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CN102781587A - 粘压测定 - Google Patents

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CN102781587A
CN102781587A CN2011800120370A CN201180012037A CN102781587A CN 102781587 A CN102781587 A CN 102781587A CN 2011800120370 A CN2011800120370 A CN 2011800120370A CN 201180012037 A CN201180012037 A CN 201180012037A CN 102781587 A CN102781587 A CN 102781587A
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CN
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fluid
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pressure
sample
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CN2011800120370A
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G.J.埃布尔
D.彼得森
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
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Abstract

本发明涉及测定流体中的酶活性的方法，其中随着时间过去的所述活性提供流体中的粘度变化，通过使用配备至少一个压力传感器(图1(4))的装置(图1)，以测定随着时间过去在流体粘度中的变化作为酶活性的量度。

Description

粘压测定
发明领域
本发明涉及测定通过使用吸液系统(图1)测量的流体中的酶活性的方法，其中随着时间过去的所述酶活性提供流体中的粘度变化，所述吸液系统配备至少一个压力传感器(图1(4))，以测定在抽吸和分配过程中吸液系统的顶部空间中的压力变化。
线内和实时的酶活性测定在许多工业工艺中是高度有利的，在其中需要测定以选择正确的酶用于应用。对于极小体积(甚至以SBS微板规模)也工作良好的实时粘度测定的应用实际上是无尽的，它们包括测定动物饲料酶、用于烘焙目的的酶、洗涤酶、餐具洗涤酶、高通量机器人筛选等。
发明背景
粘度是对由剪切应力或伸展应力造成变形的流体的阻力的量度。在日常用语中(且仅对于流体)，粘度是“稠度”。因此，水是“稀薄的”，具有更低的粘度，而蜂蜜是“浓稠的”，具有更高的粘度。粘度的精确测量在许多工业工艺中是重要的，但线内或接近于实时进行是繁重且困难的。
测量液体粘度的装置称为粘度计。通常，粘度计仅在一种流动条件下测量。一般而言，流体保持静止而物体移动通过它，或物体是静止的而流体移动经过它。通过流体和表面的相对运动引起的阻力(drag)是粘度的量度。流动条件必须具有足够小的雷诺数值，以存在层流。已设计了许多类型的粘度计，例如U形管粘度计、落球或落塞(falling piston)粘度计、振动或旋转粘度计等。用于测量运动粘度的最常见仪器之一是玻璃毛细管粘度计。
在许多情况下，我们关注粘性力与惯性力的比例，后者特征在于流体密度ρ。这个比例的特征在于定义为下述的运动粘度(希腊字母nu，v)：
v = μ ρ ,
ν的SI单位是m2/s。关于运动粘度的cgs物理单位是沲(St)，以GeorgeGabriel Stokes命名。它有时以厘沲(cSt或ctsk)的方式表示。在美国惯用法中，沲有时用作单数形式。
1St=1cm2·s-1=10-4m2·s-1。
1cSt=1mm2·s-1=10-6m2·s-1。
在20℃的水具有约1cSt的运动粘度。
自动化吸液系统可从许多商业供应商获得，并且此类系统是本领域众所周知的，包括压力传感器的添加，以监控吸液过程(WO 9308475；Abbott Lab.EP 0705424；Boehringer Mannhei.EP 0990909；Hoffmann-La Roche.EP1745851；Tecan Trading AG.WO 2009104065；Gilson SAS)。
在自动化吸液过程期间的压力监测在许多吸液应用中为了不同目的而进行，例如以放弃不规则的吸液过程(WO 2002073215；Hamilton BonaduzAG)，或提供吸液过程的完全自动控制(EP 1614468；Hamilton BonaduzAG)。
近来已陈述(EP 2009449；Hamilton Bonaduz AG)液体的表面张力和粘度越大，当液体开始流入吸头时在吸头内的压力越低，并且当活塞移动而仍未发生液体的任何流动时，压力的时间特性的斜率的绝对值越大。作为进一步的一般规律，据陈述，液体的粘度越大，当活塞的运动已停止，但液体的流动仍继续时，压力的时间特性的斜率一般越小。然而，得出结论所有这些一般规律具有更定性的性质，并且因此，尽管它们看起来相当符合直觉的，但是当具有不同物理特征的液体待使用吸液装置投入时，难以定量估计用于计算待应用的工艺变量中的差异。
