CN102863531A - 一种抗cd20单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人源化抗CD20单克隆抗体，其重链可变区具有如下氨基酸序列VH：SEQ ID：NO.6；轻链可变区具有下列氨基酸序列VL：SEQ ID：NO.8。本发明还包含了所述单克隆抗体在研究及诊断治疗方面的应用。本发明提供的高特异性的人源化抗CD20单克隆抗体，所述单抗与阳性药物相比药效更佳且制备工艺简便，成本更低，为癌症以及眼科疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发该人源化抗CD20单克隆抗体，为我国医药市场提供一种性价比更高的治疗药物，因此具有十分广阔的应用前景。

Description

一种抗CD20单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药、单克隆抗体技术、抗体人源化技术等技术领域，具体地说是涉及一种单克隆抗体及其制备方法和用途，更具体地说是涉及一种用于抗CD20单克隆抗体及其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤的死亡率在全世界各种疾病的死亡率居榜首，恶性肿瘤已经成为严重影响人类健康和生命的杀手。非霍奇金淋巴瘤（Non Hodgkin’s Lymphoma，NHL）是常见恶性血液病之一，且是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤，由B淋巴细胞恶性增长引起（B细胞来源约占85%），好发于青壮年。近年来,NHL发病率和病死率呈逐年上升趋势，严重危害着人类健康。非霍奇金淋巴瘤的治疗和诊断是近年来的一个研究热点，其由B淋巴细胞恶性增长引起（B细胞来源约占85%），好发于青壮年。近年来,NHL发病率和病死率呈逐年上升趋势，严重危害着人类健康。但是，非霍奇金淋巴瘤的机制复杂，是多种因素相互、共同作用的结果，而单一机制的研究往往不能达到满意的效果，因此多种机制的、多药物联合运用的综合性研究有待进一步开展。

由B细胞和其对应恶性肿瘤表达的细胞表面分子是免疫治疗的重要靶标。MS4A基因家族的B细胞特异成员CD20在未成熟和成熟B细胞以及其对应的恶性肿瘤的表达（Tedder andEngel(1994)Immunol.Today 15:450-454）。多数的人B细胞谱系恶性肿瘤表达CD20（Anderson等，Blood，198463：1424）。近年来针对多种恶性肿瘤表面细胞表面抗原标志物的靶向性治疗取得巨大进步，应用单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤的临床结果取得重大进展，使得针对CD20的单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤成为发展前景良好的一种新型抗肿瘤方法。

抗CD20单克隆抗体是治疗B淋巴瘤的最有效的治疗药物，在治疗NHL中有极其重要的地位。CD20是一种分子量为33～37kD的磷酸化蛋白质分子（CD20分子结构示意图见图1，其中），是B淋巴细胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，位于B淋巴细胞表面，即B淋巴细胞表面分化抗原，而在其他组织以及多能B淋巴干细胞均不表达。它主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化，在免疫系统起重要作用，CD20从前-B淋巴细胞阶段开始表达，直到浆细胞阶段才无CD20表达（Stashenko p.，Nsdler LM，Hardy R，et al.Characterization of a human Blymphocyte-specific antigen.J.Immun.1980；125：1678-1685）。CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用，因而细胞表面CD20数量并不因为抗体的结合而减少，在人体血清中无游离的CD20存在。CD20抗原高表达于超过95%的正常或恶化的B淋巴瘤细胞，没有显著内吞和脱落（Press OW，Farr AG，Borroz KI et al.Endocytosis and Degradation of MonoclonalAntibodies Targeting Human B-Cell Malignancies.Cancer Res1989；49：4906-4912），因此CD20是治疗B淋巴细胞瘤的理想靶点。

