CN102770554B

CN102770554B - 抗体糖基化变体

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Publication number: CN102770554B
Application number: CN201080049829.0A
Authority: CN
Inventors: J·罗; S·麦卡锡; T·S·拉朱; B·斯卡伦; T·斯平卡-多姆斯
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2030-10-25
Also published as: KR101965585B1; CN102770554A; CA2778809C; ES2622102T3; US20120276092A1; WO2011059684A1; IL219289A0; MX2012005006A; EP2494061B1; EA201290241A1; CA2778809A1; EP2494061A1; JP2013509415A; AU2010318542B2; BR112012010252A2; AU2010318542A1; KR20120101404A; EP2494061A4

Abstract

本发明涉及对抗体的Fc序列和其他含Fc的分子的评价。在Fc区中具有糖基化变型的抗体和其他含Fc的分子表现出对蛋白酶的抗性提高，所述蛋白酶例如胃蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、基质金属蛋白酶、丝氨酸内肽酶和半胱氨酸蛋白酶。所述含Fc的分子可用于治疗各种疾病和病症。

Description

抗体糖基化变体

背景技术

技术领域

本发明涉及对抗体的Fc序列和其他含Fc的分子的评价，更具体地讲，本发明涉及制备、改变和使用抗体制剂和其他含Fc的分子以改变对蛋白酶的敏感性的方法。

关于本领域的讨论

Fc域内的氨基酸修饰可具有可视为变构效应的作用，也就是说，从远处影响Fc构象。具体地说，经证实，CH3域中的氨基酸置换会影响与Fc-γ受体的结合，所述受体会在两条重链之间的链间二硫键下方(下绞链区)也就是在CH2域结合抗体(Shieldsetal.(2001)JBiolChem276：6591；Stavenhagenetal.(2007)CancerRes67：8882(Shields等人，2001年，《生物化学杂志》，276卷，第6591页；Stavenhagen等人，2007年，《癌症研究期刊》，第67卷，第8882页))。

在成熟抗体中，连接到Asn297的两个复合双分支低聚糖包埋在CH2域之间，形成与多肽主链的广泛接触。已经发现的是，它们的存在是抗体介导诸如ADCC的效应子功能所必需的(Lifely，M.R.，etal.，Glycobiology5：813-822(1995)；Jefferis，R.，etal.，ImmunolRev.163：59-76(1998)；Wright，A.andMorrison，S.L.，supra(Lifely，M.R.等人，《糖生物学》，第5卷，第813-822页，1995年；Jefferis，R.等人，《免疫学综述》，第163卷，第59-76页，1998年；Wright，A.和Morrison，S.L.，出处同上))。其他人和本专利申请人(WO2007005786)的研究已进一步证实，Fc区中这些天然附着的聚糖的低聚糖组分也会改变该多肽链各个非相邻位点中的Fc受体结合亲和力及蛋白酶敏感性(Raaju，S.T.2008CurrOpImmunol20：471-478(Raju，S.T.，2008年，《免疫学新观点》，第20卷，第471-478页)；WO2007024743)。

因此，随着人们对抗体分子各种构象方面的深入理解以及建模和蛋白质工程技术的不断成熟，如今可以靶向候选治疗性抗体内的区域进行修饰，以为了特定用途或适应症匹配期望的体内相互作用谱。这种修饰可提供改进的、安全性得到保持的抗体治疗剂。

发明内容

本发明提供了经过修饰、糖基化的免疫球蛋白恒定域的组合物，其可用于工程化改造抗体或抗体类治疗剂，例如包含这样的Fc区的抗体或抗体类治疗剂，所述Fc区具有一个或多个经工程化改造的、天冬酰胺(Asn)连接的糖基化位点(“N-糖基化”)。

在本发明的一个实施例中，第359位具有来自第361位的突变的N-糖基化位点和/或第419位具有来自第421位的突变的N-糖基化位点。另外，Asn297位处存在天然的Fc糖基化，在另一个实施例中可不存在天然的Fc糖基化。抗体衍生的构建体为源自或包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列的二聚蛋白结构。在一个方面，所述构建体在铰链区中的第228、234或235位(KabatEU编号)含有氨基酸置换。