在工业酶应用的领域中，始终存在对于这样的筛选测定的需要，即所述筛选测定适合于所谓的高通量筛选设置中的大规模自动化，尤其是粘度的测量已成为挑战。
发明概述
本发明提供了通过在自动化吸液系统中使用压力测量，例如Hamilton
Figure BDA00002091204000021
ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics Inc./HamiltonBonaduz AG)，用于对流体中酶活性的容易和无标记的间接测定。
在吸管的排气筒(displacement barrel)内的压力变换器或传感器测量在抽吸和/或分配过程中在筒内的压力。取决于流体的粘度，随着吸头接近液体表面，接触表面并向下移动，以及在吸液过程中，来自这个传感器的数据改变。
本发明人已证实此类数据不仅可以用于实时控制吸液，如商购可得的自动化吸液系统中常规地完成的，还可以用于测定随着时间过去起因于酶活性的流体或液化底物的粘度中的变化。将压力数据与合适的液体粘度标准相比较，以测定随着时间过去粘度中的变化，从而提供酶活性的间接测定。此类粘压测定或“ViPr测定”提供几个好处：
·可以快速测量许多样品的酶活性–在下文证实的实验设置中在5分钟内高达96个样品。
·酶活性是无标记和无破坏性测定的。
·酶活性可以实时监控，从而提供极佳的工艺控制。
·在粘度中相差少至2cSt的样品可以得到显著区分。
设想了ViPr测定的许多应用，例如在动物营养的研究中，在其中它允许研究非淀粉多糖降解酶，或在生物质降解的研究中，例如用于生物乙醇或生物气生产，在食物研究包括生面团和酸奶酪(youghurt)中，或在生物聚合物例如透明质酸的生产中。
ViPr测定允许快速和有效筛选现有酶活性的改善，以及当寻找用目前技术难以测定的新活性时，在早期开发期中对于真实世界底物的有关筛选的应用。
通过使所获得的值与水或另一种已知的粘度标准关联，相对粘度值可以衍生自在分配或抽吸液体过程中测量的压力值。可以分析粘度中显示大差异的溶液的相对粘度，并且所测量值与通过常规粘度计获得的数据关联。甚至饼状生面团的粘度也已在初步测试(未显示)中成功测量。
一般地，第一次测量会在酶加入流体前取得，以建立基线，并且随后在时间点0加入酶后随着时间过去取得一次或多次另外的测量。然而，还可以首先加入酶且随后随着时间过去后来取得测量。
粘度的终末点和动态分析两者开启了以之前不可能的速率或处理量筛选酶活性的新方法。
相应地，在第一个方面，本发明涉及测定流体中的酶活性的方法，所述流体包含所述酶活性的至少一种底物，其中随着时间过去对底物的活性提供流体中的粘度变化，所述方法包括：
(a)使用配备至少一个压力传感器(图1(4))的装置(图1)，经过合适的时间间隔自所述流体抽吸和/或分配至少两个样品，所述压力传感器能够测量在样品的抽吸和/或分配之前、过程中和之后在顶部空间(图1(3))中变化的压力(图2)，其中在至少第一个样品被抽吸和/或分配之前或之后，使所述流体与至少一种酶接触；
(b)使(a)中所获得的压力数据与在可比较条件下抽吸和/或分配的一种或多种已知粘度标准的压力数据关联，从而测定样品的粘度；和
(c)基于在所述样品之间在所述时间间隔中流体粘度中的变化，计算所述流体中的酶活性。
在另一个方面，本发明涉及测定流体中的酶活性的方法，所述流体包含所述酶活性的至少一种底物，其中随着时间过去对底物的活性提供流体中的粘度变化，所述方法包括：
(a)使所述流体与至少一种酶接触；
(b)使用配备至少一个压力传感器(图1(4))的自动化吸液系统(图1)，经过合适的时间间隔自流体抽吸和/或分配至少两个样品，所述压力传感器能够测量在样品的抽吸和/或分配之前、过程中和之后在顶部空间(图1(3))中变化的压力(图2)；
(c)使(b)中所获得的压力数据与在可比较条件下抽吸和/或分配的一种或多种已知粘度标准的压力数据关联，从而测定样品的粘度；和
(d)基于在所述样品之间在所述时间间隔中流体粘度中的变化，计算所述流体中的酶活性。
附图简述
图1在示意性概述中显示了适合于本发明的方法的自动化吸管可以如何构建的例子；构建自动化吸管的其他方法是本领域众所周知的。
图2显示了使用如图1中所述的自动化吸管，将会因有过失的基于空气的吸液动作导致的某些理论示意性一般压力曲线；该仪器能够实时检测在抽吸和分配步骤过程中的凝块或空孔。
图3显示了关于6个甘油标准的抽吸的压力曲线，其中浓度如以8个独立通道/浓度完成的从0到60%(v/v)所示。在自起始水平的陡峭的非线性增加后，压力在平滑地回到大气压水平前线性改变。
图4显示了关于分配相同6个甘油标准的压力曲线，其中浓度如以8个独立通道/浓度完成的从0到60%(v/v)所示。在自起始水平的陡峭的非线性减少后，压力在突然地回到大气压水平前线性改变。
图5显示了来自实施例1的结果，其中通过ViPr测定(抽吸步骤)测量的标准甘油溶液的平均粘度与来自参考文献在30℃的相应动力粘度相比较。
图6显示了来自实施例1的结果，其中通过ViPr测定(分配步骤)测量的标准甘油溶液的平均粘度与来自参考文献在30℃的相应动力粘度相比较。
图7显示了来自实施例2的结果，其中高范围粘度标准的粘度(cSt)针对如在ViPr测定中测量的相对粘度进行标绘。
图8显示了来自实施例2的结果，其中低范围粘度标准的粘度[cSt]针对如在ViPr测定中测量的相对粘度进行标绘。
