CN102802658A - 白细胞衍生趋化因子2于肿瘤细胞内降低肝细胞生长因子受体的磷酸化相关的方法与组合物 - Google Patents

Abstract

已发现白细胞衍生趋化因子2(LECT2)与HCC病患的血管侵入程度的抑制调控有关。亦发现LECT2通过抑制MET及其他在HGF/MET路径中下游目标的磷酸化，而强烈地减少HCC细胞的生长、迁移及侵入。发现LECT2的HXXXD基序对于其肿瘤抑制机制是重要的。除了HCC以外，LECT2于其他癌症中减少Met酪氨酸磷酸化及肿瘤细胞侵入，例如肺癌、乳癌、及胃癌。基于上述新发现的LECT2的肿瘤抑制特性，描述用于预防、治疗或诊断肿瘤(例如HCC)的方法及组合物。

Description

白细胞衍生趋化因子2于肿瘤细胞内降低肝细胞生长因子受体的磷酸化相关的方法与组合物

相关申请的交叉引用

依据35U.S.C.§119(e)本申请被授权要求申请号61/288,627、递交日2009年12月21的美国临时专利申请的优先权。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界上最普遍的癌症型态之一，其年发病率为约一百万件(1)。在台湾，肝细胞癌持续成为造成男性癌症相关死亡的首要原因及女性癌症相关死亡的第二位原因。较高分期的HCC五年内的存活率，例如第II至III期，约为20％，存活率不及第I期(即约60％)的三分之一。高癌症复发仍是HCC病患的主要死因。主要的不良预后因子包含血管侵入(2)。使用人类膜/分泌蛋白(TMSEC)的高通量技术抑制相减杂交法(SSH，suppression subtractive hybridization)及寡核苷酸微数组，已发现相较于非血管侵入性的HCC病患，血管侵入性的HCC病患有20个基因的表现有显着差异。特别是，已发现白细胞衍生趋化因子2(LECT2)(20个表现有差异的基因之一)在血管侵入性的HCC病患中会受到抑制调控(down-regulated)。

LECT2蛋白质是自植物血球凝集素-活化型人类T细胞白血病SKW-3细胞的培养上清液中分离出来，而作为一种嗜中性球的新的趋化激素，参见Yamagoe等人(3)。由于已发现LECT2蛋白质与软骨调节素II(chondromodulin-II)(一种软骨细胞的生长刺激因子)是相同的，因此LECT2蛋白质可以是多功能的。LECT2已显示与损坏后的修复及细胞生长有关(4，5)。已显示LECT2是表现于肝细胞中(17)，且LECT2在完全成熟(full-blown)的HCC细胞中变成实质上阴性的(negative)(18)，表示LECT2除了活化嗜中性球外，在HCC细胞中亦为重要角色。然而，LECT2在癌症发展(例如迁移、侵入及转移)中的确切角色目前仍未被报导。

鉴别使病患倾向死亡的因子对于肿瘤控制是重要的。许多分子因子已显示与HCC的侵入有关，并具有潜在的预后意义。这些因子包含DNA染色体套数的变化、细胞的增生标志、细胞核形态、致癌基因及其受体，例如ras、c-myc、HGF、及Met受体(6)。

Met酪氨酸激酶(Met或c-Met)，亦被称为肝细胞生长因子受体(HGFR)，是一源自于一单链前驱物进行蛋白裂解而得到的双硫键键结的异源二聚体。该异源二聚体是由一单次穿膜β链(145kDa)及一完全胞外的α链(50kDa)所形成。该胞外片段包含一Sema功能域(domain)、一由超过500个氨基酸所组成的非典型基序(motif)，其对于配体具有低亲和力的结合活性。该胞外部分亦包含一被称为Met相关序列(MRS)的富含半胱氨酸的功能域(Cys功能域)、及四个类免疫球蛋白结构(IPT功能域)，其为一典型的蛋白质-蛋白质交互作用区。该受体的胞内部分是由一近膜区段(juxtamembrane section)、一随后的催化部位及一C-端调节尾端所组成。该近膜区段对于受体的抑制调控是重要的(7)。该近膜区段包含一丝氨酸残基(例如，人类MET中的Ser 985)，其一旦磷酸化后会负责抑制该受体激酶的活性、及包含一可结合至原致癌基因产物CBL的酪氨酸(例如，人类MET中的Tyr 1003)，其是一促进受体多次泛素化(polyubiquitination)从而导致Met降解的泛素连接酶(8)。该近膜部分的两侧是催化部位，其包含二个负责调节该酶活性的酪氨酸(例如，人类MET中的Tyr 1234及1235)。最后，该C-端尾端包含二个酪氨酸残基(例如，人类MET中的Tyr 1349及1356)，当其被磷酸化后会创造一多功能的停泊位点(docking site)，可招唤一大群负责细胞内经由配体-受体交互作用所引发的讯息传递的胞内衔接子(adaptors)(9)。已证实这二个酪氨酸残基对于执行Met的生理功能及引起Met的致癌潜力是必要且足够的(10)。

Met受体调节多种细胞事件，范围自细胞运动及血管生成至形态分化及组织再生。为了有助于这些活动，Met受体细胞质的C-端区域作为许多蛋白质基质(包含Grb2、Gab1、STAT3、Shc、SHIP-1及Src)的停泊位点。这些基质的特点是具有多个功能域，包含PH、PTB、SH2及SH3功能域，其会直接和Met的多基质C-端区域交互作用。参考Victor Martin Bolanos-Garcia，Molecular and Cellular Biochemistry，2005，Vol.276：149-157。

HGF/c-Met讯息传递路径现在已被视为是一个癌症治疗中有希望的目标，例如，用于抑制血管生成、肿瘤生长、侵入、及转移(11)。肝细胞生长因子(HGF，亦被称为分散因子，SF)是一多功能的生长因子(12，13)。其是以一单链非活性前驱物蛋白质而产生。成熟的活性HGF是一由一α-链次单元及一β-链次单元所组成的异源二聚体，该异源二聚体是由一双硫键所键结(14)。该α-链次单元包含一N-端发夹(hairpin)功能域及四个三环(kringle)功能域。该β-链次单元是一由于必须残基的突变而缺少催化活性的类丝氨酸蛋白酶功能域(15)。HGF结合至c-Met会引起Met的细胞质功能域的自体磷酸化。取决于肿瘤的发展，Met的活化可引发不同表现型(16)。

需要新的策略以诊断并治疗癌症。特别地，需要调查癌细胞侵入根本的讯息传递分子机制。本发明是关于基于癌细胞侵入的讯息传递分子机制(例如，经由在肿瘤细胞中有效量的LECT2而减少MET磷酸化)而诊断及/或抑制癌细胞侵入的新的方法与组合物。

发明内容

本发明中发现LECT2通过一涉及Met受体的讯息传递路径，例如，经由于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化，而明显地减少肿瘤细胞(例如HCC细胞或其他肿瘤细胞)的增生、迁移及/或侵入。

因此，一方面而言，本发明是关于一种抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种的方法。该方法包含投予该肿瘤细胞一药剂，以于该肿瘤细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性，藉此于该肿瘤细胞中减少MET的磷酸化。

在一特定的实施态样中，本发明是关于一种在一个体中预防或治疗肝细胞癌的方法。该方法包含投予该个体一药剂，以提升该个体的肝细胞癌细胞中LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性，藉此于该肝细胞癌细胞中减少MET的磷酸化。

本发明的另一方面是关于一种于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化的方法。该方法包含投予该肿瘤细胞一药剂，以于该肿瘤细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性。

本发明的另一方面是关于一种用于预防或治疗肿瘤的医药组合物。该组合物包含一载剂及一包含LECT2蛋白质或其活性片段氨基酸序列的多肽。或者，该医药组合物包含一载剂及一多核苷酸，该多核苷酸包含一编码LECT2蛋白质或其活性片段的核苷酸序列。该包含LECT2蛋白质或其活性片段的多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

本发明的另一方面是关于一种判定个体具有增加侵入性肿瘤发展的风险的方法，该方法包含：

(a)自一个体获得一生物样本；

(b)测量该生物样本中MET磷酸化的程度；以及

(c)比较步骤(b)所测量的磷酸化的程度与对照组的程度；

其中当步骤(b)所测量的磷酸化的程度较对照组的程度为高时，则判定该个体具有增加侵入性肿瘤发展的风险。

在一特定的实施态样中，该诊断方法包含序列分析及侦测LECT2的HXXXD基序中的突变。

本发明的另一方面是关于一种用于诊断一个体具有增加侵入性肿瘤发展的风险的套组(kit，试剂盒)，该套组包含：

(a)用于量测一个体的生物样本中MET磷酸化程度的试剂；以及

(b)使用该试剂以判定该个体具有增加侵入性肿瘤发展的风险的操作指示。

在一特定的实施态样中，该套组包含用于序列分析及侦测LECT2的HXXXD基序中的突变的试剂。

本发明的又一方面是关于一种预防或治疗侵入性肿瘤的方法，其包含：

(a)基于一个体的生物样本中提升MET磷酸化的程度及减少LECT2蛋白质的蛋白质程度或生物活性，判定该个体具有增加侵入性肿瘤发展的风险；以及

(b)投予该个体一药剂，以提升LECT2蛋白质的蛋白质程度或生物活性，藉此于该个体的肿瘤细胞中减少MET的磷酸化。

本发明的另一方面是关于一种鉴定一可用于抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种的化合物的方法。该方法包含鉴定一于肿瘤细胞中提升LECT2的表达或生物活性的化合物，其中该生物活性包含于该肿瘤细胞中减少MET的磷酸化。

本发明的实施态样亦关于一种经分离的LECT2蛋白质的活性片段，其具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET；以及一种经分离的编码如上述多肽的多核苷酸、一包含该多核苷酸的载体、及一包含该载体的重组宿主细胞。

