CN102860884B - 一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法，属于组织工程和生物制造技术领域。该方法模拟骨软骨的天然材料及结构，利用定向结晶原理制备具有定向结构软骨支架，利用基于快速成形技术的低温沉积制造工艺并设计含包芯喷头的专用挤压喷射装置制备包芯结构骨支架，定向结构支架与包芯结构支架通过“溶解-粘接”方法连接从而构建具有“定向结构软骨-包芯结构骨”结构的组织工程骨软骨复合支架。本发明针对关节软骨的缺损治疗，采用具有生物活性的材料并制造具有特殊仿生结构的骨软骨复合支架，既可提高支架细胞种植密度和深度，又可针对骨软骨不同功能区域特征促进骨、软骨组织的同时再生，从而提高骨软骨缺损的修复效果。

Description

一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，本发明属于组织工程和生物制造技术领域。

背景技术

关节软骨是一种特异化的结缔组织，具有坚韧、弹性好、摩擦系数小等生物物理特性，主要起到承受、传导运动载荷、吸收震荡，并顺利完成各种关节功能活动等的作用。外伤以及关节的炎症容易导致关节软骨缺损，影响关节的稳定性，从而引起骨性关节炎及关节退化病变的发生，这类病变不仅可以使人丧失工作能力，甚至已经成为肢体残障的主要原因之一。

成人关节端骨软骨复合组织自关节面向深度方向可以分为透明软骨层、钙化层和软骨下骨，各层以特有的组成与结构连接并发挥不同的组织功能。

其中软骨细胞外基质的成分组成为70％水分，20％II型胶原，5％蛋白多糖，主要起到支撑细胞的作用，并调节细胞的正常代谢、迁移、增殖和分化以及细胞间信息传递。英国艾克赛特大学的C.J.Moger等人(Moger C J,Arkill K P,Barrett R,et al.Cartilage CollagenMatrix Reorientation and Displacement in Response to Surface Loading.JOURNAL OFBIOMECHANICAL ENGINEERING-TRANSACTIONS OF THE ASME,2009,131(0310083))根据真实软骨的结构建立了软骨细胞外基质的结构模型，在软骨表面5-10％厚度区域软骨纤维平行于软骨表面，为表层；表层以下10-20％的厚度区域属于过渡层，软骨纤维呈随机取向；过渡层以下软骨纤维呈软骨表面垂直的取向结构，为辐射层；辐射层以下通过钙化层与软骨下骨连接，关节软骨分层排列特点反映了关节软骨生理功能相适应的生物力学变化：表层主要以剪力为主，移形层和辐射层则能够承受压力载荷，钙化层将关节软骨附着于软骨下骨上并有效隔离软骨组织和骨组织。

软骨下骨细胞主要由成骨细胞、破骨细胞构成，细胞外基质则主要由I型胶原纤维、无机成分等组成，其中胶原纤维约占骨重的1/3，无机成分主要存在形式是钙磷盐(羟基磷灰石(HA)又是其中最重要的钙磷盐)，约占骨重的2/3。性能上胶原纤维柔软而有弹性，钙磷盐硬而脆，组合起来成为有足够硬度和强度而又有足够韧性的骨组织。

正常关节软骨主要由软骨细胞及其细胞外基质构成，没有直接的血液、淋巴液供应和神经网络，因此缺乏自身愈合能力。自体细胞/组织移植及人工关节等一直以来都是整形外科或生物医学工程领域中用来修复关节软骨缺损最重要、最传统的技术手段，这些方法确实缓解很多人的病情、延长了无数人的生命。但仍然存在很多诸如异体移植供体严重不足、免疫反应及病原体转移，人工关节功能单一等问题。组织工程被证明是一个理想的非传统治疗方法，其原理是在体外构建与缺损形状的一致的多孔支架接种上细胞并填补在缺损部位，试图在支架降解过程中细胞沿支架贴附增殖分化长成缺损组织。