经FDA批准上市用于治疗NHL的CD20单抗有Rituximab、Zevalin、Bexxar等，Rituximab（利妥昔单抗，商品名：Rituximab；后简称“Rituximab”）是第一个是上市的抗CD20单克隆抗体类药物，是一种嵌合体人IgG1抗人CD20单克隆抗体，能高效诱导补体（C）激活的经典途径和对新鲜分离的淋巴瘤细胞和B细胞系的补体依赖的细胞毒性（Reff等，Blood，1994，83：435-445；Golay等，Blood，98：3383-3389；Cragg等Blood，2003，101：1045-1052；Di Gaetano等J.Immunl.2003,171:1581-1587;Bellosillo等，Blood，2001，98：2771-2777）。Rituximab还在病人（van der Klok等，Br.J.Hematol.2001,115:807-811）和灵长类（Kennedy等，Blood，2003，101：1071-1079）体内激活补体。此外，包括CD59在内的补体调解蛋白的肿瘤细胞中的表达和抗CD20治疗的抗性相关（Golay等，Blood，98：3383-3389；Treon等J.Immunotheraphy,200124:263-271）。虽然许多人认为补体依赖的细胞毒性是Rituximab在体外（invitro）和体内消除人淋巴瘤细胞中所使用的主要用途（Golay等，Blood，98：3383-3389；Cragg等Blood，2003，101：1045-1052；Di Gaetano等J.Immunl.2003,171:1581-1587;Golay等，Blood，95：3900-3908；Di Gaetano等J.Hematol.2001,114:800-809;Weiner Blood2003，101：788），但是其他人发现，根据肿瘤细胞对补体介导裂解的易感性以及补体抑制剂CD46、CD55和CD59在肿瘤细胞上的表达不能预测Rituximab的治疗效果（Weng和Levy，Blood，2001，98：1352-1357）。因为与临床使用的同种型不同的嵌合体抗CD20单克隆抗体不能在非人或灵长类中消除正常的Ｂ细胞（Anderson等，Biochem.Soc.Transac.，1997，25：705-708），并且抗CD20单克隆抗体的抗肿瘤效应部分地依赖通过IgG的Fc受体（FcγR）的免疫激活（Clynes等，Nature Med.，2000，6：443-446），所以其他的抗体依赖作用也是重要的。单独使用Rituximab治疗复发以及难治的非霍奇金淋巴瘤有效率达50%左右，若与化疗药物联用，则有效率可达90-100%。同时，Rituximab会带来一系列的不良反应，诸如：脱发、恶心、呕吐、血细胞减少等，且又轻微的发热、寒颤等。但Rituximab仍由其在治疗非霍奇金淋巴瘤上表现的良好疗效和低毒副作用，已成为美国销售额最大的抗肿瘤药物之一，2008年销售额近30亿，年增长率14%。

但这些药物治疗费用较高，致使我国很多患者难以接受治疗。因此，研究疗效好、治疗成本低的药物对提高非霍奇金淋巴瘤患者的生活质量具有重大意义。此外，研发对人免疫原性更小，表达量更高，以及具有其他优良特性的抗CD20单克隆抗体或多克隆抗体，更成为目前的研究重点。因此，研制抗CD20等方面的产品，特别是药物，意义重大，并具有显著的社会效益和经济效益。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种人源化抗CD20的单克隆抗体及其制备方法和用途。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种人源化抗CD20单克隆抗体，其中重链可变区具有如下氨基酸序列VH：SEQ ID：NO.5；轻链可变区具有下列氨基酸序列VL：SEQ ID：NO.7。

优选地，上述人源化抗CD20单克隆抗体重链可变区具有SEQ ID：NO.6所示氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID：NO.8所示氨基酸序列。

本发明还提供了抗CD20单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物，具体地，本发明包括具有含超变区（互补决定区，CDR）的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物（即免疫偶联物及融合表达产物），只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。

抗体的抗原结构特性可由位于重链和轻链可变区的3各特定的区域来描述，成为互补决定区（complementarity determining region,CDR），将该段间隔成4各框架区域（FR），4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。本领域技术人员通过常规方法分析将本发明抗体的重链和轻链序列（SEQID NO:1和SEQ ID NO:3），可确定其CDR区。本发明还包括这些CDR区完全相同的抗体重链和抗体轻链，以及由所述重链和轻链构成的抗体。