图9显示了来自实施例3的结果，其中随着时间过去通过ViPr测定测量从黑麦中提取的非淀粉多糖(NSP)通过木聚糖酶(
Figure BDA00002091204000051
Wheat，NovozymesA/S，5FXU/g)的水解。
图10和11显示了来自实施例4的结果，其中随着时间过去通过ViPr测定测量通过商购可得的纤维素酶复合物的生物质水解。
图12显示了来自实施例5的结果，其中随着时间过去通过ViPr测定测量通过商购可得的果胶酶的多聚半乳糖醛酸(PGU)水解。
图13显示了来自实施例6的结果，其中随着时间过去通过ViPr测定测量通过四种不同的木聚糖酶的黑麦阿拉伯木聚糖(黑麦粉；Megazymes)的水解。
定义
粘度
在本文背景中，经过合适的时间间隔抽吸和/或分配流体的至少两个样品之前、过程中和/或之后，通过在吸液装置(图6、7和8)的顶部空间中的压力测量来测定流体的粘度。第一个样品建立初始点，并且第二个样品显示随着压力中的变化在粘度中的(任何)变化。压力测量随后与在相同或可比较条件下测量的一种或多种已知粘度标准的那些关联，以测定流体样品的粘度。在至少两个样品之间在时间间隔过程中流体粘度中的变化是对流体中的各自底物的酶活性的测量。
木聚糖裂解活性，FXU
木聚糖裂解活性可以以FXU单位表示，所述FXU单位在pH 6.0用remazol-木聚糖(用Remazol Brilliant Blue R，Fluka染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸(glucurono)-D-木聚糖)作为底物测定。
将木聚糖酶样品与remazol-木聚糖底物温育。通过乙醇沉淀未降解的经染色的底物的本底。上清液中剩余的蓝色(如通过分光光度计测量在585nm处测定的)与木聚糖酶活性成比例，并且随后在标准反应条件下相对于酶标准测定木聚糖酶单位，即在50.0℃、pH 6.0和30分钟反应时间内，底物浓度0.45%w/v、酶浓度0.04–0.14FXU(S)/mL。以FXU(S)的木聚糖酶活性相对于Novozymes FXU(S)酶标准进行测量，所述酶标准包含来自刺孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的单组分木聚糖酶制备物Shearzyme。
纤维素
纤维素是通过β-1,4-键共价键合的单糖葡萄糖的聚合物。许多微生物产生水解β连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其对通过纤维二糖水解酶的攻击开放。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺次释放纤维二糖分子。纤维二糖是水溶性β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。WO 2005/074647公开了来自土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO2005/074656公开了来自嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。美国公开申请序列号2007/0077630公开了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。
内切葡聚糖酶
术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.编号3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷键，在混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维质组分的其他植物材料中的β-1,4键的内水解。为了本发明的目的，根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59:257-268的程序，使用羧甲基纤维素(CMC)水解测定内切葡聚糖酶活性。
纤维二糖水解酶
术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖或含有任何β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-葡糖苷键水解，从链的还原或非还原端释放纤维二糖。为了本发明的目的，根据由Lever等人，1972，Anal.Biochem.47:273-279和由van Tilbeurgh等人，1982，FEBS Letters 149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187:283-288描述的程序，测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，采用Lever等人的方法，以评估玉米秸秆中的纤维素水解，而van Tilbeurgh等人的方法用于测定对荧光二糖衍生物的纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶
术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，伴随β-D-葡萄糖的释放。为了本发明的目的，根据由Venturi等人，2002，J.Basic Microbiol.42:55-66描述的基本程序，测定β-葡糖苷酶活性，除了采用如本文描述的不同条件外。β-葡糖苷酶活性的一个单位定义为在50℃、pH 5自在100mM柠檬酸钠、0.01%
