CN102822202B - 抑制金属蛋白的抗体 - Google Patents

Abstract

本申请涉及其识别[2(2-氨基乙基氨基甲酰基)-乙氧基甲基]-三[2-N-(3-咪唑-1-丙基)-乙氧基甲基]甲烷，一种非常类似于在基质金属蛋白酶中的反应性锌位点的局部结构和构象半抗原分子，的抗体。披露的是一种包括抗原识别区的抗体，该抗原识别区包括六个选自由SEQ ID NO:4-15构成的组中的CDR氨基酸序列。还披露了其应用。

Description

抑制金属蛋白的抗体

技术领域

在一些实施方式中，本发明涉及抑制诸如金属蛋白酶的金属蛋白的活性，并涉及利用该抗体用于治疗与金属蛋白的异常活性相关的诸如转移性癌症的疾病的方法。

背景技术

酶是对于从病原体感染到癌症的病症的医学靶标，因此许多药物通过抑制酶活性产生它们的药理学效应。为了获得高选择性，小分子合成抑制剂以及功能性阻滞大分子（例如抗体）通常靶向蛋白质表面位点。然而，由于在病理性症状（例如癌症和慢性感染）下发生的抗药性变异体（突变）的出现，这种方法已具有限制性效果。这样的基因改变以快速获得变异体的形式发生，导致了药物抑制的损失，同时保持蛋白质靶标的原始功能。因此，虽然极具有挑战性，在药物发展中靶向关键催化残基/元件和酶表面以保证在体内的潜能和选择性似乎是最终目标。

显著地，酶的内源性抑制剂利用分子识别机制靶向蛋白质活性位点和其表面两者。在这些之中是基质金属蛋白酶（MMP）的天然蛋白质抑制剂，即在调控生理和病理细胞过程中起重要作用的内在的自抑制性pro-区（前结构域，前区，pro-domain）和组织基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）。MMP pro-区和TIMP的分子和进化的设计利用高度有效的抑制原型机制（archetype mechanism），该机制涉及与存在于催化性裂缝中的催化性金属离子和蛋白质表面的元件的直接结合。通过对金属离子和表面表位特异性的抗体（Ab）模拟这些内源性抑制相互作用对于在体内特异性控制金属酶活性是期望的命题。阻滞靶标金属蛋白酶的金属活性是合理设计小分子抑制剂的标志。然而，由于在家族成员之间酶活性位点的高度结构相似性，因此已显示出设计针对各自的MMP的选择性小分子抑制剂是具有高度挑战性的。

包括中风、多发性硬化症（MS）和相关疾病在内的神经变性疾病影响社会的各个方面，引起巨大的痛苦和死亡以及施加巨大的财政负担。中风是由于脑部血液流动的短暂或持久的减少，而MS损伤的发病机理中最早已知的事件包括淋巴细胞穿透内皮迁移到中枢神经系统（CNS）白质中，其引起血脑屏障（BBB）的炎症和破裂。显著地，认为这些过程中的每一种很大程度上都是通过基质金属蛋白酶（MMP）的酶活性调节的。

认为MMP的主要功能是作为降解胞外基质（ECM）的结构组分的酶。然而，最新研究认为，除了它们典型的结缔组织重建（connective-tissue-remodeling）的功能之外，MMP还通过蛋白水解过程精确调控生物活性大分子的功能。因此，MMP对细胞功能的潜在影响是各种各样的。

已显示，在MS和中风中跨内皮下基膜（BM）的人T细胞迁移是通过明胶酶A和B（指定的MMP-2和MMP-9）的分泌介导的，明胶酶A和B的产生是通过独立的基因控制的。此外，已证实了米托蒽醌盐酸盐降低了基质MMP-9的活性，其中米托蒽醌盐酸盐降低患有MS的患者残疾和临床恶化的级数，正如由酶谱法、聚合酶链反应（PCR）和抑制性研究显示的。Rosenberg和同事证实了通过小分子抑制剂SB-3CT选择性抑制明胶酶降低了血液BBB破裂，并防止了神经元细胞死亡。然而，这种化合物遭遇在生理溶液中的低溶解度[Brain Res.2007]。

内皮下基板（基膜）是主要由IV型胶原（Type IV collagen）和层粘连蛋白构成的独特结构。IV型胶原形成耐非特异性蛋白水解降解而对明胶酶介导的蛋白分解敏感的非螺旋形多层网络。在体内，已发现明胶酶打开BBB，在诸如实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）的MS动物模型中，明胶酶的活性位点的药理性阻滞对抑制神经系统炎症是有效的。明胶酶除了作为T细胞迁移的介质（传递质，mediator）的关键作用之外，理论上这些蛋白酶的其他酶活性也可能促成MS的疾病过程。例如，明胶酶介导的髓磷脂碱性蛋白的裂解，可能促成这种高度致脑炎蛋白加速的抗原加工。此外，似乎缺血性中风之后不久的MMP（特别是明胶酶B）的上调通过介导神经血管基质的降解促成随后的脑损伤。这样的蛋白水解事件可以导致脑出血和神经细胞凋亡。重要地，证明了INF-β抑制人T细胞的明胶酶分泌和体内迁移。因此，控制MS中的明胶酶活性可以对治疗效能做出贡献。

国际专利申请WO2004/087042和WO2008/102359教导了靶向于MMP的催化锌离子和酶表面的抗体的产生。

发明内容

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了包括抗原识别区的抗体，该抗原识别区包括六个选自由SEQ ID NO:4-15构成的组中的CDR氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了一种药物组合物，包括本发明的抗体和药用载体。

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了在需要其的对象（受试者）中治疗与金属蛋白的不平衡或异常活性相关的疾病的方法，该方法包括给予对象（受试者）治疗有效量的本发明的抗体中的任意一种，从而在对象（受试者）中治疗与金属蛋白的不平衡或异常活性相关的疾病。

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了本发明的抗体中的任意一种在对象（受试者）中用于治疗与金属蛋白的不平衡或异常活性相关的疾病中的应用。

根据本发明的一些实施方式，抗体包括一个选自由SEQ ID NO:4、8、10和15构成的组中的CDR氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，选自由SEQ ID NO:4-15构成的组中的CDR氨基酸序列是由如在SEQ ID NO:16-27中给出的核酸序列编码的。

根据本发明的一些实施方式，抗体的VH区包括三个选自由SEQ IDNO:7-9和13-15构成的组中的CDR氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，抗体的VL区包括三个选自由SEQ IDNO:4-6和10-12构成的组中的CDR氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，抗体包括抗原识别区，该抗原识别区包括在SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中给出的CDR氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，抗体包括抗原识别区，该抗原识别区包括在SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9中给出的CDR氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，抗体具有如在SEQ ID NO:28中给出的VH氨基酸序列和如在SEQ ID NO:29中给出的VL氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，抗体具有如在SEQ ID NO:28中给出的VH氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，抗体具有如在SEQ ID NO:29中给出的VL氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，抗体针对MMP-9具有低于250nm的半最大有效浓度（EC₅₀）。

根据本发明的一些实施方式，抗体能够抑制金属蛋白的活性。

根据本发明的一些实施方式，金属蛋白是基质金属蛋白酶。

根据本发明的一些实施方式，基质金属蛋白酶是明胶酶。

根据本发明的一些实施方式，明胶酶选自由MMP-2和MMP-9构成的组。

根据本发明的一些实施方式，疾病是炎性肠疾病。

根据本发明的一些实施方式，疾病是神经变性疾病。

根据本发明的一些实施方式，神经变性疾病是多发性硬化症或中风。

除非另外定义，在本文中使用的技术和/或科学术语具有与本发明所属的技术领域中普通技术人员通常理解的相同的意义。虽然类似于或等同于在本文中描述的那些方法和材料能够用于本发明的实施方式的实施或测试，但是在下文中描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，包括定义的专利说明书将控制（冲突）。此外，材料、方法和实（施）例仅是例证性的并且不必然用来限制。

附图说明

参考附图，仅通过实施例的方式，在本文中描述了一些实施方式。现在参考特定的详细附图，强调显示的详细资料是以实施例的方式并且用于例证性讨论本发明的实施方式的目的。在这方面，随带附图做出的描述使得本领域技术人员明了可以如何实施本发明的实施方式。

在附图中：

图1A-C是MMP和锌骨架（Zn-tripod）的图示性描述。图1A：用半透明表面表示的二级结构中显示的MMP-9催化区。图1B：在四面体构象中催化金属蛋白位点、三个组氨酸侧链和水分子（未显示）结合锌离子（橙色球）的近景图。图1C：Zn-骨架的化学结构，其在结构和化学上模拟四面体构象中MMP的锌蛋白位点、3个咪唑和水分子结合锌离子（球体）。

图2A-D是针对SDS3/SDS4的结合数据和亲和力的示意图。图2A：小鼠中用Zn-骨架免疫的抗MMP-9免疫应答。通过直接ELISA检测在第1天免疫并且每两个星期加强的（boosted）小鼠的抗体反应，在ELISA上吸附以下物质作为抗原：Zn-骨架-BSA（■）、MMP-9催化区（●）、MMP-14催化区（▲）或BSA（◇）。图2B：通过SDS3和SDS4对MMP-9催化活性的抑制。图2C：SDS3/SDS4mAb（单克隆抗体）结合至MMP-9的剂量应答曲线。从四参数S形曲线拟合分析计算了SDS3和SDS4结合的EC₅₀反应（分别为200nm和15nm）。从固定的MMP-9结合至可溶的SDS3/SDS4的ELISA获得了结合数据。图2D：MMP-9-金属体（metallobody）复合物（红色）和活性MMP-9（黑色）在锌K边的代表性X-射线吸收谱，以从锌离子径向分布的形式呈现。（插图）在MMP-9-金属体复合物（红色）的边缘部位相对于活性MMP-9向更高能量移动。在锌K-边部位和XAS谱的整体径向分布的改变表明金属体与酶中的锌离子直接相互作用。

图3A-B是在体内SDS3对TNBS引发的结肠炎的影响的示意图。图3A：在小鼠中TNBS（每只小鼠1.5mg）引发严重的结肠炎，截至第7天≈20%存活率（●）。使用SDS325mg/kg（◇，45%存活率）或5mg/kg（▲，80%存活率）的每日静脉内（i.v.）治疗对防止死亡率是有效的，最有效的剂量是5mg/kg。各组包括10-12只小鼠。结果代表3次类似的独立实验中的1次。图3B：每日用5mg/kg SDS3静脉内或小鼠对照IgG治疗结肠炎（由每只小鼠1.25mg TNBS而引发）。与仅给予PBS的未经治疗的动物相比，由SDS3治疗显著降低了在TNBS给药后第7天测定的宏观损伤得分。与未经治疗的动物相比，小鼠IgG对照没有显现显著的改善效果。

图4A-C是示出了对SDS3-MMP9相互作用的结构分析的模型。与MMP-9催化区的SDS3（图4A）和SDS4（图4B）Fv相互作用的对接模型（docking model）揭示了直接结合至催化锌离子以及蛋白酶表面环。图4A：SDS3的CDR-H2（红色）穿入至MMP-9的活性部位（PDB代码：1GKC，黄色），并经由Tyr⁵⁶的羟基（棒）直接与催化锌离子（橙色球）相互作用。MMP-9的表面环（黄色）插入至与CDR环-L3（蓝色）、L1（青紫色，cyan）、H3（紫红色）相接触的抗体结合位点的边缘形成的宽裂缝（cleft）中。图4B：SDS4的CDR-H3（紫红色）穿入至MMP-9的活性部位，并经由Arg²¹⁴（棒）直接与催化锌离子相互作用。MMP-9的表面环（黄色）与CDR环-L1（青紫色）、H1（绿色）、H2（红色）和H3（紫红的）相互作用。图是使用PyMol制作的。图4C：由经典的蛋白质-蛋白质表面识别和金属-蛋白质相互作用构成的金属体的混合相互作用模式的示意模型。

图5是通过竞争ELISA测定的SDS3对Zn-骨架的结合亲和力的示意图。

在与表面涂覆的Zn-骨架-BSA相互作用之前，用各种浓度的可溶性Zn-骨架（竞争物）孵育抗体溶液。如果由抗体有效识别了竞争物，则将降低自由抗体的浓度，并从而将减少结合至固定在微量滴定板上的半抗原得到的产物。结合（率）根据在不存在任何竞争物下测定的结合的百分数，对于竞争物的浓度而绘制。根据在可溶的Zn-骨架需要50%抑制的浓度下测定IC₅₀，其为结合亲和力的估值。

图6是MMP-9-TIMP-1复合物的锌K-边（吸收）谱的示意图。以从锌离子径向分布的形式，呈现了MMP-9-TIMP-2复合物（红色）和活性MMP-9（黑色）的锌K-边的X-射线吸收谱。（插图）相对于活性MMP-9，MMP-9-催化区-mAb复合物（红色）在边缘部位移向更低能量。MMP-9-TIMP-1复合物的锌K-边XAS谱的改变表明与锌离子的直接相互作用。

图7A-B是示出SDS3仅识别MMP-2和-9的活性构象的照片。图7A：使用商业的抗-MMP-9抗体对MMP-9的蛋白质印迹分析（Western blotanalyses）。第1道-由蛋白G颗粒从小鼠腹水液中获取的SDS3；第2道-作为对照，类似地获取的无关的IgG；第3道-ProMMP-9，作为分子量标记以识别活性物质。图7B：分析固定在蛋白A颗粒上的SDS3mAb的活性以使纯化的ProMMP-9（顶部）、ProMMP-2（中间）或活性MMP-2（底部）下降（下拉，pull down）的能力。免疫沉淀物（第1道）和未结合的部分（第2道）在SDS/PAGE凝胶上分开，并且通过考马斯染色（Coomassie-staining）可视化。作为非特异性吸附的负对照，用蛋白A琼脂糖颗粒（Sepharose bead）（第3道）单独孵育酶。

