CN102884981B - 两面针组织培养培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两面针组织培养培养基，该培养基包括继代培养基和生根培养基。在H培养基的基础上进行了改良，调整了大量元素用量，增加了七水硫酸亚铁的含量，本发明更适合不同产地的两面针和两面针单株组织培养。继代周期20～25天，增殖系数4～6，继代苗生长良好，小苗粗壮、整齐，叶色浓绿、无黄化苗，得苗率高。生根苗出根率可达90%、出根快，温度25±2℃时，平均出根时间为10～15天，根系发达，出根量多平均有3～5条根，小苗木质化好，移栽成活率达90%以上，瓶苗出圃时间平均为30天左右。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养基，尤其涉及一种两面针组织培养培养基。
背景技术
两面针（Zanthoxylum nitidum），为芸香科植物，因其叶片中脉两面均有小钩刺，故称“两面针”，又名两背针、钉板刺（福州）、入山虎、麻药藤、入地金牛、叶下穿针、红倒钩筋、大叶描爪簕(广东、广西)。两面针喜生长在温热、阳光充足的地方，山地、丘陵、平地的疏林、灌丛中、荒山草坡的有刺灌丛中较常见，主要分布在我国广东、广西、福建、海南、云南、贵州及台湾等地。两面针是我国较常用的一种中药材，根茎、叶、果皮均可入药，有活血、散瘀、镇痛、消肿等功效。现代药用化学研究表明：两面针的根茎含有生物碱oxynitidine，N-demethoxychelerythrone，dihydronitidine，skimmianine，6-ethoxychelerythrine，α-allocryptopine，nitidine等。局部应用时，对神经末梢有麻醉作用，且麻醉效果稳定，无不良反应，也无肝肾损害等，是一种具有广阔药用前景的中药材，因此开展两面针的基础研究，具有十分重要的意义。
目前，国内已有一些两面针组培技术初步研究报道，在培养基的选择上一般采用基本培养基（MS）和生长调节剂的结合，但是两面针种源产地不同，组织培养条件也不同，即使是同一产地的两面针种源，选用不同单株作外植体，组织培养条件也不同。MS培养基适用于部分产地两面针组织培养，部分产地两面针种源和两面针单株用MS培养基进行继代培养，先叶片变黄、变白，继而茎变黄、变白，芽苗死亡，无法继续进行继代培养。如果不同产地两面针种源、或两面针单株使用一种培养基，生产操作难度大，成本高，不利于规模化生产。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种两面针组织培养培养基，该培养基包括继代培养基和生根培养基，其中：
每升（L）继代培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、乙二胺四乙酸二钠56.0mg/L、七水硫酸亚铁41.7mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：6-苄基腺嘌呤0.4～1.0mg/L、萘乙酸0.2～0.5mg/L；
余量为蒸馏水。
每升（L）生根培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、七水硫酸亚铁33.4mg/L、乙二胺四乙酸二钠44.8mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：生根粉ABT6号0.4～0.8mg/L、萘乙酸0.2～0.4mg/L；
余量为蒸馏水。
本发明两面针组织培养培养基中的继代、生根培养基的配制方法为：
1母液配制
1.1为便于取样，宜先配制各种母液，分为大量元素母液、微量元素母液、有机物母液和各种植物生长调节剂母液。蔗糖、琼脂不宜配成母液，需要时直接称样；
1.2大量元素母液和有机物母液的各组分浓度应与培养基的组分浓度成10～100的倍数关系，微量元素母液成200～500的倍数关系，而植物生长调节试剂母液的浓度宜配成1mg/ml；
1.3母液选用无菌的蒸馏水、去离子水或超纯水配制，大量生产时用煮沸过的水；
1.4配制大量元素母液时，每个组分应单独溶解，后按氮、钙、镁、磷的顺序逐个混合，否则容易引起沉淀；
1.5微量元素母液含有见光易分解的碘化钾和易氧化的硫酸亚铁，应用棕色瓶保存；
1.6植物生长调节剂母液和有机物母液应置于冰箱中保存；
1.7母液配制后应及时使用，贮存时间不宜超过1个月；
1.8发现母液有沉淀，或有微生物生长，或有藻类生长，应废弃不用。
2培养基配制
2.1依照培养基配方，按比例量取母液，加水定容后转至不锈钢锅等容器内；
2.2加入适量凝固剂和糖，并搅拌使凝固剂充分分散，糖充分溶解；
2.3加热至刚沸腾，使凝固剂完全溶解。若采用边分装边搅拌的自动化仪器配制培养基时，可省去加热使凝固剂溶解的过程；
2.4用1.0N盐酸或1.0N氢氧化钠调整至适当的酸碱度；
2.5尽快将培养基分装到培养器皿内，以免培养基凝固或变稠而难以分装；