本发明亦关于使用一种包含LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽于制备药剂的用途，该药剂是用于抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种，其中，该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

本发明的又一方面是关于使用一种编码一包含LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽的多核苷酸于制备药剂的用途，该药剂是用于抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种，其中，该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

本发明的其他方面、特色及优点将于下文揭露中(包含本发明的详细叙述及其较佳实施态样与所附的申请专利范围)显示。

附图说明

当与附图一并联结阅读时，将可更加地了解上述的概要说明，以及后续本发明的详细叙述。为了阐释本发明的目的，显示于附图中的是目前较佳的实施态样。然而，应理解本发明并不限于所显示的精确的安排及手段。

图1所示为人类RTK磷酸化抗体阵列的照片：将来自人类肝细胞癌细胞(HCCs)的完全的细胞萃取物反应于RTK抗体阵列上，经由后续与抗-磷酸化酪氨酸辣根过氧化酶反应而测定磷酸化状态；以成对的圆点将每一种RTK成对地打点，在每一个角落以阳性对照组(control)打点；每一对阳性RTK圆点皆以一数字标明，以鉴别该阵列下方所列的对应RTKs；在磷酸化RTK阵列上分析的25种RTKs中，7或8种生长因子RTKs在人类HCC SK-Hep1细胞中高度地磷酸化：

图1(A)显示LECT2蛋白质的表达会于HCC中减少多种受体酪氨酸激酶(RTKs)的磷酸化：SK-Hep1/LECT2是一过度表达LECT2的稳定的转染子；SK-Hep1/Neo是载体对照组的转染子；Huh-7/shLECT2-2是一剔除表现LECT2的稳定的转染子；以及Huh-7/shLuc是一载体对照组的转染子；

图1(B)显示以重组LECT2蛋白质处理会于SK-Hep1细胞中降低多种RTKs：该阵列是以来自经1.25nM、2.5nM的最终浓度、或对照组的重组人类LECT2-Fc蛋白质(rLECT2)处理或未经处理的细胞的总细胞溶胞产物样本而进行；

图2说明LECT2蛋白质以剂量依赖及时间依赖方式抑制Met及下游蛋白质的酪氨酸的磷酸化，如同经由在经rLECT2处理的SK-Hep1细胞中的Met、Erk及Akt蛋白质的磷酸化的蛋白质印迹(Western blot)分析所示，每一种处理皆以三重复进行，且该试验重复至少三次：

图2(A)：在以rLECT2蛋白质(0至10nM)处理10分钟后，回收该细胞，萃取蛋白质并经由Western blot分析检验各种蛋白质(例如，磷酸化-Met(p-Met)、磷酸化-Erk(p-Erk)及磷酸化-Akt(p-Akt))的内生性的磷酸化程度，并侦测Met、Erk及Akt的总蛋白质程度，以做为装填(loading)等量的对照组；并以rFc蛋白质处理SK-Hep1细胞，以作为经重组细胞联结的标记对照组；

图2(B)：在以2.5nM rLECT2蛋白质处理0、5、10、15、30、60、及120分钟后，经由Western blot分析测验该完全的细胞溶胞产物的p-Met、p-Erk及p-Akt，并侦测Met、Erk及Akt的总蛋白质程度，以做为装填等量的对照组；

图3说明HCC组织样本中LECT2程度与Met受体活性间的负相关(inverseassociation)：使用抗-LECT2、抗-p-Met、抗-Met及抗-β-肌动蛋白抗体进行Western blot，以测定各种疾病期(I、II及IV)的HCC肿瘤组织中LECT2、p-Met、Met及β-肌动蛋白的程度；

图4说明LECT2蛋白质于HCC细胞中抑制经HGF诱导的细胞增生、迁移及侵入，每一种处理皆进行三重复，且该试验重复至少三次：

图4(A)：暴露于具有不同浓度的rLECT2(0-5nM)的新鲜的DMEM培养基(对照组)或含有HGF(40ng/mL)的DMEM培养基的单层经培养的HCC SK-Hep1细胞的生长特性；

图4(B)：以一蓝吸头剪切(sheared)群集的SK-Hep1单层，接着曝露至具有不同浓度的rLECT2(0-5nM)的新鲜的DMEM培养基(对照组)或含有HGF(40ng/mL)的DMEM培养基中达14小时，并观察伤口的愈合；

图4(C)：经由Boyden腔室而测定的经rLECT2处理16小时的SK-Hep1细胞的活体外的侵入活性；

图5显示LECT2抑制细胞侵入及Met受体酪氨酸的磷酸化，自MET分离连结子蛋白质，但于HCC细胞中提升MET与PTP1B的联结：

图5(A)：rLECT2蛋白质于HCC细胞中抑制经HGF诱导的Met及其他下游路径中的RTKs的磷酸化；

图5(B)：LECT2于过度表现LECT2的转染子SK-Hep1/LECT2中抑制经HGF诱导的Met的磷酸化；但相较于载体对照组细胞，可于剔除表现LECT2的转染子Huh-7/shLECT2-2中观察到经HGF诱导的Met的磷酸化的提升；相较于对照组细胞，SK-Hep1/LECT2的经HGF诱导的侵入能力亦降低；

图5(C)：重组LECT2对连结子蛋白质自Met受体分离的影响的免疫沉淀(IP)及Western blot(WB)分析；

图5(D)：重组LECT2对PTP1B与Met受体的联结的影响的IP及WB分析；

图6说明HCC细胞中的LECT2-Met蛋白质的交互作用的IP、Far WB及流式细胞仪分析的结果：

图6(A)：来自HCC细胞的内生性的LECT2蛋白质及Met的IP及WB分析；

图6(B)：293T细胞中LECT2及Met的重组表现，以及重组293T细胞中重组LECT2蛋白质及Met的IP及WB分析；

图6(C)：LECT2与Met以剂量依赖方式的交互作用的Far Western blot分析；

图6(D)：于试管试验中重组LECT2蛋白质直接结合至Met受体；以及

图6(E)：于SK-Hep1细胞中的LECT2蛋白质与Met的结合试验的流式细胞仪分析；

图7说明LECT2蛋白质的HXXXD基序与Met受体联结：

图7(A)：LECT2与Met受体停泊的预测模式的停泊结果；

图7(B)：LECT2抑制Met的磷酸化及侵入，但具有经突变的HXXXD基序的突变的LECT2(例如mLECT2-1或mLECT2-2)则不然；

图7(C)：HCC细胞中Met与LECT2及突变的LECT2蛋白质的联结的IP及WB分析；

图8显示于其他癌细胞中重组LECT2蛋白质对MET受体酪氨酸的磷酸化的影响；以结合或未结合2.5nM重组LECT2蛋白质(rLECT2)的HGF(40ng/mL)处理癌细胞15分钟；24小时后，以Boyden腔室测量癌细胞的活体外的侵入活性；每一种处理以三重复进行，且该试验至少重复三次：

图8(A)：肺癌细胞株A549；

图8(B)：乳癌细胞株MB-MDA-231；

图8(C)：胃癌细胞株N87；

图8(D)：卵巢癌细胞ES-2；

图8(E)：下咽癌细胞FaDu；以及

图8(F)：神经胶母细胞瘤细胞U87；以及

图9说明pSecTag2A载体中的LECT2全长的点突变的设计。

具体实施方式

在背景技术或整篇说明书中引述或描述的各种出版物、文章及专利，每一份文献的全文皆并于此处以供参考。本说明书中包含的对于文件、行为、材料、设备、或文章等的讨论，其目的是用于提供本发明的脉络。这种讨论并非承认任何或所有的这些事项对于任何所揭露或主张的发明形成其背景技术的一部分。

除非另有定义，此处所使用的所有技术与科学词汇皆具有与本发明的技术领域中的普通技术人员通常理解相同的意义。除非，此处所使用的特定词汇具有如说明书中所规范的意义。此处所引述的所有专利、公开的专利申请案及出版物的全文皆并于此处以供参考。必须注意除非内文中另有清楚规定，当于此处及随附权利要求书中使用单数形式的“一”、“一种”、及“该”时，其包含多数的参照形式。

用于本说明书的词汇“个体”意指任何动物，特别是哺乳类，尤指人类，其即将或已经投予根据本发明的实施态样的化合物或医药组合物。本说明书所使用的词汇“哺乳类”包含任何哺乳类。哺乳类的例子包含但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猴子、人类等，较佳地，为人类。较佳地，个体是需要治疗或预防肿瘤者，或已经是治疗或预防肿瘤的观察或实验的对象者，且该肿瘤的特点为具Met受体过度活化。

词汇“生物样本”是指一得自一有机体(例如，病患)的样本，或得自一有机体的组分(例如，细胞)。该样本可为任何生物组织、细胞或流体。该样本可为源自一病患的样本的“临床样本”。这类样本包含但不限于痰、血液、血球细胞(例如，白血球)、羊水、血浆、精液、骨髓、及组织或针吸活组织检验样本、尿液、腹水、及胸膜液、或从其得到的细胞。生物样本亦可包含组职切片，例如因组织学目的而取得的冷冻切片。生物样本亦可意指一“病患样本”。“生物样本”亦可包含一实质上经纯化或分离的蛋白质、膜制备、或细胞培养。

用于本说明书的词汇“操作指示”，当其用于套组的情形时，是包含一可用以传达该套组的指定用途的功用的出版品、录制的音像、图表或任何其他表达媒体。例如，该操作指示可附加或包含于该套组的容器中。

在一实施态样中，“治疗”意指一种改良、预防、或逆转一种疾病或失调，或至少其中一种明显症状，例如，经由减少MET的磷酸化治疗HCC。在另一实施态样中，“治疗”意指一种改良、预防、或逆转至少一种关于正受治疗的疾病或失调的可测量的物理参数，其并非必然可于哺乳类中或由其所察觉辨识。在又一实施态样中，“治疗”意指抑制或减缓疾病或失调的发展，不论是身体上的(例如稳定一明显症状)、或是生理上的(例如稳定一物理参数)，或两者兼具。在又一实施态样中，“治疗”意指推迟一疾病或失调的发生。

