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CN102834525A - 使用未经加工的血液的pcr和hla分型的方法 - Google Patents

使用未经加工的血液的pcr和hla分型的方法 Download PDF

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CN102834525A CN2010800609819A CN201080060981A CN102834525A CN 102834525 A CN102834525 A CN 102834525A CN 2010800609819 A CN2010800609819 A CN 2010800609819A CN 201080060981 A CN201080060981 A CN 201080060981A CN 102834525 A CN102834525 A CN 102834525A
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Abstract

本发明提供了使用串联PCR过程扩增兴趣基因或RNA或其组的方法。第一PCR或PCR反应的组中的引物是基因座-特异性的。第二PCR或PCR反应的组中的引物特异于基因座-特异性引物的亚序列并且在第二PCR扩增期间全部耗尽。对于RNA扩增，第一PCR是逆转录，并且获得的cDNA为cRNA合成、终点PCR或实时PCR提供模板。本发明还提供的是基因或其组的等位基因分型的方法，该方法通过在含有样本的DNA或RNA上使用串联PCR来扩增基因、将获得的扩增子或其组与具有基因相关等位基因变异的序列的探针进行杂交。指示杂交的可检测信号对应着基因的等位基因型或者基因的组的等位基因型的组。

Description

使用未经加工的血液的PCR和HLA分型的方法
相关申请的交叉引用
本国际申请依据35U.S.C.120要求2010年9月24日提交的待决非临时申请U.S.序列号12/924,301的优先权，其依据§119（e）要求2009年11月16日提交的临时申请U.S.序列号61/281,404的优先权，两者整体纳入此处作为参考。
技术领域
本发明涉及PCR和HLA分型的领域。更具体地，本发明公开了用来在露天场地或医务室环境内以个体或群体规模，扩增未经加工的生物标本中的DNA或RNA及其随后的HLA分型的串联PCR过程的方法和系统。
背景技术
在当前医疗中，对HLA分型的医学意义有着新且迅速增长的认识。作为一个实例，表1证明了HLA分型广阔范围的诊断和公共健康应用。
表1
Figure BDA00001865405300011
Figure BDA00001865405300021
然而，目前，HLA分型实际地需要整个分子遗传学实验室的努力。收到的血液标本必须首先通过方法（比如离心柱（spin column）或磁珠）进行纯化，随后是通过方法（比如PicoGreen荧光法或UV吸收）对纯化的DNA进行定量。定量的DNA然后进行PCR扩增，PCR之后，然后通过高通量再测序或最近的通过珠或通过微阵列的多路杂交分析进行分析。因此，由此产生的工作流需要整个分子遗传学实验室的努力，并且需要至少一整天来编译最终的HLA分型数据。这样的标准工作流的复杂性还带来了有关保管链（chain-of-custody）的很大关注以及对复杂且昂贵的LIMS系统和工作流的标准操作程序的需要，来跟踪流经若干加工和分析工作站的样本。
简化过程的努力已包括免去DNA纯化。即使可获得用于标准PCR的Taq聚合酶的变体时，从未纯化的血液中进行PCR扩增的之前的尝试仍存在问题。使用未经加工的血液作为PCR底物尚未取得一致结果，原因是样本与样本间极端的血液白细胞补体的差异以及样本与样本间可能的极过量的血液溶质中的差异，这种差异可干扰潜在的PCR反应。
因此，本领域认识到对基因扩增和HLA分型方法的低设备和消费成本、高通量的需要。具体来说，本发明在解放双手的或自动的、实时高分辨率的HLA分型方法方面有缺陷，而不需要首先在外部从样本中纯化DNA。本发明实现了本领域中这一长期的需要和希望。
发明内容
本发明针对用于扩增兴趣DNA的方法。该方法包括获得包括DNA的未经加工的样本，在未经加工的样本上进行第一PCR来产生第一扩增子并稀释第一扩增子。就此进行第二PCR直到第二PCR反应中所用的所有引物被耗尽，来产生第二扩增子，从而将输入样本DNA扩增到最终扩增的DNA产物浓度，这受到第二PCR反应中引物浓度的限制，所述第二PCR反应不依赖于包括原始样本的DNA的量或纯度。
本发明针对相关的发明，其中在未经加工的样本上在一组（set）基因靶上平行进行第一PCR来产生第一组扩增子，并稀释第一组扩增子。使用一级扩增子产物的整组作为第二PCR反应的一组模板，就此进行第二PCR直至所有二级PCR引物被耗尽来产生第二扩增子组，从而扩增DNA。
本发明针对另一个相关的方法，其还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物对。
本发明针对另一个相关的方法，其中DNA包括一个或多个兴趣基因并且方法还包括第二扩增子与具有兴趣基因相关的等位基因变异的序列的探针杂交，从杂交的扩增子检测荧光图式并基于荧光图式指定等位基因型。
本发明针对另一个相关的方法，其还包括对第二扩增子进行测序用于其分析。
本发明还针对用于扩增一个或多个兴趣RNA的方法。方法包括从个体中获得未经加工的生物样本，在未经加工的生物样本上进行第一逆转录PCR来产生第一cDNA扩增子并稀释第一扩增子以及就此进行第二PCR直至所有引物被消耗来产生第二扩增子，从而扩增兴趣RNA。
本发明针对一个相关的方法，其还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物对。
本发明针对另一个相关的方法，其还包括第二扩增子与具有互补于基因序列兴趣区的序列的探针杂交，从杂交的扩增子中检测荧光图式，并基于荧光图式鉴定一个或多个基因或其等位基因型。本发明还针对另一个相关的方法，其还包括对第二扩增子进行测序用于其分析。
本发明还针对一种用于兴趣基因的等位基因分型的方法。该方法包括从一个或多个个体获得未经加工的生物样本，在未经加工的生物样本上使用特异于基因基因座或限定的基因基因座的组的引物进行第一PCR来产生第一扩增子或扩增子的组，并然后稀释第一扩增子或第一扩增子的组，并用这些扩增子作为用于第二PCR反应的模板，使用特异于基因基因座中外显子或外显子组的引物进行第二PCR，直到所有引物被耗尽来产生来自第二PCR反应的扩增子组。第二扩增子组与具有兴趣基因或基因的组相关的等位基因变异的序列的探针杂交，从杂交的扩增子组中检测信号，并且基于检测的杂交信号指定等位基因型。
根据以下本发明目前优选实施方式的描述，其它或进一步的目的、特征和优点将变得显而易见，其中优选实施方式是出于公开的目的而给出的。
附图说明
从而达到了这样的情况，其中本发明上述特征、优点和目的以及其它将变得清楚，并且可以详细地理解，上面简述的本发明更特定的描述和某些实施方式在附图中说明。这些附图构成说明书的一部分。然而，必须指出的是，附图说明本发明的优选实施方式，因此不应被视为限制在其范围内。
图1A-1B是凝胶，其显示从10ng纯化的DNA开始，最终的二级PCR扩增子产物的量在一级PCR扩增子（用作二级PCR扩增模板）浓度范围之上是恒定的：HLA-A外显子组2或3以及HLA-DRB1外显子2（图1A）和HLA-B外显子组2或3（图1B）。
图2A-2B是凝胶，其显示从2μl全流体血液（图2A）或10ng纯化的人类基因组DNA（图2B）产生的一级和二级HLA-A、HLA-B和DRB1PCR扩增子。在2%琼脂糖SFR凝胶电泳（Amresco 1×TBE凝胶）上进行分辨。#1：HLA-A基因座特异性一级PCR产物（约1000bp）；#2：HLA-A外显子2二级PCR产物（约300bp）；#3：HLA-A外显子3二级PCR产物（约320bp）；#4：HLA-B基因座特异性一级PCR产物（约1000bp）；#5：HLA-B外显子2二级PCR产物（约320bp）；#6：HLA-B外显子3一级PCR产物（约310bp）；#7：DRB1基因座特异性一级PCR产物（约650bp）；#8：DRB1外显子2二级PCR产物（约310bp）；L：Bio-Rad EZ分子量标记（Load ladder）。