国内外近些年关于关节软骨组织工程展开了一系列研究，得到了一些重要的成果，但也存在以下问题：

一、利用组织工程单纯修复关节软骨缺损时，移植体与移植床之间的愈合界面为软骨-软骨、软骨-骨界面，这两种界面的整合较慢，修复过程中新生组织在移植床表面不稳定，容易导致修复失败。

二、目前组织工程修复过程中软骨组织中透明软骨比例较少，复合组织生理功能、机械性能等不能长期维持，软骨支架选用的材料及构建方法的不够仿生很可能是导致现在组织工程修复过程中软骨组织中透明软骨比例较少，复合组织生理功能、机械性能等不能长期维持的原因。

三、骨软骨支架亲水性和相容性不够不理想，目前骨软骨组织工程研究中提高支架亲水性的方法主要是表面改性或者支架构建过程中间歇添加高亲水性材料，采用这些方法改性材料不易分布均匀、材料改性后不能维持完整孔隙结构等。而足够的亲水性和相容性才能保证足够密度的细胞黏附、分化和增殖，植入体内后有利于体液中氧和营养物质的渗入，并且较大的细胞密度能够保证细胞间建立连接并准确表达功能，从而保证骨软骨的成功修复。

目前的研究大多倾向于关节软骨及软骨下骨一体化修复，使得愈合界面由软骨-骨界面变为骨-骨界面，从而加快界面的整合，并且临床上软骨缺损常伴有软骨下骨的缺损，在修复软骨缺损的时同时应考虑软骨下骨的修复，骨软骨组织工程就成为修复关节软骨缺损的重要策略。新加坡国立的Dietmar W.等人(Shao X X,Hutmacher D W,Ho S T,et al.Evaluationof a hybrid scaffold/cell construct in repair of high-load-bearing osteochondraldefects in rabbits.BIOMATERIALS,2006,27(7):1071～1080)在2005构建了医学等级的聚己内酯/纤维蛋白胶的骨软骨一体化支架两边分别接种BMSCs后填充动物缺损直径4mm深5mm，3个月样品表现出较好的软骨修复特性，力学实验证明PCL是一个比较好的软骨下骨支架材料，但纤维蛋白胶由于其较弱的力学性能不适合作为软骨支架。这种方式的优点在于一方面兼顾到了骨、软骨不同材料、结构、强度的要求，同时使用BMSCs细胞也可以在修复初期能够大量增殖分化产生足够数量的软骨细胞和成骨细胞。

发明内容

本发明的目的是提出一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法，该方法基于仿生原理，充分模拟骨软骨的天然材料及结构，使其制备的骨软骨复合支架既可提高支架细胞种植密度和深度，又可针对骨软骨不同功能区域特征促进骨、软骨组织的同时再生，进而提高骨软骨缺损的修复效果。

本发明技术方案如下：

一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：所述复合支架包括含定向大孔的定向结构软骨支架和包芯结构骨支架；所述含定向大孔的定向结构软骨支架采用含软骨基质材料的天然高分子材料，定向大孔之间存在相互贯通的小孔；所述的包芯结构骨支架由连续挤出的材料单元交错堆积而成，并形成梯度孔隙结构，该梯度孔隙结构包括材料单元交错堆积形成的大孔，以及材料单元自身的微孔，其中材料单元由包芯结构骨支架内芯和包芯结构骨支架外芯组成，包芯结构骨支架内芯采用人工合成高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合物，包芯结构骨支架外芯采用胶原；所述含定向大孔的定向结构软骨支架和包芯结构骨支架通过“溶解-粘接”的方法连接并形成连接层。

上述技术方案中，所述的含软骨基质材料的天然高分子材料采用牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的混合物。所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA；所述的钙磷陶瓷为磷酸三钙或羟基磷灰石。