本发明的另一目标是提供基于经修饰的糖基化免疫球蛋白恒定域的、与具有类似未修饰免疫球蛋白恒定域的化合物相比性质有所改进的化合物；所述性质包括但不限于蛋白酶敏感性、血清半衰期和Fc受体结合。

本发明又一个目标是提供用于增强糖基化抗体制剂抵抗蛋白酶切割的能力的组合物和方法，由此提供用于治疗与蛋白酶含量升高相关的病理状况(例如癌症)的抗体制剂。在本方法的另一个实施例中，含糖基化Fc的蛋白质为抗体，优选地为治疗性单克隆抗体。其切割活性要抑制的蛋白酶选自胃蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、基质金属蛋白酶、丝氨酸内肽酶和半胱氨酸蛋白酶，其来源于宿主或病原体，病原体可以为寄生虫、细菌或病毒。在一个具体的实施例中，蛋白酶是基质金属蛋白酶，所述基质金属蛋白酶选自明胶酶A(MMP2)、明胶酶B(MMP-9)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、溶基质蛋白酶(MMP-3)和巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)。所述修饰可引入到抗体序列中。本发明所公开的经修饰的构建体对生理相关蛋白酶表现出更强抗性。

附图说明

图1示出基于IgG4的变体的铰链域与Fc域的氨基酸序列比对，其中编号是以Kabat的EU抗体编号为依据。所示序列起始于核心铰链(残基227)，终止于Fc域的C端(残基447)，表明CNTO5303和CNTO7363分别不同于CNTO530和CNTO736，不同之处在于第359位处是Asn(N)而不是Thr，第361位处是Thr(T)而不是Asn，最终产生糖基化基序并造成该蛋白质在Asn359处发生糖基化。变体CNTO5304和CNTO7364不同于CNTO5303和CNTO7363，不同之处在于第299位处的Thr由Asn取代，从而除去Asn297处的基序和糖基化。NEM3052序列通过改变第419和421位处的氨基酸而产生糖基化基序并在第419位处发生糖基化。所示的用于产生糖基化基序位置的另一个位点介于382到384之间，如图中(“可能变体”)所示。圆点表示氨基酸与野生型序列中的氨基酸相同。

图2示出了Fc片段残基359的结构，新的糖基化位点突出显示在两条重链上。

图3示出了已通过SDS-PAGE凝胶(非还原性)进行分级分离的CNTO530及其变体。

图4示出了基于AlphaScreen的分析，其分析了两种MIMETIBODY^TM构建体变体在与生物素酰化mAb竞争结合人FcRn的能力。

图5A-F示出了由MALDI-TOF-MS记录曲线得到的数据，所述记录曲线关于完整的Fc构建体与人MMP-3或人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)温育随时间推移的消失速率，其中A-D)为与MMP-3或NE温育时，CNTO5303与CNTO530、以及CNTO7363与CNTO736的比较。而E、F)为与这两种蛋白酶温育时，所有样品(包括CNTO5304和CNTO7364)的比较。

图6如图1一样示出了基于IgG1的变体的铰链域和Fc域的氨基酸序列。

图7示出的坐标图描绘了CNTO530和CNTO5303在注射了这两种分子的小鼠血液中的血清持久性。

具体实施方式

缩写

AA＝邻氨基苯甲酸；α1，3GT＝α-1，3-半乳糖基转移酶；ARD＝急性呼吸窘迫；β1，4GT＝β-1，4-半乳糖基转移酶；α2，3ST＝α-2，3-唾液酸转移酶；ADCC＝抗体依赖性细胞毒性；CDC＝补体依赖性细胞毒性；CMP-Sia＝胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸；FBS＝胎牛血清；IgG＝免疫球蛋白G；MALDI-TOF-MS＝基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；NANA＝唾液酸的N-乙酰神经氨酸异构体；NGNA＝唾液酸的N-羟乙酰神经氨酸异构体；OA＝骨关节炎；PNGaseF＝肽-N-糖苷酶F；HPLC＝反相高效液相色谱法；RA＝类风湿性关节炎；SA＝芥子酸；Sia＝唾液酸；SDHB＝含氯化钠的二羟基苯甲酸；UDP-Gal＝尿苷二磷酸半乳糖；UDP-GlcNAc＝尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡糖。

