CN102813926A

CN102813926A - miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用

Info

Publication number: CN102813926A
Application number: CN2012102856756A
Authority: CN
Inventors: 张烜; 李扬; 沈濂; 吴湘妮
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2012-08-10
Filing date: 2012-08-10
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2032-08-10
Also published as: CN102813926B

Abstract

本发明公开了miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。本发明还提供含有miR-7表达抑制剂的系统性红斑狼疮治疗药物。在B细胞中抑制表达miR-7后，PTEN的mRNA水平上调，并且发现B细胞增殖功能减弱，表明miR-7表达抑制剂可通过调控PTEN基因的表达来影响B细胞的增殖功能，从而起到治疗SLE的作用。同时，miR-7也通过抑制其靶基因CD200R1参与SLE发病，因此抑制miR-7的表达可以起到治疗SLE的目的。

Description

miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。

背景技术

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是最为经典的自身免疫病，几乎涵盖了整个免疫系统的紊乱，免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，免疫反应包括固有免疫和适应性免疫，近年研究发现micro RNA（miRNA，微RNA）参与免疫系统的紊乱。

miRNAs是一类20-22个寡核苷酸的非编码RNA，成熟miRNA通过核酸序列互补识别特定靶mRNA的3’UTR区，在转录后水平抑制靶mRNA表达，从而抑制蛋白质的合成，达到调控基因表达的目的。miRNAs广泛存在于从病毒、线虫、植物到动物体内，参与生物体的生长、发育、衰老、凋亡的调控及遗传背景的稳定。2002年，Calin GA等人发现miR-15/miR-16在人慢性淋巴瘤中表达下调，首次将microRNA的研究与人类疾病相联。Satoh M等发现，在冠状动脉心脏病中，let-7i的表达与TLR-4信号相关。在造血干细胞向免疫细胞分化的不同阶段，miRNA表达会发生相应的变化，Monticelli S在对小鼠的造血系统研究中发现，T细胞成熟过程中miR-150表达水平明显升高，但是在进一步向Th1、Th2亚群分化时它的表达水平迅速下降。脾脏来源的成熟B细胞中可以检测到miR-150表达明显上调，而在骨髓来源的pro-B细胞中并无上调。miR-181a在T细胞分化早期双阴性期表达水平较高，而在双阳性期及以后时期其水平又明显下降。miR-223可抑制粒细胞的扩增及活化，miR-223缺陷的粒细胞表现出更强的氧化耐受和杀伤白色念珠菌的能力。有研究发现与正常小鼠相比，bic/miR-155^-/-小鼠体内出现胶原沉积、抗体滴度低、T细胞反应水平低等近似人自身免疫病表现。在人树突状细胞，敲除miR-155后IL-1β等前炎分子的表达增加。巨噬细胞中miR-155的生成依赖TLR信号并能抑制DNA损害诱导的凋亡。miR-17-92簇参与胸腺阴性选择过程，并可通过抑制BIM和PTEN表达延长T细胞存活期。miR-326通过作用于其靶基因ETS1促进Th17细胞分化。Dai等通过芯片技术分析了SLE及正常人PBMC中miRNA表达谱差异，发现16个SLE相关miRNA。Tang等应用Taqman PCR方法检测了156个成熟miRNAs在SLE和正常对照组间的表达差异，发现包括miR-146a在内的42个miRNAs在SLE患者中存在表达差异，并发现miR-146a通过作用于Ⅰ型干扰素通路调节SLE的病理过程。