本发明所述含定向大孔的定向结构软骨支架中的定向大孔截面直径在20μm-200μm，定向度的OI值在0.8至1之间；所述的材料单元交错堆积形成的大孔直径100μm-1mm，材料单元自身的微孔直径20μm-200μm。所述的连接层具有均匀孔隙结构，孔隙率60％-90％。

本发明提供的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

1)将含软骨基质材料的天然高分子材料溶解于水或者醋酸溶液中，制备成质量体积浓度为10～50mg/ml的均匀、无沉淀的混合溶液；所述的含软骨基质材料的天然高分子材料采用牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的混合物；牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的质量比是0.5～5：1；

2)将装有混合溶液的模具放置在低于0℃的具有一维温度梯度的环境中，实现溶液的定向结晶，然后通过冷冻干燥形成含定向大孔的定向结构软骨支架；经交联后，清洗冻干备用；

3)将胶原溶解在醋酸溶液中形成胶原溶液，溶液的质量体积浓度为2～20mg/ml；将人工合成的高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合物溶解于有机溶剂中，制成质量体积浓度为50～500mg/ml的混合溶液；所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA；所述的钙磷陶瓷为磷酸三钙或羟基磷灰石；混合物中高分子材料与钙磷陶瓷的质量比为1～10：1；

4)使用含包芯喷头的专用挤压喷射装置，使内喷头喷出人工合成的高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合溶液，外喷头喷出胶原溶液，形成胶原材料包裹人工合成的高分子生物材料的连续的材料单元，按照预先设计的结构和路径，采用基于快速成形的低温沉积制造工艺连续挤出交错堆积制备成含包芯结构的三维结构；并经过冷冻干燥后形成包芯结构骨支架；经交联剂交联后，冷冻干燥备用；

5)在包芯结构骨支架的表面，利用有机溶剂溶解表层形成薄层熔池，将定向结构软骨支架与包芯结构骨支架在薄层溶池处粘接，通过冷冻干燥，灭菌后，形成具有稳定结构的含有连接层的骨软骨复合支架。

在本发明提供的组织工程骨软骨复合支架的制备方法中，所述的醋酸溶液的质量体积百分浓度为0.5％-3％，所述的有机溶剂优选为1，4-二氧六环或氯仿。

本发明与现有的技术相比，具有以下优点及突出性效果：

①在制备骨软骨复合支架过程中兼顾到关节软骨和软骨下骨自身物质组成和结构特点。在软骨部分：模拟软骨细胞外基质材料和结构，利用软骨基质材料构建与真实软骨结构类似的定向结构支架，可以提高组织工程新生软骨的透明软骨比例；在骨部分，通过胶原包裹人工合成高分子材料与钙磷陶瓷的混合物形成包芯结构骨支架，可以有效提高支架亲水性和胶原分布均匀性，进而提高细胞种植密度和深度；

②在软骨支架和骨支架端分别接种足量密度的骨髓基质干细胞，在修复初期能够发挥干细胞快速增殖和分化的能力，并利用骨软骨不同的微环境，有利于干细胞向骨软骨不同方向的分化，增强修复的效果。

③该高度仿生的工艺通过溶解粘接法实现两种不同材料、结构的支架的稳定、牢固粘接，进而保证新生软骨和软骨下骨稳定连接，可实现并有效加快骨-骨界面的愈合速度，从而实现骨软骨的一体化修复。

附图说明

图1为本发明提供的“定向结构软骨-包芯结构骨”结构的组织工程骨软骨复合支架结构示意图。

图2为本发明提供的“定向结构软骨-包芯结构骨”结构的组织工程骨软骨复合支架简图。

图3为本发明的方法中使用的一种专用包芯喷头结构原理示意图。

图4为定向结构软骨支架的电镜图。

图5为定向结构软骨支架的截面电镜图。

图6为骨软骨复合支架的电镜图。

图7包芯结构骨支架的微孔结构电镜图.