Figure BDA00002091204000071
20中从作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷每分钟产生1.0μmole对硝基苯酚。
糖苷水解酶
术语“家族1、家族3、家族5、家族6、家族7、家族9、家族12、家族45、家族61或家族74糖苷水解酶”、或“家族GH1、家族GH3、家族GH5、家族GH6、家族GH7、家族GH9、家族GH12、家族GH45、家族GH61或家族GH74”在本文中定义为根据Henrissat B.，1991，A classification ofglycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280:309-316，以及Henrissat B.和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316:695-696，分别属于糖苷水解酶家族1、家族3、家族5、家族6、家族7、家族9、家族12、家族45、家族61或家族74的多肽。目前，Henrissat将GH61家族列出为非分类的，表明例如机制、催化亲核基团/碱基、催化质子供体和3-D结构等性质对于属于这个家族的多肽是未知的。
含纤维素材料
在生物质的初生细胞壁中占优势的多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，并且第三是果胶。在细胞已停止生长后产生的次生细胞壁还含有多糖，并且是通过共价交联至半纤维素的聚合木质素强化的。纤维素是无水纤维二糖的同聚物和因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括在具有一系列取代物的复杂分支结构中的多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。尽管一般是多形的，但纤维素在植物组织中主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶状基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素，以及其他半纤维素，这帮助稳定细胞壁基质。
含纤维素材料可以是含纤维素的任何材料。纤维素一般例如在植物的茎、叶、皮、壳(hull，husk)和穗轴或树的叶、枝和木材中发现。含纤维素材料可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废物、废纸以及浆和造纸厂残余物。含纤维素材料可以是任何类型的生物质，包括但不限于木材资源、市政固体废物、废纸、作物和作物残余物(参见例如，Wiselogel等人，1995，于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman，编辑)，第105-118页，Taylor & Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，BioresourceTechnology 50:3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25:695-719；Mosier等人，1999，Recent Progress in Bioconversion ofLignocellulosics，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，T.Scheper，主编，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag，New York)。在本文中应当理解含纤维素材料优选是以木素纤维素的形式，例如在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。
在优选方面，含纤维素材料是玉米秸秆。在另一个优选方面，含纤维素材料是玉米纤维。在另一个优选方面，含纤维素材料是玉米穗轴。在另一个优选方面，含纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个优选方面，含纤维素材料是稻草。在另一个优选方面，含纤维素材料是纸和浆加工废物。在另一个优选方面，含纤维素材料是木本或草本植物。在另一个优选方面，含纤维素材料是甘蔗渣。