2.6分装培养基时应避免培养基粘到瓶口，一旦粘上，应擦除干净，否则容易引起污染。
3培养基消毒
3.1将分装好的培养基放入高压消毒锅内消毒；
3.2加热初期，当消毒锅消毒室的气压达0.05Mpa时，打开冷凝阀，排尽消毒室内冷空气；
3.3当消毒室内气压达到0.11Mpa、温度达121℃时，开始计时，保持温度与压力消毒15～20分钟；
3.4关闭加热电源开关，按慢排气方式排放热气，待消毒室内的气压降至大气压时打开消毒锅盖或门，取出培养基；
3.5培养基应置于空气少流动和少灰尘的干净环境冷却，否则在降温进气过程中导致霉菌孢子进入培养器皿，产生霉菌污染。或用高压高温消毒过的厚布包裹冷却。
4培养基储藏
4.1培养基应尽量现配现用。
4.2可在空气干净且不流动的环境短时间储藏培养基，但储藏超过1个月的培养基应废弃不用。
本发明两面针组织培养的方法为：
1．芽的诱导
于晴天选取生长健壮的、无病虫害的两面针植株，剪取半木质化的幼嫩枝条作为外植体，剪去叶片（留叶柄），用加有少许洗洁精的水清洗1～2次，再用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用0.1%的氯化汞消毒6-7分钟并摇动数次，最后用无菌水清洗4～5次，将已经消毒好的材料剪切成约2cm长段，每段留1～2个腋芽，然后斜插或垂直插在诱导芽的培养基中。外植体初次培养时，需全暗培养10～15天腋芽即可开始萌动，然后再移至见光的地方培养。
2．芽的增殖培养
当腋芽萌动长至1cm左右时，切取腋芽诱导分化丛生芽即可进行芽的继代增殖，一般一个月继代一次，继代材料均放在室内培养，培养室温度为（26±2）℃,光照12h.d-1,光照度2000～3000lx。
3．生根的诱导
当丛生芽长至3cm左右时，可选取较健壮的芽转移到生根培养基中，进行生根诱导，其余芽丛可转移到新配的继代培养基中让其继续增殖。芽条转入生根培养基中后，先在室内弱光条件下培养15天左右，发根率到50%时（冬季气温低室内培养20天左右，发根率达70%以上）搬到室外炼苗大棚在自然散射光照培养10～20天（秋冬时间稍长）。
4．生根苗的移栽
待生根小苗充分木质化，叶片舒展，叶色浓绿，苗茎深绿，茎轴伸长，苗高4cm左右时即可进行移栽。移栽时倒出培养基，取出小苗，用水洗净残留在根上的培养基，并截去过长的根系，保留2～2.5cm长，移栽于经0.2%高锰酸钾消毒过的营养袋中，淋透水，覆盖薄膜保持一定的温度和湿度，并要避免阳光直射。
本发明的优点是：
1、两面针种源产地和单株不同，组织培养条件也不同，MS培养基适用于部分产地两面针组织培养，本发明更适合不同产地的两面针和不同两面针单株的组织培养。
2、部分产地两面针种源用MS培养基进行继代培养，先叶片变黄、变白，继而茎变黄、变白，无法继续进行继代培养；用本发明培养基对两面针进行培养，调整了大量元素用量，增加了七水硫酸亚铁的含量，继代周期20～25天，增殖系数4～6，继代苗生长良好，小苗粗壮、整齐，叶色浓绿、黄化苗（叶片、茎叶逐渐变黄）少，得苗率高。
3、在生根培养基中增加七水硫酸亚铁的含量，用生根培养基进行培养生根苗生根率可达90%、出根快，温度25±2℃时，平均出根时间为10～15天，根系发达，出根量多平均有3～5条根，小苗木质化好，移栽成活率高，移栽成活率达90%以上，瓶苗出圃时间平均为30天左右。
与目前现有技术的两面针组织培养基相比，本发明的优点是：
具体实施方式
下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：
两面针组织培养培养基，该培养基包括继代培养基和生根培养基，其中：
每升（L）继代培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、乙二胺四乙酸二钠56.0mg/L、七水硫酸亚铁41.7mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：6-苄基腺嘌呤0.4mg/L、萘乙酸0.2mg/L；
余量为蒸馏水。
每升（L）生根培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、七水硫酸亚铁33.4mg/L、乙二胺四乙酸二钠44.8mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：生根粉ABT6号0.4mg/L、萘乙酸0.2mg/L；
余量为蒸馏水。
实施例2：
两面针组织培养培养基，该培养基包括继代培养基和生根培养基，其中：
每升（L）继代培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、乙二胺四乙酸二钠56.0mg/L、七水硫酸亚铁41.7mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：6-苄基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.5mg/L；