其中：1-定向结构软骨支架；2.-连接层；3-包芯结构骨支架；4-包芯结构骨支架内芯；5-包芯结构骨支架外芯；6-材料单元交错堆积形成的大孔；7-人工合成的高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合溶液；8-胶原溶液。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

图1和图2为本发明提供的“定向结构软骨-包芯结构骨”结构的组织工程骨软骨复合支架示意图。该组织工程骨软骨复合支架包括含定向大孔的定向结构软骨支架1和包芯结构骨支架3；所述含定向大孔的定向结构软骨支架采用含软骨基质材料的天然高分子材料，定向大孔之间存在相互贯通的小孔；所述含定向大孔的定向结构软骨支架中的定向大孔截面直径在20μm-200μm，定向度的OI值在0.8至1之间；(参见图4、图5)；含软骨基质材料的天然高分子材料采用牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的混合物。

所述的包芯结构骨支架由连续挤出的材料单元交错堆积而成，并形成梯度孔隙结构，该梯度孔隙结构包括材料单元交错堆积形成的大孔6，以及材料单元自身的微孔，其中材料单元由包芯结构骨支架内芯4和包芯结构骨支架外芯5组成，包芯结构骨支架内芯采用人工合成高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合物7，包芯结构骨支架外芯5采用胶原；所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA；所述的钙磷陶瓷为磷酸三钙或羟基磷灰石。所述的材料单元交错堆积形成的大孔6的直径一般在100μm～1mm，材料单元自身的微孔直径20μm～200μm(参见图7)。

所述含定向大孔的定向结构软骨支架和包芯结构骨支架通过“溶解-粘接”的方法连接并形成连接层2，连接层具有均匀孔隙结构，孔隙率一般在60％～90％。

本发明提供的指标上述组织工程骨软骨复合支架的方法，包括如下步骤：

1)将含软骨基质材料的天然高分子材料溶解于水或者醋酸溶液中，制备成质量体积浓度为10～50mg/ml，均匀、无沉淀的混合溶液；所述的含软骨基质材料的天然高分子材料采用牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的混合物；牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的质量比是0.5～5：1。

2)将装有混合溶液的模具放置在低于0℃的具有一维温度梯度的环境中，实现溶液的定向结晶，然后通过冷冻干燥形成含定向大孔的定向结构软骨支架；经交联后，清洗冻干备用；

3)将胶原溶解在醋酸溶液中形成胶原溶液，溶液的质量体积浓度为2～20mg/ml；将人工合成的高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合物溶解于有机溶剂中，制成质量体积浓度为50～500mg/ml的混合溶液；所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA；所述的钙磷陶瓷为磷酸三钙或羟基磷灰石；混合物中的高分子材料与钙磷陶瓷的质量比为1～10：1；醋酸溶液质量体积百分浓度为0.5％-3％；有机溶剂为1，4-二氧六环或氯仿；

4)使用含包芯喷头的专用挤压喷射装置，使内喷头喷出人工合成的高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合溶液，外喷头喷出胶原溶液，形成胶原材料包裹人工合成的高分子生物材料的连续的材料单元，按照预先设计的结构和路径，采用基于快速成形的低温沉积制造工艺连续挤出交错堆积制备成含包芯结构的三维结构；并经过冷冻干燥后形成包芯结构骨支架；经交联剂交联后，冷冻干燥备用；

5)在包芯结构骨支架的表面，利用有机溶剂溶解表层形成薄层熔池，将定向结构软骨支架与包芯结构骨支架在薄层溶池处粘接，通过冷冻干燥，灭菌后，形成具有稳定结构的含有连接层的骨软骨复合支架。