图3A-3C是凝胶，其显示从12个未纯化的全血模板产生的基因座特异性一级PCR产物，HLA-A（图3A）、HLA-B（图3B）与HLA-DRB1（图3C）。
图4A-4C是凝胶，其显示在图3中所展示的一级PCR反应产物上进行的外显子特异性二级PCR反应：使用特异于HLA-A外显子组2和3的一组PCR引物，作为多路PCR反应同时进行（图4A），使用特异于HLA-B外显子2和3的一组PCR引物，作为多路PCR反应同时进行（图4B），并使用特异于HLA-DRB1外显子2的所有相关变体的一组PCR引物，作为多路PCR反应同时进行（图4C）。对于这些二级PCR反应的模板是如图3A-3C所示从12个全血样本直接扩增的基因座特异性一级PCR产物，在分子生物学级别的水中按1:100稀释，然后以每个2μL施加到以上列出的50μL二级PCR反应中。还显示了阴性对照。
图5A-5I是凝胶，其显示HLA-A、HLA-B和DRB1PCR一级PCR产物，然后是二级PCR扩增子组，其产生自1μl全流体血液（左）相较于如实施例5，5，的操作中所述重新水化的通过重新水化3mm干血点衍生的流体所进行的相同反应（中），以及在来自相同血液标本的10ng纯化的DNA上进行的相同的反应（右）。图5D-5F显示对于获自匿名志愿者的这8个独特未经加工的血液样本，特异于HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1的一级PCR反应，而图5G-5I显示对于相同的8个未经加工的血液样本，特异于HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1的二级PCR反应。可以看出，尽管一级PCR产物的产量在8个未经加工的血液样本间是高度可变的（图5D-5F），但是随后的二级PCR反应在8个未经加工的血液样本的组之间产生了在产量和特异性上几乎一致的扩增的外显子的系列（图5G-5I）。在2%琼脂糖SFR（Amresco）1×TBE凝胶上进行分辨。L：Bio-Rad EZ分子量标记。对于HLA-A和HLA-B，在凝胶上观察到的二级PCR产物是源自相同PCR反应中外显子2和外显子3的多路（n=2）扩增的未分辨的条带的对。
图6A-6G显示重新水化的颊（buccal）拭子的HLA分型的PCR反应。去除识别信息的颊拭子从当地的供体获得。通过用力上下擦拭二十下口的各四分之一，从每个参与者收集四个拭子，并放置在15mL锥形管中。从12个个体取整个口的拭子：A1-A12。样品在层流罩下干燥72小时。干燥的拭子然后在150μl重新水化缓冲液（100mM硼酸盐+1mM EDTA）中重新水化并在70℃溶解2×小时。然后通过吹吸混合获得的流体相。重新水化的拭子然后保存于-20℃直至分析。然后针对各兴趣HLA基因座进行巢式（串联）PCR反应。采用罗氏Taq聚合酶1μl未经加工的拭子洗脱液用于一级25μLPCR反应。然后在50μL总PCR反应体积中的2.5μL一级扩增子产物上进行随后的（二级）PCR，仍然采用罗氏Taq聚合酶。一旦完成，通过QIAamp DNA血液Mini试剂盒（Qiagen目录#51104）提取剩余的样品（多达一半回收的体积）。在相同的微阵列HLA分型平台上运行获得的纯化的DNA。通过HLA分型的微阵列技术分析未纯化和纯化的颊DNA。通过凝胶电泳，将来自颊拭子的匹配的、去除识别信息的DNA与未经加工的、未纯化的样本获得的HLA类型进行比较。2.5微升各获得的2°PCR反应产物然后加载到标准的琼脂糖凝胶上。一级基因座特异性PCR产物以及二级外显子特异性反应组的产物（作为单一多路反应进行的）展示于图6A（左）中，连同获自10ng纯化的DNA（获自样本）的一致反应产物（右）。通过Amresco EZ-Vision DNA染料使条带可视。正如所看到的，获自1μL未经加工的拭子洗脱液的最终的2°扩增子的量，与获自来自相同样本的10ng纯化DNA扩增的HLA产物相比，在特异性和质量产量上是相似的。图6B-6G展示在来自总共12个供体的未经加工的颊拭子上进行的串联PCR反应的产物。图6B-6D展示对于12个未经加工的颊拭子样本，特异于HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1的一级PCR反应，而图6E-6G展示对于12个未经加工的颊拭子样本，特异于HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1的二级PCR反应。可以看出，尽管一级PCR产物的产量在12个未经加工的重新水化的颊拭子样本的组之间是高度可变的（图6B-6D），但是随后的二级PCR反应在12个未经加工的颊拭子标本的组之间产生了在产量和特异性上几乎一致的扩增的外显子的系列（图6E-6G）。
图7A-7F显示多个平行的HLA基因的串联PCR扩增：HLA-A和HLA-DRB1。基因座特异性多路和外显子特异性多路HLA-PCR反应在从UCLA免疫遗传学的I型HLA参考组上检索的5个样本的组上进行。图7A描绘了一级HLA-PCR，其中基因HLA-A和HLA-DRB1的基因座特异性引物用于多路化一级PCR。对基因座特异性PCR的产物进行1：100稀释，并且稀释液的21用于一组靶向HLA-A外显子2和3以及靶向HLA-DRB1外显子2的二级巢式PCR。第一巢式二级PCR反应仅扩增HLA-A外显子2和3。在一级多路PCR的产物上单独进行第二PCR反应，其中仅扩增HLA-DRB1外显子2。第三独立的二级PCR反应使用来自一级多路反应提及的模板，并以多路形式扩增HLA-A的外显子2和3以及HLA-DRB1的外显子2。图7B展示特异于HLA-A和HLA-DRB1的一级PCR反应，其中对于10ng人类基因组纯化的DNA的5个样本同时扩增两个基因。两个不同大小的条带在凝胶上分辨开，对应着HLA-A于1000bp和HLA-DRB1于约650bp。图7C-7E展示HLA-A加上HLA-DRB1的第一多路PCR发生之后进行的二级多路反应。图7C显示对于HLA-A外显子2和3的外显子特异性HLA-PCR。图7D展示对于HLA-DRB1外显子2的外显子特异性HLA-PCR。最后，图7E展示HLA-A外显子2和3以及HLA-DRB1外显子2在相同的外显子特异性HLA-PCR中的平行扩增。由于扩增子大小的相似性，条带在凝胶中不能被区分开。HLA-A外显子2和3的片段大小约为320bp而HLA-DRB1外显子2是310bp长。凝胶在使用2%琼脂糖凝胶上进行分辨，使用Amresco EZ-Vision DNA染料使凝胶可视。图7F展示从UCLA免疫遗传学参考组上选择的2个样本的基因分型数据，公开的已知基因型在栏上标记为UCLA。表中绿色对应着100％匹配的基因型。蓝色代表来自GUSA的在血清学水平上匹配的基因分型数据。白色的单元格（cell）代表在分析软件中经过阈值的调整的不匹配的基因型或假阳性杂交。