目前关于miR-146a与SLE的发病机制已有相关研究，然而对miR-7的研究主要在肿瘤方面，Lu ZJ发现在神经胶质瘤细胞系中，过表达Mir-7能够抑制肿瘤细胞迁移并抑制肿瘤生成。在神经母细胞瘤分化，皮质发育和胚胎干细胞分化中，miR-7和miR-214特异表达，并控制突起的生长。在胃炎和胃部肿瘤中，miR-7表达量下调,并且与炎症负相关,提示其具有肿瘤抑制作用，在胃癌细胞中转染Mir-7能够抑制细胞增殖和集落形成。在肝细胞癌中，过表达miR-7能够抑制肝癌细胞生长和转移，这一作用是通过Mir-7作用于PI3K/AKT通路实现的。但是，也有研究表示miR-7促进了肿瘤的形成，比如在肺癌中,EGFR能够通过Ras/ERK/Myc通路，促进Mir-7表达。在肺中异常的miR-7表达能促进肿瘤细胞生长，并且使裸鼠的致死率显著提高。另一方面，在内分泌系统中，发现Mir-7在胰岛高表达，在胚胎发育早期，利用反义序列抑制miR-7能够抑制出生后胰岛素的生成量，减少beta细胞的数量和葡萄糖的耐受水平。miR-7还参与了蛋白合成，在工程细胞CHO细胞中过表达Mir-7会抑制细胞生长。Doxakis E发现Alpha-突触核蛋白的表达会受到Mir-7与miR-153的负调控。然而，miR-7在自身免疫病特别是SLE的发病中的作用尚无研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。

其中，所述的所述的miR-7表达抑制剂优选为miR-7反义单链寡核苷酸和/或miR-7-sponge。

本发明中，miR-7的登录号为MIMAT0000252（http://www.miRbase.org）。miR-7的前体为miR-7-1，登录号为MI0000263（http://www.miRbase.org）。

miR-7反义单链寡核苷酸可人工合成或直接市售获得；miR-7海绵（miR-7-sponge）可根据小RNA sponge技术构建。

进一步的，所述的miR-7反义单链寡核苷酸还可经PNA、LNA或2-Ome修饰。

在本发明优选的实施方案中，所述的miR-7表达抑制剂为Anti-miRTM miR-7Inhibitor，购自Ambion公司。

本发明还提供含有miR-7表达抑制剂的系统性红斑狼疮治疗药物。

其中，所述的miR-7表达抑制剂优选为miR-7反义单链寡核苷酸和/或miR-7-sponge。

进一步的，所述的所述的miR-7反义单链寡核苷酸还可经PNA、LNA或2-Ome修饰。

检测初治SLE患者和正常对照PBMC中miR-7的表达，发现SLE患者miR-7的表达显著高于HC，具有统计学差异(0.86±0.03vs0.10±0.08,p=0.0001)。SLE患者B细胞中miR-7的表达显著高于HC，具有统计学差异(0.59±0.08vs0.31±0.06,p=0.027)，然而SLE患者T细胞及单核细胞中miR-7的表达与HC无统计学差异(0.91±0.18vs0.99±0.18,p=0.78,1.30±0.36vs0.98±0.02,p=0.70)，所以miR-7表达量的差异主要集中在B细胞。

通过生物信息学方法预测miR-7的靶基因，挑选与SLE发病可能相关的8个（PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB），采用双荧光素酶报告基因系统验证，各组荧光素酶活性均下降（P<005），说明miR-7可以通过与PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB的3′UTR区相互作用发挥功能。

比较初治SLE患者及HC的T、B细胞中PTEN mRNA的表达，发现在SLE患者B细胞中表达较HC下调，具有统计学差异（0.92±0.24vs 2.20±0.49，p=0.041），在T细胞中的表达与HC相比无明显差异（1.23±0.24vs 1.55±0.53，p=0.579）。

通过电转染的方法，分别转染Pre-miR^TM miR-7Precursor、Anti-miR^TM miR-7 Inhibitor、Pre-miR^TM miRNA Precursors-NegativeControl、Anti-miR^TM miRNA Inhibitors-Negative Control至外周血B细胞中，结果Pre-miR^TM miR-7Precursor能够在B细胞中有效过表达miR-7，Anti-miR^TM miR-7Inhibitor能够在B细胞中有效抑制表达miR-7。

