CN102791871A

CN102791871A - 通过酶法生产啶南平衍生物的方法

Info

Publication number: CN102791871A
Application number: CN201180007182XA
Authority: CN
Inventors: 山本憲太朗; 土田麻里子; 尾山和彦; 后藤公彦; 三富正明
Original assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2011-01-19
Publication date: 2012-11-21
Also published as: US20120330022A1; EP2530165A1; BR112012019457A2; JPWO2011093187A1; AU2011210969A1; CA2787829A1; MX2012008688A; EP2530165A4; KR20120127617A; RU2012136447A; WO2011093187A1

Abstract

提供了通过酶法生产由下式A所表示的啶南平衍生物的方法。本发明的生产方法允许在更简单的条件下并以更短的步骤生产啶南平衍生物，[化学式1]

[其中R表示线性、分支或者环状C_2-6烷基羰基(当该基团的烷基部分是分支或者环状时R为C_3-6烷基羰基)]。

Description

通过酶法生产啶南平衍生物的方法

相关申请的交互引用

本专利申请要求2010年1月26日提交的日本专利申请号14727/2010和2010年1月26日提交的日本专利申请号14336/2010的优先权，并且所述专利申请的全部公开在此处引用作为参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及用于生产可用作为害虫控制剂的啶南平(pyripyropene)衍生物的方法。更具体地，其涉及用于生产在1位和11位具有酰氧基以及在7位具有羟基的啶南平衍生物的方法。

技术背景

如WO2006/129714(专利文件1)和WO2008/066153(专利文件2)中所述，在1位和11位具有酰氧基以及在7位具有羟基的啶南平衍生物是对昆虫害虫发挥控制作用的化合物。

作为用于生产在1位和11位具有酰氧基以及在7位具有羟基的啶南平衍生物的方法，WO2006/129714和日本特开259569/1996(专利文件3)中已经公开了使用1，7，11-三酰氧基衍生物作为原料、从通过非选择性水解酰氧基产生的多个产物中纯化和分离所述啶南平衍生物的方法。

此外，日本特开259569/1996描述了使用保护基的组合用于合成啶南平衍生物的用途。Journal of Antibiotics第49卷，第11期，第1149页，1996年(非专利文件1)和Bioorganic Medicinal Chemistry Letter第5卷，第22期，第2683页，1995年(非专利文件2)和日本特开269065/1996(专利文件4)已经公开了合成实例，其中使用保护基将酰基引入到7位。

WO2009/022702(专利文件5)已经公开了使用保护基从1，7，11-三去乙酰基啶南平A生产1，11-二酰基-1，7，11-三去乙酰基啶南平A的方法。

迄今为止，在1位和11位具有酰氧基以及在7位具有羟基的啶南平衍生物的已知生产方法是使用1，7，11-三酰氧基衍生物的非选择性水解或者在多步骤中使用保护基的生产方法，但在工业生产中，期望进一步改进生产效率，例如降低生产费用、改进产率、简化纯化和分离或者缩短步骤的数目。

现有技术参考

专利文件

[专利文件1]WO2006/129714

[专利文件2]WO2008/066153

[专利文件3]日本特开259569/1996

[专利文件4]日本特开269065/1996

[专利文件5]WO2009/022702

非专利文件

[非专利文件1]Journal of Antibiotics第49卷，第11期，第1149页，1996年

[非专利文件2]Bioorganic Medicinal Chemistry Letter第5卷，第22期，第2683页，1995年

发明概述

本发明人已经发现了用于在更简单的条件下和以更短的步骤、使用啶南平类似物作为合成原料、通过借助微生物的酶法或者通过酶法和化学转化的组合获得所需1，11-二酰氧基衍生物的方法，所述啶南平类似物作为天然存在的产物获得(Journal of Antibiotics(1996)49(3)，292-298，Pure Appl.Chem.，第71卷，第6期，第1059-1064页，1999年；WO94/09147；日本特开239385/1996；日本特开259569/1996(专利文件3)；Bioorganic Medicinal Chemistry Letter第5卷，第22期，第2683页，1995年(非专利文件2)；和WO2004/060065)。

因此，本发明的目的是提供用于使用微生物酶法生产1，11-二酰氧基衍生物的方法。

根据本发明的一个实施方案，提供了用于生产由下式A所表示的化合物的方法：

[化学式1]

[其中R表示线性、分支或者环状C_2-6烷基羰基(当该基团的的烷基部分是分支或者环状时R为C_3-6烷基羰基)]，

该方法包括以下步骤，用由下式B所表示的化合物培养其中引入了至少一种下文(I)至(III)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物：

[化学式2]

[其中R表示与上文相同的含义]，

并且分离由式A所表示的化合物：

(I)分离的多核苷酸，具有至少一种选自以下(a)至(d)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：266的核苷酸序列，

(b)核苷酸序列，其能在严格条件下与SEQ ID NO：266的核苷酸序列的互补序列杂交，并且其编码与由SEQ ID NO：266的核苷酸序列所编码的蛋白质基本上等同的蛋白质，

(c)SEQ ID NO：266的核苷酸序列，其中缺失、替换、插入或者添加了一个或多个核苷酸，并且其编码与由每一核苷酸序列所编码的蛋白质基本上等同的蛋白质，和

(d)核苷酸序列，其与SEQ ID NO：266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％同一性，并且其编码与由SEQ ID NO：266的核苷酸序列所编码的蛋白质基本上等同的蛋白质；

(II)分离的多核苷酸，其具有编码至少一种选自SEQ ID NO：269和270的氨基酸序列或者与其基本上等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(III)分离的多核苷酸，其具有至少一种选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(1)以下(a)和(b)的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的13266至15144的核苷酸序列，和

(b)SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的16220至18018的核苷酸序列，

(2)核苷酸序列，其能在严格条件下与(1)的核苷酸序列的互补序列杂交，并且其编码与由每一核苷酸序列所编码的蛋白质基本上等同的蛋白质，

(3)(1)的核苷酸序列，其中缺失、替换、插入或者添加了一个或多个核苷酸，并且其编码与由每一核苷酸序列所编码的蛋白质基本上等同的蛋白质，和

(4)核苷酸序列，其与(1)的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90％同一性，并且其编码与由每一核苷酸序列所编码的蛋白质基本上等同的蛋白质。

根据本发明的另一实施方案，提供了生产方法，其包括以下步骤：用由上式B所表示的化合物培养包含质粒pCC1-PP1、质粒pPP2或质粒pPP3或者选自这些质粒的一个或多个载体的微生物，并分离由上式A所表示的化合物。

根据本发明优选的实施方案，提供了生产由上式A所表示的化合物的方法，该方法包括以下步骤：用由上式B所表示的化合物培养其中引入了至少一个下文(IV)至(V)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离由上式A所表示的化合物：

(IV)分离的多核苷酸，其具有编码SEQ ID NO：270的氨基酸序列或者与其基本上等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(V)分离的多核苷酸，其具有至少一种选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(1)以下(a)的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：266中所述的核苷酸序列的16220至18018的核苷酸序列，

根据本发明的另一实施方案，提供了生产方法，其进一步包括以下步骤：使用酰化剂酰化由下式D所表示的化合物的1和11位的羟基：

[化学式3]

并分离由上式B所表示的化合物。

根据本发明的另一实施方案，提供了生产方法，其进一步包括以下步骤：水解由下式C所表示的化合物的1位的乙酰基和当R′为乙酰基时的11位的乙酰基：

[化学式4]

[其中R′表示乙酰基或氢原子]

并分离由上式D所表示的化合物。

根据本发明的另一实施方案，提供了生产方法，其进一步包括以下步骤：用啶南平E培养其中引入了至少一种下文(VI)至(VII)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离由上式C所表示的化合物：

(VI)分离的多核苷酸，其具有编码SEQ ID NO：269和275的氨基酸序列或者与其基本上等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(VII)分离的多核苷酸，其具有至少一种选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(1)以下(a)和(b)的核苷酸序列：

(b)SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的25824至27178的核苷酸序列，

根据本发明的另一实施方案，提供了生产方法，包括以下步骤：用啶南平E培养包含质粒pPP2或质粒pPP9的微生物，并分离由上式C所表示的化合物。

根据本发明的另一实施方案，提供了生产方法，其进一步包括以下步骤：用去乙酰啶南平E培养其中引入了至少一种下文(VIII)至(IX)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离由上式C所表示的化合物：

(VIII)分离的多核苷酸，其具有编码至少一种选自SEQ ID NO：269、274和275的氨基酸序列或者与其基本上等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(IX)分离的多核苷酸，其具有至少一种选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(1)以下(a)、(b)和(c)的核苷酸序列：

(b)SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的23205至24773的核苷酸序列，和

(c)SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的25824至27178的核苷酸序列，

根据本发明的另一实施方案，提供了生产方法，包括以下步骤：用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP2或质粒pPP9并且还包含质粒pPP7的微生物，并分离由上式C所表示的化合物。