图7G-7L表示多个平行的HLA基因的串联PCR扩增：HLA-A和HLA-DRB1。基因座特异性多路和外显子特异性多路HLA-PCR反应在从UCLA免疫遗传学的I型HLA参考组上检索的5个样本的组上进行。图7G描绘了一级HLA-PCR，其中基因HLA-B和HLA-DRB1的基因座特异性引物用于多路化一级PCR。对基因座特异性PCR的产物进行1：100稀释，并且稀释液的21用于一组靶向HLA-B外显子2和3以及靶向HLA-DRB1外显子2的二级巢式PCR。第一巢式二级PCR反应仅扩增HLA-B外显子2和3。在一级多路PCR的产物上单独进行第二PCR反应，其中仅扩增HLA-DRB1外显子2。第三独立的二级PCR反应使用来自一级多路反应提及的模板的并以多路形式扩增HLA-B的外显子2和3以及HLA-DRB1的外显子2。图7H展示特异于HLA-B和HLA-DRB1的一级PCR反应，其中对于10ng人类基因组纯化的DNA的5个样本同时扩增两个基因。两个不同大小的条带在凝胶上分辨开，对应着HLA-B于1000bp和HLA-DRB1于约650bp。图7I-7K展示HLA-B加上HLA-DRB1的第一多路PCR发生之后进行的二级多路反应。图7I显示对于HLA-B外显子2和3的外显子特异性HLA-PCR。图7J展示对于HLA-DRB1外显子2的外显子特异性HLA-PCR。最后，图7K展示HLA-B外显子2和3以及HLA-DRB1外显子2在相同的外显子特异性HLA-PCR中的平行扩增。由于扩增子大小的相似性，条带在凝胶中不能被区分开。HLA-B外显子2和3的片段大小约为320bp而HLA-DRB1外显子2是310bp长。使用2%琼脂糖凝胶来分辨凝胶，并使用Amresco EZ-Vision DNA染料使凝胶可视。图7L展示从UCLA免疫遗传学参考组上选择的2个样本的基因分型数据，公开的已知基因型在栏上标记为UCLA。表中绿色对应着100％匹配的基因型。蓝色代表来自基因组学USA在血清学水平上匹配的基因分型数据。表中白色的单元格代表在分析软件中经过阈值的调整的不匹配的基因型或假阳性杂交。
图8A-8B是表格，其显示经过对未经加工的血液、干燥的血点（7A）以及未经加工的颊拭子的微阵列分析获得的HLA分型，从经过实施例5&6的方法获得的那些拭子（7B）纯化的相应DNA。通过收集于EDTA（作为所选的抗凝剂）中的七个不同血液样本的未经加工的血液、重新水化的血点、和纯化的DNA获得的基因分型数据与新西兰血液服务机构提供的基因分型数据进行比较用于验证。在大多数情况下，数据显示在血清学水平上结果之间的总体一致以及剩余样品中的高分辨率（图8A）。图8B展示，与实验室Corps提供的匹配的纯化DNA和独立的基因分型相比的粗制的颊样品洗脱液的基因分型数据。数据证明局部收集的11个样本的高水平一致性。绿色证明基因组学USA基因分型和Corps实验室之间的100％一致性。蓝色阴影的数据点代表在血清学水平上的一致性，而白色的数据点涉及未能匹配上第三方提供的基因型。
具体实施方式
如此处所用的术语“一”或“一个”可能意味着一个或多个。如此处权利要求中所用，当结合词“包括”一起使用时，词“一”或“一个”可能意味着一个或多于一个。如此处所用“另一个”或“其它”可能意味着至少一个第二个或更多个相同或不同权利要求的元素或其组成。
尽管本公开支持仅指替代物以及“和/或”的定义，除非明确表示是仅指替代物或替代物是相互排斥的，如此处在权利要求中所用的术语“或”是指“和/或”。
如此处所用，术语“个体”或“群体”是指生物标本的供体或潜在的供体，例如在此处所述的扩增和HLA分型方法中使用的未经加工的血液。
如此处所用，术语“未经加工的样本”或“未经加工的生物样本”是指未经处理或未纯化的样本，除了如此处所述其用于第一扩增中，如果它是或已经是干燥的需要重新水化未经加工的样本的那些步骤以外。
在本发明的一个实施方式中，提供了用于扩增兴趣DNA的方法，包括获得包括DNA的未经加工的样本；在未经加工的样本上进行第一PCR来产生第一扩增子；稀释第一扩增子；并就此进行第二PCR直至第二PCR反应中使用的所有引物耗尽来产生第二扩增子，从而将输入样本DNA扩增到最终扩增的DNA产物浓度，这受到第二PCR反应中引物浓度的限制，所述第二PCR反应不依赖于包括原始的样本的DNA的量或纯度。
本方法的实施方式进一步还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物。荧光团的一个实例是菁染料。在本方法的另一个实施方式中，可包括对第二扩增子进行测序用于其分析。在此另一个实施方式中，分析可确定身份、个体亲权、法医信息、组织配型、疾病发展的风险因素、或对药物的反应中的一个或多个。
在所有实施方式的一方面中，方法还包括在未经加工的样本上针对一组基因靶平行进行第一PCR来产生第一组扩增子；稀释第一组扩增子；并就此进行第二PCR，使用一级扩增子的整个组作为第二PCR反应的一组模板直到所有二级PCR引物被耗尽来产生第二扩增子组，从而扩增DNA。在这方面，5个以内基因靶、10个以内基因靶或20个以内基因靶，可平行扩增。此外，基因靶可能是HLA-DRB1、DQ-A1和DQB1。可能是DQ-A1和DQ-B1或可能是HLA-B和KIR。此外，该基因靶是线粒体复制起点附近的两个高变区以及一个或多个额外的线粒体基因。此外，基因靶可能是微生物特异性微生物16S DNA基因的区段从而方法在未经加工的样本中检测微生物。
在所有实施方式的另一方面中，DNA包括一个或多个兴趣基因，并且方法可还包括第二扩增子与具有兴趣基因相关等位基因变异的序列的探针进行杂交；从杂交的扩增子检测荧光图式；并基于荧光图式指定等位基因型。兴趣基因可能是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-DRB1基因、HLA-DQA1基因、或HLA-DQB1基因。
在所有实施方式中，第一PCR的引物可能是基因座特异性的引物。基因座特异性的引物的实例可能具有SEQ ID NOS：1-14所显示的序列。此外，在所有实施方式中，第二PCR反应的引物靶DNA序列可包含在第一PCR反应的扩增产物中。一方面中，第二PCR反应的引物可能是一组多外显子特异性引物。特别是，外显子特异性引物可具有SEQID NOS：15-27所显示的序列。此外，未经加工的样本可能是新鲜的或重新水化的，并包括未处理的流体血液、干燥的未处理的血液、新鲜的颊拭子样本、干燥的颊拭子样本、排泄物材料、阴道样本或通过擦拭有生命的或无生命的表面或物体获得的样本。此外还在所有实施方式中DNA可能是线粒体DNA。
在本发明的另一个实施方式中，提供了用于扩增一个或多个兴趣RNA的方法，包括从个体获得未经加工的生物样本；在未经加工的生物样本上进行第一逆转录PCR来产生第一cDNA扩增子；稀释第一扩增子并就此进行第二PCR直至所有引物被耗尽来产生第二扩增子，从而扩增兴趣RNA。
本方法的实施方式进一步包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物。荧光团的一个实例是菁染料。在两个实施方式中，未经加工的生物样本可能是新鲜的或重新水化的，并包括血液、颊样本、阴道样本或通过擦拭有生命的表面或物体获得的其它样本。
在另一个本实施方式的一方面中，该方法可包括第二扩增子或扩增子的组与具有互补于基因序列兴趣区的序列的探针杂交；从杂交的扩增子中检测荧光图式，并基于荧光图式鉴定一个或多个基因或其等位基因型。基因的实例是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-DRB1基因、HLA DQA1基因、HLA DQB1基因或KIR基因中的一个或多个。在这些实施方式的另一方面中，方法可进一步包括对第二扩增子进行测序用于其分析。在这一方面中，分析可确定身份、个体亲权、法医信息、组织配型、疾病发展的风险因素、或对药物的反应中的一个或多个。
在所有实施方式中，第二PCR可能是线性PCR并且第二扩增子是cRNA。或者，第二PCR可能是实时PCR并且引物对于第一cDNA扩增子是外显子特异性的。此外，第一扩增子是HLA-A、HLA-B或HLA-DBR1、HLA-DQA1或HLA-DQ-B1 cDNA中的一个或多个，并且外显子特异性引物具有SEQ ID NOS：15-27显示的序列。此外，未经加工的样本可能是如上所述的。
在本发明的另一个实施方式中，提供有用于兴趣基因的等位基因分型的方法，包括从一个或多个个体中获得未经加工的生物样本；使用特异于基因基因座或定义的基因基因座的组的引物，在未经加工的生物样本上进行第一PCR来产生第一扩增子或第一组扩增子；稀释第一扩增子或第一组扩增子，并且用扩增子作为第二PCR反应的模板使用特异于基因基因座中外显子或外显子组的引物进行第二PCR直到所有引物被耗尽来产生来自第二PCR反应的扩增子组；第二扩增子或第二扩增子组与具有兴趣基因或基因的组相关的等位基因变异的序列的探针杂交；从杂交的扩增子或扩增子组中检测信号，并且基于检测的杂交信号指定等位基因型。在这些实施方式的一方面中，第一扩增子或扩增子的组可能是从包括样本的RNA扩增而得的cDNA，并且第二PCR是就此进行的线性PCR或实时PCR。