图8A-C是示出SDS3/Zn-骨架复合物的结构的动画（cartoon）展示。图8A：在不对称的单元中，两个SDS3Fab分子的动画展示（Fab可变区（灰色），Fab恒定区（紫红色）），以头至尾相接的模式不对称地结合在一起。部分解离的Zn-骨架（画成绿色棒，锌离子画成橙色球）的锌离子（橙色球）通过两个咪唑臂配位，并且其四面体配位是通过来自相邻的Fab分子的轻链恒定区的两个残基（Glu¹⁹⁵羧酸酯和His¹⁹⁹ε²氮，画成粉色棒）完成的。因此，锌离子结合至相邻的Fab分子涉及分子间晶体填塞制品（crystal packing artifact）。图8B：具有Zn-骨架的复合物中SDS3Fv的近景图（特写图，close up view）。CDR是彩色的：H2-红色、H1-橙色、H3-黄色、L3-蓝色以及L1-青紫色。Zn-骨架解离的咪唑臂插入抗体结合位点。CDR-H2 Tyr⁵⁶（红色棒）倚靠着锌配体咪唑臂中的一个堆叠，并且是与锌离子最接近的残基。图8C：通过Web抗体建模（WAM）工具创建的SDS3Fv晶体结构的C-α和自由SDS3的同源性模型之间的结构排列。两个结构显示高度结构相似性，具有的RMSD偏差。不同的CDR采用它们标准的规范结构，表明在SDS3抗体结合部位中涉及部分解离的Zn-骨架的结合的晶体填塞（crystal packing）对结构改变没有显著影响。

图9A-D是SDS3和SDS4两者的治疗对抑制多发性硬化症的EAE模型中正在进行的（发作的，ongoing）疾病有效的示意图。

图10A-D是在多发性硬化症的EAE模型中SDS3和SDS4两者治疗降低临床得分严重性和总疾病负担的示意图。

图11A-B是在多发性硬化症的EAE模型中SDS4治疗提高的存活率-Kaplan Meier分析的示意图。

图12A-E是用SDS3和SDS4治疗防止TNBS结肠炎发展的示意图。通过存活率（A）、宏观损伤（B）、在结肠的苏木精/伊红染色切片中进行的组织病理学分析（C）监控A-F临床结肠炎的严重性。正常结肠（天然的，naive）、TNBS诱导的对照克隆、和用SDS3和SDS4治疗的TNBS诱导的小鼠的克隆的（D）结肠的宏观外形（目视外观，macroscopicappearance）以及代表性的结肠切片（E）的组织学特点。*，与用对照抗体治疗的小鼠相比和与未经治疗的小鼠相比，p<0.01。对于每一个治疗组n=7-10只动物，对于未经治疗的组n=19。

图13A-B是SDS3/SDS4结合至MMP-9的SPR分析结果的示意图。生物素化（biotinylated）的人或小鼠MMP-9催化纤连蛋白片段被固定在抗生蛋白链菌素（SA）芯片上。显示了对应于SDS3（图13A）和SDS4（图13B）与生物传感器表面固定的MMP-9相互作用的对照校正的传感图线（传感图，sensorgrams）。抗体浓度由不同的颜色代表，同时显示了比值。采集两份数据，并且显示了在配体浓度系列中的代表性SPR传感图线。通过SPR分析测定了ka（1/Ms）和kd（1/s）值，从ka和kd（KD=kd/ka）计算KD（M）。RU，反应单位。

图14A-B示出了锌结合抑制剂AHA对金属体结合至MMP-9的影响。在金属体与锌结合抑制剂-乙酰氧肟酸（AHA，Kd=8mM）共同注射后SDS3/SDS4结合至固定的活性MMP-9的表面细胞质基因组共振（表面等离子激元，Surface plasmon resonance）测定。AHA与SDS3/SDS4竞争暗示了金属体与锌离子的直接相互作用。

具体实施方式

本发明，在其中在一些实施方式中，涉及抑制诸如金属蛋白酶的金属蛋白的活性的抗体，并涉及利用这些抗体用于治疗与金属蛋白的异常活性相关的诸如转移性癌症的疾病的方法。

在详细地说明本发明的至少一个实施方式之前，应理解本发明不必限制于应用在以下描述所给出的或由实施例例证的细节中。本发明能够用于其它实施方式或以各种方式被实施或进行。

本发明人之前已经披露了识别金属酶的催化位点的电子或结构决定子两者的抗体能够用作其有效的抑制剂（见本发明人的WO2004/087042，将其内容通过援引合并入本文中）。本发明人设计了一种半抗原化合物，[2-(2-氨乙基氨基甲酰基)-乙氧甲基]-三-[2-(N-(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷，以产生另外的抗体。这种半抗原分子精密地模拟MMP中反应性锌位点的局部结构和构象（参见WO2008/102359，其内容通过援引合并入本文中）。

本发明人目前已经使用半抗原分子产生了新的抗体（称为SDS4），该半抗原分子针对MMP-9具有非常高的结合亲和力和特异性，EC₅₀为15nM。SDS4针对MMP-2和MMP-9表现出了紧密结合抑制模式（Ki=54nm），并针对MMP-14表现出了降低的结合抑制模式（Ki=1400nm），同时检测到针对MMP-7和TACE没有抑制活性（参见实施例部分的表6）。

在SDS3（以与SDS4相同的方式产生的另外的抗体）结晶以及比较SDS3和SDS4之间的CDR氨基酸序列之后，本发明人表明，SDS3和SDS4对MMP-9的结合和抑制是经由直接结合至催化锌离子以及结合至蛋白酶表面的部分介导的（图4A-C）。

本发明人证明了对于这两种抗体，重链CDR可变区中的一个穿入酶的底物结合裂缝中，经由金属配位的蛋白残基与催化锌离子形成直接键合（图4A-C），同时金属体的凹形适应蛋白酶的表面环。

此外，在由MOG引发的实验性自身免疫性脑脊髓炎（ExperimentalAutoimmune Encephalomyelitis）（EAE）动物模型、多发性硬化症（MS）的动物模型中，本发明人检测了SDS3和SDS4的潜在治疗效果。在图9-11中示出的结果暗示了SDS3和SDS4两者对于治疗MS的治疗潜能。

因此，根据本发明的一个方面，提供了包括抗原识别区的抗体，该抗原识别区包括六个选自由SEQ ID NO:4-15构成的组中的CDR氨基酸序列。

根据本发明的教导产生的抗体以及抗体片段，充当MMP的有效抑制剂，由于它们在催化锌位点中结合金属离子和配位的氨基酸两者的能力，因而特异性抑制在如上所述的病理过程中直接涉及的这些酶的活性构象。

如在本文使用的，术语“抗体”，指的是完整的抗体分子，而短语“抗体片段”，指的是其功能性片段，如能够结合至巨噬细胞的Fab、F(ab')₂和Fv。这些功能性抗体片段定义如下：（i）Fab，包括抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶对全抗体的消化以收获完整的轻链和一个重链的一部分而产生；（ii）Fab'，可以通过用胃蛋白酶处理全抗体，紧接着还原以收获完整的轻链和部分重链而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；（iii）(Fab')₂，可以通过用胃蛋白酶处理全抗体而不紧随着还原获得的抗体片段；F(ab')₂是两个Fab'片段通过两个二硫键保持在一起的二聚体；（iv）Fv，定义为基因工程的片段，其包括轻链的可变区和表达为两条链的重链可变区；（v）单链抗体（“SCA”），基因工程的分子，其包括通过适宜的多肽连接子（接头，linker）连接的轻链的可变区以及重链的可变区，作为基因融合的单链分子；以及（vi）用于编码单个互补性决定区（CDR）的肽。

产生抗体（例如单克隆和多克隆）的方法是本领域熟知的。可以经由本领域已知的几种方法中的任何一种产生抗体，该方法可以如披露的采用诱导体内产生抗体分子、筛选免疫球蛋白库或高度特异性结合试剂的组[Orlandi D.R.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833-3837,Winter G.et al.(1991)Nature 349:293-299]或通过培养连续型细胞系而产生单克隆抗体分子。这些包括但不限于，杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和非洲淋巴细胞瘤病毒（EBV）-杂交瘤技术[Kohler G.,et al.(1975)Nature 256:495-497,Kozbor D.,et al.(1985)J.Immunol.Methods 81:31-42,Cote R.J.et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030,Cole S.P.et al.(1984)Mol.Cell.Biol.62:109-120]。

在本发明的化合物太小而不能引发（elicit）强大的免疫应答的情况下，这样的抗原（半抗原）可以偶联到抗原性天然载体上，如钥孔戚血蓝蛋白（KLH）或血清白蛋白[例如牛血清白蛋白（BSA）]载体（参见美国专利No.5,189,178以及5,239,078和实施例部分的实施例2）。使用本领域熟知的方法可以实现偶联载体，例如可以实现直接偶联至氨基基团和可选地随后还原形成的亚氨基键。可替代地，可以使用诸如二环己基碳二亚胺或其他碳二亚胺脱水剂的缩合剂来偶联载体。连接子（接头）化合物也可以用于实现偶联；从Pierce Chemical Company，Rockford，Ill可得到同基双功能性连接子和异基双功能性连接子。然后得到的免疫原性复合物可以注射到适宜的哺乳动物对象（受试者）中，如小鼠、兔子等。根据血清中抗体加强产生的进度表，适宜的方案涉及在佐剂存在下免疫原的重复注射。使用本领域熟知的免疫测定规程，可以容易地测定免疫血清的效价。

可以直接使用获得的抗血清，或可以如在上文中描述的获得单克隆抗体。

使用本领域熟知的方法，可以获得抗体片段。（参见例如，Harlow andLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork,1988，通过引用合并入本文中）。例如，可以通过抗体的蛋白水解性水解作用或通过在DNA编码片段的大肠杆菌或哺乳动物细胞（例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白质表达系统）中表达而制备本发明的抗体片段。

可替代地，可以通过常规方法由全抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化获得抗体片段。例如，抗体片段可以用胃蛋白酶通过对抗体的酶裂解以提供表示为F(ab')₂的5S片段的产生。这种片段可以使用硫醇还原剂和可选的由二硫键的断裂得到的用于巯基的阻滞基团进一步裂解，以产生3.5SFab'单价片段。可替代地，使用胃蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab'片段和Fc片段。由例如，Goldenberg，美国专利No.4,036,945和4,331,647以及包含在其中的参考文献描述了这些方法，因此这些专利通过援引将其整体合并入本文中。还参见Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119-126,1959。只要片段结合至由完整抗体识别的抗原，还可以使用其他方法，抗体的断裂（如重链的分离以形成单价轻-重链片段），片段的进一步断裂，或其他酶技术、化学技术或基因技术。

Fv片段包括V_H链和V_L链的结合（缔合）。这种结合可以是非共价的，正如在Inbar et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 69:2659-62,1972中所描述的。可替代地，这些可变链可以通过分子间二硫键连接或通过诸如戊二醛的化学品偶联。优选地，Fv片段包括由肽连接子连接的V_H链和V_L链。通过构造包括编码由寡核苷酸连接的V_H区和V_L区的DNA序列的结构基因而制备这些单链抗原结合蛋白质（sFv）。结构基因插入表达载体中，其随后被引入到诸如大肠杆菌的宿主细胞中。重组宿主细胞合成由连接子肽桥连的两个V区的单个多肽链。例如，由Whitlow and Filpula,Methods,2:97-105,1991;Bird et al.,Science 242:423-426,1988；Pack et al.,Bio/Technology11:1271-77,1993；以及Ladner et al.,U.S.Pat.No.4,946,778描述了用于产生sFv的方法。

通过构建编码关注的抗体的CDR的基因可以获得CDR肽（“最小识别单位”）。例如，通过使用聚合酶链反应制备这样的基因以由产生抗体的细胞的RNA合成可变区。参见，例如，Larrick and Fry,Methods,2:106-10,1991。

应理解对于人类治疗或诊断，优选使用人化抗体。非人类的（例如小鼠的）抗体的人化形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（如抗体的Fv、FabFab'、F(ab')₂或其他抗原结合序列）的嵌合分子，其包括源于非人类免疫球蛋白的最小序列。人化抗体包括人免疫球蛋白（受体抗体），其中形成具有期望的特异性、亲和力和能力（capacity）的由来自诸如小鼠、大鼠或兔子的非人类物种（供体抗体）的CDR的残基取代形成受体的互补决定区（CDR）的残基。在某些情况下，由相应的非人类残基取代人免疫球蛋白的Fv框架残基。人化抗体还可以包括既没有在受体抗体中发现也没有在经导入的CDR或框架序列中发现的残基。一般而言，人化抗体将包括基本上全部的至少一个，并且典型地两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人化抗体可选地还将包括免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，典型地人类免疫球蛋白的至少一部分[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。

用于人化非人类抗体的方法是本领域熟知的。通常，人化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为导入残基（import residue），其典型地取自导入可变区（import variabledomain）。可以按照Winter和同事的方法[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)]，基本上通过用人类抗体的相应序列取代啮齿动物的CDR或CDR序列，实施人化。相应地，这样的人化抗体是嵌合抗体（美国专利号4,816,567），其中由来自非人类物种的相应序列已经取代了基本上少于一个完整的人类可变区。在实践中，人化抗体典型地是人抗体，其中由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代了一些CDR残基和可能的一些FR残基。

使用本领域已知的各种技术，也可以产生人类抗体，包括噬菌体展示库[Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等和Boerner等的技术还可用于制备人单克隆抗体[Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)和Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地，可以通过向转基因动物，如小鼠中引入人免疫球蛋白基因座来制造人类（抗体），其中该转基因动物中其内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活。在激发（进行免疫性试验，challenge）之后，观察人类抗体的产生，其在各个方面都非常类似于在人类中看到的，这些方面包括基因重排、组装和抗体谱（antibody repertoire）。例如，在美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和在下列的科学出版物中：Marks et al.,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368856-859(1994)；Morrison,Nature 368812-13(1994)；Fishwild etal.,Nature Biotechnology  14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology 14,826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)，描述了这种方法。