在B细胞中过表达或抑制表达miR-7后，PTEN的mRNA水平相应下调或上调，B细胞增殖功能相应增强或减弱，说明在人的B细胞中，miR-7能够直接抑制PTEN的表达水平，并能够促进B细胞增殖，而抑制表达miR-7后能促进PTEN的表达水平，并能够抑制B细胞增殖。

在PBMC中转染Ad-miR-7或Ad-GFP，结果显示转染Ad-GFP 48小时后CD200R1的阳性率为25.13%，平均荧光强度MFI=406.55,转染Ad-miR-748小时后CD200R1的阳性率为7.51%，平均荧光强度MFI=262.86，说明miR-7能够直接下调CD200R1的表达水平。

SLE患者miR-7的表达水平显著高于健康对照，并且SLE患者B细胞中miR-7的表达显著高于健康对照，表明SLE患者高表达miR-7参与SLE的发病。另一方面，SLE患者B细胞中PTEN的表达低于健康对照，表明SLE患者低表达PTEN参与SLE的发病。本发明证明PTEN是miR-7的靶基因，又由于SLE患者高表达miR-7，表明miR-7参与SLE发病。因此，miR-7表达抑制剂能够通过纠正SLE患者PTEN的低表达，并且抑制B细胞的增殖而起到治疗SLE的作用。通过将miR-7表达抑制剂，如miR-7反义单链核苷酸和/或miR-7-sponge直接注射给患者，使miR-7抑制剂与体内miR-7结合，而阻断miR-7对其靶基因的作用，进而起到治疗的目的。

附图说明

图1SLE患者及HC不同细胞亚群中miR-7的相对表达量。

图2所示为靶基因的双荧光素酶报告系统检测结果。

图3所示为SLE患者及HC的T、B细胞中靶基因PTEN mRNA的表达。

图4所示为转染Pre-miR^TM miR-7Precursor、Pre-miR^TM miRNAPrecursors-Negative Control、Anti-miR^TM miR-7 Inhibitor、Anti-miR^TM miRNA Inhibitors-Negative Control后，RT-PCR检测miR-7的表达。

图5所示为在B细胞中过表达或抑制表达miR-7后，PTEN的mRNA水平的变化。

图6所示为转染Pre-miR^TM miR-7Precursor、Pre-miR^TM miRNAPrecursors-Negative Control、Anti-miR^TM miR-7Inhibitor、Anti-miR^TMmiRNA Inhibitors-Negative Control后，B细胞的增殖能力。

图7所示为腺病毒转染效率及miR-7对CD200R1表达水平的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

共采集20例SLE患者，为北京协和医院2009～2011年门诊初治患者，均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE诊断标准，排除患有其它全身性疾病者。正常对照20例来自健康志愿者，年龄、性别与病例匹配，同时不得具备SLE诊断标准中的任何一条。

实施例1SLE患者及HC的PBMC、T细胞、B细胞、单核细胞中miR-7的表达

用Trizol法抽提总RNA，反转录后用实时定量PCR法扩增测定miRNA表达。采用TaqMan探针法，试剂为美国应用生物系统公司（ABI）商品化的引物及试剂盒（反转试剂盒：名称FG，Taqman(r)microRNA RT Kit 200rxns，货号4366596；PCR试剂盒：名称TaqMan Gene Expression Master Mix，货号4369016；反转引物及PCR引物：名称

MicroRNA Assays 50RT+150PCR，货号货号4427975）。

收集初治SLE患者和HC各4例，检测PBMC中miR-7的表达，发现SLE患者miR-7的表达显著高于HC，具有统计学差异(0.86±0.03vs0.10±0.08,p=0.0001)，为进一步明确各细胞亚群上miR-7的表达差异，收集SLE患者12例及HC6例，通过流式细胞仪分选T、B细胞及单核细胞，发现SLE患者B细胞中miR-7的表达显著高于HC，具有统计学差异(0.59±0.08vs0.31±0.06,p=0.027)，然而SLE患者T细胞及单核细胞中miR-7的表达与HC无统计学差异(0.91±0.18vs0.99±0.18,p=0.78,1.30±0.36vs0.98±0.02,p=0.70)，所以miR-7表达量的差异主要集中在B细（图1）。