在此实施方式中，可检测的信号可能是荧光，其中用一个或多个荧光团标记第二PCR引物对。荧光团的一个实例是菁染料。此外，第一和第二PCR引物序列、兴趣基因和未经加工的生物样本可能是如上所述的。此外，个体可包括在露天场地环境中的群体。
此处提供使用未经加工的标本用于个体或群体规模的扩增以及DNA或RNA的HLA分型的方法和系统。例如，尽管不限于，微制造装置或“芯片实验室”（LoC）装置提供诊断或公共健康中高价值、临床相关的应用。实施本方法和系统使得能够快速、微型化的DNA或RNA的收集地点（point-of-collection）分析，其显著降低了设备和耗材的成本。特别是，此处提供的方法和系统允许用户在HLA分型之前可以完全省去DNA纯化和随后的DNA定量。
因此，本发明提供从未经加工的生物标本中扩增DNA或RNA的方法。标本可能是但不限于血液，比如获自一个或多个个体的手指刺破或新生儿和大一些的婴儿的足跟刺破。标本可能以液滴的形式立即用于扩增或在卡（如古瑟瑞卡（Guthrie card））上干燥用于随后的重新水化，随后是扩增或其它处理。用于获得血液样本或滴、以及干燥、储存和血滴的重新水化的方法是本领域熟知的且标准的。用于扩增的未经加工的血液或重新水化的干血的量约1-2微升。未经加工的血液样本可收集自单个个体或收集自群体。样本的收集可以在露天场地中、在诊断实验室或诊所或医生办公室进行。使用扩增子的DNA扩增和随后的HLA分型可在收集地点实时进行。
标本还可能是，但不仅限于上皮细胞，比如获自用Q端在一个或多个成人或新生儿或较大的婴儿上的颊拭子。标本可立即作为湿拭子用于扩增或空气干燥用于随后的重新水化，随后是扩增或其它处理。用于获得拭子样本、以及干燥、储存和拭子样本的重新水化的方法是本领域熟知的且标准的。用于扩增的未经加工的湿润的拭子材料或重新水化的干燥的拭子材料是约1-2微升。未经加工的拭子样本可收集自单个个体或收集自群体。样本的收集可以在露天场地中、在诊断实验室或诊所或医生办公室进行。使用扩增子的DNA扩增和随后的HLA分型可在收集地点或运输到地区实验室过程中实时进行。
在收集的未经加工的标本上而无需先纯化DNA进行DNA的PCR扩增；使用高度的基因或基因座特异性引物，正如目前通过熟知且标准的方法所实现的。基因座特异性引物的实例具有SEQ ID NOS：1-14所示的序列。运行串联PCR（PCR#1、PCR#2）从而第一PCR反应在未经加工的标本（比如血液、或重新水化的干燥的血点、重新水化的未经加工的拭子洗脱液或排泄物样本）上发生。众所周知由于在血液或拭子材料中PCR抑制剂对标本的污染不可控，一级PCR反应的产量可显著的不同。这是可以解释这种未经加工的血液或未经加工的拭子PCR在商业情况中通常是不成功的。
然而，在本发明中，使用采用基因座特异性引物（比如但不限于外显子特异性引物）的亚组或亚序列的第一PCR反应的产物发生第二PCR反应。外显子特异性引物的实例，如SEQ ID NOS：15-27所显示的序列。因为第二PCR反应被设置为是引物限定的，即第二PCR反应意图进行到直至所有加入的PCR引物寡核苷酸被耗尽，源自第二PCR反应的PCR产物的量变得不依赖于第一PCR反应获得的产物的变量。因此，由于来自未经加工的血液标本的不受控的污染，第一PCR反应的产量上的显著差异被第二反应的自我限制性质所校正。此外，第一PCR反应的产物被显著稀释为第二PCR反应，从而将一开始污染未经加工的标本的PCR抑制剂的作用最小化。净结果通常是通过使用这种系列的两个PCR反应获得预先确定的最终PCR产物的量，即通常是通过两个PCR反应中的第二个所用的PCR引物的量确定最终产物的量。此外，通过将一级PCR反应显著稀释成第二PCR反应，整体的串联PCR反应因此实质上不依赖于原始未经加工的样本中PCR抑制剂污染中不受控制的变化。
使用此处所述的串联PCR方法可完成RNA扩增。如同DNA扩增，获得未经加工的血液样本，新鲜的或重新水化的干燥的样本，进行逆转录（RT）PCR扩增，随后是PCR，如实时PCR、终点PCR或线性cRNA扩增或合成。
扩增子，可能是但不限于扩增的人类白细胞抗原基因HLA-A、HLA-B或HLA-DRB1或DQA1或DQB1基因或HLA受体KIR，杂交至微阵列或芯片，其包括覆盖基因中一个或多个外显子兴趣区域（比如单核苷酸多态性的等位基因变异）的重叠探针组。外显子特异性引物可标记有产生可检测信号的部分或染料。例如，使用荧光团标记的引物，如用菁染料如Cy3或Cy5，其是外显子特异性的。杂交的扩增子探针对可因此被检测到，并且杂交图式与等位基因型相关。代表性的微阵列设计被美国专利号7,354,710和美国公开号20070298425和20090011949均由Hogan等人所公开，并且因此并入作为参考。此外，例如，美国公开号20070298425公开了用来扩增HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1基因的HLA引物，以及适用于位点特异性杂交的负责HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1基因中等位基因变异的HLA探针序列。
或者，在第二DNA或RNA扩增子上使用标准已知程序（比如但不仅限于焦磷酸测序）可进行核酸序列或长度分析。这种分析可用于获得HLA类型或获得个体身份和/或亲权。例如，长度依赖性核酸分析，通过基于短的末端重复（STR）的标识符反应，是目前大多数人类鉴定的基础。此外，序列或长度分析可提供例如从犯罪现场取得的样本的有用的法医信息。此外，出于人类鉴定的目的，可在线粒体DNA上进行此处所述的串联PCR反应。当样本受损时，比如非常少或被降解，使用线粒体DNA尤其有用，因为其增加的拷贝数。当样本线粒体DNA包括线粒体复制起点附近的两个超变区以及一个或多个额外的线粒体基因时，此处提供的串联PCR方法是有用的。此外，尤其是出于评价疾病风险或对药物的反应目的的基因的组的分析，除了HLA或KIR或线粒体DNA以外，可在基因或基因的组上进行此处提供的串联PCR方法。此外，可在微生物特异性微生物16S DNA基因的区段上进行串联PCR反应。因为微生物16S DNA基因在微生物之间不同，此处所述的方法可用于检测未经加工的样本（例如排泄物质）中存在的微生物。
此外，即时方法并不局限于未经加工的血液作为样本来源。最特别的是该方法可用于处理通过擦拭口内或阴道区域、或皮肤表面或其它表面或物体获得的含DNA或RNA的标本。此外，擦拭的表面或物体可能是无生命的并且获得的样本可以通过即时方法处理来获得犯罪现场的证据。
如果样本是流体的，如来自口或颊拭子，通过从拭子挤压出流体而不用DNA纯化，获得的样本可以直接用来支持此处所述的串联PCR或串联RT-PCR。如同在纸卡的干燥的血液，如果含拭子的样本是干的，或空气干燥后变干，其可重新水化而后获得的重新水化的拭子样本，也不用核酸纯化，可用来支持此处所述的即时方法。
此处提供的PCR扩增方法可以设计用于在包括芯片实验室（LoC）的系统上进行，例如但不限于HLA。用只需要一名操作技师操作的单个集成工作站的HLA-LoC替代要求当前的标准且熟知的HLA分型操作的整个工作流。一名技师只需要将预制芯片和试剂加载到工作站上并吸取输入血液标本到芯片上。此外，如果必要的话，一名技师可以倾向于平行（操作）多个工作站。从样本加载到最终的HLA型的不用动手的（hands-off）职责周期（duty cycle）少于每个标本1小时。HLA-LoC适用于基于个体的医生办公室中或群体当中露天场地诊所。此外，考虑的是采用自动化，HLA-Loc可成为所有HLA分型实验室的标准。
因此，HLA分型系统包括运行串联PCR的手段，比如PCR模块、HLA-LoC芯片、微阵列杂交平台，其中平台包括微阵列阅读器和用于数字化和杂交数据分析的软件。该系统还包括操作系统所需的并且是本领域已知的且标准的必要处理器和内存和存储组件。考虑的是，所有的样本处理步骤在一个简单的卡式盒（cartridge）格式中是自动化的。尤其是，并非限制性的，包括系统的两个分析设备，即使用模块架构方法将PCR模块和微阵列阅读器集成到一个低廉的装置中。用模块方法，该系统可以经优化来满足来自医生办公室或露天场地诊所、其它极端情况中收集地点产生的那些、中央实验室比如ASHI认证的组织配型实验室中产生的那些的各种要求。