定义&术语解释

本文所用的术语“Fc”、“含Fc的蛋白质”或“含Fc的分子”是指具有至少一个免疫球蛋白CH2和CH3域的单体、二聚体或异二聚体蛋白质。CH2和CH3域可以形成蛋白质/分子(例如抗体)的二聚体区域的至少一部分。

术语“抗体”意在涵盖抗体及其消化片段、指定部分和变体，包括但不限于抗体模拟物或者包含模拟某种抗体或其指定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括但不限于单链抗体、单结构域抗体、微型抗体及其片段。功能片段包括结合至所关注的靶抗原的抗原结合片段。例如，术语“抗体”涵盖能够结合靶抗原或其部分的抗体片段，包括但不限于Fab片段(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab′片段(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab’)₂片段(例如通过胃蛋白酶消化)、facb片段(例如通过纤溶酶消化)、pFc’片段(例如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、Fd片段(例如通过胃蛋白酶消化、部分还原和重聚集)、Fv或scFv片段(例如通过分子生物学技术)(参见例如Colligan，Immunology，出处同上)。

本文所用的术语“单克隆抗体”是含Fc的融合蛋白的特定形式，所述融合蛋白包含至少一个配体结合域，所述结合域保持与至少一种动物抗体的至少一个重链或轻链抗体可变域的实质同源性。

概述

本发明人有兴趣鉴定Fc域上用于进行聚乙二醇化的新位点，本发明由此产生。由于已知有技术用于将PEG部分缀合到蛋白质的聚糖，为修饰提供特定靶向位点，因此尝试在Asn297处使用天然聚糖，然而，已证实由于Fc二聚结构中的三级和四级结构，天然Fc聚糖不可充分接近以实现大PEG结构的缀合。

因此，考虑了Fc域上的这样的位置，通过在基序序列Asn-Xxx-Ser/Thr(已知是真核细胞内质网中糖基转移酶的识别位点)中进行工程化改造，可在其中引入另选的或附加的N连接糖基化位点。在为两种不同的含Fc的构建体CNTO530(EPOMIMETIBODY^TM构建体)和CNTO736(GLP-1MIMETIBODY^TM构建体)制备此类聚糖变体时，发现非聚乙二醇化的聚糖变体意外地表现出对蛋白水解酶的抗性显著增强。

身体可天然产生蛋白酶对蛋白质进行消化和重塑，治疗性蛋白也会受到消化和重塑。在非病原体引发的疾病状况中，例如RA和其他炎性疾病及癌症中，众所周知，某些类别的蛋白水解酶会增加。另外，众所周知，人蛋白酶与炎性疾病、增殖性疾病、转移性疾病以及感染性疾病有关。循环免疫球蛋白，特别是IgG类的那些抗体，是主要的血清蛋白。已认识到，与细菌蛋白酶如谷氨酰内肽酶(金黄色葡萄球菌(Staph.aureus))或链球菌(化脓性链球菌(Strep.pyogenes)))的免疫球蛋白降解酶相似，人蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP)和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在各蛋白酶特有的残基处切割IgG重链多肽。重链中的切割位点聚集在被称为铰链域的区域周围，两条重链的链间二硫键出现在该区域中。铰链以下的区域构成Fc区，包含负责IgG的效应子功能的结合位点。在微生物的情况中，蛋白酶表达是潜在的附加毒力途径，允许生物体避免调理作用(Rooijakkersetal.MicrobesandInfection7：476-484，2005(Rooijakkers等人，《微生物与感染》，第7卷，第476-484页，2005年))，以致铰链下游由切割导致的Fc域的蛋白酶解释放有效地中和那些本来会导致病理细胞的靶向和杀灭的功能。因此，特异性蛋白酶的活动可以代表众多疾病状态，包括癌症、炎性疾病以及感染性疾病。结合到已切割的铰链域的天然IgG自身抗体的存在，进一步证实病理体内环境中的IgG降解程度增大(Knightetal.，1995，Nasuetal.，1980，PersselinandStevens，1985，Terness，etal.1995JImunol.154：6446-6452(Knight等人，1995年；Nasu等人，1980年；Persselin和Stevens，1985年；Terness等人，1995年，《免疫学杂志》，第154卷，第6446-6452页)。因此，对生理相关蛋白酶的抗性提高将能延长含Fc的治疗性分子的体内半衰期，特别是在富含蛋白酶的环境中，这样可增强疗效和/或减少用药频率。