在特定的实施态样中，投予所关注的化合物以作为一预防措施。当用于本说明书，“预防”意指减少得到一特定疾病或失调的风险。在一较佳的实施态样的模式中，投予该经指明的化合物至一个体以作为一预防措施，该个体具有增加的肿瘤(例如HCC)的发展的风险，即使肿瘤的症状不存在或很小。

当用于本说明书，“可操作地连接”意指两核苷酸序列之间的一功能的关连性。一单股或双股核酸部分含有排列在该核酸部分中的二段核苷酸序列，其排列方式为该二段核苷酸序列中的至少一段可发挥一生理功效，并藉此特色与另一段区分。举例而言，一控制一编码序列的转录的启动子序列可操作地连接至该编码序列。经可操作地连接的核酸序列可为相邻的，典型如许多启动子序列；或为非相邻的，例如，在编码抑制子(repressor)蛋白质的核酸序列的情况中。在一重组表现载体中，“可操作地连接”意指所关注的编码序列是以允许该编码序列表现的方式而连接至该调控序列，例如，在一活体外的转录/转译系统或在一已引入该载体的宿主细胞中。

当用于本说明书，“启动子”意指一基因的一部分，其可提供一用于受调节的基因转录的控制点；启动子可包含一RNA聚合酶的结合部位。启动子亦可包含一或多个可用于一或多个转录因子的结合部位。启动子通常是一基因的转录起始部位(“5′端”)的上游。启动子典型地与该基因的转录起始部位相邻。然而，启动子亦可坐落在与该基因的转录起始部位相距一段距离之处。

“序列”意指单体在一聚合物中的线性次序，例如，氨基酸在一多肽中的次序，或核苷酸在一多核苷酸中的次序。

“经分离的蛋白质”或“经分离的多肽”是实质上自至少一种存在于该蛋白质的自然来源中的其他蛋白质中所分离的，或当该蛋白质是经化学合成时，其实质上不含有化学品前驱物或其他化学品的至少一种。于制备蛋白质时，当其他蛋白质或其他化学品(或在此所指为一“污染蛋白质”或“污染化学品”)少于约30％、20％、10％、或5％或更少，且较佳少于1％(以干重计)时，则该蛋白质是自其他蛋白质或其他化学品“实质上分离”的或者是“实质上不含”其他蛋白质或其他化学品的。

当用于本说明书，一“经分离”的核酸分子是实质上自至少一种存在于该核酸分子的自然来源中的其他核酸分子中分离的，或当该核酸分子是经化学合成时，其实质上不含化学品前驱物或其他化学品的至少一种。“经分离”的核酸分子可为例如一核酸分子，其实质上不含在该有机体的基因组DNA(该核酸源自于此)中自然地位于该核酸分子的5′及3′端的两侧的核苷酸序列的至少一者。于制备一核酸分子时，当其他核酸分子或其他化学品(或在此所指为一“污染核酸分子”或“污染化学品”)是少于约30％、20％、10％、或5％或更少，且较佳是少于1％(以干重计)时，则该核酸分子是自其他核酸分子或其他化学品“实质上分离”的或是“实质上不含”其他核酸分子或其他化学品的。

当用于本说明书，“重组”意指经由使用分子生物技术而修饰至非其自然状态的一多核苷酸、由一多核苷酸所编码的多肽、细胞、病毒粒子或有机体。

词汇“白细胞衍生趋化因子2”、“LECT2”、及“LECT2蛋白质”可替换地使用于本说明书中，其皆意指一多功能的蛋白质，其可作为中性粒细胞(neutrophil)的一趋化因子且可刺激软骨细胞及成骨细胞的生长，亦是指由转录变异体编码的多型体(polymorphisms)与异构物。LECT2亦称作软骨调节素II，与鸡的myb-诱发骨髓1蛋白质(myb-induced myeloid 1 protein)的软骨调节素重复区域具有高度序列相似性。LECT2的例子包含来自各种哺乳类，例如人类、猴子、小鼠、大鼠等者，这些LECT2的氨基酸序列可在经发布的数据库中找到，例如NCBI PubMed。

在本发明一特定的实施态样中，LECT2是一人类LECT2，包含SEQ ID No：2的氨基酸序列。

当用于本说明书，“LECT2的活性片段”意指一LECT2的片段，其仍具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。“LECT2的活性片段”的例子可包含一与SEQ ID NO：2的至少五个连续氨基酸的序列具有大于约90或95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一较佳实施态样中，该“LECT2的活性片段”包含50至100个SEQ ID NO：2的氨基酸残基。在另一实施态样中，该“LECT2的活性片段”包含HXXXD基序。

本领域普通技术人员应可轻易理解，基于本文揭露内容，可使用本技术领域中的已知方法而鉴定LECT2的活性片段。例如，可在一活体外的MET磷酸化试验中筛选有能力减少MET的磷酸化的LECT2片段，或在一结合试验中筛选有能力结合至MET的LECT2片段。自筛选试验中鉴定而选中的分子可进一步在一基于细胞的试验及/或一动物模式中测试。

词汇“Met酪氨酸激酶”、“Met受体”、“Met”、“c-Met受体”、“c-Met”、“肝细胞生长因子受体”、或“HGFR”可替换地使用于本说明书中，其皆意指原致癌基因产物，其为肝细胞生长因子受体且具有酪氨酸激酶活性，且亦是指由其转录变异体编码的多型体与异构物。一级单链前驱物蛋白质经转译后切割而产生α与β次单元，二者是以双硫键键结而形成成熟的受体。MET的例子包含来自各种哺乳类，例如人类、猴子、小鼠、大鼠等，这些MET的氨基酸序列可在经发布的数据库中找到，例如NCBIPubMed。

在本发明的一特定的实施态样中，MET是人类MET，其包含如同NCBI参照序列：NP_000236、NP_000592等氨基酸序列。

词汇“肝细胞生长因子”及“HGF”可替换地使用于本说明书中，其皆意指一在结合至c-Met受体后会经由活化一酪氨酸激酶信号级联放大(signaling cascade)而调节细胞生长、细胞运动、及形态发生的生长因子，且亦指由转录变异体编码的多型体与异构物。肝细胞生长因子是经由间质细胞所分泌，并作为一作用于主要上皮来源的细胞的多功能细胞激素。由于其刺激有丝分裂、细胞运动、及基质侵入的能力，使其在血管生成、肿瘤生成、及组织再生中扮演核心角色。其是以一单一非活性多肽而分泌，并经由丝氨酸蛋白酶切割成一α链及一β链。该α链与β链之间以一双硫键相连而产生活性的异源二聚体分子。该蛋白质属于S1肽酶的纤维蛋白溶酶原亚科，但不具有可侦测的蛋白酶活性。HGF的例子包含来自各种哺乳类，例如人类、猴子、小鼠、大鼠等，这些HGF的氨基酸序列可在经发布的数据库中找到，例如NCBI PubMed。

在本发明的一特定的实施态样中，HGF是人类HGF，其包含如同在GenBank中的氨基酸序列，例如，AAA64297、AAA64239或AAA52649。

当用于本说明书中，词汇“HXXXD基序”意指一在不同哺乳类间保守(conserved)的LECT2的基序，其对于LECT2减少MET的磷酸化的活性是重要的。HXXXD基序的突变会导致LECT2的生物活性废除或大幅减少。这类突变包含但不限于图9中所说明的mLECT2-1及mLECT2-1。

已发现相较于非血管侵入性的HCC病患，血管侵入性的HCC病患有20个基因的表现有显着地不同。特别的，已发现LECT2的表现与HCC病患的抑制调控的血管侵入有关。可参见国际专利申请案第PCT/CN2009/074086号，该文献全文并于此处以供参考。

人类LECT2是一16kDa的碱性蛋白，且特定地表现于成人及胎儿的肝脏中。其于肿瘤发展中的生物功能(例如迁移、侵入及转移)尚未经报导。本发明的研究指出LECT2明显地减少HCC中的肿瘤生长及侵入。受体酪氨酸激酶(RTK)的活化在HCC中是关键的致病事件。本发明已发现LECT2通过抑制MET及HGF/MET讯息传递路径下游的RTKs的磷酸化而抑制肿瘤侵入。更进一步发现LECT2经由结合至MET而抑制经HGF诱导的Met活化，其结合部位与HGF的结合部位为非竞争性(noncompetitive)。LECT2的HXXXD基序中的突变会导致LECT2失去肿瘤抑制活性。此外，已发现LECT2在其他癌细胞(例如肺、乳房、及胃癌细胞)中亦会减少Met酪氨酸的磷酸化及癌细胞侵入。因此，LECT2抑制癌细胞的侵入及Met受体的磷酸化，这代表一种新的治疗方式，用于治疗特点为具Met受体过度活性的肿瘤。

因此，一方面而言，本发明是关于一种抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种的方法。该方法包含投予该肿瘤细胞一药剂，以于该肿瘤细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性，藉此于该肿瘤细胞中减少MET的磷酸化。

本领域普通技术人员应可轻易理解该药剂亦可于HGF/MET讯息传递路径中减少一或多种下游蛋白质的磷酸化，该下游蛋白质包含但不限于Erk及Akt。

基于本文的揭露内容，各种药剂可用于在肿瘤细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的程度或生物活性。在本发明的一实施态样中，可投予该肿瘤细胞一包含LECT2蛋白质或活性片段的氨基酸序列的多肽。较佳地，该多肽包含一LECT2蛋白质，例如一具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的人类LECT 2。在另一较佳的实施态样中，该多肽包含一LECT2蛋白质的活性片段，其中该活性片段具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。在一实施态样中，该活性片段是一SEQ ID NO：2的片段。在另一实施态样中，该活性片段包含LECT2的HXXXD基序或其衍生物。