此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体，可用于本发明的形成嵌合抗体的技术是本领域公知的，以及抗体与药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶等偶联，组成免疫偶联物。

本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可用PRC扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短室。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

获得有关序列后，即可用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

一种制备上述单克隆抗体的方法，包括通过计算机辅助设计出人源化抗体BB3CD20-7的氨基酸序列，全基因合成BD31-7的重链和轻链可变区基因并经基因重组分别与人免疫球蛋白重、轻链恒定区基因拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建人源化抗体的轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO细胞，然后进行筛选、培养纯化即得本发明的抗人CD20的人源化抗体：BD31-7。

本发明中所述的“核酸分子”指聚核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸（DNA）和核糖核苷酸（RNA），还包括由核苷酸类似物形成的DNA或RNA的等效物、类似物，单链（有义链或反义链）和双链聚核苷酸。该术语还包括同源序列。对本领域技术人员来说，很显然，任意一种上述形式的核酸分子都当然地涵盖了该“核酸分子”的所有上述等效形式。

此外，目前已可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生物）的DNA序列，然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

上述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物稀薄。代表例有：大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞、真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收货，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域中公知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可以用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的诉诸细胞，培养中所用的培养基可选用各种常规的培养基。在适合宿主细胞生长的条件下培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转化或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上述方法中的重组多肽可在细胞内、或细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的其他特性通过各种分离方法分离纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC）和其他各种液相层析技术及这些方法的结合。

一种上述单克隆抗体的用途，是作为活性成分用于制备治疗非霍奇金淋巴瘤的药物或用于制备诊断恶性B细胞淋巴瘤的试剂。

作为进一步优选方案，是作为活性成分用于制备治疗于非霍奇金淋巴瘤、类风湿性关节炎、特发性血小板减少紫癜和溶血性贫血以及其他免疫介导的疾病的药物，最优为非霍奇金淋巴瘤。

本发明还提供了一种治疗非霍奇金淋巴瘤的药物组合物，其含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配置于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为5-8，较佳的pH为6-8，尽管pH值可随被配制物的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）:腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明药物组合物的制备方法可以是将现有的市售可得的上述化合物，或从生物中提取的含上述化合物的提取物，按配比，采用本领域的常规方法获得，即得所述的抗CD20单克隆抗体组合物。本发明中述及的各原料或试剂均市售可得。

在具体使用方面，本发明所述的抗CD20单克隆抗体组合物能够单独直接使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解抗CD20单克隆抗体组合物的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体等中的一种或多种。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体的药物组合物，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。这类载体包括，但不限于：任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、缓冲液、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。

如本文所用，术语“抗CD20的特异性单克隆抗体”、“抗CD20单抗”、“CD20单抗”、“CD20抗体”等可互换使用，都是指由抗体重链元件的氨基酸序列和抗体轻链元件的氨基酸序列构成的抗体；该术语还包括与GST等形成的融合蛋白，只要在该融合蛋白中抗体部分仍然保留与CD20的结合活性。

所述“药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了该抗补体或抗氧化组合物的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，包括润滑剂，如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠或低取代羟丙纤维素等中的一种或多种；填充剂，如淀粉、糊精或乳糖等中的一种或多种；粘合剂，如预胶化淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素等中的一种或多种；渗透压调节剂，如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；pH调节剂，如盐酸、氢氧化钠等酸或碱中的一种或多种；溶剂，如水、缓冲液、乙醇或丙二醇等中的一种或多种等；抗氧剂和络合剂，如亚硫酸钠、EDTA等中的一种或多种；表面活性剂，如季铵化合物、十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；高分子骨架剂，如环糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一种或多种；稀释剂如淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖和大豆油等中的一种或多种；稳定剂如羧甲基纤维素钠或环糊精等中的一种或多种；防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或苯甲酸钠等中的一种或多种。另外，还可以在该药物组合物中加入其他辅助剂，如香味剂和/或甜味剂如蔗糖、果糖和天冬甜素等中的一种或多种。