根据本发明的另一实施方案，提供了质粒pCC1-PP1(用质粒pCC1-PP1转化的大肠杆菌(Escherichia coli)EPI300^TM-T1^R的检索号FERM BP-11133)、质粒pPP2(用质粒pPP2转化的米曲霉(Aspergillus oryzae)的检索号FERM BP-11137)、质粒pPP3(用质粒pPP3转化的米曲霉的检索号FERM BP-11141)、质粒pPP7(用质粒pPP7转化的米曲霉的检索号FERM BP-11219)或质粒pPP9(用质粒pPP9转化的米曲霉的检索号FERM BP-11220)或者选自这些质粒的一个或多个载体的用途，用于生产由式A所表示的化合物。

根据本发明优选的实施方案，提供了质粒pPP3(用质粒pPP3转化的米曲霉的检索号FERM BP-11141)或包含该质粒的载体的用途，用于生产由式A所表示的化合物。

根据本发明的另一实施方案，提供了包含质粒pCC1-PP1(用质粒pCC1-PP1转化的大肠杆菌EPI300^TM-T1^R的保藏号FERM BP-11133)、质粒pPP2(用质粒pPP2转化的米曲霉的保藏号FERM BP-11137)、质粒pPP3(用质粒pPP3转化的米曲霉的保藏号FERM BP-11141)、质粒pPP7(用质粒pPP7转化的米曲霉的保藏号FERM BP-11219)或质粒pPP9(用质粒pPP9转化的米曲霉的保藏号FERM BP-11220)或选自这些质粒的载体的转化体的用途，用于生产由式A所表示的化合物。

根据本发明优选的实施方案，提供了包含质粒pPP2(用质粒pPP2转化的米曲霉的保藏号FERM BP-11137)、质粒pPP3(用质粒pPP3转化的米曲霉的保藏号FERM BP-11141)、质粒pPP7(用质粒pPP7转化的米曲霉的保藏号FERM BP-11219)或质粒pPP9(用质粒pPP9转化的米曲霉的保藏号FERM BP-11220)或包含这些质粒之一的载体的转化体的用途，用于生产由式A所表示的化合物。

根据本发明的另一实施方案，提供了由下式B1所表示的化合物：

[化学式5]

根据本发明的另一实施方案，提供了由上式D所表示的化合物。

根据本发明的另一实施方案，提供了用于从由上式B所表示的化合物生产由上式A所表示的化合物的方法，该方法包括使用包含SEQ ID NO：270中所述的氨基酸序列的蛋白质代替微生物的步骤。

本发明允许在更简单的条件下和以更短的步骤生产可用作为害虫控制剂、并且在1和11位具有酰氧基和在7位具有羟基的啶南平衍生物。

附图简述

[图1]图1显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：M：分子量标记物(100bp梯)，泳道1：SEQ ID NO：1和2的引物，泳道2：SEQ ID NO：239和240的引物，泳道3：SEQ ID NO：237和238的引物，泳道4：SEQ ID NO：241和242的引物，泳道5：SEQ ID NO：247和248的引物，泳道6：SEQ ID NO：251和252的引物，泳道7：SEQ ID NO：245和246的引物，泳道8：SEQ ID NO：243和244的引物，泳道9：SEQ ID NO：249和250的引物，泳道10：SEQ ID NO：235和236的引物，泳道11：SEQ ID NO：233和234的引物，泳道12：SEQ ID NO：227和228的引物，泳道13：SEQ ID NO：229和230的引物，泳道14：SEQ ID NO：231和232的引物。

[图2]类似于图1，图2显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：M：分子量标记物(100bp梯)，泳道1：SEQ ID NO：253和254的引物，泳道2：SEQ ID NO：257和258的引物，泳道3：SEQ ID NO：259和260的引物，泳道4：SEQ ID NO：255和256的引物，泳道5：SEQ ID NO：261和262的引物。

[图3]类似于图1，图3显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：泳道1：分子量标记物(100bp梯)，泳道2：SEQ ID NO：264和265的引物(400bp扩增片段)。

[图4]图4显示了pUSA的质粒图谱。

[图5]图5显示了pPP2的质粒图谱。

[图6]图6显示了P450-2cDNA扩增的方案。

[图7]图7显示了pPP3的质粒图谱。

[图8]图8显示了啶南平E在氘化乙腈中的¹H-NMR谱。

[图9]图9显示了用质粒pPP2转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的¹H-NMR谱。

[图10]图10显示了啶南平O在氘化乙腈中的¹H-NMR谱。

[图11]图11显示了用质粒pPP3转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的¹H-NMR谱。

[图12]图12显示质粒pPP7和pPP9的质粒图。

发明详述

微生物的保藏

用质粒pCC1-PP1转化的大肠杆菌(大肠杆菌EPI300^TM-T1^R)已于2008年10月9日(原始保藏日)保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11133(从国内保藏FERM P-21704移管)(保藏者所用的识别标识：大肠杆菌EPI300^TM-T1^R/pCC1-PP1)。

用质粒pPP2转化的米曲霉已于2009年6月23日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11137(保藏者所用的识别标识：米曲霉PP2-1)。

用质粒pPP3转化的米曲霉已于2009年7月3日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11141(保藏者所用的识别标识：米曲霉PP3-2)。

用质粒pPP7转化的米曲霉已于2009年12月21日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11219(保藏者所用的识别标识：米曲霉PP7)。

用质粒pPP9转化的米曲霉已于2009年12月21日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11220(保藏者所用的识别标识：米曲霉PP9)。

使用下述重组载体，可以将多核苷酸引入到本发明所使用的微生物中。然而，可以例如通过电穿孔法、聚乙二醇法、农杆菌属(Agrobacterium)法、锂法、氯化钙法等，将多核苷酸引入到微生物中。

本发明中所使用的微生物并没有特定限制，只要其可以引入多核苷酸或包含一种或多种该多核苷酸的重组载体。优选属于曲霉属(Aspergillus)的微生物，更优选的微生物包括米曲霉。

在本发明中，培养微生物可以例如通过如下进行：需氧条件下的固体培养、振荡培养、搅拌下鼓泡培养或者深部需氧培养，特别地，优选深部需氧培养。作为用于培养微生物的培养基，可以使用通常使用的组分，例如碳源，葡萄糖、蔗糖、淀粉糖浆、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动物和植物油等。此外，作为氮源，可以使用大豆粉、麦胚、玉米浆、棉籽粉、肉膏、聚胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等。此外，根据需要，加入钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸(磷酸氢二钾等)、硫酸(硫酸镁等)或者可以产生其他离子的无机盐是有效的。并且，根据需要，可以加入各种维生素如硫胺素(盐酸硫胺素等)、氨基酸如谷氨酸(谷氨酸钠等)或天冬酰胺(DL-天冬酰胺等)、痕量营养物如核苷酸或者选择试剂如抗生素。此外，可以适当加入帮助细菌生长并促进由式A所表示的化合物的产生的有机物质或无机物质。

培养基的pH为例如约pH5.5至pH8。培养的合适温度为15℃至40℃，并且在许多情况下，生长发生在约22℃至30℃。由式A所表示的化合物的产生取决于培养基和培养条件或者所使用的宿主而变化。在培养的任一方法中，积累通常在2天至10天内达到峰值。当培养物中由式A所表示的化合物的量达到峰值时，终止培养，并从培养物中分离和纯化所需物质。

为了从培养物中分离由式A所表示的化合物，可以使用其特性、通过常用的分离方法提取并纯化，例如溶剂提取法、离子交换树脂法、吸附或分配柱层析法、凝胶过滤法、透析法、沉淀法，所述方法可以单独地使用或者合适地组合使用。优选的是溶剂提取法。

在本发明中，术语“基本上等同的氨基酸序列”意为不影响多肽的活性的氨基酸序列，尽管事实上通过取代、缺失、添加或者插入改变了一个或者多个氨基酸。优选地，通过氨基酸的取代、缺失、添加或者插入所改变的氨基酸序列与改变之前的氨基酸序列等具有70％或者更多、优选地80％或者更多、更优选地90％或者更多、还更优选地95％或者更多并且仍然更优选地98％或者更多的序列同一性。进一步地，所改变的氨基酸残基数目优选地是1至40、更优选地1至20、还更优选地1至10、还更优选地1至8、并且最优选地1至4。

进一步地，不影响活性的改变的实例包括保守取代。术语“保守取代”是指将优选地1至40、更优选地1至20、更优选地1至10、还更优选地1至8并且最优选地1至4个氨基酸残基用其它化学相似的氨基酸残基取代，而多肽的活性基本上未改变。其实例包括将某个疏水性氨基酸残基用另一个疏水性氨基酸残基取代的情形和将某个极性氨基酸残基用另一个具有相同电荷的极性氨基酸残基取代的情形。能够进行此类取代的功能类似的氨基酸是本领域公知的每一氨基酸。具体而言，非极性(疏水性)氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。极性(中性)氨基酸的实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。带正电荷的(碱性)氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。带负电荷的(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸、谷氨酸等。