应理解本发明还提供了多特异性抗体和多功能抗体（例如双特异性抗体以及双功能抗体，如分别结合至两个或多个抗原或具有两种或多种功能或活性的抗体）。

一旦获得抗体，可以测试它们的金属蛋白抑制活性和结合亲和力。在Knight et al.,FEBS Letters 296(3):263-266(1992)，Cawston et al.,Anal.Biochem,99:340-345(1979)，Cawston et al.,Methods in Enzymology 80:771et seq.(1981)；Cawston et al.,Biochem.J.,195:159-165(1981)，Weingarten etal.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,139:1184-1187(1984)以及美国专利号4,743,587和5,240,958中描述了针对金属蛋白抑制活性的适宜的试验条件。

本发明的“金属蛋白（metalloprotein）”指的是金属结合的蛋白质，其中金属结合位点形成酶的催化区的一部分，其在电子和结构上都类似于用作免疫分子的Zn-骨架。

本发明的这个方面的金属蛋白优选是金属蛋白酶-MMP（例如诸如MMP-2和MMP-9的明胶酶）。

根据一个实施方式，本发明的抗体针对MMP-9具有低于250nm，更优选低于100nm和更优选低于50nm的半最大有效浓度（EC₅₀）。

应理解MMP家族的所有成员被转译为潜在酶，其一旦活化，就转变为活性酶，其中活性位点中的金属离子对于底物结合是可接近的（可进入的，accessible）。例如，之前已提出了“半胱氨酸开关模型（cysteine switchmodel）”以解释MMP的体外活化。半胱氨酸开关模型提出：一旦活化，通过带有硫醇（Cys）的前肽（propeptide）从锌原子上解离，潜在的锌结合位点转变为催化的锌结合位点。前肽（propeptide）的裂解导致酶的前区（前结构域，pro-domain）结构的断裂，并撤去催化锌离子的屏蔽。因此，金属离子和活性位点空洞（pocket）对于底物结合和水解是可接近的（可进入的）[Van Wart and Birkedal-Hansen(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,5578-5582]。

正如提到的，使用上面的方法，本发明人能够产生针对MMP-2和MMP-9的基质金属蛋白酶（MMP）抑制抗体。这些抗体中的一种称为SDS4，其具有在SEQ ID NO:28中给出的VH氨基酸序列和在SEQ ID NO:29中给出的VL氨基酸序列。SDS4的CDR序列在SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中提供。这些抗体中的另外一种称为SDS3，其具有在SEQ ID NO:30中给出的VH氨基酸序列和在SEQ ID NO:31中给出的VL氨基酸序列。SDS3的CDR序列在SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9中提供。

因此，只要不损害（compromise）其金属蛋白抑制活性（特异性抑制金属蛋白的催化活性），本发明提供任意（多）肽序列，其包括至少1个，更优选至少2个，更优选至少3个，更优选至少4个，更优选至少5个以及更优选至少6个上述CDR序列以及其同系物和片段。优选地，多肽针对MMP-9和MMP-2的Ki低于约1.5μM，在浓度为30μM时针对MMP-7或TACE没有抑制活性。

本发明人已经指出，SDS3（H2，SEQ ID NO:8）和SDS4（H3，SEQID NO:15）中的每一个的重链CDR可变区中的一个穿入至酶的底物结合裂缝中，经由金属配位的蛋白质残基与催化锌离子形成直接键合（图4A-C）。而且，本发明人已发现，SDS3的L1（SEQ ID NO:4）和SDS4的L1（SEQ ID NO:10）也可以穿入酶的底物结合裂缝中。相应地，本发明预期，本发明的这个方面的多肽至少包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15。

这样的多肽的实例是抗体（参见上文）。

本发明中涵盖的示例性抗体包括具有在SEQ ID NO:28中给出的VH氨基酸序列的那些和具有在SEQ ID NO:29中给出的VL氨基酸序列的那些。

如在本文中使用的，术语“多肽”包含天然肽（亦或降解产物、人工合成肽（synthetically synthesized peptide）亦或重组肽）和模拟肽（peptidomimetic）（典型地，人工合成肽）、以及为肽类似物的类肽和半类肽（semipeptoid），其可能具有，例如，修饰致使肽在体内更稳定或更能穿入细胞。这样的修饰包括，但不限于，N端修饰、C端修饰、肽键修饰（包括但不限于，CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH）、主链修饰，和残基修饰。例如，用于制备模拟肽化合物的方法在本领域是熟知的并且是特定的，例如在QuantitativeDrug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)中，其通过援引合并入本文中，如同完全在本文中给出的一样。在下文中提供了这个方面的进一步细节。

例如，可以用例如，N-甲基化键（-N(CH3)-CO-）、酯键（-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-）、酮亚甲基键（ketomethylen bond）（-CO-CH2-）、α-氮杂键（-NH-N(R)-CO-）（其中R是任意烷基，例如甲基）、卡巴键（carbabond）（-CH2-NH-）、羟基亚乙基键（-CH(OH)-CH2-）、硫代酰胺键（-CS-NH-）、烯属双键（-CH=CH-）、反向酰胺键（retro amide bond）（-NH-CO-）、肽衍生物（-N(R)-CH2-CO-）（其中R是“正常”侧链，天然地出现在碳原子上）。

这些修饰可以发生在沿着肽链的任意键处并且甚至同时（发生）若干次（2-3次）。

天然的芳香氨基酸，Trp、Tyr和Phe可以被替代为合成的非天然的酸，如苯基甘氨酸，Tic，萘基丙氨酸（Nal），苯基异丝氨酸，苏氨醇（threoninol），Phe的环甲基化衍生物，Phe的卤化衍生物或o-甲基-Tyr。

除上面的之外，本发明的肽也可以包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体（例如脂肪酸、复合糖等）。

如在本说明书和在权利要求书部分中使用的，术语“氨基酸”或“多种氨基酸”应理解为包括20种天然产生的氨基酸；那些通常在体内转译后修饰的氨基酸，包括，例如，羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸，包括但不限于，2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链赖氨素（isodesmosine）、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。

下表1和2列出了本发明可以使用的天然产生的氨基酸（表1）和非常规或修饰的氨基酸（例如合成的，表2）。

表1

氨基酸	三字母缩写	单字母符号
			丙氨酸	Ala	A
精氨酸	Arg	R
			天冬酰胺	Asn	N
天冬氨酸	Asp	D
			半胱氨酸	Cys	C
谷氨酰胺	Gln	Q
			谷氨酸	Glu	E
甘氨酸	Gly	G

组氨酸	His	H
			异亮氨酸	Ile	I
亮氨酸	Leu	L
			赖氨酸	Lys	K
甲硫氨酸	Met	M
			苯丙氨酸	Phe	F
脯氨酸	Pro	P
			丝氨酸	Ser	S
苏氨酸	Thr	T
			色氨酸	Trp	W
酪氨酸	Tyr	Y
			缬氨酸	Val	V
如上的任何氨基酸	Xaa	X

表2

通过包括噬菌体展示和计算生物学的本领域熟知的方法可以产生具有对关注的金属蛋白酶提高的亲和力或增强的生物活性的肽。

本发明的肽可以通过肽合成领域的技术人员已知的任何技术来合成。对于固相肽合成，许多技术的总结可以在：Stewart,J.M.and Young,J.D.(1963),"Solid Phase Peptide Synthesis,"W.H.Freeman Co.(San Francisco)；和Meienhofer,J(1973)."Hormonal Proteins and Peptides,"vol.2,p.46,Academic Press (New York)中找到。对于经典溶液合成的评论，参见Schroder,G.and Lupke,K.(1965).The Peptides,vol.1,Academic Press(NewYork)。对于重组技术参见进一步下文中的参考文献。

还涵盖了编码以上描述的多肽序列的核酸序列（参见SEQ ID NO:16-27）。

应理解本发明的抗体可以结合至功能性部分（moiety）（也称为“免疫结合体（免疫结合物，immunoconjugate）”），如可检测的或治疗性部分。免疫结合体分子可以是单独的分子，如可溶性的和/或合成的分子。

各种类型的可检测部分或报告部分可以结合至本发明的抗体。这些包括，但不局限于，放射性同位素（如^[125]碘）、磷光性化学制品、化学发光性化学制品、荧光性化学制品（荧光团）、酶、荧光多肽、亲和标签、和通过正电子发射断层显像术（PET）或磁共振成像（MRI）可检测的分子（对比试剂）。

适宜的荧光团的实例包括，但是不局限于，藻红蛋白（PE）、异硫氰酸荧光素（FITC）、Cy-铬、罗丹明、绿色荧光蛋白（GFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、得克萨斯红、PE-Cy5等。有关荧光团选择的另外的指导、将荧光团连接至各种类型的分子的方法，参见Richard P.Haugland,“Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals1992–1994”,5th ed.,Molecular Probes,Inc.(1994)；Oncoimmunin Inc.的美国专利No.6,037,137；Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Academic PressNew York,N.Y.(1995)；Kay M.et al.,1995.Biochemistry 34:293;Stubbs etal.,1996.Biochemistry 35:937；Gakamsky D.et al.,“Evaluating ReceptorStoichiometfy by Fluorescence Resonance Energy Transfer,”in“Receptors:APractical Approach,”2nd ed.,Stanford C.and Horton R.(eds.),OxfordUniversity Press,UK.(2001)；Targesome,Inc.的美国专利号6,350,466。当（抗体）结合至荧光可检测的部分时，可以用于检测抗体的荧光检测方法包括，例如，荧光活化的流式细胞计数法（FACS）、免疫荧光共焦显微术、荧光原位杂交（FISH）和荧光共振能转移（FRET）。

许多类型的酶可以附着在本发明的抗体上[例如，辣根过氧化物酶（HPR）、β-半乳糖苷酶、和碱性磷酸酶（AP）]，并且可以使用以下方法进行酶结合的抗体的检测：ELISA（例如，在溶液中）、酶连接的免疫组织化学试验（例如，在固定的组织中）、酶连接的化学发光试验（例如，在经电泳分离的蛋白质混合物中）或其他本领域已知的方法[参见例如，Khatkhatay MI.and Desai M.,1999.J Immunoassay 20:151-83；Wisdom GB.,1994.Methods Mol Biol.32:433-40；Ishikawa E.et al.,1983.J Immunoassay4:209-327；Oellerich M.,1980.J Clin Chem Clin Biochem.18:197-208；Schuurs AH.and van Weemen BK.,1980.J Immunoassay 1:229-49)]。

亲和标签（或结合对的成员）可以是由相应的抗体可识别的抗原[例如，由抗-DIG抗体识别的毛地黄毒苷（DIG））或对标签具有高亲和力的分子[例如抗生蛋白链菌素和生物素]。结合亲和标签的抗体或分子可以是荧光标记的或结合至如上所述的酶。

可以采用本领域广泛实施的各种方法将抗生蛋白链菌素或生物素分子附着在本发明的抗体上。例如，经由生物素蛋白连接酶（例如BirA）的识别序列可以将生物素分子附着至本发明的抗体，如在按照Denkberg,G.et al.,2000.Eur.J.Immunol.30:3522-3532的实施例部分描述的。可替代地，抗生蛋白链菌素分子可以附着在抗体片段（如单链Fv）上，基本上如在Cloutier SM.et al.,2000.Molecular Immunology 37:1067-1077；Dubel S.etal.,1995.J Immunol Methods 178:201；Huston JS.et al.,1991.Methods inEnzymology 203:46；Kipriyanov SM.et al.,1995.Hum AntibodiesHybridomas 6:93；Kipriyanov SM.et al.,1996.Protein Engineering 9:203；Pearce LA.et al.,1997.Biochem Molec Biol Intl 42:1179-1188中描述的。

诸如结合至抗生蛋白链菌素的荧光团的功能性部分可商购自基本上所有的免疫荧光流式细胞计数法试剂的主要供应商（例如，Pharmingen或Becton-Dickinson）。

根据本发明的一些实施方式，生物素结合的抗体结合至抗生蛋白链菌素分子以形成多价组合物（例如抗体的二聚体或四聚物形式）。

表3提供了可以结合至本发明的抗体的可识别部分的非限制性实例。

表3

正如提到的，抗体可以结合至治疗部分。治疗部分可以是，例如，细胞毒素部分、毒性部分、细胞因子部分和包括对本发明的抗体具有不同特异性的第二抗体（二抗，second antibody）部分。

在下表4中提供了可以结合至本发明的抗体的治疗部分的非限制性实例。

表4

根据本发明的一些实施方式，毒性部分是PE38KDEL。

取决于上下文、申请和目的，功能性部分（本发明的可检测的或治疗部分）可以以各种方法附着或结合至本发明的抗体。

当功能性部分是多肽时，免疫结合体可以通过重组手段产生。例如，编码毒素（例如PE38KDEL）或荧光蛋白[例如绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）或黄色荧光蛋白（YFP）]的核酸序列可以在框架中与编码本发明的抗体的核酸序列结合并在宿主细胞中表达以产生重组结合抗体。可替代地，功能性部分可以通过以下方法化学合成：例如，以规定的次序逐步添加一个或多个氨基酸残基，如固相肽合成技术。

使用本领域广泛实施的标准化学合成技术也可以将功能性部分附着至本发明的抗体[参见，例如hypertexttransferprotocol://worldwideweb.chemistry.org/portal/Chemistry]，如使用任意适宜的直接的或间接的化学连接（键联），经由肽键（当功能性部分是多肽时）或经由共价连接至插入连接元件，如连接肽或其他化学部分，如有机聚合物。可以经由结合在肽的羧基（C）或氨基（N）端或经由结合至内部化学基团（如直链、支链或环状侧链、内部碳或氮原子等）连接嵌合肽。抗体的荧光标记的描述在美国专利号3,940,475，4,289,747和4,376,110中详细地提供。