含纤维素材料可以直接使用(use as is)，或可以使用本领域已知的常规方法实施预处理。例如，物理预处理技术可以包括多个类型的研磨、照射、汽蒸/蒸汽爆炸和水热处理；化学预处理技术可以包括稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳和pH受控的水热解；并且生物学预处理可以涉及应用木质素溶解性微生物(参见例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass，于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization，Wyman，C.E.，编辑，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P和Singh，A.，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion oflignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass:a review，于Enzymatic Conversion ofBiomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.，编辑，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanolproduction from renewable resources，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper，T.，编辑，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，Germany，65:207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Productionof ethanol from lignocellulosic materials:State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
预处理的玉米秸秆
术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”在本文中定义为通过用热和稀酸处理衍生自玉米秸秆的含纤维素材料。
发明详述
以其最一般形式，本发明涉及测定流体中的酶活性的方法，所述流体包含所述酶活性的至少一种底物，其中随着时间过去对底物的活性提供流体中的粘度变化，所述方法包括：
(a)使用配备至少一个压力传感器(图1(4))的装置(图1)，经过合适的时间间隔自所述流体抽吸和/或分配至少两个样品，所述压力传感器能够测量在样品的抽吸和/或分配之前、过程中和之后在顶部空间(图1(3))中变化的压力(图2)，其中在至少第一个样品被抽吸和/或分配之前或之后，使所述流体与至少一种酶接触；
(b)使(a)中所获得的压力数据与在可比较条件下抽吸和/或分配的一种或多种已知粘度标准的压力数据关联，从而测定样品的粘度；和
(c)基于在所述样品之间在所述时间间隔中流体粘度中的变化，计算所述流体中的酶活性。
本发明的另一个方面涉及测定流体中的酶活性的方法，所述流体包含所述酶活性的至少一种底物，其中随着时间过去对底物的活性提供流体中的粘度变化，所述方法包括：
(a)使所述流体与至少一种酶接触；
(b)使用配备至少一个压力传感器(图1(4))的自动化吸液系统(图1)，经过合适的时间间隔自流体抽吸和/或分配至少两个样品，所述压力传感器能够测量在样品的抽吸和/或分配之前、过程中和之后在顶部空间(图1(3))中变化的压力(图2)；
(c)使(b)中所获得的压力数据与在可比较条件下抽吸和/或分配的一种或多种已知粘度标准的压力数据关联，从而测定样品的粘度；和
(d)基于在所述样品之间在所述时间间隔中流体粘度中的变化，计算所述流体中的酶活性。
非牛顿流体是其流动性质无法通过单一恒定粘度值描述的流体。许多聚合物溶液和熔化聚合物是非牛顿流体，如许多常见的物质例如番茄酱、淀粉悬液、涂料、血液和洗发水一样。在牛顿流体中，在剪应力和应变率之间的关系是线性的(并且如果要标绘这个关系，那么它将经过原点)，比例常数是粘度系数。在非牛顿流体中，在剪应力和应变率之间的关系是非线性的，并且甚至可以是时间依赖性的。
存在具有线性剪应力/剪应变关系的流体，在它们开始流动前，其要求有限的屈服应力。即剪应力、剪应变曲线不经过原点。这些流体称为Bingham塑料。几个例子是粘土悬液、钻探泥浆、牙膏、蛋黄酱、巧克力和芥末。典型情况是番茄酱，其不从瓶中出来，除非你通过摇动逼迫它。
在优选实施方案中，流体是浆料或非牛顿液体。在另一个优选实施方案中，流体是Bingham塑料。
可以在流体中存在、加入流体中或液化的任何酶底物在本发明的方法中可以是合适的，详尽列表事实上将是无尽的。优选地，底物包含蛋白质、脂质、纤维素、半纤维素、木质素、淀粉或非淀粉多糖。
本发明的方法可以用于测定单一酶、几种酶或甚至酶复合物的活性。在优选实施方案中，使流体与两种或更多种酶接触。
由于流体中酶的活性，在本发明的自动化吸液系统中测定的粘度值随着时间过去改变，并且它们可以增加或减少。在优选实施方案中，至少一种酶能够随着时间过去降低或增加流体的粘度。
设想能够在包含其活性的底物的流体中产生粘度变化的任何酶活性可以通过本发明的第一个方面的方法进行测定。优选地，在第一个方面的方法中，至少一种酶包含氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶；优选地，至少一种酶包含氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另一种脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
本发明进一步通过下述实施例描述，所述实施例不应解释为限制本发明的范围。
用于本发明的方法的装置优选是吸管，且更优选地，该装置是自动化吸管或吸液系统，例如Hamilton