共同拥有的专利申请WO2009/023457公开了能够降解IgG并且与疾病或病理状态(如癌症、炎症和感染)相关的蛋白酶。信息总结于表1(如下所示)，其中，“血凝蛋白酶”包括F.XIIa、FIXa、F.Xa、凝血酶以及激活的蛋白C；纤溶酶是与纤溶酶原激活物共温育的纤溶酶原；tPA，链激酶和葡激酶；“单独纤溶酶原激活物”是没有纤溶酶原；MMP是作为活性形式或酶原获得的重组蛋白酶；以及，“无”是指在24小时内无可检测到的切割。除非指明，否则所有的酶均为人类酶。残基代号是完整的成熟IgG1抗体重链的用EU编号系统代号。

表1.

(1)BarrettA.J.，RawlingsN.D.andWoessnerJ.F.(Eds.)，HandbookofProteolyticEnzymesVol.1，Elsevier，Amsterdam，2004(BarrettA.J.、RawlingsN.D.和WoessnerJ.F.(编辑)，《蛋白水解酶手册》，第1卷，Elsevier，Amsterdam，2004年)。

(2)BarrettA.J.，RawlingsN.D.andWoessnerJ.F.(Eds.)，HandbookofProteolyticEnzymesVol.2，Elsevier，Amsterdam，2004(BarrettA.J.、RawlingsN.D.和WoessnerJ.F.(编辑)，《蛋白水解酶手册》，第2卷，Elsevier，Amsterdam，2004年)。

(3)Powers，JC.，“ProteolyticEnzymesandDiseaseTreatment”1982.In：FeeneyandWhitaker(eds).ModificationofProteins：Food，Nutritional，andPharmacologicalAspectsAdvancesinChemistrySeries198.ACS，Washington，D.C.1982pp347-367(Powers，JC，“蛋白水解酶和疾病治疗”，1982年，发表于：Feeney和Whitaker(编辑)，“蛋白修饰：食品、营养和药理方面”，《化学进展丛书》，第198卷，第347-367页，ACS，Wasnington，D.C.，1982年)。

(4)TchetverikovI.，RondayH.K.，vanElB.，KiersG.H.，VerzijlN.，TeKoppeleJ.M.，HuizingaT.W.J.，DeGrootJ.andHannemaaijerR.，2004.MMPProfileinpairedserumandsynovialfluidsamplesofpatientswithrheumatoidarthritis.Ann.Rheum.Dis.63，881-883(TchetverikovI.、RondayH.K、vanElB.、KiersG.H.、VerzijlN.、TeKoppeleJ.M.、HuizingaT.W.J.、DeGrootJ.和HannemaaijerR.，2004年，“类风湿性关节炎患者的配对血清和滑液样本的MMP谱”，《风湿性疾病年报》，第63卷，第881-883页)。

(5)VincentsB.，vonPawel-RammingenU.，L.andAbrahamsonM.，2004.Enzymaticcharacterizationofthestreptococcalendopeptidase，IdeS，revealsthatitisacysteineproteasewithstrictspecificityforIgGcleavageduetoexositebinding.Biochemistry43，15540-15549(VincentsB.、vonPawel-RammingenU.、L.和AbrahamsonM.，2004年，“链球菌内肽酶IdeS的酶学鉴定表明其为因外位点结合而具有IgG切割严格特异性的半胱氨酸蛋白酶”，《生物化学》，第43卷，第15540-15549页)。

(6)SunH.，RingdahlU.，HomeisterJ.W.，FayW.P.，EnglebergN.C.，YangA.Y.，RozekL.S.，WangX.，SjobringU.，GinsburgD.，2004.PlasminogenisacriticalhostpathogenicityfactorforgroupAstreptococcalinfection.Science.305，1283-1286(SunH.、RingdahlU.、HomeisterJ.W.、FayW.P.、EnglebergN.C.、YangA.Y.、RozekL.S.、WangX.、SjobringU.、GinsburgD.，2004年，“纤溶酶原是一型链球菌感染的重要寄主致病性因子”，《科学》，第305卷，第1283-1286页)。