实施例1：组织工程骨软骨支架的构建

提取牛骨来源的软骨基质材料和壳聚糖溶于0.5％的醋酸溶液中制备成质量体积浓度为10mg/ml的软骨基质材料-壳聚糖混合溶液，溶液中软骨基质材料与壳聚糖的质量比为0.5:1。将混合溶液装入模具中并在-200℃的低温环境中构建10℃/mm的温度梯度，混合溶液凝固后冷冻干燥24小时得到定向结构软骨支架，支架用京尼平溶液交联并调整为中性，冻干后备用。将PLGA/磷酸三钙按5：1的质量比混合溶于1，4-二氧六环中形成浓度为500mg/ml的溶液，将I型胶原溶于0.5％的醋酸溶液中形成浓度为2mg/ml的胶原溶液，基于无加热、液化过程的挤压、喷射成形工艺及设计的图2所示的专用喷头和基于快速成形的低温沉积制造设备制作包芯结构骨支架，用戊二醛交联并调整为中性，冻干后备用。利用喷雾器喷洒1，4-二氧六环溶解包芯结构骨支架表层，形成薄层熔池，将定向结构软骨支架与包芯结构骨支架在薄层熔池处粘接。在-20℃低温凝固后再次冷冻干燥，灭菌后，得到“定向软骨支架-包芯骨支架”的组织工程骨软骨复合支架。

实施例2：组织工程骨软骨支架的构建

提取牛骨来源的软骨基质材料和壳聚糖溶于3％的醋酸溶液中制备成浓度为50mg/ml的软骨基质材料-壳聚糖混合溶液，溶液中软骨基质材料与海藻酸钠的质量比为5：1。将混合溶液装入模具中并在-80℃的低温环境中构建10℃/mm的温度梯度，混合溶液凝固后冷冻干燥24小时得到定向结构软骨支架，支架用多聚磷酸钠溶液交联并调整为中性，冻干后备用。将PLGA/磷酸三钙按10：1的质量比混合溶于氯仿中形成浓度为50mg/ml的溶液，将I型胶原溶于0.5％的醋酸溶液中形成浓度为20mg/ml的胶原溶液，基于无加热、液化过程的挤压、喷射成形工艺及设计的图2所示的专用喷头和基于快速成形的低温沉积制造设备制作包芯结构骨支架，用戊二醛交联并调整为中性，冻干后备用。利用喷雾器喷洒氯仿溶解包芯结构骨支架表层，形成薄层熔池，将定向结构软骨支架与包芯结构骨支架在薄层熔池处粘接。在-20℃低温凝固后再次冷冻干燥，灭菌后，得到“定向软骨支架-包芯骨支架”的组织工程骨软骨复合支架。

实施例3：组织工程骨软骨复合支架用于兔关节软骨的缺损修复

提取牛骨来源的软骨基质材料和壳聚糖溶于0.5％的醋酸溶液中制备成浓度为20mg/ml的软骨基质材料-壳聚糖混合溶液，溶液中软骨基质材料与明胶的质量比为1：1。将混合溶液装入模具中并在-200℃的低温环境中构建10℃/mm的温度梯度，混合溶液凝固后冷冻干燥24小时得到定向结构软骨支架，支架用京尼平溶液交联并调整为中性，冻干后备用。将PLGA/磷酸三钙按5：1的质量比混合溶于1，4-二氧六环中形成浓度为200mg/ml的溶液，将I型胶原溶于0.5％的醋酸溶液中形成浓度为2mg/ml的胶原溶液，基于无加热、液化过程的挤压、喷射成形工艺及设计的图2所示的专用喷头和基于快速成形的低温沉积制造设备制作包芯结构骨支架，用戊二醛交联并调整为中性，冻干后备用。利用喷雾器喷洒1，4-二氧六环溶解包芯结构骨支架表层，形成薄层熔池，将定向结构软骨支架与包芯结构骨支架在薄层熔池处粘接。在-20℃低温凝固后再次冷冻干燥，灭菌后，得到“定向软骨支架-包芯骨支架”的组织工程骨软骨复合支架。