相比现有技术，本发明具有如下的显著效果：

本发明有针对性地研究CD20单克隆抗体，发现了一种新的抗CD20单克隆抗体组合物，作出了意想不到的成绩；同时，本发明也有针对性地研究抗CD20单克隆抗体组合物的活性，其药理作用较强，使用安全，最大限度地发挥了作用。本发明对抗CD20单克隆抗体组合物拓展了新的医药用途，也为诊断、检测、保护、治疗和研究抗CD20单克隆抗体提供了一种新的药物来源。

该药物组合物用于治疗B细胞诱导的恶性肿瘤、特别是非霍奇金淋巴瘤，可显著杀伤B淋巴瘤细胞，治疗效果显著，且毒副作用小，克服了现有的常用药物造成的副作用。本发明也为治疗和诊断B细胞诱导的恶性肿瘤提供了一种新的药物手段。本发明的抗CD20单克隆抗体组合物药理作用较强，效果明显。

总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，为研究开发新的抗CD20单克隆抗体产品提供了新的药物和制剂来源，对开发利用中国现有药物具有重要价值，是用于诊断、检测、保护、治疗和研究B细胞恶性肿瘤等方面的安全来源，对改进和提高现有的医疗水平具有重要价值。

附图说明

图1为CD20分子的结构示意图，其中图1（A）为CD20的三种拓扑结构，图1（B）为CD20分子的跨膜结构；

图2体现了单克隆抗体BD31-7对Dauli细胞的ADCC实验结果；

图3体现了单克隆抗体BD31-7对Raji细胞的ADCC实验结果；

图4体现了单克隆抗体BD31-7对Dauli细胞的CDC实验结果；

图5体现了单克隆抗体BD31-7对Raji细胞的CDC实验结果；

图6体现了单克隆抗体BD31-7诱导Dauli细胞凋亡实验结果；

图7体现了单克隆抗体BD31-7诱导Raji细胞凋亡实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Smabrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均是来自市售。

Raji(人B淋巴瘤细胞，ATCC，CCL-86)

pGEM-T载体，美国Promega公司产品

pcDNA3.1(+)，美国Invitrogen公司产品

T4DNA连接酶，美国Invitrogen公司产品

pcDNA3.1/ZEO(+)载体，美国Invitrogen公司产品

COS-1细胞(ATCC CRL 1650)

CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)

pGEM-T easy载体，Promega公司产品

Human myeloma IgG1，K，Sigma公司产品

HRP-羊抗人kappa，Southern Biotechnology Associates公司产品

Human IgG为抗人her2的人源化抗体trastuzumab，Roche公司产品

Rituximab，Roche公司产品

Daudi(人B淋巴瘤细胞，ATCC，CCL-213)

人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液（鼎国生物技术发展公司产品）分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(Nucleic AcidsResearch，1982，10：4071-4079)报道昀序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T／CH和pGEM-T／CL。

实施例1小鼠单克隆抗体的制备和筛选

(1)抗原的制备人B淋巴细胞特异性膜抗原CD20基因通过PCR从人基因转录组中扩增获得，引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：

GSP1-H，5’-ACC TGG GTAGGT GCG GAC ACC ACT-3’；

GSP2-H，5’-CAC ACT TTC ACG TCAAGG ACA-3’；

GSP3-H,5’-CTT GTC CAG GGA TCC TAG AGT-3’；

GSP1-L,5’-TTG CAG TCC TGA TCA GGC CAA CT-3’；

GSP2-L,5’-TGT CGT GCA CTG GCAACA ATC TT-3’：

GSP3-L,5’-TTG TTC ATG AAG CTC AAG GCT GA-3’。

利用BamHI和Xho I双酶切，将基因片段连入原核表达载体pGEM-T(美国Promega公司产品)，PCR和双酶切鉴定阳性克隆后测序，序列测定正确后，提取质粒。原核表达载体pGEM-CD20转化Rosetta菌株，在100ml LB培养基中，OD600达到约0.5时，ImM IPTG诱导表达4小时，CD20蛋白形成包涵体。超声破菌后，用1×SDS上样缓冲液溶解包涵体，测定靶蛋白的表达量。将制备好的CD20蛋白进行SDS-PAGE电泳，割胶纯化蛋白。