低聚糖功能

由于在真核细胞的内质网中发生的糖基化作用，在分泌的蛋白质上存在特定的低聚糖，糖基化作用是为了释放到细胞外而由信号序列指示进行的正常的蛋白质加工。附接到蛋白质的低聚糖组分受到下列因素的影响，如蛋白质的性质、细胞来源物种、培养条件和胞外环境。不同物种或甚至不同个体的“糖组”性质长期以来被认为是抗原表位的来源，例如人类血型。因此，蛋白质表面糖基化代表一种用以改变特定聚糖结构或末端糖类的靶向性特异性或非特异性受体对蛋白质的识别的方法。哺乳动物受体对应的低聚糖或配体类似于凝集素，例如选凝素，如甘露糖结合蛋白、L-选凝素以及P-选凝素。

通常附接到哺乳动物IgG分子中的CH2域的Asn297的聚糖起到为Fc提供三级结构的作用，两条多肽链在CH2域周围的铰链区共价连接，两个CH3域非共价缔合。非糖基化的IgG不会结合Fc受体或具有ADCC或CDC的效应子功能或结合补体C1q。最新研究(Kaneko，2006Science313：670-673；Shieldsetal.，2002JBiol.Chem.277：3026733-26740(Kaneko，2006年，《科学》，第313卷，第670-673页；Shields等人，2002年，《生物化学杂志》，第277卷，第30期，第26733-26740页))已证实，Asn297连接的聚糖含量还可影响IgG分子与Fc(γ)受体结合的亲和力。

称为IVIG的人丙种球蛋白制剂一直以来用作通用的抗炎治疗剂。在血清诱导关节炎的鼠模型中进行的最新研究证实用高剂量的人IVIG进行处理可抑制关节炎，表明事先对IVIG进行酶促去唾液酸化废除了其治疗有益效果，而富集IVIG的唾液酸化部分增强了其抗炎功效(Kaneko，2006Science313：670-673(Kaneko等人，2006年，《科学》，第313卷，第670-673页))。

人们早已知道，抗炎特性由IVIG的Fc部分决定。后续的研究证实，主要负责抑制鼠关节炎模型中的关节炎症的IVIG分子部分，是具有与半乳糖以α2，6键连接在一起的Fc唾液酸的那些部分，而不是具有α2，3键的唾液酸的那些部分(Anthonyetal.，(2008)Science320：373(Anthony等人，2008年，《科学》，第320卷，第373页))。在脾巨噬细胞表面上表达的小鼠凝集素SIGN-R1是α2，6唾液酸化Fc片段的受体，在人树突细胞上表达的人凝集素DC-SIGN也一样(Anthony，等人，ProcNatlAcadSciUSA.2008Dec16；105(50)：19571-8(Anthony等人，《美国科学院院刊》，2008年12月16日；第105卷，第50期，第19571-19578页))。

因此，利用本发明的蛋白组合物，具有特定低聚糖结构、末端或含量的蛋白组合物可通过宿主细胞操纵和糖工程来合成，或通过前蛋白纯化加工或后蛋白纯化加工来制备，例如使用凝集素亲和色谱法或酶处理法或若干方法的组合进行分级。此类方法为本领域的技术人员已知的(如本文所提到的)，或者正在或可以利用基因工程、酶学、蛋白质分级等领域中的已知方法来开发此类方法。这些制剂可用于靶向选定的细胞类型、组织或器官上出现的特异性受体。

蛋白质的糖基化或超糖基化可增加蛋白质的水化体积，并且由于唾液酸残基的存在还能增加负电荷。这些改变可使蛋白质不易被肾过滤作用所清除。因此，除了FcRn结合作为Fc片段增强蛋白质在循环中的半衰期的手段之外，蛋白质周长的增加也会产生附加效应，但前提条件是附加的糖基化不会降低FcRn结合。