余量为蒸馏水。
每升（L）生根培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、七水硫酸亚铁33.4mg/L、乙二胺四乙酸二钠44.8mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：生根粉ABT6号0.8mg/L、萘乙酸0.4mg/L；
余量为蒸馏水。
实施例3：
两面针组织培养培养基，该培养基包括继代培养基和生根培养基，其中：
每升（L）继代培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、乙二胺四乙酸二钠56.0mg/L、七水硫酸亚铁41.7mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：6-苄基腺嘌呤0.6mg/L、萘乙酸0.3mg/L；
余量为蒸馏水。
每升（L）生根培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、七水硫酸亚铁33.4mg/L、乙二胺四乙酸二钠44.8mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：生根粉ABT6号0.6mg/L、萘乙酸0.3mg/L；
余量为蒸馏水。
实施例4：
两面针组织培养培养基，该培养基包括继代培养基和生根培养基，其中：
每升（L）继代培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、乙二胺四乙酸二钠56.0mg/L、七水硫酸亚铁41.7mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：6-苄基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L；
余量为蒸馏水。
每升（L）生根培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、七水硫酸亚铁33.4mg/L、乙二胺四乙酸二钠44.8mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L、盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素（VH）0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：生根粉ABT6号0.6mg/L、萘乙酸0.4mg/L；
余量为蒸馏水。
对比例：
继代培养基MS+6-BA2.0+NAA1.0,生根培养基1/2MS+ABT10.8+IBA0.6，浓度单位为mg/L。
利用上述实施例1和对比例制成的培养基，对两面针进行组织培养，从下表的结果可以看出，实施例的技术指标远超过对比例。
Claims (1)
1.一种两面针组织培养培养基，该培养基包括继代培养基和生根培养基，其特征在于：
每升（L）继代培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、乙二胺四乙酸二钠56.0mg/L、七水硫酸亚铁41.7mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：6-苄基腺嘌呤0.4-1.0mg/L、萘乙酸0.2-0.5mg/L；
余量为蒸馏水；
每升（L）生根培养基的组分及各组分的含量如下：
（1）大量元素：硝酸钾1250mg/L、硝酸铵1000mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水氯化钙166mg/L、磷酸二氢钾150mg/L、七水硫酸亚铁33.4mg/L、乙二胺四乙酸二钠44.8mg/L；
（2）微量元素：四水硫酸锰25mg/L、七水硫酸锌10mg/L、硼酸10mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.083mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L；
（3）有机物：肌醇100.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、叶酸0.5mg/L、生物素0.05mg/L；
（4）植物生长调节剂：生根粉ABT6号0.4-0.8mg/L、萘乙酸0.2-0.4mg/L；
余量为蒸馏水。
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| CN102884981A (zh) | 2013-01-23 |
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