将支架切成直径4mm，厚度为6mm，其中定向结构软骨支架厚2mm，包芯结构骨支架厚4mm。新提取的胎兔骨髓基质干细胞培养到第三代后分散于培养液中得到细胞悬液浓度为10⁷个细胞/ml，并分别接种于润湿的骨软骨复合支架两端。培养7天后将细胞支架复合物接种到兔关节人造缺损(直径4mm,深度6mm)中，70天后检测可见缺损基本得到修复。

Claims (7)

1.一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：该骨软骨复合支架包括含定向大孔的定向结构软骨支架(1)和包芯结构骨支架(3)；所述含定向大孔的定向结构软骨支架采用含软骨基质材料的天然高分子材料，定向大孔之间存在相互贯通的小孔；所述的包芯结构骨支架由连续挤出的材料单元交错堆积而成，并形成梯度孔隙结构，该梯度孔隙结构包括材料单元交错堆积形成的大孔，以及材料单元自身的微孔，其中材料单元由包芯结构骨支架内芯(4)和包芯结构骨支架外芯(5)组成，包芯结构骨支架内芯采用人工合成高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合物，包芯结构骨支架外芯(5)采用胶原；所述含定向大孔的定向结构软骨支架和包芯结构骨支架通过“溶解-粘接”的方法连接并形成连接层(2)，所述的连接层具有均匀孔隙结构。

2.如权利要求1所述的一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：所述的含软骨基质材料的天然高分子材料采用牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的混合物。

3.如权利要求1或2所述的一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA；所述的钙磷陶瓷为磷酸三钙或羟基磷灰石。

4.如权利要求3所述的一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：所述含定向大孔的定向结构软骨支架中的定向大孔截面直径在20μm-200μm，定向度的OI值在0.8至1之间；所述的材料单元交错堆积形成的大孔(6)直径100μm-1mm，材料单元自身的微孔直径20μm-200μm。

5.如权利要求1所述的一种组织工程骨软骨复合支架，其特征在于：所述的均匀孔隙结构的孔隙率为60％-90％。

6.如权利要求1或2所述的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

1)将含软骨基质材料的天然高分子材料溶解于水或者醋酸溶液中，制备成质量体积浓度为10～50mg/ml的均匀、无沉淀的混合溶液；所述的含软骨基质材料的天然高分子材料采用牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的混合物；牛骨来源的软骨基质材料与壳聚糖、海藻酸钠或明胶的质量比是0.5～5:1；

2)将装有混合溶液的模具放置在低于0℃的具有一维温度梯度的环境中，实现溶液的定向结晶，然后通过冷冻干燥形成含定向大孔的定向结构软骨支架；经交联后，清洗冻干备用；

3)将胶原溶解在醋酸溶液中形成胶原溶液，溶液的质量体积浓度为2～20mg/ml；将人工合成的高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合物溶解于有机溶剂中，制成质量体积浓度为50～500mg/ml的混合溶液；所述的人工合成的高分子生物材料采用PLGA、PGA或PLA；所述的钙磷陶瓷为磷酸三钙或羟基磷灰石；混合物中的高分子材料与钙磷陶瓷的质量比为1～10：1；

4)使用含包芯喷头的专用挤压喷射装置，使内喷头喷出人工合成的高分子生物材料与钙磷陶瓷的混合溶液，外喷头喷出胶原溶液，形成胶原材料包裹人工合成的高分子生物材料的连续的材料单元，按照预先设计的结构和路径，采用基于快速成形的低温沉积制造工艺连续挤出交错堆积制备成含包芯结构的三维结构；并经过冷冻干燥后形成包芯结构骨支架；经交联剂交联后，冷冻干燥备用；

5)在包芯结构骨支架的表面，利用有机溶剂溶解表层形成薄层熔池，将定向结构软骨支架与包芯结构骨支架在薄层溶池处粘接，通过冷冻干燥，灭菌后，形成具有稳定结构的含有连接层的骨软骨复合支架。

7.如权利要求6所述的一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，其特征在于：所述的醋酸溶液质量体积百分浓度为0.5％-3％，所述的有机溶剂为1，4-二氧六环或氯仿。