该多肽可自各种来源中获得。例如，其可为一经由哺乳类细胞内生性地表现的天然的LECT2蛋白质或其活性片段，并基于本文揭露内容，使用本技术领域中所已知的方法而自细胞中分离。较佳地，该多肽是一经由一重组宿主细胞、较佳以提升的表达水平(程度)而表达的重组多肽。基于本文揭露内容，可使用本领域普通技术人员所已知的任何重组表达的方法以产生重组的LECT2。

该多肽可具有数种不同的物质形态。其可以一完整长度的新生的或未经加工的多肽而存在，或为一经部分加工的多肽，或为经加工的多肽的结合。该完整长度的新生的多肽可经转译后修饰，经由特定的蛋白解切割事件而导致形成完整长度的新生多肽的片段。一片段、或物理上相连的片段可具有与该完整长度的多肽相关的生物活性，然而，与个别片段相关的生物活性的程度可以各有变化。

该多肽亦可以一经修饰的形式存在，包含但不限于糖基化形式、豆蔻酸化(myristoylated)形式、棕榈酸酰化(palmitoylated)形式、核糖基化(ribosylated)形式、乙酰化形式、泛素化形式等。修饰亦包含分子内的交联及共价结合至各种基团(moieties)，例如脂质、黄素、生物素、聚乙二醇或其衍生物等。此外，修饰亦可包含环化、分支及交联。此外，经由基因的密码子所编码的习知的20种氨基酸以外的氨基酸亦可包含于一多肽中。

在本发明的另一实施态样中，经由投予该肿瘤细胞一多核苷酸以提升LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性，该多核苷酸包含一编码LECT2蛋白质或其活性片段的核苷酸序列。该多核苷酸包含一调控序列，例如一启动子，其可操作地连接至LECT2蛋白质或其活性片段的编码序列，从而使肿瘤细胞中表达LECT2蛋白质或其活性片段。较佳地，该经编码的LECT2蛋白质包含一LECT2蛋白质，例如一具有SEQID NO：2的氨基酸序列的人类LECT2。在另一较佳的实施态样中，该经编码的多肽包含一LECT2蛋白质的活性片段，其中该活性片段具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。在一实施态样中，该经编码的活性片段可为一SEQ ID NO：2的片段，或一包含LECT2的HXXXD基序或其衍生物的片段。

该多肽可经由各种方式而得到，包含但不限于(i)活体外的扩增，例如，经由聚合酶连锁反应(PCR)；(ii)合成，例如，经由化学合成；(iii)经由克隆而重组产生；(iv)纯化，例如经由裂解及电泳或层析分离。

该多核苷酸包含但不限于独立于其他序列之外的分离的核酸分子(例如，经由PCR或限制性内切酶处理而产生的cDNA或基因组DNA片段)；以及并入一载体、一自主复制质体、一病毒(例如，一反转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)、或一真核细胞的基因组DNA的核酸分子。

可使用任何适宜的方法将该多核苷酸引入肿瘤细胞中，包含，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、转形、基因枪法(biolistics)及病毒感染、微脂体递送等。该多核苷酸或其一部分，可嵌合或不嵌合(共价地连接)至构成肿瘤细胞的基因组的染色体DNA中。例如，该多核苷酸可于一游离基因组单元(episomal element)(例如一质体)上运作。或者，对于一经稳定地转型或转染的细胞，该多核苷酸已嵌入至该染色体中，因此可通过染色体复制而经由子代细胞遗传。这种稳定性是经由该经稳定地转型或转染的细胞具有建立包含含有外源多核苷酸的子代细胞的群体的细胞系或无性系(cell lines orclones)的能力而证实。

在本发明的又一实施态样中，该方法包含投予肿瘤细胞一化合物，以于该肿瘤细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的表达及/或生物活性。该生物活性包含于该肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及/或于该肿瘤细胞中结合至MET。这类化合物可使用以下所述的方法而判定。

该根据本发明的实施态样的方法可用于各种癌细胞，包含但不限于以下群组：肝细胞癌细胞、肺癌细胞、乳癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、下咽癌(hypopharyngealcarcinoma)细胞、神经胶母细胞瘤细胞、或任何其他表现MET受体的肿瘤细胞。

在一特定的实施态样中，本发明是关于一种于一个体中预防或治疗肝细胞癌的方法，包含投予该个体一药剂，以于该个体的肝细胞癌细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性，其中该生物活性包含于该肝细胞癌细胞中减少MET的磷酸化。较佳地，该LECT2蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

蛋白质治疗可用于在一个体的肝细胞癌细胞中提升LECT2或其活性片段的蛋白质程度。根据本发明的一实施态样，投予一治疗有效量的LECT2蛋白质或其活性片段至该个体，以于该肝细胞癌细胞中减少MET的磷酸化，并于该个体中预防或治疗肝细胞癌。基于本文揭露内容，该LECT2蛋白质或其活性片段可被制成配方，并使用本技术领域中用于蛋白质配方与传递的方法而投予至该个体中。

在另一实施态样中，基因治疗可经由于该肝细胞癌细胞中引入具有表达LECT2蛋白质的能力的核酸分子，而用以于一个体的肝细胞癌细胞中提升LECT2或其活性片段的表达。该方法包含投予该个体一多核苷酸，该多核苷酸包含编码LECT2蛋白质或其活性片段的核苷酸序列，以于肝细胞癌细胞中减少MET的磷酸化，并于该个体中预防或治疗肝细胞癌。

一种用于执行活体外的基因治疗的程序已概述于美国专利第5,399,346号，并展示于该专利所提交的历史档案中，前述皆为公开可得的文件。一般而言，基因治疗可牵涉于活体外引入一基因的功能性拷贝(functional copy)至一个体的细胞中，并将该经基因工程处理的细胞送回该个体中。该基因的功能性拷贝是处于调节元件的操作控制下，其使该经基因工程处理的细胞中的基因得以表达。许多转染与转导技术及适宜的表达载体已为本领域普通技术人员所知悉，其中一部分描述于国际专利申请案第WO95/00654号。活体内的基因治疗是使用载体，例如腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒、疱疹病毒(如EB病毒(Epstein-Barr virus))。基因转移亦可使用需要活体外感染的非病毒的方式而达成。这类方式可包含磷酸钙、DEAE-聚葡萄醣、电穿孔、及原生质体融合。目标型微脂体亦可能有用于传递DNA至细胞中。

作为一个例子，一编码人类LECT2蛋白质的DNA分子首先可克隆至反转录病毒载体中。自该载体的LECT2蛋白质的表达可经由其基因内的启动子、该反转录病毒的长末端重复序列(long terminal repeat)、或对特定目标细胞具有特异性的启动子而驱动。该载体可接着引入至一个体的一细胞中，以成功地于该目标细胞中表达LECT2蛋白质。该基因可以一种可让细胞使用而编码足够的蛋白质，以提供有效功能的形式，而较佳地传递至这些细胞中。反转录病毒载体通常是用于基因治疗中一较佳的基因传递载体，特别是因为其高感染效率及稳定的嵌合与表达。或者，编码LECT2的DNA 可经由非病毒的技术而转殖至细胞中，以进行基因治疗，其中这些技术包含使用配体-DNA接合或腺病毒-配体-DNA接合的由受体媒介(receptor-mediated)的目标DNA转移、微脂体转染膜融合或直接的微注射。这些程序及其变化皆适用于活体外及活体内的LECT2基因治疗。适合与LECT2基因一起使用的基因治疗的分子方法学的操作流程已描述于GeneTherapy Protocols，由Paul D.Robbins编辑，Human press，Totowa NJ，1996。

在又一实施态样中，可使用一小分子化合物以提升该个体的肝细胞癌细胞中的LECT2的表达或生物活性。该方法包含投予该个体一化合物，以于该肝细胞癌细胞中有效地提升LECT2的表达或生物活性，藉此于该肝细胞癌细胞中减少MET的磷酸化，并于该个体中预防或治疗肝细胞癌。

在治疗期间，投予至各别个体的本发明的多肽、核酸分子或化学化合物的有效量可根据各种因素而变动，其中该因素包含该病患的类型、物种、年龄、体重、性别及医疗状况；待治疗的严重程度；投予的途径；该病患的肾与肝的功能；及所选定的特定的多肽、核酸分子或化学化合物。在治疗中具备专业技能的医生或兽医可决定并开具所需的有效量的处方，以预防、对抗或终止症状的发展。在达成浓度的最佳精确范围内产生不具毒性的功效需要一种疗法，其是基于该活性医药成分对于目标部位的有效性的动力学。这牵涉到考虑涉及该治疗的活性医药成分的分布、平衡及排除。

本文所揭露的方法可在经由例行试验而定义的适宜的剂量下单独使用，以获得LECT2的程度或生物活性的最佳的提升，并同时减低任何可能的毒性。此外，其他药剂的共同投予或依序投予可为所欲的。当数种药剂结合时，投予的剂量是经调整以达到所欲的功效。这些各种药剂的剂量可独立地优化或结合以达到一协同结果，其中相较于单独使用任一种药剂，并用其他药剂会进一步地减少病变。

在一实施态样中，根据本发明的实施态样的方法是与另一抗肿瘤治疗结合，包含但不限于另一化学治疗、放射线治疗等。

另一方面而言，本发明是关于一种用于治疗肿瘤的医药组合物，其包含一载剂及一包含LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

在一实施态样中，该医药组合物包含人类LECT2蛋白质，例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其活性片段的蛋白质。

本发明的另一实施态样是关于一种用于治疗肿瘤的医药组合物，其包含一载剂及一多核苷酸，该多核苷酸包含编码一包含一LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

在一实施态样中，该医药组合物包含一编码一人类LECT2蛋白质的多核苷酸，例如具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其活性片段的蛋白质。