实施例2双荧光素酶报告基因系统验证预测的miR-7的靶基因

通过Targetscan、PicTar及miRanda三个软件对miR-7的靶基因进行预测，根据这些靶基因的生物学功能是否与自身免疫病的发病机制相关，选取8个作为miR-7的靶基因进行验证，分别为PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB。

克隆miR-7预测的靶基因3’-UTR序列，并在引物两端加上酶切位点XbaI(5’-TCTAGA-3’)和NotI(5'-GCGGCCGC-3')。引物序列如下：

分别对pmiRGLO载体（购自Promega）和上述扩增到的序列进行XbaI和NotI双酶切。回收目的片段后，将各自的扩增片段连接到载体上，构建成携带有靶基因3′UTR区的双荧光素酶报告基因载体。

将构建好的质粒共转染293T细胞（中国医学科学院细胞中心），方法如下：

1）293T细胞至对数生长期，胰酶消化后计数，按每孔为2×104个细胞将细胞均匀接种在96孔细胞培养板，常规培养过夜，细胞生长状态稳定并达到每孔细胞的贴壁覆盖率为90-95%左右；

2）转染293T细胞，每孔细胞转染报告基因质粒150ng，共转Pre-miR^TM miR-7Precursor（miR-7前体，购自美国Ambion公司）或Pre-miR^TM miRNA Precursors-Negative Control（针对Pre-miR^TM miR-7Precursor的阴性对照，购自美国Ambion公司）3pmol，二者按比例混合后加入到25opti-MEM培养基中；

3）用25μl Opti-MEM培养基稀释1.0μl脂质体（Lipofectamine^TM2000），轻混匀，室温孵育5min；

4）将稀释的质粒DNA和脂质体混合后混匀，室温孵育20min；

5）吸除培养板中的细胞培养液，每孔加入50μl预热的新鲜无血清DMEM培养基；

6）将50μl脂质体和质粒混合液加入到各培养孔中，轻轻混匀；

7）置于37℃，5%CO₂培养箱中孵育6h，更换新鲜的完全细胞培养基，继续培养24h后用双荧光报告基因检测系统检测报告基因的表达水平。

将Pre-miR^TM miR-7 Precursor或Pre-miR^TM miRNAPrecursors-Negative Control与含有靶基因3′UTR区的报告质粒共转染入293T细胞中，以miR-7的非靶基因IL-10作为该系统的阴性对照，设计与miR-7前体序列完全互补的序列作为该系统的阳性对照，测定细胞荧光素酶活性。所有实验均重复两次，每次三复孔。如果miRNA与相应的靶基因的3′UTR相互作用，则表现为细胞荧光素酶活性表达下降。结果显示，转染miR-7前体的细胞中，共转miR-7前体序列完全互补的序列后，荧光素酶活性显著下降，说明过表达的miR-7能够通过与互补序列结合有效抑制荧光素酶活性。共转靶基因PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB的3′UTR序列后，各组荧光素酶活性下降（P<005）；共转IL10的3′UTR序列荧光素酶活性几乎与对照相当。说明miR-7可以通过与PTEN、FOXO1、CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB的3′UTR区相互作用发挥功能（图2）。