术语“严格条件”在本发明中是指杂交后的膜的洗涤操作在低盐浓度溶液中、在高温进行的条件，本领域的技术人员能适当地确定该条件，例如所述条件包括在具有2×SSC(1×SSC：15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠)和0.5％SDS的溶液中、在60℃洗涤20分钟的条件，以及在具有0.2×SSC(1×SSC：15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠)和0.1％SDS的溶液中、在60℃洗涤15分钟的条件。

可以根据已知的方法进行杂交。此外，当使用市售可得的文库时，可以根据所附说明书中的方法进行。

在本说明书中，用于核苷酸序列的术语“同一性”(也称为同源性)意为在待比较的序列之间，构成每一序列的碱基的匹配程度。此时，考虑空位的存在和氨基酸的特征。在本说明书中所示的“同一性”的任一值都可以是使用本领域技术人员已知的同源性检索程序计算的值。例如，通过使用FASTA、BLAST等中默认的(最初设定的)参数容易地计算该值。

在本说明书中，用于核苷酸序列的“同一性”为90％或更多，优选地95％或更多，更优选地98％或更多，仍然更优选地99％或更多。

在本说明书中，术语“在多核苷酸中缺失、替换、插入或添加了一个或多个核苷酸”意为通过以下进行改变：已知方法如位点特异性诱变方法，或者以可天然发生的程度下多种核苷酸的取代等。改变的核苷酸的数目是一个或几个核苷酸(例如一个至几个核苷酸或者1、2、3或4个核苷酸)。

术语“编码与由(每一)核苷酸序列所编码的蛋白质基本上等同的蛋白质的核苷酸序列”意为编码具有与“由(每一)核苷酸序列所编码的蛋白质”的活性等同的活性的蛋白质的核苷酸序列。

优选地，与由SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的13266至15144的核苷酸序列编码的蛋白质基本上等同的蛋白质具有细胞色素P450单加氧酶(1)(P450-1)活性。

优选地，与由SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的16220至18018的核苷酸序列编码的蛋白质基本上等同的蛋白质具有细胞色素P450单加氧酶(2)(P450-2)活性。

优选地，与由SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的23205至24773的核苷酸序列编码的蛋白质基本上等同的蛋白质具有乙酰基转移酶(AT)活性。

优选地，与由SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的25824至27178的核苷酸序列编码的蛋白质基本上等同的蛋白质具有乙酰基转移酶-2(AT-2)活性。

分离的多核苷酸的获得

没有特别限制用于获得本发明的分离的多核苷酸的方法。可以通过以下方法从粪生青霉(Penicillium coprobium)PF1169株(Journal of Technical Disclosure 500997/2008)或丝状菌分离多核苷酸。具体地，基于通过下文实施例9的方法等获得的同源序列，合成能特异性扩增参与啶南平合成的聚酮化合物合酶基因、异戊烯转移酶基因、羟化酶基因、乙酰转移酶基因或腺苷酸合成酶基因中的任意一种或多种基因的引物。对另外制备的粪生青霉PF1169株的F粘粒基因组文库进行PCR，然后进行菌落杂交，从而获得用于本发明的分离的多核苷酸。

重组载体

根据本发明的重组载体可如下制备：取决于目标，将上述(I)至(III)中的任意一个或多个多核苷酸修饰成合适的形式，并根据常规方法将它们连接至载体，例如在[Sambrook，J.等人，“Molecular cloning：a laboratory manual”，(美国)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989]中所述的基因重组技术。

用于本发明的重组载体可以合适地选自病毒、质粒、F粘粒、粘粒载体等。例如，当宿主细胞是大肠杆菌时，其实例包括基于λ噬菌体的噬菌体和基于pBR和pUC的质粒。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的情况下，实例包括基于pUB的质粒。在酵母的情况下，实例包括基于Yep、YRp、YCp和YIp的质粒。

优选地，在所使用的质粒中，至少一种质粒包含用于选择转化体的选择标记。作为选择标记，可以使用编码药物抗性和基因互补营养缺陷体的基因。其具体优选的实例包括，当待使用的宿主是细菌时，为氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等；在酵母的情况下，为色氨酸生物合成基因(TRP1)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮氨酸生物合成基因(LEU2)等；在真菌的情况下，为潮霉素抗性基因、双丙氨膦抗性基因、博来霉素抗性基因、短梗霉素(aureobasidin)抗性基因等；和在植物的情况下，为卡那霉素抗性基因、双丙氨膦抗性基因等。

此外，作用为本发明中所使用的表达载体的DNA分子优选地具有表达每一基因所必需的DNA序列，例如转录调控信号和翻译调控信号，如启动子、转录起始信号、脂质体结合位点、翻译终止信号、终止子。启动子的优选实例包括大肠杆菌中的乳糖操纵子、色氨酸操纵子等的启动子；酵母中的醇脱氢酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖代谢基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因等的启动子；真菌中的α-淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、纤维二糖水解酶基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因、abp1基因等的启动子；植物中的CaMV 35S RNA启动子、CaMV 19S RNA启动子或胭脂氨酸合成酶基因启动子。

转化体

根据所使用的载体的类型，导入本发明的分离的多核苷酸的宿主可以适宜地选自放线菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、丝状真菌、植物细胞等。

根据受试宿主细胞，将重组载体导入宿主的方法可以选自接合转移、通过噬菌体的转导、以及钙离子法、锂离子法、电穿孔法、PEG法、农杆菌(Agrobacterium)法或粒子枪法等转化法。

在本发明中当将多种基因导入宿主细胞中时，所述基因可以包含在单一的DNA分子中或分别在不同的DNA分子中。进一步地，当宿主细胞是细菌时，可以设计每一基因表达为多顺反子mRNA并在一个DNA分子中。

生产方法

除非另外指明，在本说明书中，术语“烷基”作为取代基或其部分，各自意为线性、分支、环状烷基或其组合。

在本说明书中，附标于取代基的符号“Ca-b”意为包含在取代基中的碳原子的数目为a至b。在“Ca-b烷基羰基”的情况下，符号“Ca-b”意为包含在烷基部分中的碳原子的数目为a至b，排除了羰基部分的碳原子。

由R表示的线性、分支、环状C2-6烷基羰基(当该基团的烷基部分是分支或环状时为C3-6烷基羰基)的具体实例包括环丙烷羰基、丙酰基等。

啶南平E可例如如下制备：基于在日本特开239385/1996、WO94/09147或美国专利号5597835中所述的方法、通过培养微生物的方法；或者在Tetrahedron Letters，第37卷，第36期，6461-6464，1996年中所述的总合成方法。

1.式C所表示化合物的生产

在式C所表示的化合物中，其中R′是乙酰基的啶南平O可以例如通过基于Journal of Antibiotics(1996)49(3)，292-298或WO94/09147中所述的方法、通过用于培养微生物的方法获得。

在式C所表示的化合物中，其中R′是氢原子的11-去乙酰啶南平O可以例如通过下文参考实施例1中所述的方法合成。

根据本发明优选的实施方案，优选地使用微生物生产由上式C所表示的化合物。当使用微生物时，可以使用培养基本身，或者可以使用微生物细胞悬液，所述微生物细胞悬通过从培养基分离微生物细胞并洗涤它们、然后将所得活微生物细胞悬浮在水、生理盐水或指定浓度的合适缓冲液中。化合物可如下获得：将去乙酰啶南平E或啶南平E加入到所用微生物的悬液或者其微生物细胞悬液中，并允许所得物质在最佳温度和pH、在酶存在下反应适当的一段时间。可以如上所述培养微生物。待加入的去乙酰啶南平E或啶南平E的优选浓度为1μg/mL至50,000μg/mL。

当加入啶南平E时，可以使用具有羟化功能的蛋白质(在下文中称为羟化酶)代替微生物。当使用羟化酶时，化合物可如下获得：将啶南平E溶解在羟化酶在水或合适缓冲液中的溶液中，并允许所得物质在最佳温度和pH、在酶存在下反应适当的一段时间。

当加入去乙酰啶南平E时，可以使用具有乙酰化功能的蛋白质(在下文中称为乙酰基转移酶)和羟化酶代替微生物。当使用乙酰基转移酶和羟化酶时，化合物可如下获得：将去乙酰啶南平E溶解在乙酰基转移酶和羟化酶水或合适缓冲液中的溶液中，并允许所得物质在最佳温度和pH、在酶存在下反应适当的一段时间。

当加入啶南平E时和当加入去乙酰啶南平E时，优选的反应条件是10℃至40℃的温度，5-9的pH，以及30分钟至24小时的反应时间。更优选的条件是20℃至35℃的温度，6-8的pH，以及1小时至12小时的反应时间。