在又一实施态样中，本发明是关于一种用于治疗肿瘤的医药组合物，其包含一载剂及一于细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的表达或生物活性的化合物。该生物活性包含以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。这类化合物可使用以下所述的方法而判定。

基于本文揭露内容，任何本技术领域中所已知的方法皆可用于制备根据本发明的实施态样的各种医药组合物。

不论单独或与一额外的治疗药剂结合而投予，根据本发明的实施态样的治疗活性成分可经由任何已知的投予途径而投予，包含剂量单位或含有传统医药上可接受的载剂的医药组合物的口服、外用、肠道外给药(包含皮下注射、静脉注射，肌肉注射、及胸骨内注射或输液投药技术)、经由吸入喷雾或直肠给药，且任何这种剂量单位或医药组合物皆在本发明的范围内。

适合用于口服投药的医药组合物包含固体形式，例如药丸、药片、药锭、及硬或软胶囊(每一种皆包含立即释放、定时释放、及缓释的配方)、以及含片及分散的粉末或颗粒。适合用于口服投药的液体形式的医药组合物包含溶液、糖浆、药酒、乳剂、及水性或油性悬浮液。任何这些剂型形式皆可根据任何本领域所已知的用于制造医药组合物的方法或复合技术而制备。制造固体口服剂量型式时可视需要地使用医药上可接受的载剂，包含惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒或崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶、或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。为了提供诱人或可口的配方，适合用于口服投药的固体医药组合物可视需要地进一步包含一或多种甜味剂、调味剂、着色剂、或防腐剂。

适合用于口服投药的医药组合物亦可呈现为硬或软的明胶胶囊，其中在硬胶囊的情况下，该活性成分可与一惰性固体稀释剂混合，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土；在软胶囊的情况下，该活性成分可与水或可互溶的溶剂混合，例如丙二醇、PEG’s及乙醇，或一油性介质，例如花生油、液体石蜡、或橄榄油。

可制备含水悬浮液，其包含与适宜用于制造含水悬浮液的赋形剂掺和的活性成分。这种赋形剂包含悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯-吡咯啶酮、黄芪胶(gum tragacanth)及阿拉伯胶、聚葡萄糖、聚乙烯-吡咯啶酮或明胶；以及分散剂或湿润剂，例如卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、十七氧乙烯鲸[蜡]醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯(polyoxyethylenesorbitol monooleate)、及聚乙烯山梨醇酐单油酸酯(sorbitan monooleate)。含水悬浮液亦可包含一或多种防腐剂，例如乙基或正-丙基、对-羟基苯甲酸；一或多种着色剂、一或多种调味剂、及一或多种甜味剂，例如蔗糖、甜精或阿斯巴甜。

油性悬浮液可经由将该活性成分悬浮于一植物油中而制备，例如棉籽、橄榄、芝麻或椰子油；或悬浮在一矿物油中，例如液态石蜡。该油性悬浮液可包含一增稠剂，例如蜂蜡、硬蜡、或鲸蜡醇。可添加如前述的甜味剂及调味剂，以提供一可口的口服制剂。这种油性悬浮液可经由添加一抗氧化剂而保存，例如抗坏血酸。

适宜用于制备一适用于口服投药的含水悬浮液的可分散粉末及颗粒可与所有以上讨论过的分散剂或湿润剂、悬浮剂、及一或多种防腐剂掺和而提供活性成分。视需要亦可存在甜味剂、调味剂、或着色剂。

适合用于口服投药的医药组合物亦可以一水中油乳剂(oil-in-water emulsion)的形式存在。该油相可为如前述的植物或矿物油、或其混合物。合适的乳化剂可为自然发生的磷脂，例如大豆、卵磷脂、山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯。该乳剂亦可包含甜味剂或调味剂。

糖浆及药酒亦可与甜味剂一起配制，例如，甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。这种配方亦可包含一缓和剂、防腐剂及调味剂或着色剂。

该医药组合物可进一步以一适合用于肠道外给药的形式(即注射或输液)提供。可注射的含水或含油的悬浮液是视需要地灭菌，并可根据已知的方法使用上述的适宜的分散剂、湿润剂、及悬浮剂而配制。亦可使用一肠道外给药可接受的稀释剂或溶剂，例如1，3-丁二醇、水、林格溶液、及等渗氯化钠。亦可使用共溶剂，例如乙醇、丙二醇或聚乙二醇。此外，传统上是利用经杀菌、不挥发的油(fixed oil)作为在可注射或可输注溶液中的溶剂或悬浮媒介，且其可包含任何温和的不挥发油，例如任何合成的单或双甘油酯。于制备可注射或可输注溶液时亦可使用脂肪酸，例如油酸。

该医药组合物亦可以一栓剂的形式存在。栓剂可经由混合该活性成分及任何视需要的额外的医疗药剂与一合适的无刺激性赋形剂而制备，该赋形剂在室温下是固体，但在体温下会融化，以释放该活性成分。合适的材料包含可可脂及聚乙二醇。

可制备用于局部使用、包含该活性成分的乳膏、软膏、胶、溶液或悬浮液。局部的配方可包含共溶剂、乳化剂、渗透促进剂、防腐剂、软化剂等。

根据本发明的实施态样的活性成分亦可以一微脂体传递系统的形式的医药组合物而提供，该微脂体传递系统例如为小单层囊泡、大单层囊泡、及多层囊泡。微脂体可自各种脂质形成，包含但不限于两性脂质(amphipathic lipids)，例如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines)、神经鞘磷脂(sphingomyelins)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines)、磷脂胆碱(phophatidylcholines)、心磷脂(cardiolipins)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserines)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerols)、磷脂酸(phosphatidic acids)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositols)、二酰基三甲基铵丙烷(diacyltrimethylammonium propanes)、二酰基二甲基铵丙烷(diacyl dimethylammoniumpropanes)、及硬脂胺(stearylamine)；中性脂质，例如三酸甘油酯；及其组合物。这些微脂体可含有胆固醇或不含胆固醇。

本发明的另一方面是关于一种判定个体具有增加的侵入性肿瘤发展风险的方法。该方法包含：

(a)自一个体获得一生物样本；

(b)测量该生物样本中MET的磷酸化的程度；以及

(c)比较步骤(b)所测量的磷酸化的程度与对照组的程度；

其中当步骤(b)所测量的磷酸化的程度较对照组的程度高时，判定该个体具有增加的侵入性肿瘤发展的风险。

在一特定的实施态样中，该肿瘤是肝细胞癌。

基于本文揭露内容，可使用任何本技术领域中所已知的方法测量MET的磷酸化程度，例如，经由Western blot。

可经由各种方式测量LECT2蛋白质的蛋白质程度或生物活性。基于本文揭露内容，LECT2的蛋白质程度可经由任何本领域普通技术人员所已知的用于测量多肽的方法而测量，包含但不限于利用抗-LECT2的抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISAs)、蛋白质印迹、免疫沉淀(IP)、及免疫组织化学法。LECT2的蛋白质程度亦可经由测量该生物样本中的LECT2 mRNA的程度而间接地测量，例如，通过RT-PCR。该生物活性可经由LECT2结合至MET的能力的结合试验而测量，或经由在LECT2存在下，经由HGF的MET磷酸化而测量。

在一特定的实施态样中，LECT2的生物活性是经由侦测HXXXD突变的存在而测量，该突变已知会减少该生物活性。该方法包含：

自一个体获得一生物样本；

自该生物样本获得一编码LECT2蛋白质的HXXXD基序的多核苷酸序列；

测序该多核苷酸序列；

基于该测序侦测该HXXXD基序中的突变；以及

基于该HXXXD基序中存在的突变，判定该个体具有增加的肝细胞癌的风险。

HXXXD基序中突变的例子包含但不限于：1)自该基序删除一或多个氨基酸；2)添加一或多个氨基酸至该基序；3)该基序的一或多个氨基酸是经取代的等。基于本文揭露内容，可使用已知的分子生物技术侦测这些突变。本技术领域中有许多已知的试验技术可用于侦测突变，例如选择性扩增反应(selective amplification)、及选择性引物延伸(selective primer extension)、限制酶切割模式、杂交样本与对照组核苷酸、序列比对等。

本申请案的实施态样亦关于一用于判定一个体具有增加的侵入性肿瘤发展的风险的套组(kit，试剂盒)。该套组包含：

(a)用于测量该个体的生物样本中MET的磷酸化程度的试剂；以及

(c)使用该试剂以判定该个体具有增加的侵入性肿瘤发展的风险的操作指示。

在一特定的实施态样中，该肿瘤是肝细胞癌。

在本发明的一实施态样中，这种套组较佳是包含一适合固定于至少一容器的封闭隔室内的经区隔的载体。该载体可包含一种用于侦测的工具。例如，该套组可包含一具有侦测经磷酸化的MET的能力的经标记化合物或试剂、一具有侦测LECT2多肽或编码LECT2多肽的mRNA的能力的经标记化合物或试剂、及用于测定一样本中多肽或mRNA的含量的工具(例如，一与该多肽结合的抗体、或一与编码该多肽的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针)。该套组亦可包含一种用于生物活性测量的工具，例如用于METRTK磷酸化试验的试剂。较佳地，操作指示是与该试剂一起包装于例如一手册或包装标签中。该操作指示的标签解说如何使用该试剂以自一生物样本中测量LECT2蛋白质的蛋白质程度及生物活性，及如何基于测得的程度评定侵入性肿瘤的发展的风险，例如肝细胞癌的后期，例如，若LECT2蛋白质程度或其生物活性低于一正常或对照组程度，则可用于测定一受测个体是否患有HCC或具有发展的HCC的风险。