实施例3SLE患者及HC的T、B细胞中靶基因PTENmRNA水平的检测

分别提取SLE患者以及HC的T、B细胞的RNA，反转录成cDNA后，用荧光定量PCR测定靶基因PTEN的mRNA表达水平，以GAPDH作为内参基因。

引物设计如下：

PCR反应条件如下：95℃预变性1min，95℃5s，60℃30s，30个循环，95℃1min，55℃1min，然后以每10s上升0.5℃，共需81个循环升至95℃，采集溶解曲线。结果如图3所示。比较初治SLE患者及HC的T、B细胞中靶基因PTEN mRNA的表达，发现在SLE患者B细胞中表达较HC下调，具有统计学差异（0.92±0.24vs 2.20±0.49，p=0.041），在T细胞中的表达与HC相比无明显差异（1.23±0.24vs 1.55±0.53，p=0.579）。

实施例4过表达或者抑制表达miR-7后PTEN的mRNA水平的变化

通过电转染的方法，转染Pre-miR^TM miR-7Precursor、Pre-miR^TMmiRNA Precursors-Negative Control、Anti-miR^TM miR-7 Inhibitor、Anti-miR^TM miRNA Inhibitors-Negative Control（购自美国Ambion公司），至外周血B细胞，采用荧光定量PCR法（Taqman探针法）检测转染后的细胞中miR-7的表达以明确转染效果，结果显示，Pre-miR^TM miR-7Precursor能在B细胞中有效过表达miR-7，而Anti-miR^TM miR-7Inhibitor能够在B细胞中有效抑制表达miR-7（图4）。

选取1例SLE初治患者，通过电转染的方法，在B细胞转染Pre-miR^TM miR-7 Precursor、Pre-miR^TM miRNA Precursors-NegativeControl、Anti-miR^TM miR-7 Inhibitor、Anti-miR^TM miRNAInhibitors-Negative Control后，PTEN的mRNA相对表达量分别为0.79、0.87、1.29、0.86，说明与miRNA阴性对照相比，过表达miR-7能够在一定程度抑制PTEN的基因表达，而抑制miR-7能够促进PTEN的基因表达（图5），即在人的B细胞中，Anti-miR^TM miR-7Inhibitor能够抑制miR-7对PTEN的下调作用，实现SLE患者PTEN表达的上调，抑制患者体内B细胞过度增殖，控制疾病发展。

实施例5miR-7对B细胞增殖功能的影响

为了解miR-7对于B细胞增殖功能的影响，在B细胞转染Pre-miR^TM miR-7Precursor、Pre-miR^TM miRNA Precursors-NegativeControl、Anti-miR^TM miR-7Inhibitor、Anti-miR^TM miRNAInhibitors-Negative Control，使其miR-7的表达上调或者下调，再将细胞进行CFSE染色后进行培养5天，观察B细胞中miR-7的表达水平对B细胞增殖功能的影响，可见转染了Pre-miR^TM miR-7Precursor的B细胞增殖能力高于转染Anti-miR^TM miR-7Inhibitor的B细胞，说明miR-7表达抑制剂能够抑制B细胞的增殖（图6）。

实施例6miR-7对CD200R1表达水平的影响

Li Y，Zhao LD,Tong LS,et al.Aberrant CD200/CD200R1expression and function in systemic lupus erythematosus contributes toabnormal T-cell responsiveness and dendritic cell activity.Arthritis ResTher.2012;14(3):R123的研究结果表明，SLE患者PBMC中CD200R1的mRNA水平及蛋白水平均较HC有明显减少，致SLE患者体内CD200/CD200R1信号通路缺陷，该缺陷使SLE患者炎性Th17细胞分化增加，调节性Treg生成减少，促进抗CD3/抗CD28刺激的CD4+T细胞增殖，DC对凋亡细胞吞噬障碍等，为明确miR-7是否能够调控PBMC中CD200R1的表达，将miR-7前体片段克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV多克隆位点，构建成pAdTrack-CMV-miR-7。构建好的pAdTrack-CMV-miR-7（过表达miR-7前体的带有GFP标签的穿梭载体）与腺病毒载体AdEasy1同源重组成重组腺病毒载体，将重组腺病毒载体转染293A细胞包装成重组腺病毒Ad-miR-7。另外，将pAdTrack-CMV与腺病毒载体AdEasy1按相同方法同源重组并转染细胞包装成重组腺病毒Ad-GFP（仅仅带有GFP标签的重组腺病毒）作为阴性对照。用Ad-miR-7或Ad-GFP感染PBMC，通过流式细胞仪检测GFP阳性率来确定转染效率，并检测GFP阳性细胞中CD200R1的表达，即可比较过表达miR-7的PBMC及阴性对照中CD200R1的表达水平，方法如下：