对于乙酰基转移酶，可以使用纯化的乙酰基转移酶，或者可以使用通过破碎含乙酰基转移酶的细菌、放线菌、酵母或真菌获得的粗酶溶液。此外，还可以使用经破碎的真菌等的溶液形式的粗酶溶液。对于乙酰基转移酶，优选地，可以使用来源于具有产生啶南平能力的微生物的乙酰基转移酶，所述微生物例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)FO-1289株(日本特开360895/1992)、网状孢正青霉(Eupenicillium reticulosporum)NRRL-3446株(Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-35)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)F1959株(WO2004/060065)和粪生青霉PF1169株(Journal of Technical Disclosure 500997/2008)。

对于羟化酶，可以使用经纯化的羟化酶，或者可以使用通过破碎含羟化酶的细菌、放线菌、酵母或真菌获得的粗酶溶液。此外，还可以使用经破碎的真菌等的溶液形式的粗酶溶液。对于羟化酶，优选地，可以使用来源于具有产生啶南平能力的微生物的羟化酶，所述微生物例如烟曲霉FO-1289株(日本特开360895/1992)、网状孢正青霉NRRL-3446株(Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-35)、灰黄青霉F1959株(WO2004/060065)和粪生青霉PF1169株(Journal of Technical Disclosure500997/2008)。

可以如上所述分离通过转化产生的由上式C所表示的化合物。

根据本发明优选的实施方案，可以用啶南平E培养其中引入了至少一种上文(VI)至(VII)所述的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离由上式C所表示的化合物。

根据本发明另一优选的实施方案，可以用啶南平E培养包含质粒pPP2和质粒pPP9的微生物，并分离由上式C所表示的化合物。

通过用啶南平E培养包含质粒pPP2的微生物获得的由上式C所表示的分离的化合物优选但不限于在上式C中R’为氢原子的11-去乙酰啶南平O。此外，通过用啶南平E培养包含质粒pPP9的微生物获得的由上式C所表示的分离的化合物优选但不限于其中在上式C中R’为乙酰基的化合物。

根据本发明的另一优选的实施方案，可以用去乙酰啶南平E培养其中引入了至少一种上文(VIII)至(IX)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离由上式C所表示的化合物。

根据本发明的另一实施方案，可以用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP2或质粒pPP9且还包含质粒pPP7的微生物，并分离由上式C所表示的化合物。

通过用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP2的微生物获得的由上式C所表示的分离的化合物优选但不限于其中在上式C中R’为氢原子的11-去乙酰啶南平O。此外，通过用乙酰啶南平E培养包含质粒pPP9的微生物获得的由上式C所表示的分离的化合物优选但不限于其中在上式C中R’为乙酰基的化合物。

根据本发明的另一优选实施方案，可以用去乙酰啶南平E培养其中引入了至少一种上文(VIII)至(IX)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离由上式C所表示的化合物。

2.从由式C表示的化合物(在下文中称为化合物C，包括其中R′是乙酰基的啶南平O和其中R′是氢原子的11-去乙酰啶南平O)生产由式B表示的化合物(在下文中有时称为化合物B)的方法

化合物B如下获得：通过水解化合物C，然后酰化得到的由上式D所表示的化合物(在下文中有时称为化合物D)。

化合物C的水解可以在其中使用酸或碱的条件下进行。可以使用的酸的具体实例包括盐酸、硫酸、对甲苯磺酸、对甲苯磺酸一水合物、对甲苯磺酸吡啶鎓、10-樟脑磺酸等。可以使用的碱的具体实例包括无机碱如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、氢化钾、氰化钠、氰化钾、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锂或氢氧化钡；碱金属或碱土金属的醇盐，如甲醇钠、乙醇钠或叔-丁醇钾；和有机碱，如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、肼或胍。水解可以在合适的溶剂中进行。可以使用的溶剂的具体实例包括具有1至4个碳原子的醇溶剂如甲醇；醚溶剂，如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃或二

烷；非质子极性有机溶剂，如N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N，N-二甲基乙酰胺或乙腈；卤化溶剂如二氯甲烷或氯仿；或水；以及它们的混合物。

可以在通过酰化化合物D(1，11-二去乙酰啶南平O)获得的化合物B的方法中使用的溶剂的实例包括醚溶剂，如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃或二

烷；非质子极性有机溶剂，如N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N，N-二甲基乙酰胺或乙腈；卤化溶剂，如二氯甲烷或氯仿；芳族烃溶剂，如甲苯；以及它们的混合物。

反应可以在不使用碱的情况下进行。然而，在使用碱的情况下，可以使用的碱的实例包括无机碱，如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、氢化钾、氰化钠、氰化钾、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锂或氢氧化钡；和有机碱，如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶或胍。

对于对应于所需R的酰化剂，可以使用ROH、RCl、(R)₂O或混合酸酐，其中RCl、(R)₂O是优选的。反应可以在碱存在或不存在下或者通过使用缩合剂进行，所述缩合剂例如二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐、羰基二咪唑、二吡啶二硫醚、二咪唑二硫醚、1，3，5--三氯苯甲酰氯、1，3，5-三氯苯甲酸酐、PyBop或PyBrop；并且优选地在碱存在或不存在下、通过使用RCl或(R)₂O进行。优选的酰化剂的实例包括环丙烷羰基氯。

当使用碱时，其用量基于化合物D优选地为2至10当量，更优选地为3至6当量。

待使用的酰化剂的量基于化合物D优选地为2至10当量，更优选地为2至5当量。优选地，反应温度在-20℃至50℃之内。优选地，反应时间在0.1小时至7天之内。

3.从化合物B生产由式A所表示的化合物(在下文中描述为化合物A)

当使用微生物进行生产时，可以使用培养基本身，或者也可以使用真菌细胞悬液，其通过将活的真菌细胞悬浮在水、生理盐水或指定浓度的合适缓冲液中获得，所述活的真菌细胞通过从培养基中分离真菌细胞并洗涤它们获得。可以将化合物B加入到所用微生物的培养基中或者其真菌细胞悬液中，并允许在酶的最佳温度和pH反应合适的一段时间，从而获得化合物A。培养微生物的方法可以根据上文进行。待添加的化合物B的优选浓度为1μg/mL至50,000μg/mL。

当通过具有羟化功能的蛋白质(在下文中称为羟化酶)而不是微生物进行生产时，可以将化合物B溶解于通过溶解羟化酶于水或者合适的缓冲液中所获得的酶溶液中，并允许在酶的最佳温度和pH反应合适的一段时间，从而获得化合物A。

对于优选的反应条件，温度为10℃至40℃；pH为pH5至pH9；且反应时间为30分钟至24小时。对于更优选的反应条件，温度为20℃至35℃；pH为pH6至pH8；且反应时间为1小时至12小时。对于羟化酶，可以使用经纯化的羟化酶或通过破碎含有羟化酶的细菌、放线菌、酵母或真菌所得的粗酶溶液。此外，还可以使用经破碎的真菌等的溶液形式的粗酶溶液。作为羟化酶，优选地，可以使用来源于具有产生啶南平能力的微生物的羟化酶，所述微生物为烟曲霉FO-1289株(日本特开360895/1992)、网状孢正青霉NRRL-3446株(Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-35)、灰黄青霉F1959株(WO2004/060065)和粪生青霉PF1169株(Journal of Technical Disclosure 500997/2008))。可以根据上文分离通过转化产生的化合物A。

根据本发明，提供了生产由上式A所表示的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：用由上式B所表示的化合物培养其中引入了至少一种上文(I)至(III)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离由上式A所表示的化合物。

根据本发明优选的实施方案，提供了这样的生产方法，其中由上式B所表示的化合物是由上式B1所表示的化合物。

提供了生产方法，包括以下步骤：用由上式B所表示的化合物培养包含质粒pCC1-PP1、质粒pPP2或质粒pPP3或者选自这些质粒的一个或多个载体的微生物，并分离由上式A所表示的化合物。

根据本发明的更优选的实施方案，提供了生产由上式A所表示的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：用由上式B所表示的化合物培养其中引入了至少一种上文(IV)至(V)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离由上式A所表示的化合物。

根据本发明优选的实施方案，提供了生产1，11-二-O-环丙烷羰基-1，7，11-三-去乙酰啶南平A的方法，通过使用酰化剂酰化由上式D所表示的化合物的1和11位的羟基，以产生由上式B1所表示的化合物，并用由上式B1所表示的化合物(1，11-二-O-环丙烷羰基-1，11-二去乙酰啶南平O)培养包含质粒pPP3的微生物。

实施例

本发明通过以下实施例进一步详细说明，所述实施例并不旨在限制本发明。

实施例1：制备粪生青霉PF1169株的基因组DNA

将无菌NB培养基(500ml)置于三角瓶(1L)。将在1/2CMMY琼脂培养基中28℃预培养4天的粪生青霉PF1169株(Journal of Technical Disclosure No.500997/2008)加入上述培养基，并在28℃液体培养4天。用Miracloth过滤，获得5g真菌细胞。从这些真菌细胞根据基因组DNA纯化试剂盒Genomic-tip 100/G(Qiagen K.K.制)所附的手册获得30μg基因组DNA。