在下文中描述了将肽部分（治疗的或可检测的部分）结合至本发明的抗体中的示例性方法：

SPDP结合-在Cumber et al.(1985,Methods of Enzymology 112:207-224)中描述了SPDP结合方法的非限制性实施例。简言之，将诸如可检测的或治疗部分的肽（例如1.7mg/ml）与10倍过量的SPDP（在乙醇中50mM）混合；将抗体与在20mM磷酸钠、0.10M的NaCl（pH 7.2）中的25倍过量的SPDP混合，并且每一个反应在室温下孵育约3小时。然后将反应对PBS渗析。还原肽，例如在室温下用50mM的DTT持续1小时。用50mM的KH₂PO₄（pH6.5）通过在G-25柱上平衡使经还原的肽脱盐（可达5%样品/柱体积）。经还原的肽与SPDP-抗体以抗体：肽为1:10的摩尔比结合，并在4°C下孵育过夜以形成肽-抗体结合体。

戊二醛结合-在G.T.Hermanson(1996,"Antibody Modification andConjugation,in Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego)中描述了戊二醛结合方法的非限制性实施例。简言之，在10倍过量下用在0.1M磷酸盐、0.15M的NaCl（pH6.8）中的0.05%戊二醛混合抗体和肽（1.1mg/ml），并且使其在室温下反应2小时。可以加入0.01M赖氨酸以阻滞过量的位点。在反应之后，使用以PBS平衡的G-25柱（10%v/v样品/柱体积）去除过量的戊二醛。

碳二亚胺结合-使用诸如碳二亚胺的脱水剂可以实现肽和抗体的结合，例如在4-二甲基氨基吡啶的存在下。碳二亚胺结合可以用于在肽的羧基和抗体的羟基之间形成共价键（导致酯键的形成），或与抗体的氨基形成共价键（导致酰胺键的形成），或与抗体的巯基形成共价键（导致硫酯键的形成）。同样，碳二亚胺偶联可以用于在抗体的碳基团与肽的羟基、氨基或巯基之间形成类似的共价键[参见J.March,Advanced OrganicChemistry:Reaction's,Mechanism,and Structure,pp.349-50 & 372-74(3ded.),1985]。例如，使用碳二亚胺（如二环己基碳二亚胺），肽可以经由共价键结合至抗体上[B.Neises et al.(1978),Angew Chem.,Int.Ed.Engl.17:522；A.Hassner et al.(1978,Tetrahedron Lett.4475)；E.P.Boden et al.(1986,J.Org.Chem.50:2394)和L.J.Mathias(1979,Synthesis 561)]。

正如在上文中提到的，本发明的抗体的一个具体应用是防止或治疗与诸如金属蛋白酶的金属蛋白的不平衡或不正常活性相关的疾病。

这样的疾病的实例包括，但是不局限于，关节炎疾病，如骨关节炎（OA）、类风湿性关节炎（RA）、脓毒性关节炎、软组织风湿病、多软骨炎和肌腱炎；转移性肿瘤，牙周病；角膜溃疡，如由碱或其他烧伤、由辐射、由维生素E或类维甲酸缺乏引发的；肾小球疾病，如蛋白尿、营养不良型大疱性表皮松解症（dytrophobic epidermolysis bullosa）；骨质吸收疾病，如骨质疏松症、佩吉特病（变形性骨炎，Paget's disease）、甲状旁腺功能亢进和胆脂瘤（珠光瘤）；通过防止排卵或植入的节育；涉及肿瘤生长或与糖尿病视网膜病和黄斑变性有关的新血管形成的血管生成；与动脉粥样硬化斑块破裂有关的冠状血栓症；肺气肿、伤口愈合和艾滋病毒感染。

如实施例5所示，本发明人已经指出本发明的抗体可以用于治疗过敏性肠疾病。

炎性肠疾病（IBD）是严重的胃肠道病症，其特征为肠道炎症和组织重建，其频率增加并且可以证明使患者伤残（失能）。IBD的主要形式，溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩氏病是慢性的复发性病症，其临床上特征为腹痛、腹泻、直肠出血和发烧。

本发明人还提出本文中披露的抗体可以用于治疗神经变性紊乱（neurodegenerative disorder）。如实施例8所示，本发明人已经指出本发明的抗体可以用于治疗多发性硬化症。

正如在本文中使用的，短语“神经变性紊乱（neurodegenerativedisorder）”指的是神经系统（优选CNS）的任何紊乱、疾病或病症，其特征为神经组织、神经递质、或神经中枢的功能的逐渐和累进的损失（损耗）。神经变性紊乱的另外的实施例包括，帕金森氏病、中风、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、自身免疫性脑脊髓炎、阿尔茨海默氏症和亨廷顿氏症。

因此，根据本发明另外的方面，提供了在需要其的对象（受试者）中抑制基质金属蛋白酶活性的方法。

根据本发明的优选个体对象是动物，如哺乳动物（例如犬科，猫科，绵羊、猪、马科、牛科、灵长类），优选人。

该方法包括，向该对象提供治疗有效量的本发明的MMP抑制剂（即如上所述的抗体或抗体片段）。

正如在下文中进一步详述的，MMP抑制剂可以经由直接给药（例如口服给药或注射）提供，或其可以由给予个体的靶细胞的多核苷酸构建体表达。

本发明的MMP抑制剂可以以其本身提供给个体，或作为药物组合物的一部分，其中其与药用载体混合。

正如在本文中使用的，“药物组合物”指的是一种或多种在本文中描述的活性成分与诸如生理上适宜的载体和赋形剂的其他化学组分的制剂。药物组合物的目的在于便于化合物对生物体的给药。

在本文中，术语“活性成分”指的是抗体制剂，其可解释生物效应。

在下文中，可交替使用的短语“生理学可接受的载体”和“药用载体（药学可接受载体）”指的是载体或稀释剂，其不会对生物体引起显著的刺激，并且不消除给予的化合物的生物活性和性能。这些短语下包括佐剂。包含在药用载体中的成分中的一种可以是，例如聚乙二醇（PEG），一种在亦或有机介质亦或水性介质中具有宽范围的溶解度的生物相容性聚合物（Mutter et al（1979））。

在本文中，术语“赋形剂”指的是添加到药物组合物中的惰性物质，以进一步促进活性成分的给药。赋形剂的实例包括，而局不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

药物的配制和给药技术可以在"Remington’s Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA,latest edition中找到，其通过援引合并入本文中。

适宜的给药途径，例如，可以包括口服、直肠、经粘膜，特别是经鼻，肠内或肠胃外递送，包括肌肉、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

可替代地，人们可以以局部而不是系统的方式给予制剂，例如，经由向患者身体的特定区域直接注射制剂。

本发明的药物组合物可以通过本领域已知的工艺生产，例如依靠常规混合、溶解、粒化，制作糖衣丸（制作糖锭剂，dragee-making）、研磨（levigating）、乳化、封装、截留或冻干工艺。

根据本发明使用的药物组合物可以以传统方式配制，使用一种或多种生理学可接受载体，其包括赋形剂和辅剂，其促进活性成分加工成药物学可以使用的制剂。适当的配制（品）依赖于选定的给药途径。

对于注射，本发明的活性组分可以配制在水溶液中，优选在生理学相容的缓冲液（如汉克溶液、林格溶液或生理学盐缓冲液）中。对于经粘膜给药，在配制品中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知的。

对于口服给药，化合物可以容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药用载体结合来配制。这样的载体使得本发明的化合物被配制成片剂、丸剂、糖衣丸（糖锭剂，dragee）、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、膏剂（slurries）、混悬剂等，用于患者经口摄入。使用固体赋形剂可以用于制作口服使用的药理学制剂，可选地，如果希望，在加入适宜的辅剂之后，研磨得到的混合物，并且加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸核心。适宜的赋形剂是，特别地，填料，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨糖醇；纤维素制剂，如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻谷淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠（sodiumcarbomethylcellulose）；和/或生理学可接受的聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）。如果希望，可以加入崩解剂，如交联的聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。

可以以适当的涂层提供给糖衣丸核心。为此，可以使用浓糖溶液，其可以可选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶（卡波普凝胶，carbopol gel）、聚乙二醇、二氧化钛、天然树脂溶液（lacquersolution）和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以加入到片剂或糖衣丸的涂层中以鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可以用于口服的药物组合物包括由明胶制作的推合胶囊以及由明胶和诸如甘油和山梨醇的增塑剂制作的软的密封胶囊。推合胶囊可以在混合物中包括活性成分和填料，如乳糖、诸如淀粉的黏合剂、诸如滑石或硬脂酸镁的润滑剂，和可选的稳定剂。在软胶囊中，可以在适宜的液体（如脂肪油、液态石蜡或液态聚乙二醇）中溶解或悬浮活性组分。此外，可以加入稳定剂。用于口服给药的所有配制品应当以适宜于选定的给药途径的剂量。

对于颊部给药（口腔给药），组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于鼻部吸入给药，根据本发明使用的活性组分，是从加压包装（组件）或使用适宜的推进剂的喷雾器中以气溶胶喷雾呈现的方式常规递送的，该推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送经计量的量来测定。例如用于分配器中的明胶的胶囊和药筒可以通过包含化合物和诸如乳糖或淀粉的适宜粉末基质（base）的粉剂混合物来配制。

可以配制在本文中描述的制剂，用于肠道外给药，例如通过快速注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型呈现，例如在安瓿或多剂量容器中与可选加入的防腐剂。组合物可以是在油性载体或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以包含配制剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠道外给药的药物组合物包括水溶形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的悬浮液可以制成适宜的油基或水基注射悬浮液。适宜的亲脂性溶剂或载体包括诸如芝麻油的脂肪油、或诸如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体的合成脂肪酸酯。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液的黏度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。可选地，悬浮液也可以包含适宜的稳定剂或其增加活性成分的溶解度以允许用于高浓度溶液制备的药剂。

可替代地，活性成分可以以粉剂形式与适宜的载体用于构成（组合物），该载体例如在使用前为无菌的无热原的水基溶液。

使用例如常规的栓剂基质，如可可酯或其他甘油酯，本发明的制剂也可以配制成直肠组合物，如栓剂或保留灌肠剂。

适合用于本发明范围的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以达到预期目的的组合物。更具体地说，治疗有效量意味着对防止、减轻或改善疾病的症状，或延长待治疗对象的生存有效的活性成分的量。

治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内。

对于用于本发明的方法的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初由体外试验估测。例如，可以在动物模型中配制剂量，并且这样的信息可以用于更精确地测定人的有效剂量。

在本文中描述的活性成分的毒性和治疗效能可以在细胞培养物或实验动物中通过体外标准药物规程测定。从这些体外试验和细胞培养试验以及动物研究中获得的数据可以用于配制人用范围的剂量。取决于采用的剂型和利用的给药途径，剂量可以变化。考虑到病情，个体医生可以选择精确的剂型、给药途径和剂量。[参见，例如Fingl,et al.,(1975)"ThePharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1p.1]。

取决于要治疗的病症的严重性和反应性，剂量可以是单次给药的或多次给药的，治疗过程持续从几天至几周，或直至实现治愈或达到疾病状态的减轻。

当然，待给予的组合物的量取决于要治疗的对象、痛苦的严重性、给药的方式、开处方医生的判断等。

在相容性的药物载体中配制的包括本发明的制剂的组合物，也可以置于适当的容器中、并标以用于治疗的表明的病症而制备。

如果期望，本发明的组合物可以存在于包装或分配器装置中，如经FDA批准的试剂盒，其可以包括包含活性组分的一个或多个单位剂型。例如，包装可以包括金属箔或塑料箔，如透明罩。包装或分配器装置可以随附用于给药的说明书。包装或分配器也可以容纳以控制药物的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的与容器有关的注意事项，其信息反映了由该机构批准的组合物或人类的或兽医给药的形式。例如，这样的注意事项可以是由美国食品药品监督管理局（U.S.Food and Drug Administration）批准的用于处方药的标签或批准的产品插页。

正如上文描述的，本发明的抗体抑制剂可以由核酸构建体表达。

应理解编码本发明的抗体的多核苷酸优选地进一步编码允许抗体分泌或运输到关注的亚细胞或细胞外的局部区域内的信号肽。例如，当靶标金属蛋白是MMP时，分泌的信号肽优选在框架中结合至编码抗体区段的多核苷酸。

应进一步理解，可以优选表达重组单链Fv（ScFv）片段，因为与全抗体分子相比其具有显著不复杂的结构。正如在上文中描述的，ScFv是包括V_L和V_H抗体多肽链合成为单链的蛋白质，其V_L的羧基端通过肽桥连接至V_H的氨基端。用于重组制备这些肽的方法是本领域熟知的[参见Bird et al.,Science 242:423-426(1988)；Huston et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和de Kruif et al.,J.Mol.Biol.248:97-105(1995)]。根据本发明的这个方面的实施方式，使用本发明的化合物按照免疫法，从经免疫的动物体内收获脾脏mRNA，并且其用于在展示ScFv片段的噬菌体中产生cDNA库。然后筛选噬菌体颗粒以测定与关注的金属蛋白的活化形式特异性地和优先相互作用的那些。从这些噬菌体颗粒中回收ScFv区段，并且克隆至表达构建体中（参见美国专利号5,800,814）。

可以对个体对象的靶细胞给予本发明的这个方面的核酸构建体（即体内基因治疗）。

可替代地，经由适当的基因递送运载体（媒介物，vehicle）/方法（转染、转导、同源重组等）和所需的表达系统将核酸构建体引入到适宜的细胞中，然后在培养基中扩大（培养）修饰的细胞并使其回到个体中（即离体基因治疗）。

为了使本发明的抗体或抗体片段能够细胞表达，本发明的核酸构建体进一步包括至少一个顺式作用调控元件。正如在本文中使用的，短语“顺式作用调控元件（cis acting regulatory element）”指的是一个多核苷酸序列，优选启动子，其结合反式作用调节子，并调节位于下游的编码序列至此处的转录。