根据一特定的实施态样，该套组包含：

用于自该生物样本获得一编码LECT2蛋白质的HXXXD基序的多核苷酸序列的聚合酶链式反应(PCR)引物；

一用于测序该多核苷酸序列的测序引物；以及

基于存在LECT2的HXXXD基序中的突变，而判定该个体具有增加的侵入性肿瘤(例如肝癌)的发展的风险的操作指示。

在本发明的一实施态样中，结合根据本发明的实施态样的诊断方法及治疗方法以提供更有效的肿瘤预防及/或治疗。例如，一根据本发明的一实施态样的经结合的方法包含：

基于一个体的生物样本中提升的MET的磷酸化程度而判定该个体具有增加的侵入性肿瘤发展的风险；以及

投予该个体一药剂，以提升LECT2蛋白质的蛋白质程度或生物活性，藉此于该个体的肿瘤细胞中减少MET的磷酸化。

在一特定的实施态样中，该经结合的方法是用以预防或治疗选自以下群组的肿瘤：肝细胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、下咽癌、神经胶母细胞瘤、或任何其他表现MET受体的肿瘤。

本发明的另一方面是关于一种鉴定一可用于抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种的化合物的方法。该方法包含鉴定一于肿瘤细胞中增加LECT2的表达或生物活性的化合物，其中该生物活性包含于该肿瘤细胞中减少MET的磷酸化。

候选的化合物包含许多化学种类。虽然一般而言这些化合物皆为有机化合物，较佳地，为小的有机化合物，但候选化合物亦可为生物分子，例如肽、核酸、糖类、脂肪酸、硬脂醇、类异戊二烯、嘌呤、嘧啶、上述的衍生物或结构类似物、或前述的结合等。当该化合物是一核苷酸时，该化合物一般为一DNA或RNA分子，虽然亦可考虑经修饰的具有非自然键结或次单元的核酸。

该化合物的鉴定方法可使用传统的实验格式(format)而进行，或以适宜用于高通量的试验而进行。词汇“高通量”意指一允许同时轻易地筛选多个样本的试验设计，且可包含机械操作的能力。高通量试验另一所欲的特色是一优化以减少试剂使用、或降低操作次数以达到所欲的分析的试验设计。试验格式的例子包含96孔或384孔盘、悬浮液滴、及用于液体处理实验的“实验室芯片”微通道芯片。本领域普通技术人员已知如小型化的塑料模具及液体处理装置是有益的，或设计经改进的试验装置，从而使用本发明的设计而操作大量的样本。

在一实施态样中，该化合物是使用一报告实验(reporter assay)以经由其于肿瘤细胞中提升LECT2的表现的能力而鉴定。该化合物鉴定方法包含：

(a)提供一表达报告基因的细胞，其中该报告基因是受到来自肿瘤细胞的LECT2调控序列的控制；

(b)将该细胞与一测试化合物接触；

(c)测量该细胞的该报告基因的表达程度；以及

(d)鉴定增加报告基因的表达程度的测试化合物。

“LECT2调控序列”意指一可于该肿瘤细胞中控制LECT2的开放阅读框架(openreading frame)的表达的核酸序列。

在另一实施态样中，该化合物是经由其于该肿瘤细胞中提升MET与LECT2之间的交互作用的能力而鉴定。该方法包含：

(a)提供一包含LECT2蛋白质或其活性片段、Met或其活性片段、及一测试化合物的反应混合物；

(b)测定LECT2蛋白质或其活性片段与Met或其活性片段之间的交互作用；以及

(c)鉴定提升该交互作用的测试化合物。

在一较佳的实施态样中，该测定步骤包含测量Met或其活性片段的蛋白质磷酸化的量，且该经鉴定的测试化合物可减少蛋白质磷酸化的量。较佳地，该反应混合物进一步包含一HGF或其活性片段。

该可用于本发明的化合物亦可自一结合试验而鉴定，该试验包含：

(a)将该Met或其活性片段与一测试化合物及一经标记的LECT2或LECT2的活性片段接触；

(b)测定与Met或其活性片段结合的该经标记的LECT2或该经标记的LECT2的活性片段的量；以及

(c)比较步骤(b)中所测定的量与一对照组的测量，于对照组中，在测试化合物不存在下，该Met或其活性片段已与经标记的LECT2或经标记的LECT2的活性片段接触。

该可用于本发明的化合物亦可鉴定为一结合至Met并仿似LECT2的化合物，包含：

(a)将一测试化合物与一包含Met或其活性片段的试验试剂接触；

(b)测定Met或其活性片段的生物活性；以及

(c)比较于步骤(b)中所测定的结果与对照组测量的结果，于对照组中，在该测试化合物不存在下，该Met或其活性片段是与LECT2或其活性片段接触。

在一实施态样中，该Met是在一独立的膜制备中，该测定步骤包含测量该独立的膜制备的蛋白质磷酸化的量，及该经鉴定的测试化合物减少蛋白质磷酸化的量。

在另一实施态样中，该方法进一步包含测试该经鉴定的测试化合物于活体内或活体外抑制肿瘤细胞的增生、迁移或侵入的能力。

本发明的另一方面是关于一种经分离的多核苷酸，其具有一编码一LECT2的活性片段的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2的约51至100氨基酸残基)的核苷酸序列，该活性片段具有减少Met的磷酸化、结合至Met、或前述互补的能力。这种多核苷酸可经由筛选含有各种部分的SEQ ID NO：2的编码序列的DNA结构而鉴定，基于其编码一LECT2的活性片段的能力。基于本文揭露内容，可使用本技术领域中的方法执行该筛选，例如噬菌体展示(phage display)。

本发明的另一方面是关于一经分离的多肽，其具有一LECT2的活性片段，例如SEQID NO：2的约51至100氨基酸残基，其具有减少Met的磷酸化或结合至Met的能力。

该用于LECT2的活性片段的重组表达的载体及重组细胞亦包含于本申请案的实施态样中。

本发明的另一方面是关于一种包含LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽于制备药剂的用途，该药剂是用于抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种，其中，该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

在一较佳的实施态样中，该肿瘤细胞选自以下群组：肝细胞癌细胞、肺癌细胞、乳癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、下咽癌细胞、神经胶母细胞瘤细胞、或任何其他表现MET受体的肿瘤细胞。

在另一较佳的实施态样中，该多肽包含一具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LECT2蛋白质或其活性片段。

本发明的又一方面是关于一种编码一包含LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽的多核苷酸于制备药剂的用途，该药剂是用于抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种，其中，该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

较佳地，该肿瘤细胞选自以下群组：肝细胞癌细胞、肺癌细胞、乳癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、下咽癌细胞、神经胶母细胞瘤细胞、或任何其他表现MET受体的肿瘤细胞。

在另一较佳的实施态样中，该多核苷酸编码一具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LECT2蛋白质或其活性片段。

可经由参考以下非限制性的实施例而更加地了解本发明，但本领域普通技术人员应可轻易理解这些实施例仅是用于解释本发明，本发明于后附申请专利范围中有更完整的叙述。

实施例

材料与方法

细胞培养

所有使用的癌细胞株皆得自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，马里兰州，美国)。

肝细胞癌细胞是在37℃下，于5％二氧化碳-95％空气的潮湿氛围中，于DMEM培养基(Life Technologies公司，GIBCO BRL，Rockville，马里兰州)中生长，其中，该培养基具有10％小牛血清蛋白(FBS)及2毫升L-谷氨酰胺(Life Technologies公司)。细胞是根据供货商的建议而培养。贴壁细胞是经由胰蛋白酶-EDTA的处理而自该培养皿中脱离。

A549(人类肺腺癌)是维持并培养于DMEM培养基中。CL1-5(人类肺腺癌)、MB-MDA231(人类乳癌)、N87(人类胃癌)是维持并培养于RPMI-1640培养基中。所有培养基皆添加有10％FBS。

转染及建立稳定转殖细胞

LECT2的表达载体是经由放置人类LECT2 cDNA于该具有受相同启动子控制的湿球菌素B(hygromycin B)基因的pSecTag2A真核表现载体中而建立。该LECT2-正意义(LECT2-sense)表现载体是使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen Life tech.)而转染至肝细胞中。经由50微克/毫升的湿球菌素B而选择稳定的细胞族群。经由RT-PCR及Western Blot分析而确认单个克隆中具有显著表达的LECT2。

经由受体酪氨酸激酶(RTKs)阵列的磷酸化试验

使用Proteome Profiler Array Kit(R&D系统，Minneapolis，明尼苏达州，美国)侦测生长因子受体酪氨酸激酶(RTKs)的磷酸化程度。于冷的溶解缓冲液(1％Triton X-100、1mM钒酸钠、1mM氟化钠、0.05mM钼酸钠、20μg/mL抑肽酶(aprotinin)、20μg/mL亮抑酶肽(leupeptin)、4μg/mL(4-脒苯基苯)甲烷磺酰氟((4-amidinophenyl)methanesulfonyl fluoride)、150mM氯化钠于50mM Tris-HCl，pH 7.4中)中收集经重组LECT2蛋白质处理的HCC细胞的样本。该溶胞产物是经由上下来回的移液吸量而和缓地再悬浮，并于2至8℃下摇晃30分钟。该溶胞产物接着于14,000×g下微量离心5分钟。将该上清液转移至一干净的测试管中，并保存于-80℃。将得自该HCC细胞上清液中的500毫克总蛋白质与经各种抗-磷酸-RTK的抗体打点(spotted)的RTK阵列膜一起孵化(incubated)。该磷酸化侦测程序是根据制造商的操作流程而进行。

增生试验

以胰蛋白酶处理(trypsinized)90％群集生长(confluent growth)的癌细胞；转移至24孔盘(3×10⁴细胞/孔)；并于一培养基中预培养24小时。接着将该培养基换成新鲜的培养基，并于37℃下培养72小时。在培养结束后，使用MTT试验估算存活细胞的数目。在后续实验开始的2小时前，添加200μL的MTT溶液(Sigma，St Louis，密苏里州)(2mg/mL)至各孔中，接着于黑暗中反应。接着将甲臜(foemazan)颗粒溶解于DMSO中，并使用一酶联免疫吸附分析测读仪(ELISA reader)测读570nm的吸光值。