实施例2：用于扩增聚酮化合物合酶(PKS)的简并引物和其扩增片段

基于多种丝状菌聚酮化合物合酶中保守的氨基酸序列，设计并合成下列引物作为简并引物用于扩增：

LC1：GAYCCIMGITTYTTYAAYATG(SEQ ID NO：1)

LC2c：GTICCIGTICCRTGCATYTC(SEQ ID NO：2)

(其中R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，I＝肌苷)。

使用这些简并引物，将实施例1中制备的基因组DNA和ExTaq聚合酶(Takara Bio Inc.制)按照所附的手册进行反应。检测到约700bp的扩增片段(见图1)。进一步地，分析上述扩增片段来特定其内部的500bp序列(SEQ ID NO：3)。

实施例3：基因组DNA的大量测序和氨基酸序列同源性检索

将实施例1中获得的粪生青霉PF1169株的基因组DNA进行大量测序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50μg份进行预处理并随后供Roche 454FLX DNA测序仪测序，获得了约250bp，103000个片段序列(总计49Mb的序列)。

对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列，选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶：烟曲霉PKS 2146a.a.和灰黄青霉(Penicillium(P.)griseofluvum)6-甲基水杨酸(methylsalycilic acid)合酶1744a.a.；以及异戊烯转移酶：烟曲霉异戊烯转移酶，烟曲霉异戊烯转移酶(4-羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)和马尼菲青霉(Penicillium(P.)marneffei)异戊烯转移酶)，并用同源序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得89个、86个、2个、1个和3个同源序列(见表1)。进一步地，从烟曲霉PKS 2146a.a.和灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.的同源序列，分别获得19个和23个叠连序列(烟曲霉PKS 2146a.a.的叠连序列：SEQ ID NO：179至197；灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.的叠连序列：SEQ ID NO：198至220)(见表1)。

表1

实施例4：从基因组DNA的PCR扩增

从实施例3获得的blastx的检索结果，对于聚酮化合物合酶，合成了SEQ ID NO：227至252所示的13种引物对。类似地，对于异戊烯转移酶，合成了SEQ ID NO：253至262所示的5种引物对。当使用这些引物对基因组DNA进行PCR时，对所有的引物对观察到了预期大小的扩增片段(见图1和图2)。

实施例5：构建噬菌体基因组文库

使用λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit(Takara Bio Inc.制，目录号69242-3)按照所附的手册构建粪生青霉PF1169株的λ噬菌体基因组文库。即，用限制性酶Sau3A1部分消化基因组DNA。将约20kb的DNA片段(0.5μg)连接至试剂盒所附的0.5μg λBlueSTAR DNA。将该连接溶液使用Lambda INN Packaging试剂盒(Nippon Gene Co.，Ltd.制)，根据该试剂盒所附的手册进行体外包装，获得1ml溶液。将该经包装的噬菌体溶液(10μl)感染100μl大肠杆菌ER1647株，并在噬斑形成培养基上于37℃过夜培养，从而获得约500个克隆的噬斑。因此，构建了基因组文库，其包含通过感染导入了10至20kb粪生青霉PF1169株的基因组DNA的约50000个噬菌体克隆。

实施例6：噬菌体文库的筛选

从实施例5制备的噬菌体文库的10000个克隆，使用自上述制备的LC1-LC2c引物对扩增的PCR产物作为探针、通过噬斑杂交进行初步筛选。对于探针的标记和检测，使用AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star(GE Healthcare制，目录号RPN3690)。上述杂交按照所附的手册进行。

通过初步筛选后，留下6个克隆作为候补。进一步地，作为通过噬斑杂交进行的二次筛选的结果，获得了4个克隆。将这些阳性克隆感染大肠杆菌BM25.8株，并按照所附的手册将噬菌体变换为质粒，从而获得了含有目的区域的4种质粒。

实施例7.制备F粘粒基因组文库

按照CopyControl Fosmid Library Production Kit(EPICENTRE制，目录号CCFOS110)所附的手册，构建粪生青霉PF1169株的基因组文库。即，将约40kb基因组DNA的0.25μg DNA片段末端平端化后掺入F粘粒(fosmid)载体pCCFOS(Epicentre制)。将该连接溶液使用该试剂盒所附的MaxPlax Lambda Packaging Extract、根据该试剂盒所附的手册进行体外包装。将该经包装的病毒溶液(10μl)感染100μl大肠杆菌EPI300^TM-T1^R株，并在含有氯霉素的培养基上于37℃过夜培养并选择，从而获得约300个克隆的菌落。因此，获得了约30000个F粘粒克隆，其中通过感染导入了40kb粪生青霉PF1169株的基因组DNA。将它们以每孔约50个克隆注入96孔板。从而构建了包含96个池、约4800个克隆的基因组文库。

实施例8：筛选F粘粒文库

按照F粘粒所附的手册，分别从实施例7制备的文库的96个池制备质粒DNA。使用实施例2中合成的用于聚酮化合物合酶扩增的简并引物，对96个池的这些质粒DNA样本实施PCR。结果，从9个池扩增了约700bp的DNA片段。进一步地，从所述阳性池制备含有约300个或以上克隆的集落的平皿，并再次通过菌落杂交筛选。结果，使用LC1-LC2c引物对，自约4800个克隆获得了9种F粘粒。

实施例9：基因组DNA的大量测序和氨基酸序列同源性检索

将实施例1中获得的粪生青霉PF1l69株的基因组DNA进行大量测序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50μg份进行预处理并随后供Roche 454FLX DNA测序仪测序，获得了平均重叠群长度19.621kb的1405个片段序列(总碱基长27.568160Mb的序列)。

对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列，选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶：灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.(P22367)和烟曲霉PKS 2146a.a.(Q4WZA8)；以及异戊烯转移酶：马尼菲青霉异戊烯转移酶(Q0MRO8)、烟曲霉异戊烯转移酶(Q4WBI5)和烟曲霉异戊烯转移酶(4-羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)(Q4WLD0)的序列)，并用同源序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得22个(P22367)、21个(Q4WZA8)、2个(Q0MRO8)、3个(Q4WBI5)和3个(Q4WLD0)同源序列。

实施例10：F粘粒文库筛选和簇集基因的序列分析

按照F粘粒试剂盒(EPICENTRE制，CopyControl Fosmid Library Production Kit)所附的手册，从实施例7制备的文库的96个池分别制备各质粒DNA。基于Roche 454FLX DNA测序仪确定的碱基序列，进行氨基酸序列的同源性检索，以检索与聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶邻近的区域。基于所获得的区域的异戊烯转移酶的碱基序列，合成能够扩增400bpDNA片段的引物对(No.27)。使用该引物，对48个池的质粒DNA样本进行PCR。结果，从11个池扩增了约400bp的预期DNA片段(SEQ ID NO：263)(见图3)。进一步地，从该阳性池中的6个池制备含有约300个或以上克隆的集落的平皿，并再次通过菌落杂交筛选。结果，使用27F+27R引物对(27F引物：SEQ ID NO：264，27R引物：SEQ ID NO：265)，自约4800个克隆获得了4种F粘粒。其中之一命名为pCC1-PP1，并且确定了插入片段的全序列(SEQ ID NO：266)。

将获得的pCC1-PP1转化入大肠杆菌EPI300^TM-T1^R株(包括在F粘粒试剂盒中)，由此获得了大肠杆菌EPI300^TM-T1^R株/pCC1-PP1。

当在上述SEQ ID NO：266的序列和CoA连接酶；LovB样聚酮化合物合酶(PKS)；细胞色素P450单加氧酶、环化酶(IMP：整合膜蛋白)、FAD依赖的单加氧酶(FMO)，它们为羟化酶；UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)；乙酰转移酶(AT)、乙酰转移酶-2(AT-2)，它们为乙酰基化酶；以及转运阳离子的ATPase(上述酶均来自烟曲霉Af293株)之间分别进行同源性检索时，在任一检索中均观察到70％或以上的高同源性。

SEQ ID NO：266的核苷酸3342至5158编码CoA连接酶，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：267所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸5382至12777编码LovB样聚酮化合物合酶(PKS)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：268所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸13266至15144(此后将该多核苷酸序列编码的蛋白质(P450-1)称为细胞色素P450单加氧酶(1)(P450-1))和核苷酸16220至18018(此后将该多核苷酸序列编码的蛋白质(P450-2)称为细胞色素P450单加氧酶(2)(P450-2))编码细胞色素P450单加氧酶，相应的多肽分别显示为SEQ ID NO：269和270所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸18506至19296编码环化酶，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：271所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸19779至21389编码FAD依赖的单加氧酶(FMO)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：272所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸21793至22877编码UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：273所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸23205至24773编码乙酰转移酶(AT)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：274所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸25824至27178编码乙酰转移酶-2(AT-2)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：275所示的氨基酸序列；和SEQ ID NO：266的核苷酸27798至31855编码转运阳离子的ATPase，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：276所示的氨基酸序列。

