液经0.5 μm滤膜过滤后，旋转蒸发浓缩得到色素粗品，回收溶剂。色素粗品用乙醇复溶，用石油醚：乙酸乙酯= 1：1-10:1进行硅胶柱层析洗脱，收集535 nm洗脱峰，旋转蒸发浓缩后用乙醇复溶，0.5 μm滤膜过滤，C18 反相半制备HPLC 纯化，收集535 nm洗脱峰。减压加热干燥或者冷冻干燥获得纯度>98%的灵菌红素。
实施例7 产品数据
UV:535 nm(酸性甲醇溶液) ，470 nm(碱性甲醇溶液) 。
FT-IR(KBr)：3416,2924,2853,1740,1618,1464,1382,1261,1096 cm-1。
MS-ES+:m/z 分子离子峰324.2，特征碎片79,149,183,279。
Claims (1)
1.一种粘质沙雷氏菌ZL3（Serratia marcescens ZL3）菌株高产灵菌红素的生产方法，所述粘质沙雷氏菌ZL3菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 201209，保藏日期为2012年4月4日，保藏地点为中国，武汉，武汉大学，其特征在于包括如下步骤：
（1）将所述菌株涂布于含苯酚1000 mg/L的无机盐培养基中，培养24~72 h挑取生长情况良好的红色菌落；所述无机盐培养基的组分为1g/L硝酸铵、0. 5g/L磷酸二氢钠、0. 5g/L磷酸氢二钾、0.2g/L硫酸镁、0.1g/L氯化钙、0.2g/L氯化钠、pH 7.0、2%琼脂粉；
（2）一级摇瓶培养：蔗糖19 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸镁2.4 g/L、装液量50 mL，摇速130 r/min，pH为6，30℃培养20-24 h；
（3）二级摇瓶培养：1%-5%花生粉培养基，装液量50 mL，摇速130 r/min，pH为6，30℃培养20-24 h；
（4）三级发酵培养：1%-5%花生粉培养基，装料系数0.6，搅拌转速200 r/min，溶氧20%-40%，pH为6，5%接种量，25-30℃培养30-40 h；
（5）纯化方法：发酵液离心后收集菌体，按湿菌体质量的5-20倍加入酸性无水乙醇，搅拌提取，提取液经0.5 μm滤膜过滤后，旋转蒸发浓缩得到色素粗品，回收溶剂，色素粗品用乙醇复溶，用石油醚：乙酸乙酯= 1：1-10：1进行硅胶柱层析洗脱，收集橙色组分，旋转蒸发浓缩后用乙醇复溶，经Sephadex LH-20柱层析进一步纯化，收集535 nm洗脱峰，浓缩后干燥获得纯度>98%灵菌红素产品。
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