侵入及迁移试验

使用含有8μm孔洞的24孔盘(Millipore)的穿透性实验(transwell inserts)进行侵入试验。使用经基质胶(Matrigel)(70μg；Collaborative Biomedical，Becton DickinsonLabware，美国)涂布的过滤器进行侵入试验。将细胞(1×10⁵个于100μL的DMEM完全培养基中)放置于上层腔室中，并放置1mL的相同培养基于下层腔室中。培养16小时后，以甲醇固定细胞20分钟。以棉花棒(cotton-tipped swabs)移除在该过滤器上侧的细胞，并以PBS清洗该过滤器。接着以含有0.05％结晶紫的PBS染色细胞。以显微镜检视并计数在该过滤器的下侧的细胞。于迁移试验中使用穿透性膜(Transwellmembranes)，并在16小时后固定2×10⁴个细胞。

Far Western Blot

Far Western Blot衍生自标准的蛋白质印迹方法，于活体外侦测蛋白质-蛋白质间的交互作用。于一还原或非还原的Laemmli样本缓冲液中加热细胞溶胞产物或重组的LECT2蛋白质；经由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)进行解析；并电转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membranes)(Immobilon-Pmembran；Millipore公司，Bedford，马萨诸塞州)上。接着于5％脱脂牛奶、0.1％Tween20及PBS(PBST)的溶液中反应1小时，该膜接着与重组Met蛋白质反应整夜。接着于PBST中清洗该膜并与HRP-接合的抗-Met或抗-LECT2的抗体一起反应，再经由增强的化学发光试剂(Amersham Pharmacia Biotech，美国)显影，并以KodakX-Omat Blue放射线底片拍照。

Western Blot

经由SDS-PAGE将总细胞溶胞产物或细胞上清液中的蛋白质分离，并电转移至聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P membrane；Millipore公司，Bedford，马萨诸塞州)。于PBST中膜封闭(blot blocking)后，以抗LECT2(R&D system)、PY-99(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，加州)、p-Met及Met(cell signaling)的一级抗体探测膜结合蛋白质。清洗该膜并接着与辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)接合的二级抗体反应30分钟。以增强的化学发光试剂(Amersham Pharmacia Biotech，美国)侦测经抗体结合的蛋白质条带(bands)，并以Kodak X-Omat Blue放射线底片拍照。

免疫沉淀及Western Blot分析

以如同前述的方法制备细胞溶胞产物，且于4℃及温和旋转下，将等量的蛋白质与特定的、固定至蛋白质A-琼脂糖凝珠(protein A-Sepharose beads)上的抗体一起反应2小时。以溶解缓冲液大量地清洗这些凝珠、煮沸、并微量离心。以SDS-PAGE解析蛋白质并将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。于PBST中填塞后，以特定的一级抗体反应该膜。于清洗并以二级抗体反应后，使用增强的化学发光侦测(Amersham，Arlington Heights，伊利诺伊州)显现免疫活性蛋白质。其中特别说明，这些膜是经去除(stripped)并再以其他抗体进行探针探测。

Fc标签下拉分析(Fc Tag Pulldown Assay)及试管分析

经由Fc tag pull-down与蛋白质A-琼脂糖结合的复合物而分析Met与经Fc标记的重组LECT2(rLECT2)的结合。经由Ni-NTA树脂(纯度大于95％)纯化来自乳房细胞生产的rLECT2。于结合缓冲液(50mM磷酸钠，pH 7.5、500mM氯化钠、1％诺纳德P-40(Nonidet P-40)；最终体积为150μl)中将Met蛋白质与经纯化的rLECT2混合，并于4℃下和缓地旋转反应4小时。添加于结合缓冲液中经预平衡的Ni-NTA树脂凝珠(50μl)至该混合物中，并于4℃下温和旋转反应2小时。经由简易的离心并以该结合缓冲液清洗三次而沉淀该树脂凝珠。以50μl的2X Laemmli缓冲液萃取与树脂凝珠联结的蛋白质，并使用抗-LECT2抗体经由Western Blot分析进行分析。

流式细胞仪蛋白质交互作用试验

以胰蛋白酶处理90％群集生长的SK-Hep1细胞，转移至一6孔盘并于一培养基中培养整夜。将该培养基换成一无血清的培养基，接着添加经Fc标记的重组LECT2蛋白质达5分钟。于4℃下在含有抗-LECT2抗体的FACS染色缓冲液中再悬浮该细胞1小时。经由以FACS染色缓冲液于900转/分钟下离心以清洗该细胞5分钟。接着，添加经二级抗体接合的FITC至该细胞，并于黑暗中反应30分钟。将该细胞保持于冰上，直到FACS分析仪就绪。经由碘化丙啶染色将死细胞排除。并经由FACS分析活细胞。

结果

具有不同LECT2蛋白质程度的HCC细胞中的生长因子RTKs的差异性磷酸化。使用磷酸化-受体酪氨酸激酶(RTKs)阵列以测定具有不同LECT2程度的HCC细胞中生长因子RTKs的磷酸化轮廓(profile)，例如，LECT2过度表达或剔除(knockdown)表达的稳定的HCC转染子(transfectant)(图1A)、或经重组LECT2蛋白质处理或未经处理的HCC细胞(图1B)。经由斑点印迹(dot blotting)量化HCC细胞中生长因子RTKs的磷酸化程度。

如同图1B所示，在以重组LECT2蛋白质处理HCC细胞后，多种生长因子RTKs的磷酸化程度是以剂量依赖的方式而受到差异性的影响(图1B)。在25种RTKs分析中，SK-Hep1细胞中7种生长因子RTKs高度磷酸化。这些RTKs为EGFR、HGFR(或c-Met、Met)、Tie-2、FGF-R3、c-Ret、ROR1、及Dtk。以经重组LECT2蛋白质以1.25或2.5nM最终浓度处理或未经处理的来自总细胞溶胞产物的样本进行试验。在以重组LECT2处理后，以下HCC中的RTKs的磷酸化程度显著地变化：HGFR、Tie-2、及FGF-R3。在以重组LECT2蛋白质处理以下HCC后，观察到EGFR的磷酸化程度没有变化或变化很小。

如同图2所示，重组LECT2蛋白质于SK-Hep1细胞中以剂量依赖与时间依赖的方式抑制Met及下游蛋白质的磷酸化，例如，Erk及Akt(图2)。

LECT2蛋白质程度与HCC肿瘤组织中Met酪氨酸的磷酸化负相关。为了测试LECT2可于HCC细胞中调节Met的磷酸化的假设，于74份得自台湾大学附设医院的病患手术切除的HCC组织样本中分析LECT2与Met的磷酸化程度。使用Western Blot分析，发现该组织样本中较大量的LECT2蛋白质表达与较少的Met的磷酸化有关，且于较后期的HCC中发现较少的LECT2蛋白质与较多的Met的磷酸化(图3)。

LECT2于HCC细胞中抑制由HGF刺激的细胞增生、迁移及侵入。HGF/Met讯息路径包含HGF及其受体Met，现已被认作一用于癌症治疗的有希望的目标，例如，用于抑制细胞增生、迁移及侵入。已进行研究测定LECT2是否可通过HGF/Met讯息路径而调节HCC细胞的表现型。

将SK-Hep1细胞接种至细胞培养孔中，并如同MTT细胞增生试验中所指示，以与HGF(40ng/mL)结合的0、1.25、2.5nM的最终浓度的rLECT2处理72小时。如同图4A所示，HGF刺激细胞增生，但LECT2是以剂量依赖的方式抑制由HGF刺激的细胞增生，例如，2.5nM rLECT2可较1.25nM观察到更多细胞增生的抑制。亦如同图4B及图4C所示，LECT2以剂量依赖方式抑制由HGF刺激的细胞迁移及侵入。

LECT2于HCC细胞中抑制由HGF刺激的Met与其他RTKs的磷酸化。执行Western Blot分析以比较Met、Akt及Erk的表达与磷酸化程度，及经HGF、rLECT2及SU11274(Met的选择性的小分子抑制剂)处理或未经处理的细胞的细胞侵入能力。如同图5A所示，于经HGF处理的SK-Hep1细胞中观察到Met及下游蛋白质(例如，Akt及Erk)的磷酸化的提升，这与提升的细胞侵入有关。与SU11274相似，LECT2抑制经HGF诱导的Met、Akt、及Erk的酪氨酸的磷酸化，如同经由经rLECT2处理的细胞中减少的信号条带所指示的，这与减少的细胞侵入有关。相似地，于对照组的HCC细胞中，HGF刺激Met的磷酸化，但在稳定的转染LECT2过度表达的转染子中则不然(图5B)。

Met的下游信号分子可于讯息传递期间结合至Met。例如，Gab1可结合至一Met受体的p-Tyr1349磷酸化部位，而Grb2可结合至一第二Met受体的p-Tyr1356磷酸化部位，因此在Met二聚体或多聚体上可发生Gab1与Grb2之间的交互作用。LECT2减少Met于p-Tyr1349的磷酸化，因此使Gab1自Met受体分离(图5C)。

经由持续时间、强度及该受体的下游的的讯息活化的特异性测定由RTK活化所导致的生物后果。除了如抑制调控机制的受体的内化(internalization)、运送、及在溶酶体中降解以外，Met受体已被判定为数种PTPs的受质。非受体蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)1B及T细胞磷酸酶(TCPTP)已被认为可作为多种讯息路径的负调控因子(negativeregulator)，包含Met受体酪氨酸激酶。已有报导指出两种磷酸酶皆与Met有交互作用，且这种交互作用需要成对酪氨酸(Tyr-1234/1235)在Met激酶功能域的活化环(activationloop)中的磷酸化。可参考Sangwan等人，J Biol Chem.2008；283(49)：34374-34383，该文献全文并于此处以供参考。如同图5D所示，以rLECT2处理会导致与Met联结的PTP1B的量提升。