实施例11：通过转化米曲霉羟化啶南平E或啶南平O

以下所用的啶南平E可以基于日本特开239385/1996、WO94/09147或美国专利号5597835中所述的方法、通过微生物培养法而生产，或者可以根据Tetrahedron Letters，第37卷，第36期，6461-6464，1996所述的全合成方法而生产。另外，以下所用的啶南平O可以基于J.Antibiotics49，292-298，1996或WO94/09147所述的方法、通过微生物培养法而生产。

(1)丝状菌导入用表达载体的制备

将pUSA(图4)和pHSG399(Takara Bio Inc.)分别用KpnI消化并连接，由此获得pUSA-HSG。将该质粒用SmaI和KpnI按所提及的顺序消化，进行凝胶纯化，由此获得具有KpnI粘末端和SmaI平末端的线性载体DNA。

(2)质粒pPP2的制备

将F粘粒pCCl-PP1作为模板，使用具有Kpn F的P450-1(SEQ ID NO：277)/具有SWa R的P450-1(SEQ ID NO：278)的引物对扩增上述P450-1的多核苷酸。将纯化的DNA片段克隆入pCR-Blunt(Invitorogen，目录号K2700-20)。将获得的质粒用KpnI和SwaI消化。将上述P450-1片段连接入上述载体pUSA-HSG。由此获得了图5所示的质粒pPP2。

(3)质粒pPP3的制备

将F粘粒pCC1-PP1作为模板，按照图6所示的流程，首先，使用引物对F1(SEQ ID NO：279)/R1(SEQ ID NO：280)、F2(SEQ ID NO：281)/R2(SEQ ID NO：282)、F3(SEQ ID NO：283)/R3(SEQ ID NO：284)、F4(SEQ ID NO：285)/R4(SEQ ID NO：286)、F5(SEQ ID NO：287)/R5(SEQ ID NO：288)和F6(SEQ ID NO：289)/R6(SEQ ID NO：290)仅扩增外显子，由此获得6个片段。接下来，用这些片段作为模板，使用引物对Fl/R2、F3/R4和F5/R6进行扩增，由此获得更长的片段。进一步地，通过使用引物对F1/R4和F1/R6反复扩增，制备上述P450-2的多核苷酸的不含内含子的cDNA。将该cDNA片段插入pCR-Blunt(Invitorogen，目录号K2700-20)，并将所获得的质粒作为模板，使用引物对P450-2-cDNA的infusion F(SEQ ID NO：291)/P450-2-cDNA的infusion R(SEQ ID NO：292)进行扩增。使用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(Clontech)、根据该试剂盒的手册，获得了图7所示的质粒pPP3。

(4)质粒pPP7(AT)的制备

使用上述实施例11(1)中获得的、用于丝状真菌转化的载体pUSA-HSG，获得质粒pPP7。

用F粘粒pCC1-PP1作为模板，使用具有Swa的AT F(SEQ ID NO：293)和具有Kpn的AT R(SEQ ID NO：294)的引物对各自扩增AT的多核苷酸。将纯化的片段克隆到PCR片段的载体pCR-Blunt(Invitorogen，货号K2700-20)中。所得到的质粒用KpnI和SwaI消化。在上述丝状菌载体DUSA-HSG的KpnI和SmaI位点之间连接每一片段，从而获得图12中所示的质粒pPP7。

(5)质粒DPP9(AT-2)的制备

用F粘粒pCC1-PP1作为模板，使用毒素(Toxin)的infusion F(SEQ ID NO：295)和毒素的infusion R(SEQ ID NO：296)的引物对扩增毒素片段，并使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech制，目录号：639619)、基于试剂盒的手册，插入到上述丝状菌载体pUSA-HSG的KpnI和SmaI位点之间，从而获得图12中所示的质粒pPP9。

(4)米曲霉(A.oryzae)的转化

在CD-Met(含有40μg/ml L-甲硫氨酸)琼脂培养基中，30℃培养米曲霉(HL-1105株)一周。自该平皿收集分生孢子(＞10⁸个)并接种于500ml烧瓶的100ml YPD液体培养基中。培养20小时(30℃，180rpm)后，获得具有藻球状的真菌细胞。将这些真菌细胞用3G-1玻璃滤纸收集，用0.8M NaCl洗涤，充分脱水。将获得物用TF溶液I(原生质体形成溶液)悬浮，然后30℃、60rpm振摇2小时。每隔30分钟，在显微镜下观察，并检查原生质体的存在。然后过滤培养液，离心(2000rpm，5分钟)收集原生质体，然后将原生质体用TF溶液II洗涤。洗涤后，加入0.8体积的TF溶液II和0.2体积的TF溶液III并混合，由此获得原生质体悬液。

向200μl该悬液加入10μg质粒DNA(pPP2或pPP3)。将混合物置于冰上30分钟，加入TF溶液III(1mL)。将所得的混合物轻轻混合，然后置于室温15分钟。然后，将质粒DNA导入上述原生质体。向其加入TF溶液II(8mL)并离心(2000rpm 5分钟)。进一步地，留下1至2ml而回收原生质体。将回收的原生质体溶液滴入再生培养基(下层)，并倒入再生培养基(上层)。将所得物旋转平皿混合后，30℃培养4至5天，长出的克隆在再生培养基(下层)中分离、传代培养并纯化，由此获得了转化体(米曲霉PP2-1和米曲霉PP3-2)。

基于上述实施例11(6)中所述的方法，获得了其中引入了各个质粒DNA(pPP7和pPP9)的转化体(米曲霉PP7和米曲霉PP9).

使用下列组分制备上述TF溶液I(原生质体形成溶液)。

制备上述组分(pH5.5)后，过滤灭菌。

使用下列组分制备上述TF溶液II。

进一步加入水至总体积200ml。

制备上述组分后，高压灭菌。

使用下列组分制备上述TF溶液III。

进一步加入水至总体积10ml。

制备上述组分后，过滤灭菌。

使用下列组分制备上述再生培养基。

进一步加入水至总体积1L。

制备上述组分(pH5.5)后，高压灭菌。

另外，使用下列组分制备上述痕量元素溶液。

进一步加入水至总体积1L。

制备上述组分后，高压灭菌。

(7)P450-1的功能分析和添加培养试验

向含有1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)右旋糖)中加入1/100体积的啶南平E的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基A。从Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP2-1菌群收集分生孢子，并悬于无菌水中。将该分生孢子悬液调节为10⁴个孢子/mL。进一步地，将该调节的分生孢子悬液100μL添加至10mL培养基A，并在25℃振摇培养96小时。向该培养液加入10mL丙酮，并充分混合混合物。然后，用离心浓缩器去除丙酮。向其加入10mL乙酸乙酯并充分混合所得的混合物，然后仅回收乙酸乙酯层。将通过使用离心浓缩器去除乙酸乙酯获得的经干燥的产物溶解于1000μL甲醇。将其作为样本，并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))和LC-NMR(Avance500，Burker Daltonik制)进行分析。

由上述LC-MS测定的结果，证实了所获得的化合物是与啶南平E相比较而言分子量增加了16的单一化合物E。此外，由LC-NMR测定的结果，证实了该化合物E是啶南平E的11位羟化物。这证实了上述细胞色素P450单加氧酶(1)是以啶南平E作为底物，羟化啶南平E的11位的酶。

上述化合物E的物理化学特性如下所示：

1.质谱：ES-MS 468M/Z(M+H)⁺

2.分子式：C₂₇H₃₃NO₆

3.HPLC：柱：Waters XTerra Column C18(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，流动相：在10分钟从20％乙腈水溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速：0.8ml/分钟，检测：在UV 323nm的保留时间6.696分钟

4.¹H-NMR谱(CD₃CN，2H：3.134，3.157H-11)

啶南平E的¹H-NMR谱和上述4所述的¹H-NMR谱分别显示于图8和图9。

(8)P 450-2的功能分析和添加培养试验

向含有1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v右旋糖)中加入1/100体积的啶南平E的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基A；类似地，加入1/100体积的啶南平O的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基B。从Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP3-2菌群收集分生孢子，并悬于无菌水中。将该分生孢子悬液调节为10⁴个孢子/mL。进一步地，将该调节的分生孢子悬液500μL添加至50mL培养基A或培养基B，并在25℃振摇培养96小时。向该培养液加入50mL丙酮，并充分混合混合物。然后，用离心浓缩器去除丙酮。向其加入50mL乙酸乙酯并充分混合所得的混合物，然后仅回收乙酸乙酯层。将通过使用离心浓缩器去除乙酸乙酯获得的经干燥的产物溶解于1500μL甲醇。将其作为样本，并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))和LC-NMR(Burker Daltonik制，Avance500)进行分析。由上述LC-MS测定的结果，自培养基A得到的样本，检测到了与啶南平E相比较而言分子量增加了32的化合物F。此外，自培养基B得到的样本，检测到了与啶南平O相比较而言分子量增加了32的化合物G。进一步地，由LC-NMR测定的结果，证实了化合物G是啶南平O的7位和13位羟化物。这证实了上述细胞色素P450单加氧酶(2)对每一啶南平E或啶南平O的7位和13位具有羟化酶活性。