(2)小鼠的免疫将纯化后的CD20蛋白溶解在1×PBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂(Sigma)混匀乳化，取8周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋自溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma)混匀乳化，在小鼠的皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾脏进行细胞融合。

(3)细胞融合和阳性克隆的筛选

引颈处死小鼠，用70%酒精消毒其体表。无菌条件下取出脾脏，在灭菌不锈钢网中，用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次获得细胞悬液，将细胞悬液注入50ml离心管中，加入20ml无血清培养液，轻轻吹打数次，1000rpm/min离心。用无血清培养液将细胞重悬，与小鼠骨髓瘤细胞SP210以适当比例轻轻混匀，在37℃水浴锅中加入PEG1400，水浴1.5min。加入无血清培养液35ml，离心。沉淀用含有20%FCS的RPM1-1640重悬，每孔200uL均分到96孔细胞培养板，放入37℃5%CO₂培养箱中培养。24小时后，加入选择培养液HAT，每3天换一次新鲜培养液。

14天后，取细胞培养上清，ELISA鉴定出阳性克隆。多次进行亚克隆鉴定阳性克隆细胞成系，继续体外培养6个月。选出7株高效表达细胞株，分别命名为31-1、31-2、31-3、31-4、31-5、31-6、31-7。

(4)单克隆抗体的鉴定

血清1：1000-1：50000稀释，100ng CD20上样，进行Western Blot分析抗体的特异性。将CD20基因通过TOPO克隆方法连入表达载体pLent17.3/V5-TOPO，真核表达载体pLent17.3/V5-CD20利用Lipofectamine2000(1nvitrogen)介导瞬时转染293T细胞，血清1：100稀释，进行免疫荧光鉴定抗体。测定可知，21-7细胞株的抗体特异性最好，且能识别细胞内源表达的抗原。

(5)单克隆抗体可变区序列的获得

利用Trizol(Invitrogen)法提取杂交瘤细胞株21-7的总RNA，然后用oligo-dT引物和SuperScript II Reverse Transcriptase(lnvitrogen)反转录成cDNA。根据小鼠抗体重链和轻链的FR1区氨基酸序列，合成兼并的寡核苷酸引物，用作正同引物。反向引物根据小鼠抗体的恒定区设计，可将全部的可变区扩增得到。PCR反应完成后，分别将抗体重链和轻链的DNA片段连于TA克隆载体，挑取克隆进行测序。

所得抗体序列如下：

重链可变区核酸序列：

CAGGTACAACTACAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCAGGAAATGGTTTCACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACAAGGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCA；

重链可变区氨基酸序列：

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGFTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYKGGDWYFNVWGAGTTVTVSA；

轻链可变区核酸序列：

CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTCGCCCACCCACGTTCGGTGGTGGG ACCAAGCTGGAGA TCAAA；

轻链可变区氨基酸序列：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSRPPTFGGGTKLEIK。

实施例2鼠单克隆抗体的人源化和表达纯化

(1)鼠单克隆抗体的人源化将小鼠的抗体氨基酸序列与人抗体氨基酸序列进行比对，获得最高同源序列的人亚类共有序列的架构，即人轻链VLκ亚组II(VLκII)和重链VH亚组I(VHI)，作为人源化构架。按照kabat等人的定义将L链的CDR1：24-34，CDR2：50-56，CDR3：89-97；H链的CDR1：26-35,CDR2:50-65,CDR3:95-102(sequences of proteins ofimmunological Interest,(5th),Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。利用计算机构建鼠单克隆抗体VL-VH区的立体图模型(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285-4289(1992)Eigenbrot.J．Mol.Biol.）229：969-995(1993))，确定将哪些鼠抗体构架区残基引入人源化抗体。其中重链除CDR1，CDR2，CDR3外，在H73位点人源化构架改用鼠抗体氨基酸，轻链CDRL1，CDRL2，CDRL3使用鼠抗体氨基酸序列。