这些结果指出经由抑制Met的磷酸化，LECT2可于HCC细胞中抑制经HGF刺激的细胞增生、迁移及侵入，因此代表了一种用于癌症治疗的新的机制。

LECT2直接结合至Met受体。为了测定LECT2是否可直接与Met交互作用，首先测试LECT2与Met是否可于HCC细胞的表面形成一复合物。以来自HCC细胞(例如，huh-7及PLC/PRF/5细胞)的溶胞产物执行免疫共沉淀(co-IP)，这些细胞内生性地表现LECT2及Met受体。如同图6A所示，co-IP研究的结果证实LECT2可与Met交互作用。

利用经LECT2及/或Met的基因转染的重组293T细胞进一步研究LECT2与Met受体的交互作用。Co-IP实验确认了经LECT2及Met基因转染的293T细胞中LECT2与Met之间的交互作用(图6B)。Far Western Blot试验显示LECT2以剂量效果方式与Met受体的细胞外的功能域交联(图6C)。于一试管试验中进一步证明该LECT2-Met蛋白质及蛋白质的交互作用(图6D)。

此外，经由一快速与敏感的流式细胞仪方法，并使用经rLECT2蛋白质(5nM的最终浓度)处理10分钟的SK-Hep1细胞以研究LECT2与Met的蛋白质-蛋白质交互作用。在rLECT2处理后，收集活细胞。添加抗-LECT2抗体至该悬浮的细胞中。在反应约1小时后，添加经FITC荧光接合的二级抗体至该细胞中。流式细胞仪分析显示SK-Hep1细胞清楚地以FITC标示，指出LECT2与该细胞表面的交互作用(图6E)。

为了证实LECT2与Met受体之间特定的交互作用，该流式细胞仪研究亦以额外地以Met及EGFR的siRNA处理的SK-Hep1细胞来进行，其中，这些siRNA会各自地减少Met及EGFR的蛋白质程度。如同图6E的右侧图所示，以Met siRNA处理细胞导致FITC荧光的减少(自左边开始的第二个波峰)，但于以GFR siRNA处理细胞或于对照组中没有观察到改变。这指出rLECT2与Met在SK-Hep1细胞表面上进行交互作用，但不与EGFR交互作用。

LECT2蛋白质的HXXXD基序调节肿瘤生长与转移。为了侦测牵涉于调节肿瘤生长与转移的LECT2的潜在的功能性功能域，分析151个氨基酸。序列分析的结果显示LECT2的HXXXD基序在调节肿瘤生长与转移中扮演重要的角色。建立并研究于HXXXD基序中具有突变的LECT2突变体。这种突变体包含，例如，以AQGVA(SEQID NO：4，显示为mLECT2-1)或AQAVA(SEQ ID NO：5，显示为mLECT2-2)取代HQGVD(SEQ ID NO：3的一部分)。并建立及研究于其他氨基酸具有突变的LECT2突变体以作为对照组，例如mLECT2-3、mLECT2-4。可参见，例如，图7A及图9。

当相较于过度表达野生型(wild type)LECT2或其他LECT2突变体(例如，mLECT2-3、mLECT2-4)，过度表达HXXXD突变体(例如，mLECT2-1、mLECT2-2)的SK-Hep1细胞具有提升的经HGF诱导的Met磷酸化及细胞侵入(图7B)。共免疫沉淀分析指出LECT2的HXXXD突变体已失去其所有或大部分与Met结合的活性(图7C)。这些数据指出HXXXD对于LECT2与Met交互作用及经由HGF调节Met的磷酸化是重要的。

重组LECT2蛋白质在各种癌细胞中减少经HGF刺激的Met的磷酸化。亦调查LECT2蛋白质在其他癌细胞株中对Met活化的影响，包含人类肺癌细胞(A549)、人类乳癌细胞(MB-MDA-231)、人类胃癌细胞(N87)、人类卵巢癌细胞：ES-2、人类下咽癌细胞：FaDu、及人类神经胶母细胞瘤细胞：U87。

以HGF(40ng/mL)单独或与重组LECT2蛋白质(2.5nM)结合处理癌细胞15分钟。接着，研究Met受体酪氨酸激酶的活性及侵入能力。如同图8所示，在各种癌细胞测试中，LECT2亦可抑制经HGF诱导的Met的磷酸化及经HGF诱导的侵入。这指出LECT2代表一种用于除了HCC之外的其他肿瘤及癌症的新的癌症治疗。

结论

近来已调查了HGF及Met受体在肿瘤生长及入侵的过程中的刺激角色。在本研究中，已发现LECT2经由抑制Met活化而抑制肿瘤细胞增生、迁移及侵入，以抑制对于刺激细胞为必需的下游讯息路径。此外，以LECT2处理，不论是经由于HCC细胞中内生性的LECT2过度表现，或经由投予外在的LECT2至HCC细胞中，皆可减少Met酪氨酸激酶活性，从而抑制HGF对HGF/Met路径的刺激。已证实LECT2与Met受体于HCC细胞中直接的特定交互作用，例如，通过LECT2的HXXXD基序。尽管不希望受此理论约束，LECT2的肿瘤抑制机制显然与HCC细胞中蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)1B与Met的联结有关。

本发明的发现指出LECT2抑制HCC细胞的侵入及Met受体的磷酸化。本申请案的研究亦指出LECT2代表一种用于治疗或预防其他通常具有Met受体过度活性特性的肿瘤的新的治疗手段。

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本领域普通技术人员可理解，在不悖离本发明的广义发明概念下，可对上述实施态样进行改变。因此，应理解本发明并不限于这些特定揭露的实施态样，而是包含如后附申请专利范围所界定的本发明精神与范畴内所作的改变。

Claims (27)

1.一种抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种的方法，其包含投予该肿瘤细胞一药剂，以于该肿瘤细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性，藉此于该肿瘤细胞中减少MET的磷酸化。

2.如权利要求1的方法，其包含投予该肿瘤细胞一具SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LECT2蛋白质。

3.如权利要求1的方法，其包含投予该肿瘤细胞一LECT2蛋白质的活性片段，其中该活性片段具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

4.如权利要求1的方法，其包含投予该细胞一包含一编码一LECT2蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸，该LECT2蛋白质具SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

5.如权利要求1的方法，其包含投予该细胞一包含一编码一LECT2蛋白质的活性片段的核苷酸序列的多核苷酸，其中该活性片段具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

6.如权利要求1的方法，其中该肿瘤细胞选自以下群组：肝细胞癌细胞、肺癌细胞、乳癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、下咽癌细胞、神经胶母细胞瘤细胞、或任何其他表现MET的肿瘤细胞。

7.一种于个体中预防或治疗肝细胞癌的方法，其包含投予个体一药剂，以于该个体的肝细胞癌细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性，藉此于该肝细胞癌细胞中减少MET的磷酸化。

8.如权利要求7的方法，其中该LECT2蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

9.一种于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化的方法，其包含投予该肿瘤细胞一药剂，以于该肿瘤细胞中提升LECT2蛋白质或其活性片段的蛋白质程度或生物活性。

10.如权利要求9的方法，其中该LECT2蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

11.一种预防或治疗侵入性肿瘤的方法，其包含：

(a)基于一个体的生物样本中提升的MET磷酸化的程度，判定该个体具有增加的侵入性肿瘤发展的风险；以及

(b)投予该个体一药剂，以提升LECT2蛋白质的蛋白质程度或生物活性，藉此于该个体的肿瘤细胞中减少MET的磷酸化。

12.如权利要求11的方法，其中该肿瘤选自以下群组：肝细胞癌、肺癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、下咽癌、神经胶母细胞瘤、或任何其他表现MET的肿瘤。

13.如权利要求11的方法，其中该药剂包含一包含一具SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LECT2蛋白质的多肽，或一编码一包含一具SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LECT2蛋白质的多肽的多核苷酸。

14.一种用于预防或治疗肿瘤的医药组合物，其包含一载剂及一包含一LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

15.如权利要求14的医药组合物，其中该多肽包含LECT2蛋白质，该LECT2蛋白质具SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

16.如权利要求14的医药组合物，其中该多肽包含LECT2的活性片段。

17.一种用于预防或治疗肿瘤的医药组合物，其包含一载剂及一多核苷酸，该多核苷酸编码一包含一LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

18.如权利要求17的医药组合物，其中该多核苷酸包含一编码LECT2蛋白质的核苷酸序列，该LECT2蛋白质具SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

19.如权利要求17的医药组合物，其中该多核苷酸包含一编码LECT2的活性片段的核苷酸序列。

20.一种经分离的LECT2蛋白质的活性片段，其具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

21.一种经分离的编码如权利要求20的活性片段的核苷酸。

22.一种包含LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽于制备药剂的用途，该药剂是用于抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种，其中，该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

23.如权利要求22的用途，其中该肿瘤细胞选自以下群组：肝细胞癌细胞、肺癌细胞、乳癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、下咽癌细胞、神经胶母细胞瘤细胞、或任何其他表现MET受体的肿瘤细胞。

24.如权利要求22的用途，其中该LECT2蛋白质包含SEQ ID NO：2。

25.一种编码一包含LECT2蛋白质或其活性片段的氨基酸序列的多肽的多核苷酸于制备药剂的用途，该药剂是用于抑制肿瘤细胞的增生、迁移及侵入的至少一种，其中，该多肽具有以下能力的至少一种：于肿瘤细胞中减少MET的磷酸化及于肿瘤细胞中结合至MET。

26.如权利要求25的用途，其中该肿瘤细胞选自以下群组：肝细胞癌细胞、肺癌细胞、乳癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、下咽癌细胞、神经胶母细胞瘤细胞、或任何其他表现MET受体的肿瘤细胞。

27.如权利要求25的用途，其中该LECT2蛋白质包含SEQ ID NO：2。

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