本方法可以使用任何可用的启动子。在本发明的优选实施方式中，由本发明的核酸构建体利用的启动子在转变的特定细胞群中是活性的。细胞类型特异性的和/或组织特异性的启动子的实例包括以下启动子：诸如肝脏特异性的白蛋白的启动子[Pinkert et al.,(1987)Genes Dev.1:268-277]、淋巴特异性启动子[Calame et al.,(1988)Adv.Immunol.43:235-275]；特别是T细胞受体的启动子[Winoto et al.,(1989)EMBO J.8:729-733]和免疫球蛋白的启动子；[Banerji et al.(1983)Cell 33729-740]，诸如神经丝启动子的神经元特异性启动子[Byrne et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477]，胰特异性启动子[Edlunch et al.(1985)Science 230:912-916]或诸如奶乳清启动子的乳腺特异性（美国专利号4,873,316和欧洲申请公开出版物264,166）。本发明的核酸构建体可以进一步包括增强子，其对启动子序列可以是毗邻的或远离的，并且可以起到上调来自此处的转录功能。

本方法的构建体优选进一步包括适当的可选择的标记和/或复制的起点。优选地，利用的构建体是穿梭载体，其可以在大肠杆菌（其中构建体包括适当的可选择的标记和复制的起点）中繁殖，并且对于在细胞中的繁殖、或在选择的基因或组织中的整合是相容的。根据本发明的构建体可以是，例如，质粒、杆粒（bacmid）、噬粒、黏粒、噬菌体、病毒或人工染色体。

目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒的或非病毒的构建体转染，如腺病毒、慢病毒、单疱疹I病毒或腺病毒群（AAV）和脂基系统。用于脂类介导的基因转移的有用的脂类是，例如DOTMA、DOPE和DC-Chol[Tonkinson et al.,Cancer Investigation,14(1):54-65(1996)]。用于基因疗法中的最优选的构建体是病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒、或逆转录病毒。病毒的构建体（如逆转录病毒构建体）包括至少一个转译启动子（transcriptional promoter）/增强子或基因座定义的（多个）元件（locus-defining element(s)），或其他通过其他手段控制基因表达的元件，这些手段如交替剪接、核RNA输出、或信使的转译后修饰。这样的载体构建体也包括包装信号（packaging signal），长末端重复序列（long terminalrepeats）（LTR）或其一部分，适于使用的病毒的正链和反链引物结合位点，除非其已经存在于病毒构建体中。此外，这样的构建体典型地包括从其所存在的宿主细胞中用于分泌肽或抗体的信号序列。优选地，用于这个目的的信号序列是哺乳动物信号序列。可选地，构建体也可以包括引导多聚腺苷酸化的信号，以及一个或多个限制位点和转译终止序列。以实例的方式，这样的构建体将典型地包括5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起点、3'LTR或其一部分。可以使用的其他载体是非病毒的，如阳离子脂类、聚赖氨酸（polylysine）和树枝状聚合物（dendrimer）。

用于执行基因治疗方案的优选模式在Somia and Verma[(2000)NatureReviews 1:91-99],Isner(2002)Myocardial gene therapy.Nature415:234-239；High(2001)Gene therapy:a 2001perspective.Haemophilia7:23-27；和Hammond and McKirnan(2001)Angiogenic gene therapy forheart disease:a review of animal studies and clinical trials.49:561-567中提供。

因为本发明的抗体差异性识别金属蛋白的活化形式的能力（参见实施例部分的实施例4），因此他们可以用作有效的诊断和预测工具，如通过在生物样品中监测MMP活性[即诸如血液（血清或血浆）、痰、腹水流体、胸腔积液、尿液、活检标本、分离的细胞和/或细胞膜制品]。当评估癌细胞（其中MMP的不平衡的活性促进肿瘤侵袭）的新陈代谢特点时这具有特别的意义。同样，本发明的抗体可以用于监控MMP抑制剂的治疗剂量。对于这样的应用，本发明的抗体优选标记有放射性的、荧光的、生物的或酶的标签或在本领域使用的标准标签。关于使用这样的标签的美国专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。

应理解这样的检测方法也可以用于新型MMP的高通量筛选。简言之，本发明的抗体可以接触多种生物样品，其中活化的MMP可以结合于此。采取措施以使用生物样品，其包括诸如源于肿瘤细胞系的那些活化的MMP。典型地，放射性标签用于减少试验体积。

可替代地，本发明的抗体可以用于从生物样品中纯化活性金属酶。

许多蛋白质纯化方法是本领域已知的。例如，本发明的抗体或抗体片段可以用于亲和色谱，用于分离金属酶。可以制备柱，其中抗体连接在固体底物上，例如颗粒（如琼脂糖、葡聚糖凝胶等）和生物样品（如溶胞产物），其可以通过柱，洗涤柱，紧接增加温和变性剂的浓度，借此释放经纯化的金属酶。

根据本发明的教导，产生的抗体或其片段可以包含在诊断或治疗试剂盒中。抗体或抗体片段可以包装在一个或多个含有适当的缓冲液和防腐剂的容器中，并用于诊断或用于指导医学治疗。

因此，抗体或其片段可以各自混合在单个容器中或置于单独的容器中。优选地，容器包括标签。例如，适宜的容器包括瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由诸如玻璃或塑料的各种材料形成。

此外，也可以加入其他添加剂，如稳定剂、缓冲液、阻滞剂等。这种试剂盒的抗体也可以附着在固体载体上，如珠粒、阵列底物（例如芯片）等，并且用于诊断目的。试剂盒也可以包括用于检测的说明书，如果测试对象正经受着或处于发展为与关注的MMP表达相关的病症、紊乱或疾病的风险中。

正如在本文中使用的，术语，“约”指的是±10%。

术语“包括”、“构成”、“包含”、“含有”、“具有”和它们的结合意味着“包括但不限于”。

术语“由……组成”意味着“包括并局限于”。

术语“本质上由……组成”意味着组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但是只有当另外的成分、步骤和/或部分并不本质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新特征时。

正如在本文中使用的，单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文中另外明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

在整个此申请中，可以以范围形式呈现本发明的多种实施方式。应当理解，以范围形式的描述仅是为了方便和简要起见，并且不应当解释为对本发明的范围不灵活的限制。相应地，应当认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围，以及在那个范围内独立的数值。例如，范围描述，如从1至6应当认为具体公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等以及那个范围内独立的数值，例如，1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度这都适用。

每当在本文中指明了数值范围，就意味着包括在指明的范围内的任何引用数字（分数或整数）。短语“范围/范围在……之间”第一个指明的数字和第二个指明的数字之间以及“范围/范围从”第一个指明的数字“至”第二个指明的数字在本文中可交替使用，并且意味着包括第一个和第二个指明的数字以及所有在其间的分数或整数。

如在本文中使用的，术语“方法”指的是用于完成给定的任务的方式、手段、技术和规程，其包括，但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或由这些从业者从已知的方式、手段、技术和规程容易地开发的那些方式、手段、技术和规程。

如在本文中使用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或扭转病症的进展，实质上改善病症的临床或视觉症状（aesthetical symptom）或基本上防止病症的临床或视觉症状的表现。

应理解，为了清楚而在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特点，也可以在单独的实施方式中结合提供。相反，为了简要而在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以分别地或以任何适宜的子结合或适合于本发明描述的任何其他实施方式提供。除非实施方式在没有那些要素的情况下是无效的，在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不认为是必要的特征。

在下列实施例中可以找到上文描述的和在随附的权利要求书部分要求保护的本发明各种实施方式和方面的实验性支持。

实施例

现在参考以下实施例，其与上文的描述一起以非限制的方式示出了本发明的一些实施方式。

通常，在本文中使用的命名法和在本发明中利用的实验室规程包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中充分地解释说明了这样的技术。参见，例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"VolumesI-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols inMolecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,NewYork；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中给出的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)的"Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique",Third Edition；"Current Protocols inImmunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basicand Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；在专利和科学文献中大量描述了可用的免疫测定法，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic AcidHybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcriptionand Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984)；"Animal CellCulture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRLPress,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:AGuide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些通过援引合并入本文中，好像完全在本文中给出的。贯穿该文档，提供了其他通用参考文献。认为本领域熟知其中的规程并且提供了这些规程以方便读者。其中包括的所有信息通过援引合并入本文中。

材料与方法

Zn-骨架的合成：

A、

在烧瓶中混合季戊四醇（9.53g，0.07mol）和NaOH（30%w/w的0.7ml），并缓慢加入丙烯腈（20.3mL，0.44mol）以使温度不超过30°C。在室温下搅拌混合物过夜，用1N的HCl中和，萃取到EtOAc（200mL）中，用水洗涤两次，在Na₂SO₄上干燥，并浓缩。获得22.9g的四腈衍生物（94%收率）。

B、

用浓HCl（10ml）处理四腈1（7.22g，0.021mol），在95°C下回流4h，萃取至冷EtOAc（300ml）中，用水洗涤两次，在Na₂SO₄上干燥，并浓缩。获得以75%收率的四酸（6.67g）。

C和D

向四酸2（11.5g）中加入SOCl₂（11.9ml），并且将溶液升温至40°C持续15小时（过夜）。蒸馏过量的亚硫酰氯，并且在无水CHCl₃（30ml）中溶解残余物，粗四酰基氯。加入五氯苯酚（28.76g），将混合物冷却至0°C，加入Et₃N（15ml，0.108mol），并在室温下搅拌混合物。反应后紧接是IR，以观测氯化物的峰消失（大约1天）。去除溶剂，并且通过快速色谱（硅胶，洗脱液CHCl₃）纯化残余物。在失活的中性矾土上通过过滤去除残余的五氯苯酚以获得11.94g（8.42mmole，31%收率）的四活性酯。

IR(CDCl₃)：v=1783cm^-1(COOC₆-Cl₅)。

1H NMR(CDCl₃)δ=3.81(t，J)6Hz，8H，CCH₂OCH₂)，3.46(s，8H，CCH₂O)，2.91(t，J)6Hz，8H，CH₂CN)。

E、

在20ml无水二氯甲烷中溶解四活性酯3（1g，0.69mmole）和单-BOC-乙二胺（100mg，0.62mmole）。搅拌溶液过夜，同时用三乙胺使pH保持在大约8。去除溶剂，并用氯仿：乙酸乙酯（90:10）通过快速色谱法纯化残余物以给出（152mg，15%产率）的化合物4。

¹H NMR 250MHz(CDCl₃)：δ=1.4(s,9H,Boc)；2.4(t,2H,J=6Hz,-CH₂-CH₂-CONH)；2.9(t,6H,J=6Hz,-CH₂-CH₂-COOPCP)；3.2(q,2H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc)；3.31(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc)；3.38(s,2H,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-)；3.42(s,6H,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-COOPCP)；3.61(t,2H,J=6Hz,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-)；3.78(t,6H,J=6Hz,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH);5.03(t,1H,NH)；6.7(t,1H,NH)。

F、

将化合物4（150mg，0.11mmole）和1-(3-氨基丙基)-咪唑（33μl，0.39mmole）完全溶解在无水THF（20ml）中并在室温下搅拌过夜。去除溶剂，并用氯仿：甲醇（5:9）作为洗脱液通过柱色谱法纯化残余物。获得以44%产率的45mg产物5。

¹H NMR 250MHz(CDCl₃/MeOD)δ=1.45(s,9H,Boc)；2.0(m,6H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi)；2.4(t,6H,J=6Hz,-O-CH₂-CH₂-CONH-);2.5(t,2H,J=6Hz,-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc)3.0(m,8H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi,-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc)；3.1(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc)；3.4(b,8H,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-)；3.6(m,8H,J=6Hz,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc,)；4.0(t,6H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi)；5.5(t,1H,NH)；6.98(s,3H,Imi)；7.06(s,3H,Imi)7.32(t,3H,NH)；7.57(s,3H,Imi).ESI-MS:910.87[M+Na]⁺,925.98[M+K]⁺。

G、

将三(咪唑)衍生物5（40mg，0.045mmole）溶解在二氯甲烷和三氟乙酸（6ml）为2:1的溶液中，并且搅拌1小时。去除溶剂，并用四氯化碳通过共蒸发进一步去除过量的TFA。获得以85%产率的30mg产物6。

¹H NMR 250MHz(CDCl₃/MeOD)δ=1.9(m,6H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi)；2.3(m,8H,J=6Hz,-O-CH₂-CH₂-CONH-,-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂)；2.9(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi)；3.0(t,2H,J=14Hz,-CONH-CH₂-CH₂-NH₂)；3.31(t,2H,J=6Hz,-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂)；3.4(b,8H,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-)；3.6(m,8H,J=6Hz,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂)；4.0(t,6H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi)；7.26(s,3H,Imi)；7.32(s,3H,Imi)；8.82(s,3H,Imi)。

H、骨架6的锌(II)复合物

在甲醇（1ml）中溶解骨架6（30mg）。加入1N的NaOH（1-2滴），紧接着加入在甲醇中的ZnCl₂（5mg）溶液，并搅拌溶液半小时。获得白色沉淀物并过滤。获得以37%收率的复合物（12mg）。

¹H NMR 250MHz(MeOD/D₂O)δ=1.8(m,6H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi)；2.4(m,8H,J=6Hz,-O-CH₂-CH₂-CONH-,-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂)；3.0(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi)；3.0(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH₂-CH₂-NH₂)；3.31(b,2H,-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂)；3.4(b,8H,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-)；3.6(m,8H,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-,-C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂)；4.2(b,6H,-CONH-CH₂-CH₂-CH₂-imi)；7.19(s,3H,Imi);7.28(s,3H,Imi)；8.55(s,3H,Imi).ESI-MS:852.09[M+1]⁺。