HLA分型或其它基因分析的即时方法不限于芯片实验室的应用。通过即时串联PCR方法的相似应用、或串联RT然后PCR方法的相关应用，如果串联反应在平行的很多个96反应中进行，也可以使用即时方法对批处理（非芯片实验室的格式）进行HLA分型而不用进行核酸纯化，随后跟随着通过微阵列的获得的二级PCR扩增子分析，或跟随着可以平行进行的其它遗传分析方法。
考虑的是，PCR#1+PCR#2方法和系统可用于其它基于PCR的遗传测试来取代标准的DNA纯化+DNA定量+PCR的步骤。此外，考虑的是，此处提供的HLA分型方法可用于其它医疗或健康应用。例如，实体器官移植和骨髓和干细胞移植需要HLA分型。此外，HLA分型的即时方法可用于公共健康应用，如但不仅限于个性化接种反应性、传染病风险中基于HLA的变异以及基于HLA的对自体免疫疾病的敏感性。此外，考虑的是使用作为兴趣分析物组的未经加工的血液淋巴细胞RNA表达，无需纯化的RNA分析可用作早期败血症、或不良药物反应（ADR）的诊断工具。
出于说明本发明各种实施方式的目的给出如下实施例，并非意图以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易理解，本发明能很好地适于实现所提及的目的并获得结果和优点，以及此处固有的那些目的、结果和优点。本领域技术人员将理解，如权利要求的范围所限定的，其中的变化和其它用途包括在本发明精神范围内。
实施例1
在广范围的1°输入量之上，串联PCR产生恒定的2°产物
2μl未经加工的血液用作HLA芯片分析所需的一级基因座特异性HLA PCR反应的模板。通过Finnzymes
Figure BDA00001865405300141
血液直接检测试剂盒进行扩增。不同量的一级基因座特异性PCR产物，然后在H2O中进行稀释并用作二级自我限制的外显子特异性PCR反应的模板。然后一微升各获得的2°PCR反应产物加载到标准的丙烯酰胺凝胶上。通过Amresco EZ-Vision DNA染料使HLA-A外显子2和3以及HLA-DRB1外显子2（图1A）和HLA-B外显子2和3（图1B）可视。凝胶上的阳性对照是指相同的串联HLAPCR反应的产物，但不同的是使用10ng高纯度的罗氏DNA作为原始样本输入。可见，获自2μl未经加工的血液的最终2°扩增子的量几乎不依赖于反应中所用的1°扩增子的量，并且与从10ng纯化的罗氏DNA所获得的扩增的HLA产物在特异性和质量产量上相似。
实施例2
HLA基因座特异性扩增子的产生
使用从Finnzymes（Woburn，Mass）可商业上获得的Phusion Blood
Figure BDA00001865405300142
试剂盒通过PCR反应从2μl全流体血液产生HLA基因座特异性扩增子（图2A）。反应条件如下：20μl反应体积中
Figure BDA00001865405300143
血液PCR缓冲液，0.8μl
Figure BDA00001865405300144
血液DNA聚合酶，1.75mMEDTA，400nM各引物。使用以下操作进行反应循环：98°C下初始变性5分钟，随后是35个循环的i）98°C下变性5秒，ii）70°C下退火5秒，以及iii）72°C下延伸30秒，以及一次最后的72°C下延伸1分钟。
当从纯化的DNA（图2B）扩增HLA基因座时，10ng基因组DNA作为PCR模板，使用罗氏（Basel,Switzerland）FastStart Taq DNA聚合酶在如下条件下：在总反应体积25μl中1×PCR缓冲液（无镁++）、1.5mM MgCl2、0.16mg/ml BSA（V片段）、0.05μΜ各dNTP、400nM各引物、以及1单位的Taq。使用以下操作进行反应循环：98°C下初始变性5分钟，随后是35个循环的i）98°C下变性5秒，ii）70°C下退火1分钟，以及iii）72°C下延伸30秒，以及一次最后的72°C下延伸7分钟。
HLA基因座特异性一级PCR引物序列
HLA-A基因座一级引物对：
正向引物1：5'-GCC TCT GYG GGG AGA AGC AA-3'(SEQ ID NO:1)
反向引物1:5'-GTC CCA ATT GTC TCC CCT CCT T-3'(SEQ ID NO:2)
HLA-B基因座一级引物对：
正向引物2a:5'-GGG AGG AGC GAG GGG ACC GCA G-3'(SEQ ID NO:3)
正向引物2b:5'-GGG AGG AGA GAG GGG ACC GCA G-3'(SEQ ID NO:4)
正向引物2c:5'-GGG AGG AGC AAG GGG ACC GCA G-3'(SEQ ID NO:5)
反向引物1:5'-GGA GGC CAT CCC GGG CGA TCT AT-3'(SEQ ID NO:6)
反向引物3:5'-GGA GGC CAT CCC CGG CGA CCT AT-3'(SEQ ID NO:7)
反向引物3a:5'-TTC TCC ATT CAA CGG AGG GCG ACA-3'(SEQ ID NO:8)
反向引物3b:5'-TTC TCC ATT CAA GGG AGG GCG ACA-3'(SEQ ID NO:9)
HLA-DRN1基因座一级引物对组：
正向引物1a:5'-CTT GGA GGT CTC CAG AAC AGG-3'(SEQ ID NO:10)
正向引物1b:5'-CTT AGA GGT CTC CAGAAC CGG-3'(SEQ ID NO:11)
反向引物4-xx:5'-CAC ACA CAC ACA CAC ACT CAG ATT C-3'(SEQ ID NO:12)
反向引物4-07:5'-CAC ACA CAC AAC CAC ACT CAG ATT C-3'(SEQ ID NO:13)
反向引物4-10:5'-CAC ACA CAC ACA CAG AGT CAG ATT C-3'(SEQ ID NO:14)
来自基因座特异性反应的产物（图3A-3C）按1:100在分子生物学级水中稀释并用作随后外显子特异性“巢式”PCR反应的模板（图4A-4C）。使用Applied Biosystems'（FosterCity,CA）Amplitaq
Figure BDA00001865405300151
DNA聚合酶在100μl反应体积中与如下成分一起进行PCR反应：5μl1:100稀释的基因座特异性PCR产物、1×PCR缓冲液II、1.5mM MgCl2、0.16mg/mlBSA（V片段）、0.2mΜ各dNTP、400nM各引物、以及4单位的Amplitaq
Figure BDA00001865405300152
DNA聚合酶。循环条件是：94°C下初始变性2分钟，随后是40个循环的（i）98°C下变性30秒，（ii）68°C下退火30秒，以及（iii）72°C下延伸30秒，以及最后的72°C下延伸7分钟。用菁3染料标记外显子特异性PCR引物以有助于在微阵列扫描仪比如ProScan Array HT（Perkin Elmer，Waltham，MA）中通过激光激发/发射检测阳性杂交事件。
外显子特异性二级PCR引物序列
HLA-A外显子2二级引物对：
正向引物2b-24:5'-(cy3)AGC CTG GTT CAC TSC TCG YCC CCA GGC TC-3'(SEQID NO:15)
反向引物2a-28:5'-(cy3)TAC TAC AAC CTT GCC TCG CTC TGG TTG TAG TAG C-3'(SEQ ID NO:16)
HLA-A外显子3二级引物对：
正向引物2b-24:5'-(cy3)GTG AGA ACT AGT CSG GGC CAG GTT CTC ACA-3'(SEQ ID NO:17)
反向引物2b-26:5'-(cy3)GTA CCA GGT TCC CGT GGC CCC YGG TAC C-3'(SEQID NO:18)
HLA-B外显子2二级引物对：
正向引物2c-20:5'-(cy3)ACC CTC TTG AGC CGC GCC GGK AGG AGG GTC-3'(SEQ ID NO:19)