(2)人源化抗体IgG的构建和表达纯化人源化抗体重链和轻链可变区核苷酸序列全基因合成后，分别克隆入载体AbVec1-hIgG1，AbVec1-hIgKappa。转化DH5Q，提取阳性克隆质粒。利用转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)，将构建好的质粒共转染人293A细胞。培养24h后，DMEM培养基被换成基本培养基，并在5天之内每天收获上清。上清合并以后用ProteinA-Sepharose CL-4B(Amersham)纯化抗体，并用SDS-PAGE电泳鉴定。经过亲和层析的鉴定产物再次通过分子筛层析，获得高纯度的单抗，然后利用EZQ ProteinQuantitationKit(Invitrogen)对抗体定量，以进行下一步的实验。

实施例3人源化单克隆抗体CD20亲和力分析

Scatchard法测定单克隆抗体31-7、BD31-7、Rituximab的亲和力。表1显示了测定的结果，实验结果说明两株单克隆抗体与VEGF有较强的结合亲和力。

表1单克隆抗体亲和力结果

实施例4、检测单抗BD31-7对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用

1.抗体依赖的细胞毒性实验

1)实验目的：观察BD31-7能否诱导Raji细胞和Daudi细胞的抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）。

2)实验方法

用新配制的PBS将BD31-7配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的溶液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=5.1×10⁵个/ml，Daudi=4.9×10⁵个/ml,PBMC=1×10⁸个/ml。

将细胞充分悬匀，按每孔800μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。

分组设置如表2：

表2各分组设置

按表2所示，在每孔含有800μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的BD31-7或Rituximab或等体积PBS，每组设三个复孔。将细胞放入培养箱内孵育1小时，再向各相应孔中加入PBMC（效靶比：25:1）或等体积PBS,继续孵育5小时后处理样品。处理样品前45分钟向细胞最大释放LDH组每孔加入100μl试剂盒配备的裂解液。处理样品时每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，取50μl上清于96孔细胞培养板中，按照CytoTox

非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书，每孔加入配好的底物混合物50μl，避光30分钟，再向每孔中加入50μl终止液，随即用酶标仪在470nm处测OD值。

细胞毒性计算公式：

杀伤活性%=100×(实验孔OD值-细胞自发释放LDH组OD值)/(细胞最大释放LDH组OD值-细胞自发释放LDH组OD值）

3)统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

4)实验结果

a)Daudi细胞ADCC实验结果:

如图2所示,与阴性对照组相比，BD31-7低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及Rituximab组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞的抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）(P<0.01)；相同浓度的BD31-7和Rituximab（2μg/ml）诱导Daudi细胞的ADCC作用无显著性差异(P>0.05)。

b)Raji细胞ADCC实验结果：

如图3所示,与阴性对照组相比，BD31-7低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及Rituximab组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞的抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）(BD31-7低浓度时,P<0.05,BD31-7中浓度和高浓度时P<0.01)；相同浓度的BD31-7和Rituximab（2μg/ml）诱导Raji细胞的ADCC作用无显著性差异(P>0.05)。

2.补体依赖的细胞毒性实验

1)实验目的：观察BD31-7能否介导Raji细胞和Daudi细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC）。

2)实验方法

用新配制的PBS将BD31-7配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的溶液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=4.5×10⁵个/ml，Daudi=5.3×10⁵个/ml。

将细胞充分悬匀，按每孔800μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。分组设置见表3。

表3实验分组设置

	药物浓度（μg/ml）	实验体系设置
			阴性对照组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μl补体
BD31-7低剂量组	0.08	800μl细胞+100μlBD31-7+100μl补体
			BD31-7中剂量组	0.4	800μl细胞+100μlBD31-7+100μl补体
BD31-7高剂量组	2	800μl细胞+100μlBD31-7+100μl补体
			阳性药组（Rituximab）	2	800μl细胞+100μlRituximab+100μl补体
细胞自发释放LDH组	0	800μl细胞+200μlPBS
			细胞最大释放LDH组	0	800μl细胞+100μlPBS+100μl裂解液