Zn-骨架-蛋白质结合体(结合物)的制备：将Zn-骨架结合至钥孔戚血蓝蛋白（KLH）用于免疫并结合至牛血清白蛋白（BSA）用于特异性抗体的获得。将Zn-骨架（4mg）溶解在NaHCO₃的饱和溶液（0.5ml）中，在搅拌下向溶液中加入1-乙基-3-(3'-二甲氨基丙基)碳二亚胺（4mg）。类似地，在搅拌下向溶液中加入均在PBS缓冲液中的KLH（以50:1的摩尔比）或BSA（以25:1或10:1的摩尔比）。在室温下3h以及在4°C下过夜之后，将结合体（结合物）广泛渗析（2xPBS），并稀释至最终浓度为1mg/ml。使用来自Spectro的ICP-AES模型“Spectroflame”（Kleve，德国），通过电感耦合等离子体原子发射光谱法测定锌含量来确定Zn-骨架的半抗原密度（每个BSA或KLH分子的半抗原分子的数量）。用在不含金属的水中的5%硝酸消化样品，并将体积调节至6ml。测定样品中相对于其当量蛋白浓度的锌含量。

使用Zn-骨架-KLH作为免疫原的抗-MMP金属体的制备：在第1天用弗氏完全佐剂和50μg的Zn-骨架-KLH免疫雌性BALB/c小鼠，并通过乳化和腹膜内注射用弗氏不完全佐剂每两周加强。将来自免疫小鼠的脾细胞与NSO鼠的骨髓瘤细胞融合，并在HAT（次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷）选择性培养基中培养。使用ELISA筛选杂交瘤的培养上清液，采用微量滴定板中的成对的孔，在该微量滴定板上吸附MMP-9催化区和作为抗原的Zn-骨架-BSA（每个孔中0.5μg的MMP-9或Zn-骨架-BSA结合体）。在用100μl的杂交瘤上清液孵育，并且其间用包含0.05%的吐温20（TBS-吐温）的Tris缓冲盐水（pH7.5）洗涤之后，用过氧化物酶结合的羊抗鼠IgG，紧接着用包括2'-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的底物溶液孵育这些孔。然后通过有限的稀释来克隆相当于上清液在MMP-9和Zn-骨架-BSA两者上为阳性并且在天然BSA上是阴性的杂交瘤细胞。在重复筛选之后，获得对两种抗原显示最特征性识别的四种克隆，并选择克隆SDS3以便进一步表征。

抗体的制备和纯化：在组织培养基中增殖抗体。在不含血清的培养基中培养杂交瘤；培养上层清液通过蛋白G亲和色谱用于抗体纯化。通过10%SDS-PAGE和尺寸排阻色谱法（HiLoad Superdex 200，Pharmacia）分析纯化的抗体的均一性。

通过竞争性ELISA试验测定SDS3对Zn-骨架的亲和力：在4°C下用3μg/ml的Zn-骨架-BSA结合体涂覆Nunc maxisorp板过夜，然后在室温下用10mg/ml的BSA阻滞（阻断）2小时。加入含有用可溶性Zn-骨架预先孵育（30分钟）的SDS3的溶液，并使得孵育1h。然后漂洗板，并用过氧化物酶结合的抗鼠IgG和2'-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐作为底物检测任何捕获的抗体。从一系列不同的可溶性Zn-骨架（竞争物）浓度（200μM-10nM）计算IC₅₀值，而IC₅₀值指的是在不存在任何配体下给出50%的检测信号的竞争物浓度。

酶：将缺乏前（pro）区、纤连蛋白区、铰链区和血液结合素区的MMP-9催化区（人和鼠107-215，391-443）、鼠MMP-2催化区和纤连蛋白区（氨基酸110-467）、以及人MTl-MMP催化区（残基114-290）各自克隆至在N端带有His标签的pET3a表达载体中，并在大肠杆菌BL21株中表达。在表达之后，酶在包含体部分中积累。收获、洗涤、溶解并离心大肠杆菌以分离包含体。然后，使其在6M的尿素、50mM Tris（pH 8.5）中悬浮以溶解蛋白质。在Ni-NTA柱上纯化蛋白质，用6M尿素、50mM Tris，150mMβ-巯基乙醇（pH8.5）稀释至50μg/ml，然后通过在浓度递减的尿素中缓慢渗析再折叠（refold）。最终通过凝胶过滤纯化酶。

在重组接种后牛痘病毒（recombinant vaccinia virus）哺乳动物细胞表达系统中表达人前-MMP-2（pro-MMP-2）和前-MMP-9（pro-MMP-9），并通过明胶-琼脂糖亲和色谱法从感染的人子宫颈癌传代细胞（HeLa cell）培养基中纯化至均一，正如之前描述的[R.Fridman et al.,J Biol Chem 267,15398(Aug 5,1992)；R.Fridman,M.Toth,D.Pena,S.Mobashery,CancerRes 55,2548(Jun 15,1995)]。在37°C下用溶解在200mM的Tris中的1mM对氨基苯基汞基乙酸酯（p-aminophenylmercuric acetate）（APMA）活化pro-酶（前-酶）2h。

TACE，使用重组杆状病毒表达系统表达人TACE的催化区。从经感染的粉纹夜蛾（Trichoplussia ni）细胞的培养基中纯化这种截短体（truncate）至均一，正如在M.L.Moss et al.,Nature 385,733(Feb 20,1997);和M.E.Milla et al.,JBiol Chem 274,30563(Oct 22,1999中描述的。

MMP-7-重组人MMP-7催化区是从ProSpec Technogene LTD购买的。

ELISA-结合试验：根据生产商的方法将生物素化的小鼠催化MMP-9偶联至涂有抗生蛋白链菌素的微量滴定板（Nunc）。在涂覆板之后，在室温下用SDS3/4单克隆抗体（mAb）孵育2小时。洗涤板，并根据标准规程用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（Jackson）检测结合的抗体（Ab）。从四参数的S形曲线拟合分析计算EC₅₀或半最大结合浓度。

酶动力学试验：通过在λ_ex=340nm和λ_em=390nm下监测荧光肽Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂（SEQ ID NO:1）的降解，在37°C和在mAb存在下测定MMP-9、MMP-2和MT1-MMP的酶活性，正如Knightet al.(5)描述的。类似地，通过监测荧光肽QF-45（Mca-Ser-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Lys(二硝基苯基)-NH₂）（SEQ ID NO:2）的降解测定TACE的酶活性。在37°C下用在50mM Tris缓冲液（pH7.5，37°C）、200mM NaCl、5mM CaCl₂和0.05%Brij 35中的2nM活性酶预先孵育一系列不同的mAb浓度（0.4-30μM）。通过加入10μM产荧光肽（fluorogenic peptide）引发酶促反应。立即持续记录荧光（作为底物降解的量度）30-50分钟。测定初始反应速率，并且通过与竞争抑制方程拟合计算抑制常数（vi/vo=Km+[S]/(Km(1+I/Ki)+[S]）[I.H.Segel,Enzyme Kinetics(Wiley-Interscience Publication,1993)]，其中vi是在mAb存在下的初始速率，vo是在缺乏mAb抑制剂下的初始速率，S底物浓度，Km是Michaelis-Menten常数，I是mAb的浓度。

为了确定抑制的类型，测定MMP-9的初始速率作为底物浓度（1-30μM）的函数，如上所述在mAb的几个固定浓度（在0.5-5μM之间）下。通过将实验数据与Michaelis-Menten方程vi=[S]Vmax/(Km+[S])拟合，得到表观Km和Vmax值。得到的值用于重新构建双倒数Lineweaver-Burk图，通过分析动力学数据的Lineweaver-Burk图（1/v对1/s）的线性回归确定抑制模式。

腹水流体中天然SDS3-MMP-9复合物的检测：通过繁殖SDS3杂交瘤获得SDS3抗体，通过蛋白G琼脂糖珠获得小鼠的腹水。为了检测和表征与SDS3共免疫沉淀的MMP-9，在8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中捕获获得的mAb，转移至NC膜（Bio-Rad），随后使用商用抗MMP-9抗体（Sigma）进行免疫印迹分析。结合至辣根过氧化物酶（Jackson）的羊抗鼠IgG用作二次抗体（二抗）。使用ECL（Pierce）检测信号。用同样的方式已繁殖和捕获的非相关的IgG mAb充当阴性对照。

Pro-MMP-9结合试验：在4°C下和在PBS中用蛋白A琼脂糖CL-4B（GE Healthcare）孵育mAb（单克隆抗体）过夜。在洗涤未结合的抗体之后，室温下和持续搅拌下孵育2小时，随后加入纯化的酶Pro-MMP-9、Pro-MMP-2、或活性MMP-2片段（催化区和纤连蛋白区）。通过离心收集珠结合的免疫复合物，并用PBS洗涤三次。用SDS样品缓冲液洗脱结合的蛋白质，用SDS-PAGE分离，并通过考马斯蓝染色检测。用蛋白A琼脂糖珠孵育用于非特异性吸附酶的阴性对照。

TNBS引发的结肠炎的引发和用SDS3的治疗：通过2%（wt/vol）2,4,6-三硝基苯磺酸（Sigma）与等体积乙醇混合直肠滴注至麻醉的小鼠内诱发TNBS结肠炎，100μl/小鼠。为了确定SDS3对存活率的影响，给予小鼠的每个结肠1.5mg TNBS的剂量，并用5-25mg/Kg SDS3或PBS（载体）作为对照，静脉内注射（每天地，从第0天开始直至实验结束）。为了确定SDS3对鼠对照IgG的具体效果，给予小鼠的每个结肠1.25mg TNBS。随后，从第0天开始每天腹膜内注射5mg/kg SDS3或5mg/Kg鼠对照IgG（MP Biomedicals，LLC）或PBS。

根据Reuter等（J Clin Invest 98,2076(Nov 1,1996)），使用4个标准宏观参数的组合值：结肠溃疡形成的程度（等级从0，即完全正常；至10，即最严重）；肠和腹膜粘连（0至2）；腹泻（0至1）；以及厚度（0至1），将总的结肠损伤宏观得分以盲方式分级。每个治疗组包括10-12只小鼠。

统计：用ANOVA测试组间变化，并根据Tukey-HSD使用同源子集对所有配对比较测试显著性。认为P<0.05是显著的。

XAS研究

MMP-9与SDS3复合物的样品制备：使用Millipor Centricon-10（Bedford，MA）设备通过超滤浓缩活性MMP-9和SDS3mAb，以使得最终浓度分别为0.2mM和0.45mM。将样品装载（上样）至盖有麦拉带（聚酯膜带，Mylar tape）的铜试样架（样品容器，sample holder）（10×5×0.5mm）中，并立即在液氮中冻结。然后将已冻结的样品安装在Displex闭式循环氦低温恒温器内部。

XAS数据收集：将已冻结的样品安放在Displex闭式循环氦低温恒温器内部，并且温度保持在14K以使XAS数据中的热紊乱最小化。以荧光几何学记录锌k-边的谱带。使用平面Si（111）单色仪晶体定义光束能。使用电离室记录入射光束强度I0。使用13-元素锗探测器（Canberra）记录荧光强度。用参照离子室同时用荧光测定来自锌箔的传输信号，以便校准光束能。收集在横跨边缘处读数为1x10⁶以上的每个样品的五次扫描。在每次扫描之后检查样品的燃烧标记，并且在每次扫描之前改变样品上的光束位置，以便将辐射损伤减至最小。

XAS数据处理和分析：使用参照锌金属箔XAS数据的第一个拐点，将对每个样品的5次独立XAS测量之后获得的平均锌K-边吸光系数μ（E）对齐。随后，将针对不同样品的吸光系数在X-射线能量中移动，直至它们的第一个拐点在相同的能量下对齐。用Athena XAS数据分析包去除平滑的原子背景[B.Ravel,M.Newville,J Synchrotron Radiat 12,537(Jul,2005)]。选择在0.6和之间的用于使信号最小化至低于第一个壳层的R-空间区。在去除背景之后，在作为结果的k²-加权的χ(k)中有用的k-范围是在2.0至之间。

SDS3/SDS4克隆和测序：克隆免疫球蛋白V区基因，并在通过PCR扩增之后测序。根据生产商的方案通过苯酚-异硫氰酸胍法（phenol-guanidine  isothiocyanate）（peqGOLD TriFast peqlabbiotechnologie）从5x10⁶个杂交瘤细胞中制备完全RNA。获得CDNA，并进行扩增，在一个步骤中使用反向-iT^TM一步RT-PCR试剂盒（ABgene）。通过使用同源于小鼠重链和轻链前导序列和反义恒定引物的简并有义引物扩增V区基因（Amersham Biosciences）。通过使用标准方案将扩增产物结合至pGEM-T Easy载体（Promega）中，在DNA测序单元在自动化定序器（Biological Services,Weizmann Institute of Science）上测序插入物的双链。

SDS3 Fab片段与Zn-骨架的复合物的制备和结晶：通过Amicon超离心装置（Milipore）根据在280nm下的吸光度将纯化的抗体浓缩至6mg/ml[A（280nm，0.1%）=1.45]。通过木瓜蛋白酶消化（番木瓜乳木瓜蛋白酶，Sigma-Aldrich）由全抗体产生Fab片段。用在以20mM EDTA补充的1MTris-HCl（pH 8.0）中的10mM二硫苏糖醇（DTT）使最终浓度为1mg/ml的木瓜蛋白酶活化15分钟。随后以1:1000的比率（w/w）使活化的木瓜蛋白酶溶液与SDS3混合。使得在37°C下持续水解约1小时。通过凝胶过滤（Pharmacia Superdex 75）实现Fab片段和Fc片段的分离。从100mMTris-HCl pH7.5、150mM NaCl的柱中收集Fab，并浓缩至6.5mg/ml。在结晶筛选之前，以大约1:25的摩尔比混合纯化的SDS3 Fab和Zn-骨架。在24-孔VDX（Hampton Research）板中利用悬滴通过汽相扩散结晶。在包含1μl Fab-Zn-骨架混合溶液和在室温下对1ml储备液平衡的1μl储备液（在0.1M乙酸盐缓冲液（pH=5.5）、0.2M硝酸钠中的23-25%（w/v）聚乙二醇2000）的2μl液滴中，双锥体形晶体在很少的几天内生长。在结晶溶液中的30%（v/v）的乙二醇中浸湿晶体几秒，并在液氮下迅速冷冻（flash-frozen）。