Figure BDA00002091204000111
ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics Inc./Hamilton Bonaduz AG)。
实施例
在本文中描述且请求保护的本发明在范围中并不受本文公开的具体方面限制，因为这些方面预期作为本发明的几个方面的举例说明。任何等价方面预期在本发明的范围内。实际上，根据前述说明书，本发明的多种修饰加上本文显示且描述的那些对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修饰还预期属于附加权利要求的范围。在冲突的情况下，以本公开内容包括定义为准。
用作缓冲液和底物的化学制品是至少试剂级别的商业产品。
设备
在每个吸管的排气筒内配备压力传感器的自动化微量滴定板吸液站用于下述实验中；
Figure BDA00002091204000121
ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics)。
Figure BDA00002091204000122
ELISA STARlet液体处理器具有8个吸液通道：每个通道可以抽吸高达1ml的体积，并且通道基于排气技术构建，这类似于手持式电子吸管。为了在不同体积范围内抽吸，通道可以容纳体积从10、50、300到1000μl的一系列吸头(tips)。
液体处理器具有位于每个吸液通道的顶部空间中的压力传感器(参见图1)。来自每个传感器的压力数据通过在计算机上运行的合适软件收集，例如通过
Figure BDA00002091204000123
ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics)的“吸放液全程监控(Total Aspiration Dispense Monitoring)”(TADM)软件收集。
在抽吸过程中，活塞向上移动，并且生成与大气压相比较的负压(underpressure)。在液体上的顶部空间中的压力通过压力传感器不断测量。在分配过程中，活塞向下移动，并且生成同样测量的超压。测量的压力值受可以固定在通道上的不同吸头影响，因为它们具有不同开口大小。此外，吸头表面的液体同样是改变的且将影响该值。通过改变分配和抽吸速度例如从0.5μl到500μl/秒，测量的压力的量级将相应地改变。每10毫秒以Pa收集数据点且贮存于数据文件中。
通过监控基于空气的吸液动作，该仪器实时检测在抽吸和分配步骤过程中的凝块或空孔(参见图2)。
在下述实验中测试Hamilton液体处理器，以测量相对粘度：
1.甘油稀释物的粘度。
2.商业粘度标准的粘度。
3.通过粘度测量的通过木聚糖酶的NSP水解。
实施例1：甘油稀释物的粘度
制备范围为0-60%(v/v)甘油的甘油稀释物。将该溶液转移至96深孔微量滴定板，其中在8个孔中分配1.5ml每种稀释物。使用ELISASTARlet液体处理器(Hamilton Robotics)，在表面下2mm处抽吸每种溶液250μl(8个平行通道，压力传感器发现液体表面)，并且距离孔上5mm向回分配到相同孔。
来自Hamilton的TADM(吸放液全程监控)软件用于监控在下述条件下在抽吸和分配过程中的压力：
·环境温度。
·具有滤器的300μl吸头
·250μl体积以抽吸和分配
在TADM软件中用于甘油抽吸的“液体细节”设置如下在“编辑液体类别”菜单中进行编辑：
·液体装置:1000μl通道。
·液体:甘油80%
·吸头类型:300μl标准体积吸头(0)
·分配模式:喷射排空吸头
·压力LLD灵敏度:低
·最大高度差异:0。
在TADM软件中用于分配甘油的“液体细节”设置如下在“编辑液体类别”菜单中进行编辑：
·液体装置:1000μl通道。
·液体:甘油80%
·吸头类型:1000μl高体积吸头(4)
·分配模式:喷射排空吸头
·压力LLD灵敏度:低
·最大高度差异:0。
Figure BDA00002091204000141
来自1000毫秒抽吸的压力数据从TADM数据文件提取到电子表格，其中对来自每个通道的8次测量求平均值，并且随后与来自参考文献在30℃的相应动力粘度相比较(参见下表1)。结果在图5中标绘，其显示在来自参考文献的粘度和来自ViPr测定的压力数据之间的明确关联。注：关于每种溶液的8次测量的CV低于2%。
来自分配的压力数据也与来自参考文献的数据相比较，并且结果在图6中标绘。根据该图，明确的是超过20%浓度的甘油溶液显示某些分离，而在10-20%甘油之间的浓度范围中的分离较不显著。在10-20%之间的分离可以通过选择1000μl过滤头且抽吸500μl得到改善。
表1.甘油溶液(含水)的粘度。来源：www.dow.com。
Figure BDA00002091204000151
Figure BDA00002091204000161
(1)水的粘度得自“Properties of Ordinary Water-Substance.”N.E.Dorsey，第184页.New York(1940)。
实施例2:商业粘度标准的粘度测量
商业粘度标准的粘度在ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics)上进行测试，使用1000μl吸头和2个液体类别(8次重复/标准)：
·用于高粘度标准N100的一个液体类别。
·用于低粘度范围的一个液体类别。