制备含已改造的Fc的分子的方法

根据需要选择附加糖基化的位点，以添加Asn连接的聚糖而又不影响Fc结构或功能。对IgG4Fc结构(1adq)(Corperetal(1997)NatStructBiol.4：374(Corper等人，1997年，《自然结构和分子生物学》，第4卷，第374页))进行分析以鉴定潜在的修饰位点。靶向了远离下铰链中Fc(γ)R结合位点以及远离CH2-CH3连接区中FcRn结合位点的CH3域环区域。359-TKNQVS-364、382-ESNGQP-387和419-EGNVFS-424环包含看似可进行修饰的残基。在这些环内，残基359、382和419被鉴定为引入糖基化的有利位点，其依据在于表面暴露并且预测采用所得糖基化进行的Asn置换将是结构上相容的。然后利用计算机为这些位置创建大量N-糖基化序列基序(N×S/T)，并将这些序列提交至NetNGlyc服务器(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)以此评估它们糖基化的潜能。排除评分为0.5或更低的基序。选择引入到测试分子内的基序为359NKT和419NGT(图1)。由于考虑到新的聚糖可能会指向会干扰FcRn结合的方向，因此不采用第382位点。然而，在残基382处引入糖基化位点可能会产生完全功能性Fc域。

含Fc的蛋白质的酶修饰

制备具有特定聚糖结构或特定低聚糖含量的、含Fc的蛋白质的一种方法，是使用蔗糖酶(如岩藻糖苷酶或唾液酸酶)来处理含Fc的蛋白质制剂，从而去除特定糖残基，例如岩藻糖或唾液酸。还可使用体外糖基化方法将糖类连接到Fc区。

糖基转移酶自然起到合成低聚糖的作用。它们所产生的特定产物具有出色的立体化学和区域化学几何形状。糖基残基的转移会导致寡糖或多糖的延长或合成。目前已对许多糖基转移酶类进行了描述，包括唾液酸转移酶、岩藻糖转移酶、半乳糖基转移酶、甘露糖转移酶、N-乙酰氨基半乳糖转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶等。本发明中可用的糖基转移酶包括例如α-唾液酸转移酶、α-葡糖基转移酶、α-半乳糖基转移酶、α-岩藻糖转移酶、α-甘露糖转移酶、α-木糖转移酶、α-N-乙酰己糖胺转移酶、β-唾液酸转移酶、β-葡糖基转移酶、β-半乳糖基转移酶、β-岩藻糖转移酶、β-甘露糖转移酶、β-木糖转移酶和β-N-乙酰己糖胺转移酶，例如那些来源于脑膜炎奈瑟氏菌或其他细菌的糖基转移酶，以及那些来源于大鼠、小鼠、兔、牛、猪、人和昆虫或病毒的糖基转移酶。优选地，该糖基转移酶是糖基转移酶的截短变体，其中的膜结合域已去除。示例性的半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，参见例如Dabkowskietal.，TransplantProc.25：2921(1993)(Dabkowski等人，《移植学会会报》，第25卷，第2921页，1993年)和Yamamoto等人，Nature345：229-233(1990)(Yamamoto等人，《自然》，第345卷，第229-233页，1990年))和α(1，4)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.38)。可使用其他的糖基转移酶，例如唾液酸转移酶。

α(2，3)唾液酸转移酶常被称为唾液酸转移酶，可用于生产唾液酸乳糖或更高阶结构。这种酶将唾液酸(NeuAc)从CMP唾液酸转移到Gal残基，从而在两个糖之间形成α键。糖之间的结合(键合)处于NeuAc的第2位和Gal的第3位之间。称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾液酸转移酶将唾液酸转移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原性末端Gal。参见VandenEijndenetal.，J.Biol.Chem.，256：3159(1981)，Weinsteinetal.，J.Biol.Chem.，257：13845(1982)andWenetal.，J.Biol.Chem.，267：21011(1992)(VandenEijnden等人，《生物化学杂志》，第256卷，第3159页，1981年；Weinstein等人，《生物化学杂志》，第257卷，第13845页，1982年；以及Wen等人，《生物化学杂志》，第267卷，第21011页，1992年)。其他示例性α-2，3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.4)将唾液酸转移到二糖或糖苷的非还原性末端Gal上。参见Rearicketal.，J.Biol.Chem.，254：4444(1979)andGillespieetal.，J.Biol.Chem.，267：21004(1992)(Rearick等人，《生物化学杂志》，第254卷，第4444页，1979年，以及Gillespie等人，《生物化学杂志》，第267卷，第21004页，1992年)。其他示例性酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾液酸转移酶(参见Kurosawa等人，Eur.J.Biochem.219：375-381(1994)(Kurosawa等人，《欧洲生物化学杂志》，第219卷，第375-381页，1994年))。