SDS3结构测定和精修(精化，Refinement)：在ESRF（EuropeanSynchrotron Radiation Facility，Grenoble，法国）的ADSC Q210CCD探测器（光束ID14-1）上收集达到的完全数据集。用HKL2000（数据）包使衍射数据指数化、归并化（综合化）和刻度化[Z.Otwinowski,W.Minor,Charles W.Carter,Jr.,in Methods in Enzymology.(Academic Press,1997),vol.Volume 276,pp.307-326]。在具有Vm为的不对称晶胞中，晶体包括两个Fab单体。使用最大似然技术（maximum-likelihood technique）通过分子置换测定复合物结构，正如在PHASER程序中实施的。来自IGG2A 8F5结构（PDB代码：1A3R）的Fab片段的恒定区和可变区各自用作用于分子置换的起始模型。使用程序CCP4/Refmac5进行精修。使用程序COOT，在电子密度图（2F_obs-F_calc和F_obs-F_calc）的基础上重建模型。

SDS3/4Fv对接至MMP-9催化区：使用刚体对接算法（rigid bodydocking algorithm）MolFit进行SD S3/4Fv至MMP-9催化区（PDB代码1GKC）上的对接（docking）。通过定义每一个分子的表面层并将其与内部区分开，该算法涉及分子表面的匹配。表面层的特征是其几何（外形）和化学（静电和疏水）性能。在这个研究中，抗体Fv分子在空间中固定，并且MMP-9催化区相对于晶体旋转至不同方向并沿着三个直角坐标轴转译。使用网格间距为和12°的标准转译和旋转进行完全旋转/转译扫描[N.Kowalsman,M.Eisenstein,Bioinformatics 23,421(Feb 15,2007)]。除了Zn⁺²和Ca⁺²离子之外，省略了配体和水分子。省略了高度柔性的MMP-9的四个N-端残基。修整了（trim）赖氨酸残基[A.Heifetz,M.Eisenstein,Protein Eng 16,179(Mar,2003)]。防止涉及通常与Fc区接触的Fv表面部分的相互作用，通过将它们定义为“内部”。对每一个产生几何-静电-疏水互补性得分的相对位置计算表面匹配的质量。当几何和化学互补性较广泛并且没有相互贯通时，这个得分较高[E.Katchalski-Katzir et al.,Proc NatlAcad Sci U S A 89,2195(Mar 15,1992)；M.Eisenstein,I.Shariv,G.Koren,A.A.Friesem,E.Katchalski-Katzir,J Mol Biol 266,135(Feb 14,1997)]。通过将极值分布函数与检测的得分分布拟合，对所有方案的得分进行统计分析，提供得分的平均值和标准偏差σ的估值[A.Heifetz,E.Katchalski-Katzir,M.Eisenstein,Protein Sci 11,571(Mar,2002)；N.Kowalsman,M.Eisenstein,Bioinformatics 23,421(Feb 15,2007)]。基于之前的mAb和MMP-9之间结合的生物化学的和生物物理特征，本发明人搜索了将允许mAb和MMP-9的催化锌位点之间接触的对接方案。因此，对所有对接方案（溶液，solution）应用扫描后过滤器（post-scan filter），仅选择在MMP9活性位点周围的残基和Fv的CDR之间至少10个原子-原子接触的模型。在排名靠前的方案中，发现假定模型的两个聚类（cluster）显示与催化锌离子直接相互作用（排名2和3）。通过重新计算三个直角坐标轴的小角度偏差（±2°）的得分精修这些方案。使用InsightII包的Discover模块优化聚类的代表。MMP-9的主链原子在最小化中固定。就MMP-9而言，允许mAb的半刚性体运动施加在mAb的Cα原子之间的距离限制（不包括CDR）。MMP-9和抗体两者的侧链可自由移动。进行若干次间歇动力学和最小化步骤直至结构收敛（converge）。

表5

晶体学数据采集和精化统计的总结

^a括号内的值对应于高分辨率壳层。

^bR_sym=∑|<I_hkl>-I_hkl|/I_hkl|，其中<I_hkl>是对称相关的反射的平均强度而I_hkl是检测强度。

^cR=∑||F_o|-|F_c||/∑|F_o|，其中F_o表示检测的结构因子振幅而F_c是计算的结构因子振幅。

实施例1

活性部位金属无机模拟抗原的合理设计

将对称三骨架的三咪唑锌复合物（Zn-骨架）（ZnC₃₆H₅₉N₁₁O₈）设计为MMP中的天然四面体锌-蛋白质基序的模拟复合物（mimicry complex）（Netta Sela-Passwell,Raghavendra Kikkeri,Gal Dela,Rotem Sertchook,Orly Dym,Haim Rozenberg,Raanan Margalit,Rina Arad,Miriam Eisenstein,Tsipi Shoham,Tamar Danon,Abraham Shanzer,I.Sagi,Metallobodies:function-blocking antibodies targeted at enzymatic metalloprotein sites havepotential for therapeutic use.,Submitted(2010)）。这种设计是基于位于活性位点裂缝中间并由共有的螺旋和充当用于三个组氨酸残基（其与四面体构型中的催化锌离子相配位）的支架（骨架，scaffold）的随后的环稳定的保守HExxHxxGxxH（SEQ ID NO:3）锌结合基序（图1A-C）。Zn-骨架结合至作为蛋白质载体的KLH用于免疫小鼠。在已知引发免疫以及炎症反应的完全弗氏佐剂存在下进行免疫。

实施例2

抗-MMP金属体的诱发(elicitation）

每2个星期用以完全弗氏佐剂乳化的Zn-骨架-KLH免疫雌性BALB/c小鼠。利用基于ELISA的试验，在小鼠血清中检测抗-Zn-骨架免疫应答、抗-MMP免疫应答。观测进程中应答作为Zn-骨架重复注射的函数（图2A）。可以与抗-MMP-9应答和抗-MMP-14应答一起检测预期的升高水平的强抗Zn-骨架免疫应答。以不相关的B细胞表位免疫来自对照小鼠的血清没有导致抗-MMP抗体的产生。

杂交瘤的筛选是基于两种B细胞刺激物Zn-骨架和选定的蛋白酶MMP-9的双重识别。特别地，带有固定的Zn-骨架-BSA和MMP-9催化区的ELISA板用于筛选分泌对免疫的模拟Zn-骨架复合物和MMP-9催化区两者特异的抗体的杂交瘤。在4个选定的克隆中，证实了利用竞争性ELISA试验SDS3mAb对Zn-骨架的IC₅₀为200nM（图5），而利用ELISA结合试验对小鼠MMP-9催化区估测的结合常数（EC₅₀）为200nM。值得注意地，SDS3与诸如碳酸酐酶或醇脱氢酶的类似金属蛋白基序没有显示交叉反应性。增加Zn-骨架增强剂（boost）的数量，允许选择对MMP-9具有较高亲和力和特异性的另外的金属体SDS4，其EC₅₀为15nM（图2B）。因此，这些结果进一步提示充当免疫刺激物的Zn-骨架表位产生了针对MMP-9的单克隆抗体（mAb）。使用蛋白G亲和色谱从增殖的杂交瘤中纯化SDS3金属体，然后进行结构和功能特征的进一步分析。

实施例3

金属体经由金属蛋白酶催化锌离子的直接结合抑制肽水解

基于产荧光的肽底物[C.G.Knight,F.Willenbrock,G.Murphy,FEBSLett 296,263(Jan 27,1992)]以及天然明胶底物的转化，利用标准肽水解试验检测SDS3和SDS4对MMP的酶活性的影响。在若干浓度的用各种MMP和肿瘤坏死因子-α转移酶（TACE）孵育的金属体存在下，测定初始反应速率。SDS3抑制的MMP-9和MMP-2具有1±0.1μM的Ki值，同时对MMP-14显示低得多的14.4±0.75μM的Ki值，并且在测试的最高浓度下对MMP-7或TACE没有抑制活性（图2C和在下文中的表6）。SDS4对MMP-2和MMP-9显示紧密的结合抑制模式（Ki=54nM），并且对MMP-14的Ki为1400nM，同时检测到对MMP-7和TACE没有抑制活性。对来自人MMP-9的全长活性酶以及删除（depleted of）类血液结合素区（结构域）和三个类纤连蛋白II型区（结构域）的酶催化区检测这种抑制模式，因而进一步表明SDS3直接与MMP-9的催化区相互作用。

表6

通过SDS3/SDS4对MMP抑制的IC₅₀值

实施例4

金属体直接结合酶的活性构象中的锌离子

为了检测SDS3和SDS4是否直接结合活性MMP-9中的催化锌离子，本发明人已经测定了MMP-9-SDS3复合物和MMP-9-SDS4复合物的锌K-边X-射线吸收谱（XAS）的变化。XAS谱分析提供了分析的金属离子周围的局部结构，包括其总的有效电荷和平均锌-蛋白键长。SDS3和SDS4结合至MMP-9导致第一壳层原子显著的边缘能移动（位移）和径向分布的谱带改变，与锌离子相配位的该第一壳层原子表明金属体与MMP-9锌离子的直接相互作用（图2D）。在MMP-9-TIMP-1复合物的锌K-边谱带中这样的改变也是明显的，在此处用作对照（图6）。因此类似于酶-内源性抑制剂相互作用，本X-射线吸收光谱分析表明两种金属体直接结合MMP-9中的锌离子

为了进一步证实金属体与金属蛋白酶的活性形式（删除酶pro-区）的相互作用，本发明人进行了免疫沉淀实验。在从带有SDS3杂交瘤肿瘤的小鼠中收获的腹水流体中分析SDS3-MMP9复合物的形成。蛋白质印迹和明胶酶谱分析显示，除分泌的SDS3 mAb之外，腹水流体中存在MMP-9的活性形式和酶原形式。与图2中呈现的研究结果一致，使用商购的抗-MMP-9抗体，通过免疫共沉淀捕获SDS3和蛋白质印迹分析，可以在腹水流体中检测天然SDS3-MMP-9复合物（图7）。特别地，在以相同的方式分析的不相关的小鼠mAb对照的经纯化的部分中没有检测到MMP-9（图7，第2排）；表明酶的存在与内源性免疫球蛋白污染无关。重要地，共纯化的MMP-9的分子量对应于缺乏空间上屏蔽催化锌-组氨酸基序的pro-区（前结构域，pro-domain）的活性酶形式。这些结果表明，SDS3与以其活化形式的天然小鼠MMP-9形成复合物，大概是通过识别存在于酶活性位点的相对暴露的催化锌-蛋白质基序。预期地，用纯化的MMP-9或MMP-2酶原的体外免疫沉淀“下拉（pull down）”实验表明在酶pro-区存在下，SDS3不形成复合物，而其特异性结合MMP-2的活性形式（图7）。重要地，用于这些实验的SDS3是从不包含MMP的不含血清的杂交瘤上清液中纯化的。

实施例5

利用抗-MMP金属体的治疗在炎性肠疾病的小鼠模型中是有效的

在用作相关模型系统的炎性肠疾病（IBD）中测试金属体SDS3的生物活性。IBD包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，它们是不能治愈的慢性肠紊乱。已经显示，MMP-9敲除小鼠具有减弱的结肠炎（G.Monteleone,D.Fina,R.Caruso,F.Pallone,Curr Opin Gastroenterol 22,361(Jul,2006);P.Garg et al.,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 296,G 175(Feb,2009)），同时广泛的合成抑制剂对MMP活性的抑制显示在由2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）引发的IBD动物模型中减弱结肠炎[A.P.Sykes et al.,AlimentPharmacol Ther 13,1535(Nov，1999)；P.Di Sebastiano et al.,Digestion 63,234(2001)]。因此本发明人选择检测IBD鼠类模型中由TNBS引发的SDS3的体内生物学效应，其类似于人克罗恩氏病。

经受TNBS的直肠内给药的小鼠发展了预期症状，例如血性腹泻，导致80%的死亡率。用SDS3治疗，通过5-25mg/Kg鼠的每日注射给药，显著降低了整体死亡率（图3A），最大的治疗效应在5mg/Kg鼠处。此剂量用于进一步检测SDS3mAb的具体效应。因为之前显示的，非特异性IgG可以具有一些抗炎效果，因此对SDS3平行分析小鼠对照总IgG。根据存活曲线结果，与未经治疗的动物相比，5m/Kg鼠SDS3mAb治疗显著降低了TNBS给药导致的宏观结肠损伤（图3B）。非特异性IgG治疗不能证明与SDS3类似的显著改善效果。虽然从这些实验不能推断出SDS3介导其保护性抗炎活性的精确生物机制，但是这些结果表明SDS3在MMP依赖性炎性疾病状态下具有相当大的效能。这可能主要归因于其对MMP-9的选择性阻断活性的功能。因此，由于不同MMP在IBD中可能具有保护性作用[P.Garg et al.,J Immunol 177,4103(Sep 15,2006)]，因此通过工程化设计的在炎性疾病状态下高度选择性的抗-MMP金属体靶向关键个体MMP的活性构象可以视为潜在的治疗方法。