在TADM软件中用于高粘度液体抽吸的“液体细节”设置如下在“编辑液体类别”菜单中进行编辑：
·液体装置:1000μl通道。
·液体:甘油80%
·吸头类型:1000μl高体积吸头(4)
·分配模式:喷射排空吸头
·压力LLD灵敏度:低
·最大高度差异:0。
Figure BDA00002091204000163
Figure BDA00002091204000171
在TADM软件中用于低粘度范围液体抽吸的“液体细节”设置如下在“编辑液体类别”菜单中进行编辑：
·液体装置:1000μl通道。
·液体:甘油80%
·吸头类型:1000μl高体积吸头(4)
·分配模式:喷射排空吸头
·压力LLD灵敏度:低
·最大高度差异:0。
Figure BDA00002091204000172
表2.粘度标准。
Figure BDA00002091204000173
来自TADM中的抽吸步骤的ViPr测定压力数据就密度进行校准，且通过用对于水测量的压力除以对于样品测量的压力而转变成相对粘度。分别对于低粘度和高粘度标准，这些数据针对图7和8中的运动粘度数据进行标绘。图7和8中的曲线图显示对于所有标准在参考文献数据和由ViPr测定测量的数据之间的显著关联。
实施例3:通过粘度测量酶促活性
在谷类中的非淀粉多糖(NSP)部分可以引起生产动物的消化系统中的高粘度且从而减少营养素的摄取。木聚糖酶可以通过阿拉伯木聚糖的降解减轻这种抗营养效应。当加入含有谷类(例如大麦、小麦、玉蜀黍、黑麦、黑小麦或燕麦)的饲料(例如用于单胃动物包括家禽或猪)时，它们增加植物细胞壁的分解，这导致封入植物细胞内的营养素的更佳释放。此外，木聚糖酶它们还帮助减少由溶解的NSP组分引起的粘度。酶补充剂的总体效应是改善的生长率和饲料转化。
研究酶对粘度的作用可能是繁重任务，难以实现且受每天可以进行的测试数目限制。
通过底物NSP经由木聚糖酶的水解来研究ViPr测定技术在研究酶促活性中的潜力。NSP通过在乙酸盐缓冲液中在pH 5.0(0.1M)以0.175g/ml的浓度提取黑麦来分离。
将50FXU/kg黑麦材料(Bio-
Figure BDA00002091204000182
小麦，Novozymes A/S，在水中稀释至50FXU)的酶剂量加入阳性对照(NSP-黑麦+50FXU/kg黑麦)，同时将水加入阴性对照(NSP-黑麦)。
在特定时间点，自两个温育取出1.5ml溶液且转移至96孔深孔板中的孔。随后使用
Figure BDA00002091204000183
ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics)，通过ViPr测定测量粘度中的变化。
来自TADM软件文件的压力数据(抽吸步骤)在图9中针对时间进行标绘，所述图9显示了与大气压的明确减少的压力差，这继而又反映随着时间过去在取样的液体中粘度的减少。
实施例4：生物质水解的无标记测定
使用ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics)，通过测量在24孔微量滴定板中酶处理的样品的粘度，应用ViPr测定，以跟踪生物质的水解。酶处理的生物质是非牛顿液体的例子。
首先，为了分析生物质，必须做出某些硬件变化。生物质材料中的颗粒显示对于彼此的高亲和力且因此导致吸头的堵塞。因此，所有测量用定制的吸头完成。切割1000μl Hamilton吸头且将上部连接至1000μl宽口吸头。这是必需的，因为标准Hamilton吸头的样品开口仅具有0.6mm的外径，而宽口吸头是其两倍(1.2mm)，并且显示材料显著更少的因颗粒材料的堵塞。在两个部分之间的密封通过几层石蜡膜(parafilm)完成。
此外，支持吸头的支架必须适合于
Figure BDA00002091204000192
ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics)中的尺度，这同样要求盖板布局(deck layout)的某些调整，因为该机器甚至对于监控吸头适配器中的微小变化都是非常灵敏的。
分别具有10%或2.5%干物质含量(DM)的预处理的玉米穗轴或磨碎的预处理的玉米穗轴用作底物，且用10mg/g(DM)“CellicTM CTec”；商业纤维素酶复合物(Novozymes A/S)处理。酶促水解反应在旋转式温箱(rotisserieincubator)中在50℃和pH 5.0温育22小时。
样品1：预处理的玉米穗轴。
样品2：预处理的玉米穗轴(cols)加上CellicTM CTec。
样品3：磨碎且预处理的玉米穗轴。
样品4：磨碎且预处理的玉米穗轴加上CellicTM CTec。
使用允许液体类别的TADM软件(TADM software enabled liquid class)，用标准方法测量(8次重复)四种样品。从24孔板(Whatman，10ml体积/孔)中抽吸500μl样品，且向回分配到抽吸孔。
自抽吸所得到的个别压力曲线略微波动，可能是由于样品中的颗粒状材料，但图10中所示的平均压力曲线是相对平滑的。压力的减少可以与粘度的减少有关，并且可能反映生物质材料的期望水解。
自分配所得到的个别压力曲线显示于图11中；较低曲线是用CellicTMCTec处理的样品，而较高曲线是不用酶处理的样品。除了1-2曲线外，与来自抽吸步骤的那些(未显示)相比较，这些看起来是更平滑的，因此更可能给出更可靠的数据。
明确地，ViPr测定可以用于测定对复杂底物例如生物质的酶促活性。