1、重组腺病毒的构建与包装

1)利用PCR方法从人基因组DNA中扩增得到的miR-7-1前体片段用BglⅡ-NotⅠ双酶切后与同样用BglⅡ-NotⅠ双酶切穿梭载体pAdTrack-CMV定向连接，连接产物转化E.coli DH5α，铺卡那霉素抗性LB平板，挑取克隆，接种于5ml卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃震摇过夜，次晨直接用菌液进行PCR鉴定，或提取质粒进行酶切鉴定，鉴定为阳性的克隆经测序正确后扩大培养，提取质粒并标记为pAdTrack-CMV-miR-7。

2)将穿梭质粒pAdTrack-CMV-miR-7或pAdTrack-CMV 300ng经PmeI酶切4h或过夜，充分线性化（不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率，将线性化质粒去磷酸化有助于降低背景信号），凝胶回收纯化酶切后的DNA，溶于6μl去离子水中。

3)pAdTrack-CMV-miR-7或pAdTrack-CMV与AdEasy1同源重组：将回收的线性化载体与1μl（100ng/μl）腺病毒载体（Ad easy-1质粒）共转化E.coli BJ5183感受态细菌（电转条件2500V，200Ohms，25micro-FD）。用500μl LB培养基重悬细菌，37℃孵育10-20min，铺卡那霉素抗性LB平板，置于37℃孵箱内培养16-20h。

4)鉴定阳性克隆：挑取较小的克隆15-20个，分别接种于卡那抗性液体LB培养基5ml中，37℃震摇过夜。次晨收菌，立即提取质粒（避免在任何温度下储存菌液，但可将其制成甘油菌-80℃冻存），凝胶电泳，挑选大质粒，然后用PCR的方法鉴定筛选重组子。带有目的基因者用PacI酶切鉴定可得到30kb带以及较小的4.5kb或3kb条带。

5)质粒大量提取：取鉴定正确的重组质粒转化E.coli DH5α，铺卡那霉素抗性LB平板，置于37℃孵箱内培养过夜。挑取阳性菌落接种于含25μg/ml卡那霉素的液体LB培养基100-200ml中，37℃震摇过夜（20h），按常规方法提取质粒。

6)PacI酶切线性化：取50μg重组质粒用PacI酶切4-6h或过夜。酚、氯仿/氯仿+异戊醇（24：1）各抽提一次，乙醇沉淀后，在无菌条件下溶于MilliQ级别纯水中，-20℃保存备用。

7)将上一步线性化的重组质粒转导293A细胞：转染前一天，293A细胞按70％左右接种于10cm平皿中，取3-4ug线性化的重组质粒，与Lipofectamine2000试剂按比例混合，按Lipofectamine2000说明书转染293A细胞。

8)上述转染的细胞培养约7-10天左右可用荧光显微镜观察，至细胞基本全部呈绿色且30－50％细胞悬浮时，收集细胞及培养液，于-80℃与37℃之间，冻融4次，2000g离心收集上清，用于再次扩增病毒。

9)以上步收集病毒液再次感染293A细胞，2-3天后，细胞约有50％左右悬浮，重复（8）步骤，增加病毒滴度，约3－5次。

10)每种重组病毒感染约15个10cm平皿，收集细胞，PBS洗2次，离心后以PBS重悬（约1－2ml），反复冻融3－4次，融化时使用37度水浴，但是控制融化的温度，不要让病毒温度升得太高，刚刚融化时即放入冰上，然后离心收集上清。