按表3所示，在每孔含有800μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的HO2或Rituximab或等体积PBS，每组设三个复孔。将细胞放入培养箱内孵育1小时，再向各相应孔中加入补体或等体积PBS,继续孵育5小时后处理样品。处理样品前45分钟向细胞最大释放LDH组每孔加入100μl试剂盒配备的裂解液，继续孵育。处理样品时，从每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，取50μl上清于96孔板中，按照CytoTox

非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书，每孔加入配好的底物混合物50μl，避光30分钟，再向每孔加入50μl终止液，随即用酶标仪在470nm处测OD值。

细胞毒性计算公式：

杀伤活性%=100×(实验孔OD值-细胞自发释放LDH组OD值)/（细胞最大释放LDH组OD值-细胞自发释放LDH组OD值）。

3)统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

4)实验结果

a)Daudi细胞CDC实验结果：

如图4所示,与阴性对照组相比，BD31-7低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及Rituximab组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC）(P<0.01)；相同浓度的BD31-7和Rituximab（2μg/ml）诱导Daudi细胞的CDC作用无显著性差异(P>0.05)。

b)Raji细胞凋亡实验结果

如图5所示,与阴性对照组相比，BD31-7低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及Rituximab组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC）(P<0.01)；相同浓度的BD31-7和Rituximab（2μg/ml）诱导Raji细胞的CDC作用无显著性差异(P>0.05)。

3.细胞凋亡实验

1)实验目的:观察CD20单抗BD31-7能否显著诱导B淋巴瘤细胞凋亡。

2)实验方法

用新配制的PBS将BD31-7配制成浓度分别为0.8、4、20μg/ml的药液，利妥昔单抗注射液配制成浓度为20μg/ml的溶液待用。细胞计数Raji=5.9×10⁵个/ml，Daudi=6.2×10⁵个/ml。

将细胞充分悬匀，按每孔900μl将Raji或Daudi细胞悬液种于12孔培养板中，在37℃、含5%二氧化碳的培养箱里孵育。分组设置见表4。

表4实验各分组设置

按表4所示，在每孔含有900μl细胞悬液的12孔板各孔加入相应浓度的HO2或Rituximab或等体积PBS，每组设三个复孔。在培养箱里孵育16小时后处理样品。处理样品时，每孔取1ml置于1.5mlEP管里1000转离心5分钟，弃上清，加1mlPBS轻轻重悬细胞，1000转离心5分钟，弃上清，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书，加入195μlAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μlAnnexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光10分钟，1000转离心5分钟，弃上清，加入190μlAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测，早期凋亡率和晚期凋亡率之和计为细胞凋亡率。

3)3.统计分析

统计学检验用t检验，p<0.05为有显著性差异，p≤0.01为有非常显著差异，p>0.05为无显著性差异。

4)实验结果

a)Daudi细胞凋亡实验结果：

如图6所示,与阴性对照组相比，BD31-7低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及Rituximab组（2μg/ml）均能显著诱导Daudi细胞凋亡(BD31-7低浓度和中浓度时，P<0.05；BD31-7高浓度和Rituximab，P<0.01)；相同浓度的BD31-7和Rituximab（2μg/ml）诱导Daudi细胞凋亡作用无显著性差异(P>0.05)。

b)Raji细胞凋亡实验结果：

如图7所示,与阴性对照组相比，BD31-7低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度组（2μg/ml）及Rituximab组（2μg/ml）均能显著诱导Raji细胞凋亡(BD31-7低浓度、高浓度和Rituximab时，P<0.01；BD31-7中浓度，P<0.05)；相同浓度的BD31-7和Rituximab（2μg/ml）诱导Raji细胞凋亡作用无显著性差异(P>0.05)。