实施例5：通过粘度测量果胶酶活性
我们研究了底物多聚半乳糖醛酸(PGA)通过商购可得的果胶酶
Figure BDA00002091204000201
ULTRA(Novozymes A/S，丹麦)的水解。
将PGA底物(15.24g/L)溶解于70mM磷酸盐；30mM柠檬酸盐中，其随后用4M氢氧化钠调整至pH 3.5。
将果胶酶加入反应混合物中至终浓度：6.9、8.63和10PGU/ml，同时仅将样品缓冲液(50mM磷酸盐；50mM柠檬酸盐；pH 3.5-RB)加入阴性对照。
一个PGU(聚半乳糖醛酸酶单位)相对于酶标准进行定义。聚半乳糖醛酸酶水解聚半乳糖醛酸(PGA)并因此减少标准的粘度。这个粘度减少与聚半乳糖醛酸酶活性成比例，并且用振动轴式粘度计MIVI(Sofraser，法国)进行测量。PGU相对于在标准反应条件下的酶标准进行测定：在30.0℃15.24PGAg/L的PGA底物浓度、7-10.5PGU/ml的酶浓度，调整至pH 3.5且在30分钟反应时间内。
根据本发明，粘度测定作为吸液装置
Figure BDA00002091204000202
ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics)中的压力测量间接地进行。在时间点0分钟时，分别地在酶加入反应或水加入阴性对照前，将粘度测量一次。如图12中所示的，经过约30分钟，来自液体处理器的压力数据(抽吸步骤)针对时间进行标绘，在其中存在明确减少的与大气压的压力差，这继而又反映与样品中的果胶酶活性成比例的随着时间过去在样品中减少的粘度。
实施例6：通过粘度测量木聚糖酶活性
木聚糖酶可以通过阿拉伯木聚糖的降解减轻其在动物饲料中的已知抗营养效应。当将木聚糖酶加入含有谷类(例如大麦、小麦、玉蜀黍、黑麦、黑小麦或燕麦)的饲料(例如用于单胃动物包括家禽或猪)时，它们增加植物细胞壁的分解，这导致封入植物细胞内的营养素的更好释放。此外，木聚糖酶还帮助减少由溶解的NSP组分引起的粘度。木聚糖酶添加对于饲料的总体效应是动物中改善的生长率和饲料转化。
通过底物黑麦阿拉伯木聚糖(黑麦粉；Megazymes)经由木聚糖酶的水解来研究ViPr测定技术在研究酶促活性中的潜力。黑麦阿拉伯木聚糖底物根据制造商的指导进行制备，但用0.1M NaAc缓冲液代替milli Q水作为溶剂。
属于家族10或11的四种不同的木聚糖酶分别以0.04、0.2和5mg EP/kgRAX投入。酶原液在酶稀释缓冲液中进行制备：100mM NaAc pH 6.0、5mMCaCl2、0.01%BSA、0.01%Tween 20。仅将酶稀释缓冲液加入阴性对照。
在时间点0和15分钟时，使用
Figure BDA00002091204000211
ELISA STARlet液体处理器(Hamilton Robotics)测量粘度。在40℃以抽吸和分配速度400μL/秒使用定制的吸头测量一式三份地进行，并且每个测量重复3次。(压力值在分配过程中在时间点600毫秒时取得)。由压力数据计算的粘度中的变化在图13中针对时间进行标绘，所述图13显示了明确减少的与大气压的压力差(误差条指示标准差)，这继而又反映作为木聚糖酶活性的效应的随着时间过去在取样的液体中粘度的减少。

Claims (9)

1.一种测定流体中的酶活性的方法，所述流体包含所述酶活性的至少一种底物，其中随着时间过去对底物的活性提供所述流体中的粘度变化，所述方法包括：
(a)使用配备至少一个压力传感器(图1(4))的装置(图1)，经过合适的时间间隔自所述流体抽吸和/或分配至少两个样品，所述压力传感器能够测量在样品的抽吸和/或分配之前、过程中和之后在顶部空间(图1(3))中变化的压力(图2)，其中在至少第一个样品被抽吸和/或分配之前或之后，使所述流体与至少一种酶接触；
(b)使(a)中所获得的压力数据与在可比较条件下抽吸和/或分配的一种或多种已知粘度标准的压力数据关联，从而测定所述样品的粘度；和
(c)基于在所述样品之间在所述时间间隔中流体粘度中的变化，计算所述流体中的所述酶活性。
2.权利要求1的方法，其中所述流体是浆料或非牛顿液体。
3.权利要求1或2的方法，其中所述底物包含蛋白质、脂质、纤维素、半纤维素、木质素、淀粉或非淀粉多糖。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中使所述流体与两种或更多种酶接触。
5.权利要求1–4中任一项的方法，其中所述至少一种酶能够随着时间过去降低所述液体的粘度。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述至少一种酶能够随着时间过去增加所述流体的粘度。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述至少一种酶包含氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶；优选地，至少一种酶包含氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另一种脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述装置是吸管。
9.权利要求8的方法，其中所述装置是自动化吸管。
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