上述化合物F的物理化学特性如下所示：

1.质谱：ES-MS 484M/Z(M+H)⁺

2.分子式：C₂₇H₃₃NO₇

3.HPLC：柱：Waters XTerra Column C18(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，流动相：在10分钟从20％乙腈水溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速：0.8ml/分钟，检测：在UV 323nm的保留时间5.614分钟

上述化合物G的物理化学特性如下所示：

1.质谱：ES-MS 542M/Z(M+H)⁺

2.分子式：C₂₉H₃₅NO₉

3.HPLC：柱：Waters XTerra Column C18(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，流动相：在10分钟从20％乙腈水溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速：0.8ml/分钟，检测：在UV 323nm的保留时间5.165分钟

4.¹H-NMR谱(CD₃CN，1H 4.858H-13)，(CD₃CN，1H 3.65H-7)

啶南平O的¹H-NMR谱和上述化合物G的¹H-NMR谱分别显示于图10和图11。

(9)乙酰转移酶-1的功能分析和添加培养试验

向含有1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)右旋糖)中加入1/100体积的去乙酰基啶南平E(参见参比实施例3)的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基D；加入1/100体积的11-去乙酰基啶南平O(参见参比实施例4)的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基E，和7-去乙酰基啶南平A(参见参比实施例5)的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基F。从Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP7菌群收集分生孢子，并悬于无菌水中。将该分生孢子悬液调节为10⁴个孢子/mL。进一步地，将该调节的分生孢子悬液200μL添加至20mL培养基 D、培养基E或培养基F，并在25℃振摇培养96小时。向该培养液加入20mL丙酮，并充分混合混合物。然后，用离心浓缩器去除丙酮。向其加入20mL乙酸乙酯并充分混合所得的混合物，然后仅回收乙酸乙酯层。将通过使用离心浓缩器去除乙酸乙酯获得的经干燥的产物溶解于1000μL甲醇。将其作为样本，并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))进行分析。

由上述LC-MS测定的结果，自培养基D检测到单一化合物，其与去乙酰基啶南平E相比分子量增加了42。证实了该化合物具有与啶南平E相同的保留时间、分子离子峰和UV吸收(参见参比实施例6)。同时，从培养基E和培养基F没有检测到新生成的化合物。据此，证实了乙酰基转移酶-1具有特异性乙酰化去乙酰啶南平E的1位的乙酰基转移酶活性。

(10)乙酰转移酶-2的功能分析和添加培养试验

向含有1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)右旋糖)中加入1/100体积的去乙酰基啶南平E(参见参比实施例3)的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基D；加入1/100体积的11-去乙酰基啶南平O(参见参比实施例4)的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基E，和7-去乙酰基啶南平A(参见参比实施例5)的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基F。从Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP9菌群收集分生孢子，并悬于无菌水中。将该分生孢子悬液调节为10⁴个孢子/mL。进一步地，将该调节的分生孢子悬液200μL添加至20mL培养基D、培养基E或培养基F，并在25℃振摇培养96小时。向该培养液加入20mL丙酮，并充分混合混合物。然后，用离心浓缩器去除丙酮。向其加入20mL乙酸乙酯并充分混合所得的混合物，然后仅回收乙酸乙酯层。将通过使用离心浓缩器去除乙酸乙酯获得的经干燥的产物溶解于1000μL甲醇。将其作为样本，并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))进行分析。

由上述LC-MS测定的结果，自培养基E检测到单一化合物，其与11-去乙酰基啶南平O相比分子量增加了42。证实了该化合物具有与啶南平O 相同的保留时间、分子离子峰和UV吸收(参见参比实施例7)。此外，从培养基F检测到单一化合物，其与7-去乙酰基啶南平A相比分子量增加了42。证实了该化合物具有与啶南平A相同的保留时间、分子离子峰和UV吸收(参见参比实施例8)。同时，从培养基D没有检测到新生成的化合物。据此，证实了乙酰基转移酶-2具有特异性乙酰化11-去乙酰啶南平O的1位和7-去乙酰基啶南平A的7-位的乙酰基转移酶活性。

实施例12：化合物D(1，11-二去乙酰啶南平O)的合成和结构分析

将啶南平O(30mg)溶解于甲醇-水(19∶1，2mL)中，并向其加入碳酸钾(20mg)。室温搅拌产物22.5小时，之后加入乙酸(0.1mL)以浓缩。加入乙酸乙酯和水，然后用乙酸乙酯进行萃取。用饱和的氯化钠溶液洗涤乙酸乙酯层，并用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发溶剂，从而获得1，11-二去乙酰啶南平O的粗产物。通过制备型薄层层析(Merck硅胶60F254，0.5mm，己烷∶丙酮＝1∶1)纯化粗产物，从而获得1，11-二去乙酰啶南平O(23mg)。

ESI-MS；426m/z(M+H)⁺；¹H-NMR(CDCl₃)δ0.89(3H，s)、0.97(3H，s)、1.14(1H，dt，J＝4.2，12.8Hz)、1.20-1.25(1H，m)、1.28(3H，s)、1.45-1.59(3H，m)、1.64-1.75(3H，m)、1.82(1H，dt，J＝3.5，9.6Hz)、2.11-2.14(1H，m)、2.25(1H，dd，J＝12.8，17.1Hz)、2.54(1H，dd，J＝4.6，17.1Hz)、3.45(1H，d，J＝10.3Hz)、3.68(1H，dd，J＝5.0，11.2Hz)、3.75(1H，d，J＝10.3Hz)、6.42(1H，s)、7.39(1H，dd，J＝4.8，8.0Hz)、8.10(1H，ddd，J＝1.6，2.0，8.0Hz)、8.65(1H，dd，J＝1.6，4.8Hz)、8.99(1H，d，J＝2.0Hz)。

实施例13：化合物B1(1，11-二-O-环丙烷羰基-1，11-二去乙酰啶南平O)的合成和结构分析

将1，11-二去乙酰啶南平O(22mg)悬浮在乙酸乙酯(1mL)中，并向其加入吡啶(20mg)和环丙烷甲酰氯(22mg)。室温搅拌产物4小时，并加入水，并然后用乙酸乙酯实施萃取。用饱和的氯化钠溶液洗涤乙酸乙酯层，并用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发溶剂，从而获得1，11-二-O-环丙烷羰基-1，11-二去乙酰啶南平O的粗产物。通过制备型薄层层析(Merck硅胶60F254，0.5mm，氯仿∶甲醇＝10∶1)纯化粗产物，从而获得1，11-二-O-环丙烷羰基-1，11-二去乙酰啶南平O(17mg)。

ESI-MS；562m/z(M+H)⁺；¹H-NMR(CDCl₃)δ0.88(3H，s)、0.99(3H，s)、0.84-1.08(8H，m)、1.21(1H，dt，J＝3.6，13.4Hz)、1.28(3H，s)、1.43-1.48(2H，m)、1.56-1.73(6H，m)、1.81-1.85(2H，m)、2.13-2.16(1H，m)、2.26(1H，dd，J＝12.8，17.1Hz)、2.55(1H，dd，J＝4.6，17.1Hz)、3.71(1H，d，J＝11.7Hz)、3.93(1H，d，J＝11.7Hz)、4.82(1H，dd，J＝4.7，12.0Hz)、6.44(1H，s)、7.41(1H，dd，J＝4.8，8.0Hz)、8.12(1H，ddd，J＝1.4，2.0，8.0Hz)、8.66(1H，dd，J＝1.4，4.8Hz)、9.00(1H，d，J＝2.0Hz)。

实施例14：1，11-二-O-环丙烷羰基-1，7，11-三-去乙酰啶南平A的合成

从培养于Czapek Dox琼脂培养基的米曲霉PP3-2(FERM BP-11141)的菌群中，收集其分生袍子并悬浮在无菌水中，以获得10⁴个孢子/mL的分生孢子悬液。向20mL含1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、2％(w/v)右旋糖)中加入200μL分生孢子悬液和200μL实施例13中获得的1，11-二-O-环丙烷羰基-1，11-二去乙酰啶南平O的2mg/mL二甲亚砜溶液，将所得混合物在25℃振荡培养96小时。向该培养液中加入20mL丙酮，充分混合该混合物。之后，使用离心浓缩机去除丙酮。向其加入20mL乙酸乙酯，并充分混合所得混合物，然后回收乙酸乙酯层。使用离心浓缩器去除乙酸乙酯，从而获得产物。通过在以下条件下分析，证实产物为WO2006/129714中所述的标题化合物(转化率90％)。

LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695分离模块，柱子：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))，流动相：在10分钟从20％乙腈水溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速：0.8ml/分钟，柱加热炉：40℃，检测：UV 330nm。

参考实施例1：11-去乙酰啶南平O的合成和结构分析

将啶南平O(30mg)溶解于甲醇-水(19∶1，2mL)中，向其加入碳酸钾(20mg)。搅拌产物22小时，之后加入乙酸(0.1mL)，在减压下蒸发溶剂。加入乙酸乙酯和水，然后用乙酸乙酯进行萃取。用饱和的氯化钠溶液洗涤乙酸乙酯层，并用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发溶剂，从而获得1，11-二去乙酰啶南平O的粗产物(30mg)。将1，11-去乙酰啶南平O的粗产物(23mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中，向其加入三乙胺(8mg)和乙酸酐(7mg)。在室温搅拌所得混合物23小时后，加入水，然后用乙酸乙酯进行萃取。用饱和的氯化钠溶液洗涤乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发溶剂，从而获得1-去乙酰啶南平O的粗产物(28mg)。将1-去乙酰啶南平O的粗产物(28mg)溶解于甲苯中，加入1，8-二氮杂双环[5，4，0]-7-十一碳烯(20mg)。在70℃搅拌混合物20小时，允许冷却。加入乙酸乙酯和水，然后用乙酸乙酯进行萃取。用饱和氯化钠溶液洗涤乙酸乙酯层，用无水硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，从而获得11-去乙酰啶南平O的粗产物(20mg)。

溶解于甲醇后，将其用作为样品，重复HPLC(由SHIMADZU生产，LC-6AD，SPD-M20A PDA，CBM-20A，柱：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm，流动相：25分钟内30％乙腈水溶液至55％乙腈水溶液(线性梯度)，流速：1.0ml/分钟，停留时间18至19分钟)，以进行制备型分离，从而获得11-去乙酰啶南平O(4.0mg)。

ESI-MS；m/z 468(M+H)⁺¹；H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)；0.68(3H，s)、0.95(3H，s)、1.21-2.21(10H，m)、1.25(3H，s)、2.05(3H，s)、2.20(1H，dd，J＝4.63，17.3Hz)、2.50(1H，dd，J＝4.63，17.3Hz)、2.94(1H，d，J＝12.5Hz)、3.33(1H，d，J＝12.5Hz)、4.87(1H，dd，J＝4.6，12.2Hz)、6.48(1H，s)、7.57(1H，dd，J＝5.1，8.1Hz)、8.29(1H，d，J＝8.3Hz)、8.68(1H，d，J＝4.6Hz)、9.04(1H，s)。

参考实施例2：去乙酰啶南平E的合成和结构分析

将啶南平E(29mg)(由日本特开239385/1996中所述方法获得的啶南平E)溶解于乙醇-水(19∶1，1mL)，向其加入碳酸钾(53mg)。搅拌产物44小时。之后，在减压下蒸发溶剂，并加入氯仿-甲醇(10∶1)的混合溶剂。通过过滤除去不溶性物质，在减压下蒸发溶剂，从而获得粗产物。通过制备型薄层层析(Merck硅胶60F254，0.5mm，氯仿∶甲醇＝10∶1)纯化粗产物，从而获得去乙酰啶南平E(18mg)。

ESI-MS；m/z 410(M+H)⁺¹；H-NMR(CDCL₃)δ(ppm)0.82(3H，s)、0.92(3H，s)、1.00-1.03(1H，m)、1.04(3H，s)、1.12(1H，dt，J＝4.0，13.2Hz)、1.27(3H，s)、1.41-1.53(2H，m)、1.59-1.75(3H，m)、1.80-1.84(2H，m)、2.15(1H，dt，J＝3.2，12.4Hz)、2.18-2.29(1H，m)、2.54(1H，dd，J＝3.2，17.6Hz)、3.25(1H，dd，J＝4.4，11.2Hz)、6.43(1H，s)、7.39(1H，dd，J＝4.8，8.0Hz)、8.11(1H，d，J＝8.0Hz)、8.65(1H，d，J＝4.8Hz)、8.99(1H，d，J＝1.6Hz)。

参考实施例3：7-去乙酰啶南平A的合成

通过日本特开259569/1996中所述方法合成7-去乙酰啶南平A。

参考实施例4：啶南平E的获得

通过日本特开239385/1996中所述方法获得啶南平E。

参考实施例5：啶南平O的获得

通过J.Antibiot.1996，49，292中所述方法获得啶南平O。

参考实施例6：啶南平A的合成

通过WO94/09147中所述方法获得啶南平A。

[检索号]

FERM BP-11133

FERM BP-11137

FERM BP-11141

FERM BP-11219

FERM BP-11220 。

PCT/RO/134表

PCT 打印出来的(原为电子形式)

PCT 打印出来的(原为电子形式)

仅用于接受机构

仅用于国际局

Claims

1.用于生产由下式A所表示的化合物的方法：

[化学式1]

[其中R表示线性、分支或者环状C_2-6烷基羰基(当该基团的烷基部分是分支或者环状时R为C_3-6烷基羰基)]，

所述方法包括以下步骤：用由下式B所表示的化合物培养其中引入了至少一种下文(I)至(III)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物：

[化学式2]

[其中R表示与上文相同的含义]，

并且分离由式A所表示的化合物：

(a)SEQ ID NO：266的核苷酸序列，

(II)分离的多核苷酸，具有编码至少一种选自SEQ ID NO：269和270的氨基酸序列或者与其基本上等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(III)分离的多核苷酸，具有至少一种选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(1)以下(a)和(b)的核苷酸序列：

2.根据权利要求1的生产方法，其中根据权利要求1的由式B所表示的化合物是下式B1所表示的化合物：

[化学式3]

3.根据权利要求1的生产方法，包括以下步骤：用根据权利要求1的式B所表示的化合物培养包含质粒pCC1-PP1、质粒pPP2或质粒pPP3或者选自这些质粒的一个或多个载体的微生物，并分离根据权利要求1的式A所表示的化合物。

4.根据权利要求1或2的生产方法，其包括以下步骤：用根据权利要求1的式B所表示的化合物培养其中引入了至少一种下文(IV)至(V)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离根据权利要求1的式A所表示的化合物：

(IV)分离的多核苷酸，具有编码SEQ ID NO：270的氨基酸序列或者与其基本上等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(V)分离的多核苷酸，具有至少一种选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(1)以下(a)的核苷酸序列，

(a)SEQ ID NO：266中所示的核苷酸序列的16220至18018的核苷酸序列，

5.根据权利要求1-4中任一项的生产方法，进一步包括以下步骤：使用酰化剂酰化由下式D所表示的化合物的1和11位的羟基：

[化学式4]

并分离根据权利要求1的式B所表示的化合物。

6.根据权利要求5的生产方法，进一步包括以下步骤：水解下式C所表示的化合物的1位的乙酰基和当R′为乙酰基时11位的乙酰基：

[化学式5]

[其中R′表示乙酰基或氢原子]

并分离根据权利要求5的式D所表示的化合物。

7.根据权利要求6的生产方法，进一步包括以下步骤：用啶南平E培养其中引入了至少一种下文(VI)至(ⅥI)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离根据权利要求6的式C所表示的化合物：

(VI)分离的多核苷酸，具有编码至少一种选自SEQ ID NO：269和275的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(VII)分离的多核苷酸，具有至少一种选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(1)以下(a)和(b)的核苷酸序列：

8.根据权利要求7的生产方法，包括以下步骤：用啶南平E培养包含质粒pPP2或质粒pPP9的微生物，并分离根据权利要求6的式C所表示的化合物。

9.根据权利要求6的生产方法，进一步包括以下步骤：用去乙酰啶南平E培养其中引入了至少一种下文(VIII)至(IX)的多核苷酸或者包含该至少一种多核苷酸的重组载体的微生物，并分离根据权利要求6的式C所表示的化合物：

(VIII)分离的多核苷酸，具有编码至少一种选自SEQ ID NO：269、274和275的氨基酸序列或者与其基本上等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(IX)分离的多核苷酸，具有至少一种选自以下(1)至(4)的核苷酸序列的核苷酸序列：

(1)以下(a)、(b)和(c)的核苷酸序列：

10.根据权利要求9的生产方法，包括以下步骤：用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP2或质粒pPP9且还包含质粒pPP7的微生物，并分离根据权利要求6的式C所表示的化合物。

11.质粒pCC1-PP1、质粒pPP2、质粒pPP3、质粒pPP7或质粒pPP9、或者一个或多个选自这些质粒的载体的用途，用于生产由式A所表示的化合物。

12.包含质粒pCC1-PP1、质粒pPP2、质粒pPP3、质粒pPP7或质粒pPP9、或一个或多个选自这些质粒的载体的转化体的用途，用于生产由式A所表示的化合物。

13.根据权利要求2的式B1所表示的化合物。

14.根据权利要求5的式D所表示的化合物。