反向引物2a-28:5'-(cy3)TAC TAC AAC CTT GCC TCG CTC TGG TTG TAG TAG C-3'(SEQ ID NO:20)
HLA-B外显子3二级引物对：
正向引物2a-22:5'-(cy3)GTG AGA CTT ACC GGG GCC AGG GTC TCA CA-3'(SEQID NO:21)
反向引物2a-26:5'-(cy3)GTA CCA GGT TCC CAC TGC CCC TGG TAC C-3'(SEQID NO:22)
DRB1外显子2二级引物对组：
正向引物3-xx-24:5'-(cy3)AAC GTG CTT TTT CGT GTC CCC ACA GCA CGT TTC-3'(SEQ ID NO:23)
正向引物3-04-24:5'-(cy3)AAC GTG CTT TTT CTT GTC CCC CCA GCA CGT TTC-3'(SEQ ID NO:24)
正向引物3-07-24:5'-(cy3)AAC GTG CTT TTT TGT GCC CCC ACA GCA CGT TTC-3(SEQ ID NO:25)
反向引物3-xx-20:5'-(cy3)TGC AGC TTT GCT CAC CTC GCC GCT GCA C-3'(SEQID NO:26)
反向引物3-09-22:5'-(cy3)TGC AGA GTT GCT TAC CTC GCC TCT GCA C-3'(SEQID NO:27)
作为一个组在单个PCR反应中扩增的外显子特异性PCR’s，在使用如下程序的自我组装单碱基区分微阵列杂交（single base discriminatory microarray hybridization）中用作靶：微阵列载片在组装到Grace Bio-Labs（Bend,OR）ProPlate多列阵载片系统中之前，用ddiH2O在40°C下预冲洗15分钟。用由3×SSC（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）和5×Denhardt's溶液（Amresco,Inc.Solon,OH）组成的75μl预杂交缓冲液平衡微阵列载片/Poroplate上部构造上的16个孔的每一个。靶PCR产物与其它试剂相结合来制备由3×SSC、5×Denhardt's溶液和50％外显子特异性PCR产物组成的杂交混合物。混合物然后在99°C下变性5分钟，随后就在与基因分型微阵列杂交之前即刻迅速冷却至-20°C持续3分钟。变性的PCR产物施加到之前平衡的微阵列上并允许在25°C杂交16小时。杂交后，阵列用100μl每孔的0.2×SSC洗涤两次，每次15分钟。拆卸阵列盒（cassettes），用0.2×SSC以散装（bulk）形式简要洗涤载片，然后通过在Eppendorf 5810离心机中以60×g离心干燥。通过在Perkin-Elmer Scan-Array Lite激光扫描仪中，使用菁3和菁5通道分别设置为60％和40％的PMT增益，扫描载片获得荧光数据。产生的数据文件，由微阵列载片上的各探针特征的定量荧光测量组成，通过Genomics USA开发的软件进行分析以生成HLA基因型调用（calls）。
实施例3
芯片实验室微阵列平台
LoC微阵列平台（In-CheckTM）系统在单个芯片实验室上集成了PCR扩增和用于遗传测试的微阵列检测过程。通过在单个低密度微阵列上集成PCR扩增和杂交，该系统设计用于比如在HLA分型中鉴定多个核酸分析物。该系统是基于这样的技术，将顺流（fluidically）连接至由低密度微阵列组成的杂交反应器的PCR微反应器集成到微型硅芯片实验室（LoC）上。
PCR模块
PCR模块（In-CheckTM）具有集成的硅加热器、温度传感器和微型25μl体积，这允许PCR模块进行高度可靠的终点PCR所需的快速加热和冷却循环。通过温度控制系统（TCS；In-CheckTM）热驱动PCR模块。TCS以允许平行进行5种不同LoC测试的方式允许快速且可编程的温度循环。
芯片实验室
LoC是一种使用硅半导体MEMS技术制造，并安装到提供必要的机械、热和电连接的1”×3”塑料载片上的一次性装置。硅芯片是一种单片集成了具有30μl杂交区域的25μlPCR反应器的电活性系统，其承载了在1平方厘米上高达500个点的低密度微阵列。通过3个电阻加热器和位于PCR反应器上方的温度传感器保持精确的温度控制。
微阵列杂交及检测
在LoC芯片的1cmx1cm微阵列模块中可以放置多达500个探针点。微阵列模块顺流连接至LOC（In-CheckTM）上的PCR室，并耦合到芯片上的温度控制系统，从而允许在杂交和洗涤期间全面的温度控制。杂交后，通过将整个1”×3”LoC插入微阵列光学阅读器（OR；In-CheckTM）中读取微阵列模块。根据所需的分辨率，通过OR的扫描通常要60秒以内，随后直接将数据传输到额外的软件，如Ricimer（GenUSA，www.GenomicsUSA.com），用于基因分型。通过加样站由常规的实验工具直接将样本施加到LoC。由只具有常规生化训练的工作人员可以进行所有处理。预计用未经加工的血液作为样本输入每天每个工作站可以完成多达50个HLA-Loc测试（PCR模块上每次5个），基本上只有手工的移液作为必要实验室设备。
实施例4
微阵列图像处理
对于HLA芯片的临床和流行病学应用，有必要将未经加工的微阵列图像数据自动化地数字化，并根据探针杂交与我们已经描述的（局部）等位基因结构之间的关系，然后将那些图像数据转换成等位基因特异性探针调用。
自动化的阵列数字化
微阵列图像的数值分析是基于“点的寻找”以及，一经划界，点内杂交信号强度整合。这种点的寻找和整合是目前成像软件中的常规功能。通过采用Cy5标记的25merOligo-dT寡核苷酸的使用进行自动化的图像分析，其中寡核苷酸以5%的密度掺加到打印到阵列上的各探针元素中。通过引入这种标志物和使用成像仪的两种标准光学通道（对于标志物是Cy5以及对于杂交信号是Cy3），有可能不依赖于其它的点来定位各探针点：从某种意义上，基准标记物的数目等于杂交信号的数目，从而创建冗余。
等位基因特异性探针杂交数据自动组装成HLA等位基因型
在未经加工的数据，探针图，以及相关基因的所有已知等位基因序列读取之后，Ricimer软件在有或没有来自打印的探针的杂交信号的基础上确定等位基因调用。这是本质上是通过两阶段的淘汰过程而完成的。第一阶段涉及检查报告为“关闭”的各探针并比较该探针序列和已知的等位基因序列。如果等位基因的序列匹配一个或多个“关闭”探针的序列，那么等位基因作为候选被淘汰，因为它不能是样本中存在的等位基因对中之一。
此第一阶段一旦完成后，候选基因的组已显著减少。在这一点上，分别评价其余等位基因的每个可能的配对。各等位基因对与阵列所报告的整组“开启”探针进行比较。如果实验测量的“开启”探针组与等位基因序列预测的预期的“开启”探针组之间有任何差异，则该等位基因对不再被认为是解集的候选。进行这两步剔除步骤后，已确定解释数据的所有可能的等位基因配对，并报告给用户。典型地，还报告基于世界范围群体频率计算的配对中出现的等位基因的概率值，来辅助用户做决定。这种非常强大的等位基因调用统计学功能地成为呈现给用户的图形相间、实验HLA型的确定和所有可能的替代等位基因调用的基础。
实施例5
从流体状态的未经加工的血液以及从允许在古瑟瑞卡上干燥的未经加工的血液中的用于HLA-分型的PCR反应
未经加工的匿名未经加工的血液获自Memorial Blood实验室，Minneapolis MN，并且在-20℃冷冻保存直到需要时。解冻的未经加工的血液直接用作HLA芯片分析所需的一级基因座特异性HLA PCR反应的模板。通过吸取新鲜的从未冷冻过的血液至标准Whatman-GE古瑟瑞卡上，随后在层流罩中25℃下干燥72小时，制备相应的干燥的血液样本，并此后在25℃下保存在一个密封袋。对于古瑟瑞卡上干燥的血液，从血液卡上切除下2mm的圆冲孔，向其中添加100μl pH 7.5的100mM硼酸和1mM EDTA。冲孔然后在70℃下加热2小时来重新水化血点，并将血点的成分洗脱至溶液中。获得的流体相然后通过吹吸混合。重新水化的冲孔然后保存于-20℃直到分析。