实验结论

通过ADCC、CDC及细胞凋亡实验，得出以下结论：人鼠嵌合单克隆抗体BD31-7在体外低浓度（0.08μg/ml）、中浓度（0.4μg/ml）、高浓度（2μg/ml）和Rituximab高浓度（2μg/ml）均能显著诱导Raji人B淋巴瘤细胞和Daudi人B淋巴瘤细胞发生抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）以及细胞凋亡，从而显著杀伤B淋巴瘤细胞；相同浓度的BD31-7和Rituximab（2μg/ml）诱导Raji人B淋巴瘤细胞和Daudi人B淋巴瘤细胞ADCC、CDC和凋亡的作用无显著性差异。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>上海博沃生物工程有限公司

<120>血管内皮生长因子人源化单克隆抗体

<170>Patentln version3.3

<210>1

<211>990

<212>DNA

<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列

<400>1

GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC

ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA

ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCT

TCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG

TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC

CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT

CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTT

CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT

CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT

GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAAGA

GCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG

ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA

GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA

GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCC

TGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG

AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC

CGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGC

AGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT

ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTAAA

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>人抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列

<400>2

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP

PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

<210>3

<211>321

<212>DNA

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列

<400>3

CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT

CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG

TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA

GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA

AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA

GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA GTGT

<210>4

<211>106

<212>PRT

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列

<400>4

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ

DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

<210>5

<211>363

<212>DNA

<213>人源化抗体BD31-7重链可变区核酸序列

<400>5

CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCGGGCGCGGAACTGGTGCGCCCGGGCGCGAGCGTGAA

AATGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTAGCAGCTATAACATTCATTGGGTGAAA

CAGACCCCGGGCCGCGGCCTGGAATGGATTGGCGCGATTTATCCGGGCAACGGCGATA

CCAGCTATAACCAGAAATTTAAGGCAAAGCGACCCTGACCGCGGATAAAAGCAGCA

GCACCGCGTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGATTTATTATTG

CGCGCGCAGCACCTATTATTATGGCGCGTATTATTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCA

CCCTGACCGTGAGCAGC

<210>6

<211>121

<212>PRT

<213>人源化抗体BD31-7重链可变区氨基酸序列

<400>6

QVQLQQPGAELVRPGASVKMSCKASGYSFSSYNIHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTS

YNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYYCARSTYYYGAYYFDYWGQGTTL

TVSS

<210>7

<211>318

<212>DNA

<213>人源化抗体BD31-7轻链可变区核酸序列

<400>7

CAGATTGTGCTGAGCCAGAGCCCGGCGATTCTGAGCGCGAGCCCGGGCGAAAAAGTG

ACCATGACCTGCCGCGCGAGCAGCAGCGTGAGCTATATTCATTGGTTTCAGCAGAAAC

CGGGCAGCAGCCCGAAACCGTGGATTTATGCGACCAGCAACCTGGCGAGCGGCGTGC

CGGTGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTATAGCCTGACCATTAGCCGCGT

GGAAGCGGAAGATGCGGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCGCCGAC

CTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTAAACGC

<210>8

<211>106

<212>PRT

<213>人源化抗体BD31-7轻链可变区氨基酸序列

<400>8

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVR

FSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGAGTKLELKR

Claims (4)

1.一种人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于：其重链可变区具有如下氨基酸序列VH：SEQ ID：NO.6；轻链可变区具有下列氨基酸序列VL：SEQ ID：NO.8。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子含有SEQ ID NO.5所示的编码所述单克隆抗体可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO.7所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述核酸分子，其特征在于：它编码权利要求1所述的单克隆抗体。

4.一种药物组合物，其特征在于：它以权利要求1～3所述的人源化抗CD20单克隆抗体作为主要有效组分和药学上可接受的载体。

一种制备权利要求1所述的人源化抗CD20单克隆抗体的方法，其特征在于：在宿主细胞中表达权利要求2所述的核酸分子，以及从宿主细胞培养物中分离纯化抗体。

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