11)上步上清以Amicon Ultra-15(1000,000MW)柱纯化病毒，测定病毒滴度。

2、腺病毒感染方法

1）取适量病毒纯化液（Ad-miR-7和Ad-GFP）加入到细胞培养基中（培养基体积不宜太多，以10⁶细胞/ml以上密度为宜），混匀后再加入polylysine至终浓度0.5μg/ml，室温放置100min。

2）细胞以PBS洗2次后，将上述病毒培养基混合液加到细胞上面，放置于培养箱内孵育100min。

3）以1:1体积比加入含10%FBS的完全培养基，培养24h。

4）荧光显微镜观察感染效率，并以PBS洗细胞2次，更换新鲜培养基并进行后续实验。

3、流式标本的荧光染色

1)PBMC经病毒转染48小时后，收集细胞检测CD200R1的表达，取100μl(5×105cell)/每管加入已做好相应标记的流式检测管。

2)检测管中加入PE-CD200R1流式抗体10μl，对照管中加入与抗体相对应的同型对照。轻柔震荡混匀，4℃避光孵育30分钟。

3)孵育结束，每管加入2ml FACS缓冲液，1500rpm，离心6分钟，弃上清。重复洗涤2遍。

4)加入PBS 200μl重悬细胞，立即上机检测或4%多聚甲醛溶液固定，48小时内上机检测。

结果显示，Ad-GFP的转染效率为42.7%，Ad-miR-7的转染效率为57.4%，转染Ad-GFP 48小时后CD200R1的阳性率为25.13%，平均荧光强度MFI=406.55,转染Ad-miR-748小时后CD200R1的阳性率为7.51%，平均荧光强度MFI=262.86，说明miR-7能够直接下调CD200R1的表达水平（图7）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国医学科学院北京协和医院

<120>miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用

<130>

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tctagaacac gtacttgtgc ga 22

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gcggccgctc ttgtaatgta aac 23

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tctagacaga gcactgggtt g 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcggccgcga tttattagtt c 21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tctagaccca cccatgagaa g 21

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcggccgcca gcttgtttat tc 22

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tctagaggat tctcattcat accc 24

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gcggccgcca tatttaatct gg 22

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tctagatggc tacgattctc tc 22

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gcggccgcgc gcgcaaaatc c 21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tctagaaaac atggctacta g 21

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gcggccgcaa tcagtggaac 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tctagacagt gctaaaattc 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gcggccgcta tatatcaatg 20

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

tctagagaca gtcctttgca c 21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gcggccgctc acccttttcc c 21

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tctagagcca gctaccccct acc 23

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

gcggccgctg ggtccagccc tgtt 24

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ccaggaccag aggaaacc 18

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gctagccttc tggatttga 19

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

tcggagtcaa cggatttggt c 21

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gccatgggtg gaatcatatt gg 22

Claims

1.miR-7表达抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的miR-7表达抑制剂为miR-7反义单链寡核苷酸和/或miR-7海绵。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的miR-7反义单链寡核苷酸经PNA、LNA或2-Ome修饰。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的miR-7表达抑制剂为Anti-miR^TM miR-7Inhibitor。

5.含有miR-7表达抑制剂的系统性红斑狼疮治疗药物。

6.如权利要求5所述的药物，其特征在于，所述的miR-7表达抑制剂为miR-7反义单链寡核苷酸和/或miR-7海绵。

7.如权利要求4所述的药物，其特征在于，所述的miR-7反义单链寡核苷酸经PNA、LNA或2-Ome修饰。

8.如权利要求5或6所述的药物，其特征在于，所述的miR-7表达抑制剂为Anti-miR^TM miR-7Inhibitor。