对于未经加工的和重新水化的干燥的血液，不用随后的纯化1μl样本用作PCR模板。通过Finnzymes
Figure BDA00001865405300181
血液直接检测试剂盒进行第一PCR扩增。1μl一级基因座特异性PCR产物然后直接施加作为二级、自我限制的外显子特异性PCR反应的模板。一微升各获得的2°PCR反应产物然后加载至标准的丙烯酰胺凝胶上。通过AmrescoEZ-Vision DNA染料使HLA-A外显子2和3以及HLA-DRB1外显子2（图5A）和HLA-B外显子2和3（图5B-5C）可视化。凝胶上的阳性对照是指相同的串联HLA PCR反应的产物，但不同的是使用10ng高纯度的罗氏DNA作为原始样本输入。可见，获自1μl未经加工的血液的最终2°扩增子的量几乎不依赖于反应中所用的样本的量，并且与从10ng纯化的罗氏DNA所获得的扩增的HLA产物在特异性和质量产量上相似。
实施例6
来自重新水化的颊拭子的HLA分型的PCR反应
去除识别信息的颊拭子从当地的供体获得。通过用力上下擦拭二十下口的各四分之一，从每个参与者收集四个拭子，并放置在15mL锥形管中。从12个个体取整个口的拭子：A1-A12。样品在层流罩下干燥72小时。干燥的拭子然后在150μl重新水化缓冲液（100mM硼酸盐+1mM EDTA）中重新水化并在70℃溶解2×小时。获得的流体相然后通过吹吸混合。重新水化的拭子然后保存于-20℃直至分析。然后针对各兴趣HLA基因座进行巢式（串联）PCR反应。1μl未经加工的拭子洗脱液用于采用罗氏Taq聚合酶的一级25μL PCR反应。然后在25μL总PCR反应体积中的2.5μL一级扩增子产物上进行随后的（二级）PCR，仍然采用罗氏Taq聚合酶。一旦完成，通过QIAamp DNA血液Mini试剂盒（Qiagen目录#51104）提取剩余的样品（多达一半回收的体积）。在相同的微阵列HLA分型平台上运行获得的纯化的DNA。通过HLA分型的微阵列技术分析未纯化和纯化的颊DNA。通过凝胶电泳，将来自颊拭子的匹配的、去除识别信息的DNA与未经加工的、未纯化的样本获得的HLA类型进行比较。一微升各获得的2°PCR反应产物然后加载到标准的丙烯酰胺凝胶上。
一级基因座特异性PCR产物以及二级外显子特异性反应组的产物（作为单一多路反应进行的）展示于图6A（左）中，连同获自10ng纯化的DNA（获自样本）的一致反应产物（右）。通过Amresco EZ-Vision DNA染料使条带可视。正如所看到的，获自1μL未经加工的拭子洗脱液的最终的2°扩增子的量，与获自来自相同样本的10ng纯化DNA扩增的HLA产物相比，在特异性和质量产量上是相似的。图6B-6G展示在来自总共12个供体的未经加工的颊拭子上进行的串联PCR反应的产物。图6B-6D展示对于12个未经加工的颊拭子样本，特异于HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1的一级PCR反应，而图6E-6G展示对于12个未经加工的颊拭子样本，特异于HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1的二级PCR反应。可以看出，尽管一级PCR产物的产量在12个未经加工的重新水化的颊拭子样本的组之间是高度可变的（图6B-6D），但是随后的二级PCR反应在12个未经加工的颊拭子标本的组之间产生了在产量和特异性上几乎一致的扩增的外显子的系列（图6E-6G）。
实施例7
来自纯化的DNA的几个基因的平行多路PCR
使用FastStart Taq DNA聚合酶在如下条件下通过PCR反应从1μl全流体血液产生HLA-A加上HLA-DRB1、以及HLA-B和HLA-DRB1的HLA基因座特异性扩增子（图7A-7B，7G-7H）：在总反应体积25μl中1×PCR缓冲液（无镁++）、1.5mM MgCl2、0.16mg/mlBSA（V片段）、0.05μΜ各dNTP、平行扩增的各基因的400nM各基因座特异性引物、以及1单位的Taq。使用以下操作进行反应循环：98°C下初始变性5分钟，随后是35个循环的i）98°C下变性5秒，ii）70°C下退火1分钟，以及iii）72°C下延伸30秒，以及一次最后的72°C下延伸7分钟。
来自HLA-A和DRB1的基因座特异性反应的产物平行进行，以及HLA-B和HLA-DRB1也平行进行（图7B、7H），以1:100在分子生物学级水中稀释并用作随后外显子特异性“巢式”PCR反应的模板（图7C-7E、7I-7K）。图7A和7G的图表上还显示的是，基因座特异性PCR的稀释用作外显子特异性PCR反应的模板，其中仅扩增HLA-A、HLA-DRB1或HLA-B外显子。可以进行的第二反应是，对于HLA-A或HLA-B的外显子2和3可同时用来自HLA-DRB1的外显子2进行扩增。使用Applied Biosystems'（Foster City,CA）Amplitaq
Figure BDA00001865405300201
DNA聚合酶在100μl反应体积中与如下成分一起进行上述PCR反应：5μl 1:100稀释的基因座特异性PCR产物、1×PCR缓冲液II、1.5mMMgCl2、0.16mg/ml BSA（V片段）、0.2mΜ各dNTP、400nM各兴趣引物、以及4单位的Amplitaq
Figure BDA00001865405300202
DNA聚合酶。循环条件是：94°C下初始变性2分钟，随后是40个循环的（i）98°C下变性30秒，（ii）68°C下退火30秒，以及（iii）72°C下延伸30秒，以及一次最后的72°C下延伸7分钟。用菁3染料标记外显子特异性PCR引物以有助于在微阵列扫描仪比如ProScan Array HT（Perkin Elmer，Waltham，MA）中通过激光激发/发射检测阳性杂交事件。进行平行扩增的基因的杂交，其中HLA-A和HLA-B的外显子2和3以及HLA-DRB1的外显子2的二级扩增的产物，可以与在预先的数据收集中获得成功匹配的基因型的相应HLA 芯片进行杂交（图7F）。此外，平行扩增的基因（比如HLA-A和HLA-DRB1）的二级PCR产物可以杂交至HLA-A 芯片或HLA-DRB1芯片，同样适用于HLA-B和HLA-DRB1多路的二级PCR产物（图7L）。
实施例8
来自未经加工的未纯化的排泄物物质DNA的几个基因的平行多路PCR
排泄物DNA补充物（complement）的分析对于排泄物中微生物多样性的临床和研究分析、以及多样性和人或动物疾病之间的关系是非常重要的。众所周知，原核微生物中，基于其16S基因的序列变异以及从中表达的16S rRNA可以鉴定个体微生物。还已知，可以使用“通用”PCR引物组扩增16S DNA，其中当作为组使用时，将扩增原核16SRNA基因家族的所有成员，从而可以通过微阵列上的序列分析或通过化学或生化测序方法来分析扩增的DNA。尽管可以通过所有这些方法进行16S DNA序列分析来产生标本中原核微生物类型的评估，但是由于从排泄物物质中纯化DNA的相关成本和健康风险，在排泄物中这种类型的分析已被证明在大临床或露天场地研究中难以实施。
众所周知，普通人类大便的微生物含量包括10+10高至10+11微生物每CC，按质量计这接近1％。非常高的细胞密度的基础上，这些相同样本中的16S基因DNA的密度因此也将超过10+10高至10+1116S基因区段每CC，或约10+7拷贝每μl。在实施例1-9中所述的那种串联PCR反应在约10ng人类DNA（约2000拷贝）每μl上可良好运行。因此，在排泄物中普通微生物密度，16S DNA以高于未经加工的血液或颊拭子的实施例1-9中所展示的至少1000倍的拷贝数密度存在。在非常高的拷贝数的基础上，因此有可能使用此处所述的技术对未纯化的排泄物物质进行基于16S DNA的微生物多样性分析：
步骤1.通过用棍或枪头接触转移来获得约10μl（约10mm3）的排泄物。
步骤2.排泄物溶于约100μl水中。
步骤3.取约1μl稀释的排泄物混悬液，并用通用的16s PCR引物组进行一级16S PCR反应。
步骤4.从PCR反应#1中取1μl一级PCR扩增子产物组，稀释10倍，然后施加1-2μl稀释的一级扩增子混合物作为第二PCR反应的模板，可以用第一PCR反应中所用的相同的通用16S DNA引物组或靶向一级反应中扩增的16S PCR基因亚组的引物组起始第二PCR反应。