实施例6

金属体蛋白质结构分析证明通过直接结合至酶表位的功能阻断机制

为了在原子水平上提供关于金属体与MMP-9的催化区的相互作用模式的详细分子洞察（insight），本发明人已结晶了SDS3Fab片段。SDS3具有凹形抗原结合部位，不同于常规抗-蛋白质抗体，针对其的抗原结合部位基本上是具有小突起和凹陷的平面。以的分辨率测定了晶体结构（表5）。SDS3Fab片段与Zn-骨架在pH 5.5共结晶。在这个pH下，Zn-骨架咪唑基团易于质子化，因此在晶体结构中可以检测来自锌离子的部分解离（图8A-C）。通过Web抗体建模（Web Antibody Modeling）（WAM）工具（N.R.Whitelegg,A.R.Rees,Protein Eng 13,819(Dec,2000)）建立的SDS3/Zn-骨架复合物与自由SDS3基于序列的同源模型的比较，显示高相似性的mAb互补决定区（CDR）以及轻链和重链的相对定向（RMSD偏差为）（图8C）。这表明在使用的结晶条件下和在Zn-骨架存在下，不同CDR采用其标准极限结构（canonical structure）（C.Chothia et al.,Nature 342,877(Dec 21-28,1989)），并且配体结合没有在SDS3抗体-结合位点施加结构变化。因此，这种结构进一步用于对接研究。基于SDS3的晶体结构和SDS4CDR的氨基酸序列，使用标准规程构建了同源模型（N.R.Whitelegg,A.R.Rees,Protein Eng 13,819(Dec,2000)）。

使用MolFit对接程序进行SDS3-MMP-9和SDS4-MMP-9复合物的计算对接分析（E.Katchalski-Katzir et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 89,2195(Mar 15,1992)）。将SDS3的Fv（从Fab SDS3晶体结构获得的）和SDS4的Fv（从构建的模型获得的）对接至MMP-9催化区（PDB代码：1GKC）（图4A-B）。代表性的分子对接模型显示，SDS3和SDS4对MMP-9的结合和抑制是经由其直接结合至催化锌离子以及蛋白酶表面的一部分而介导的。有趣的是，在两个模型中，重链CDR可变区中的一个穿入酶的底物结合裂缝中，经由与蛋白质残基相配位的金属与催化锌离子形成直接键合（图4A-C），而金属体的凹形容纳蛋白酶表面环。重要地，这些蛋白酶表面环在MMP良好保守的家族的成员中显示多样性，并且认为调节肽底物识别，因此，与这些环的相互作用可以定义SDS3和SDS4对这种蛋白酶的选择特性。

有趣的是，基于膜类型的抑制剂丝氨酸蛋白酶1的抗体（由噬菌体展示库筛选产生的）的结构分析，表明蛋白酶抑制是利用经典的蛋白质-蛋白质疏水相互作用通过将非常长的H3环插入到蛋白酶裂缝中介导的（C.J.Farady,P.F.Egea,E.L.Schneider,M.R.Darragh,C.S.Craik,J Mol Biol 380,351(Jul 4,2008)）。可替代地，最近可获得的Fab58（一种功能阻断抗-丝氨酸蛋白酶（S1家族）单克隆抗体（mAb））的晶体结构，揭示了通过将CDR-H1和CDR-H2插入到底物结合裂缝中同时CDR-H3和CDR-L3与暴露的酶表面环相互作用，这种常规的凹形抗体与酶催化裂缝相互作用[C.J.Farady,P.F.Egea,E.L.Schneider,M.R.Darragh,C.S.Craik,J Mol Biol 380,351(Jul 4,2008)；Y.Wu et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 104,19784(Dec 11,2007)]。类似于Fab58，SDS3和SDS4利用多个CDR识别催化金属离子和不同的蛋白酶表面元件两者。

本结果表明这些功能阻断金属体利用混合蛋白质-蛋白质相互作用（hybrid protein-protein interaction）经由金属离子和酶表面两者的结合来结合它们的靶标金属酶（图4A-C）。特别地，这种抑制的分子识别机制与通过MMP内源抑制剂、TIMP和自抑制性MMP pro-区结合它们的靶标酶的模式显示惊人的相似性。类似于抗-MMP金属体，通过利用由金属-蛋白质相互作用和经典的蛋白质-蛋白质相互作用模式两者构成的混合蛋白质-蛋白质相互作用，这些天然的MMP抑制剂阻断肽水解。

实施例7

通过分子模拟机制驱动金属体的体内诱发

这个研究工作揭示了金属无机模拟（metalloinorganic mimicry）合成化合物用作B细胞受体刺激物以引发亲和力成熟和靶向活化的内源性金属蛋白酶的催化位点的选择性抑制金属体的产生的应用。由于B细胞可以通过多种已知和未知的不同机制遇到抗原并对抗原响应，就发起抗原应答而言，其提供大的通用性。本结果提示，金属体的产生是使用两种抗原通过连续的B细胞刺激驱动的。尽管在此处第一金属无机模拟复合物是免疫的结果，并且第二抗原利用提高的内源酶水平，但是这个构思可以扩大至两种模拟相关的抗原通过连续免疫的应用。第一抗原是包括金属离子的核心活性位点结构的小部分的模拟物，该第一抗原激活免疫应答，而第二抗原是包括该小抗原和另外的表面表位的完整酶（原酶，intact enzyme）。

可以认为体内亲和力成熟过程最初可以通过由金属无机模拟分子和内源酶的天然表位两者呈现的高能金属-蛋白质相互作用驱动，紧接着以更多的经典方式对酶表面元件亲和力成熟，这些经典方式例如经由CDR-H2、CDR-H3。使用小的合成金属无机模拟复合物的这种B细胞刺激在使抗体靶向到催化金属-蛋白质裂缝中可以是更有效的。由于它们受限的表面可达性或由于B细胞表位中金属离子可以释放（不限制，loose）其配位位点而在呈递（presentation）期间它们的不稳定性，经常发现后者（催化金属-蛋白质裂缝）是非抗原性的。

重要地，报道的金属体是利用非常规的免疫规程产生的，以使抗体功能区指向存在于包埋在蛋白质支架（骨架）中的关键金属-蛋白质天然基序。类似于MMP内源性抑制剂，SDS3和SDS4的独特设计得益于结合两个不同表位的其结合能不同的优势，其结合能即金属-蛋白质相互作用（>35Kcal/Mol）和蛋白质-蛋白质相互作用（>5Kcal/Mol）。因此本发明人提出，最初的分子模拟识别机制是通过金属-蛋白质配位化学驱动的。

结论

这个研究工作提供了按照非常规免疫方法的功能性阻滞性金属体的设计和产生。报道的研究结果为开发靶向拥有低可达性并因而具有低免疫原性的各种不同的金属蛋白位点的有效的和选择性的抑制性金属体提供了独特的机会。因为据估计，超过30%的已知蛋白质需要具有适当功能性的金属，这个方法概述了用于进一步诱发靶向非免疫原性的额外（premium）的金属蛋白位点的抗体的一般手段。

实施例8

在多发性硬化症的治疗中SDS3和SDS4的应用

材料与方法

EAE诱导和临床评估：对于EAE诱导，在第0天，在侧腹中向8至10周龄的雌性C57Bl6小鼠的皮下注射150μg的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）肽。在包含500μg加热失活的结核分枝杆菌的100μl不完全弗氏佐剂中彻底乳化该肽。在第0天和第2天，用溶解在400μl的缓冲液（0.5M NaCl、0.017%Triton X-100、0.015M Tris，pH=7.5)中的250ng百日咳毒素也在腹膜内注射小鼠。在用MOG免疫之后，每日观察小鼠，并对疾病的严重性打分（具有0.5分度的0-5得分的范围）用于中间临床征兆（intermediate clinical sign）。得分定义如下：0，没有可探测的临床征兆；1，尾巴无力；2，后肢无力或步态异常；3，后肢完全瘫痪；4，后肢完全瘫痪，同时前肢无力或瘫痪；5，垂死或死亡。给予瘫痪的小鼠容易获得的食物和水。

结果

如图9A-D、10A-D和11A-B所示，用抗体SDS4和SDS3进行治疗，检测到与EAE相关的死亡率以及平均和最大疾病得分的显著降低。从疾病发作开始以仅0.5mg/kg每2天的SDS4医学治疗显著抑制了疾病活性。在开始治疗的2至3天内，与小鼠IgG治疗的对照组相比，平均临床得分显著降低，对整体疾病严重性和负担显著降低（相比于用IgG对照治疗的3.65±0.35（得分），对于SDS4治疗的小鼠的平均最大疾病得分是1.7±0.08），以及对疾病存活率有显著益处（在第30天SDS4治疗的小鼠的100%存活率对IgG对照组的60%存活率）。

疾病发作开始以仅5mg/kg以及0.5mg/kg每2天的SDS3医学治疗显著抑制了疾病活性。在开始治疗的7至8天内，与IgG治疗的对照小鼠相比，平均临床得分显著降低，整体疾病严重性降低，并且疾病负担显著降低（与用IgG对照治疗的52±4（的累积疾病得分）相比，对于SDS3治疗的小鼠的累积疾病得分为38.1±2.3）。

这些结果提示SDS3和SDS4对治疗MS具有治疗潜力。

实施例9

TNBS结肠炎的引发和用SDS3/4的治疗

如所描述的，在balb/c小鼠体内引发TNBS结肠炎（Wirtz et al.NatProtoc 2,541-6(2007)）。从第0天开始（TNBS给药），每天以5mg/kg静脉内注射抗体SDS3/4（均为IgG1同种型）持续7天。作为对照，用载体PBS（未经治疗的）或鼠IgG1同种型对照（5mg/kg）治疗小鼠（克隆MOPC-21，Biolegend）。在前2天内死亡的小鼠视为治疗伤亡成员并且排除在所有的计算或描述之外。每个抗体治疗组包括7-10只小鼠（其在第2天后存活）。未经治疗的对照组包括19只小鼠。按照Reuter et al,J ClinInvest 98,2076-85(1996)，以盲方式对TNBS给药后的7天总的肠损害的宏观得分分级。微观得分：将结肠的近端部分、中间部分和远端部分固定在10%磷酸盐缓冲的甲醛中。用苏木精和伊红对嵌入石蜡的部分染色。按照Elson et al.,J Immunol 157,2174-85(1996)，以盲方式对组织学损伤和炎症程度分级。用ANOVA测试组间变化的统计分析，根据Tukey-HSD使用同源子集用所有成对比较测试显著性。认为P<0.05是显著的。

结果

如图12A-F所示，用SDS3金属体或SDS4金属体治疗防止了TNBS结肠炎的发展。

实施例10

SDS3/SDS4结合至MMP-9的表面细胞质基因组共振(表面等离子激元，Surface plasmon resonance）(SPR）分析

使用BIAcore 3000仪器（BIACORE）测定SDS3/SDS4和人与鼠MMP-9催化纤连蛋白片段之间的亲和力。根据生产商的使用说明，通过生物素-抗生蛋白链菌素偶联方法将生物素标记的MMP-9固定在传感器芯片SA上。对于在TBS缓冲液（50mM Tris、100mM NaCl、5mM CaCl₂，pH 7.5）中的结合相（缔合相）和解离相，所有测量都在25°C下以20μl/min的流速进行。随着SPR响应的改变监测相互作用。使用BIAevaluation 3.2软件包（Pharmacia），通过传感图线的适当区的分析测定结合速率常数和解离速率常数k_a和k_d。从两个速率常数（k_d/k_a）之比确定表观平衡解离常数K_D。

结果

分别在图13A和13B中显示了相当于用生物传感器表面固定的MMP-9与SDS3和SDS4的相互作用的对照校正的传感图线。

在下表7中给出了通过SPR分析测定的ka（1/Ms）和kd（1/s）值、和从ka和kd计算的KD（M）（KD=kd/ka）（RU，反应单位）。

表7

	Ka(1/MS）	Kd(1/s）	KD(M）
				SDS3	6.64x103	1.35x10-3	200x10-9
SDS4	4.39x109	1.66x10-3	3.78x10-9

在图14中示出了由表面细胞质基因组共振（表面等离子激元，Surfaceplasmon resonance）测定的锌结合抑制剂AHA对金属体结合至MMP-9的影响。

虽然已结合其具体实施方式描述了本发明，但是显然许多可替代方式、改变和变型对于本领域技术人员是显而易见的。相应地，其涵盖所有落入随附的权利要求的精神和宽的保护范围内的所有这样的可替代方式、改变和变型。

在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在本文中以相同的程度通过援引将其整体合并至说明书中，如同具体和单独地指明独立的出版物、专利或专利申请以在本文中通过援引而合并。此外，本申请中的任何参考文献的引用或辨识不应解释为这样的参考文献作为可获得的本发明的现有技术的许可。对于标题部分使用的范围，它们不应解释为必要的限制。

Claims (5)

1.一种抑制MMP-9和MMP-2的催化活性的Ki低于1.5 μM的抗体，所述抗体包括抗原识别区，所述抗原识别区包括在SEQ ID NO: 10、11、12、13、14和15中给出的六个CDR氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10是该抗体轻链上的CDR1序列，SEQ ID NO:11是该抗体所述轻链上的CDR2序列，SEQ ID NO:12是该抗体所述轻链上的CDR3序列，SEQ ID NO:13是该抗体重链上的CDR1序列，SEQ ID NO:14是该抗体所述重链上的CDR2序列，SEQ ID NO:15是该抗体所述重链上的CDR3序列；或者在SEQ ID NO: 4、5、6、7、8和9中给出的六个CDR氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 4是该抗体轻链上的CDR1序列，SEQ ID NO: 5是该抗体所述轻链上的CDR2序列，SEQ ID NO: 6是该抗体所述轻链上的CDR3序列，SEQ ID NO: 7是该抗体重链上的CDR1序列，SEQ ID NO: 8是该抗体所述重链上的CDR2序列，SEQ ID NO: 9是该抗体所述重链上的CDR3序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，具有如在SEQ ID NO: 28中给出的VH氨基酸序列。

3. 根据权利要求1所述的抗体，具有如在SEQ ID NO: 29中给出的VL氨基酸序列。

4. 一种药物组合物，包括权利要求1-3中任一项所述的抗体和药用载体。

5. 根据权利要求1-3中任一项所述的抗体在制备用于治疗在对象中的炎性肠疾病或多发性硬化症的药物中的应用。