步骤5.二级PCR反应在杂交缓冲液中稀释并通过与微阵列杂交进行分析，其中微阵列包含特异于16S基因序列的变异的探针，其中已知16S基因序列的变异在原核生物混合物中可区分出一个原核生物：结果是，以在分析前省去了DNA纯化的方式，进行了一组原核生物的基于16S DNA的分析。
本说明书中提到的任何专利或出版物指示着本发明所涉及的领域的技术人员的水平。此外，并入这些专利和出版物作为参考至这样的程度，正如同各单个出版物专门地单独地并入作为参考。
本领域技术人员将容易地理解，本发明能很好地适于实现提及的目的并获得结果和优点，以及此处固有的那些目的、结果和优点。本实施例，连同此处所述的方法、程序和系统是目前优选实施方式的体现，是示例性的，并非意图作为本发明范围的限制。本领域技术人员将想到其中的变化和其它用途，如权利要求的范围所限定的，变化和其它用途包括在本发明的精神内。

Claims (39)

1.一种用于扩增兴趣DNA的方法，包括：
获得包括DNA的未经加工的样本；
在未经加工的样本上进行第一PCR来产生第一扩增子；
稀释第一扩增子；以及
就此进行第二PCR直到第二PCR反应中所用的所有引物被耗尽，来产生第二扩增子，从而将输入样本DNA扩增到最终扩增的DNA产物浓度，这受到第二PCR反应中引物浓度的限制，所述第二PCR反应不依赖于包括原始样本的DNA的量或纯度。
2.根据权利要求1的所述方法，包括：
在未经加工的样本上平行进行一组基因靶的第一PCR来产生第一组扩增子；
稀释第一组扩增子；以及
使用一级扩增子产物的整组作为第二PCR反应的一组模板，就此进行第二PCR，直至所有二级PCR引物被耗尽来产生第二扩增子组，从而扩增DNA。
3.根据权利要求2的所述方法，其中可平行扩增5个以内基因靶、10个以内基因靶或20个以内基因靶。
4.根据权利要求2的所述方法，其中基因靶是HLA-DRB1、DQ-A1和DQ-B1，是DQ-A1和DQ-B1或者是HLA-B和KIR。
5.根据权利要求2的所述方法，其中基因靶是线粒体复制起点附近的两个高变区以及一个或多个额外的线粒体基因。
6.根据权利要求2的所述方法，其中基因靶是微生物特异性微生物16S DNA基因的区段，所述方法在未经加工的样本中检测微生物。
7.根据权利要求1的所述方法，还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物。
8.根据权利要求7的所述方法，其中荧光团是菁染料。
9.根据权利要求8的所述方法，其中DNA包括一个或多个兴趣基因，还包括：
第二扩增子与具有兴趣基因相关等位基因变异的序列的探针进行杂交；
从杂交的扩增子检测荧光图式；以及
基于荧光图式指定等位基因型。
10.根据权利要求9的所述方法，其中兴趣基因是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-DRB1基因、HLA-DQA1基因、或HLA-DQB1基因。
11.根据权利要求1的所述方法，其中第一PCR的引物是基因座特异性引物。
12.根据权利要求11的所述方法，其中引物具有SEQ ID NOS：1-14所显示的序列。
13.根据权利要求1的所述方法，其中靶向DNA序列的第二PCR反应的引物包含在第一PCR反应的扩增产物中。
14.根据权利要求13的所述方法，其中第二PCR反应的引物是一组多外显子特异性引物。
15.根据权利要求14的所述方法，其中引物具有SEQ ID NOS：15-27所显示的序列。
16.根据权利要求1的所述方法，还包括：
对第二扩增子进行测序用于其分析。
17.根据权利要求16的所述方法，其中分析确定身份、个体亲权、法医信息、组织配型、疾病发展的风险因素、或对药物的反应中的一个或多个。
18.根据权利要求1的所述方法，其中未经加工的样本是新鲜的或重新水化的，并包括未处理的流体血液、干燥的未处理的血液、新鲜的颊拭子样本、干燥的颊拭子样本、排泄物材料、阴道样本或通过擦拭有生命的或无生命的表面或物体获得的样本。
19.根据权利要求1的所述方法，其中DNA是线粒体DNA。
20.一种用于扩增一个或多个兴趣RNA的方法，包括：
从个体获得未经加工的生物样本；
在未经加工的生物样本上进行第一逆转录PCR来产生第一cDNA扩增子；
稀释第一扩增子并就此进行第二PCR直至所有引物被耗尽来产生第二扩增子，从而扩增兴趣RNA。
21.根据权利要求20的所述方法，还包括用一个或多个荧光团标记第二PCR引物。
22.根据权利要求21的所述方法，其中荧光团是菁染料。
23.根据权利要求21的所述方法，还包括：
第二扩增子或扩增子的组与具有互补于基因序列兴趣区的序列的探针杂交；
从杂交的扩增子中检测荧光图式；以及
基于荧光图式鉴定一个或多个基因或其等位基因型。
24.根据权利要求23的所述方法，其中所述基因是HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-DRB1基因、HLA-DQA1基因、或HLA-DQB1基因或其组合中的一个或多个。
25.根据权利要求20的所述方法，还包括对第二扩增子进行测序用于其分析。
26.根据权利要求25的所述方法，其中分析确定身份、个体亲权、法医信息、组织配型、疾病发展的风险因素、或对药物的反应中的一个或多个。
27.根据权利要求20的所述方法，其中第二PCR是线性PCR并且第二扩增子是cRNA。
28.根据权利要求20的所述方法，其中第二PCR是实时PCR并且引物对于第一cDNA扩增子是外显子特异性的。
29.根据权利要求20的所述方法，其中第一扩增子是HLA-A、HLA-B或HLA-DBR1、HLA-DQA1或HLA-DQ-B1cDNA中的一个或多个，并且外显子特异性引物具有SEQ ID NOS：15-27显示的序列。
30.根据权利要求20的所述方法，其中未经加工的样本是新鲜的或重新水化的，并包括未处理的流体血液、干燥的未处理的血液、新鲜的颊拭子样本、干燥的颊拭子样本、排泄物材料、阴道样本或通过擦拭有生命的或无生命的表面或物体获得的样本。
31.一种用于兴趣基因等位基因分型的方法，包括：
从一个或多个个体获得未经加工的生物样本;
在未经加工的生物样本上使用特异于基因基因座或限定的基因基因座的组的引物进行第一PCR来产生第一扩增子或扩增子的组；
稀释第一扩增子或第一扩增子的组，并用这些扩增子作为用于第二PCR反应的模板，使用特异于基因基因座中外显子或外显子组的引物进行第二PCR，直到所有引物被耗尽来产生来自第二PCR反应的扩增子组；
第二扩增子或扩增子组与具有兴趣基因或基因的组相关的等位基因变异的序列的探针杂交；
从杂交的扩增子或扩增子组中检测信号；以及
基于检测的杂交信号指定等位基因型。
32.根据权利要求31的所述方法，其中第一扩增子或扩增子的组是从包括样本的RNA扩增而得的cDNA，并且第二PCR是就此进行的线性PCR或实时PCR。
33.根据权利要求31的所述方法，其中信号是荧光，用一个或多个荧光团标记所述第二PCR引物对。
34.根据权利要求33的所述方法，其中荧光团是菁染料。
35.根据权利要求31的所述方法，其中兴趣基因是HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-DRB1基因、HLA-DQA1基因、或HLA-DQB1基因或其组合中的一个或多个。
31、根据权利要求31的所述方法，其中基因座特异性引物具有SEQ ID NOS：1-14所显示的序列。
36.根据权利要求31的所述方法，其中引物的亚组是外显子特异性引物。
37.根据权利要求36的所述方法，其中外显子特异性引物具有SEQ ID NOS：15-27所显示的序列。
38.根据权利要求31的所述方法，其中未经加工的样本是新鲜的或重新水化的，并包括血液、干燥的血液、颊拭子样本、排泄物物质或阴道样本或通过擦拭有生命的表面或物体获得的其它样本。
39.根据权利要求31的所述方法，其中个体包括露天场地环境中的群体。
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