特别适用于制备本发明的低聚糖的其他葡糖基转移酶是甘露糖转移酶，包括α(1，2)甘露糖转移酶、α(1，3)甘露糖转移酶、β(1，4)甘露糖转移酶、Dol-P-Man合酶、OCh1和Pmt1。其他的葡糖基转移酶还包括N-乙酰氨基半乳糖转移酶，包括α(1，3)N-乙酰氨基半乳糖转移酶、β(1，4)N-乙酰氨基半乳糖转移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.267：12082-12089(1992)andSmith等人，J.BiolChem.269：15162(1994)(Nagata等人，《生物化学杂志》，第267卷，第12082-12089页，1992年；以及Smith等人，《生物化学杂志》，第269卷，第15162页，1994年))和多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶(Homa等人，J.BiolChem.268：12609(1993)(Homa等人，《生物化学杂志》，第268卷，第12609页，1993年))。合适的N-乙酰葡糖胺转移酶包括GnTI(2.4.1.101，Hulletal.，BBRC176：608(1991)(2.4.1.101，Hull等人，BBRC，第176卷，第608页，1991年))、GnTI和GnTIII(Ihara等人，J.Biolchem.113：692(1993)(Ihara等人，《生物化学杂志》，第113卷，第692页，1993年))、GnTV(Shoreiban等人，J.Biol.Chem.268：15381(1993)(Shoreiban等人，《生物化学杂志》，第268卷，第15381页，1993年))。

在将该方法以商业规模实施的那些实施例中，可能有利的是将糖基转移酶固定在载体上。这种固定化有利于从该批次产品中去除该酶，随后再利用该酶。可例如通过下列方法完成糖基转移酶的固定化：从转移酶中去除膜结合域，然后在其位置上连接纤维素结合域。本领域的技术人员将理解，还可以使用其他的固定化方法，这些方法在已有的文献中有所描述。

由于受体底物可基本上为任何这样的单糖或低聚糖，特定的糖基转移酶对所述这些糖的末端糖残基具有特异性，因此底物可在其非还原性末端的位置处进行置换。因此，糖苷受体可为单糖、低聚糖、荧光标记的糖类、或糖类衍生物，例如氨基糖苷抗生素、神经节苷脂或糖蛋白(包括抗体和其他含Fc的蛋白质)。在一组优选实施例中，糖苷受体是低聚糖，优选地Galβ(1-3)GlcNAc、Galβ(1-4)GlcNAc、Calβ(1-3)GalNAc、Galβ(1-4)GalNAc、Manα(1，3)Man、Manα(1，6)Man、或GalNAcβ(1-4)-甘露糖。在具体的优选实施例中，低聚糖受体连接至含Fc的蛋白质的CH2域。

避免使用活化糖底物(即糖核苷磷酸酯)的方法是将再生反应与糖基转移酶反应同时使用(也称为再循环系统)。例如，正如美国专利6,030,815中所提出的，CMP唾液酸再循环系统利用CMP唾液酸合成酶来补充CMP唾液酸(CMP-NeuAc)，因为当α(2，3)唾液酸转移酶存在时，CMP唾液酸会与唾液酸转移酶受体发生反应而产生唾液酸糖。可用于本发明的CMP唾液酸再生系统包含胞苷一磷酸(CMP)、核苷三磷酸(例如三磷酸腺苷(ATP))、磷酸供体(例如磷酸烯醇丙酮酸或乙酰磷酸)、能够将磷酸从磷酸供体转移至核苷二磷酸的激酶(例如丙酮酸激酶或乙酸激酶)以及能够将末端磷酸从核苷三磷酸转移至CMP的核苷一磷酸激酶(例如肌激酶)。还可将α(2，3)唾液酸转移酶和CMP唾液酸合成酶视为CMP唾液酸再生系统的一部分，因为移除活化唾液酸可维持合成的正向速率。发表于1992年10月1日的国际专利申请WO92/16640公开了唾液酸化工序中唾液酸化合物的合成和用途，其所采用的噬菌粒包含已修饰的CMP唾液酸合成酶的基因。

制备低聚糖的替代方法是通过使用糖基转移酶和活化糖基衍生物作为供体糖，而无需糖核苷酸作为供体糖，如美国专利5,952,203中所提出的。活化糖基衍生物充当天然底物的替代物，这些天然底物是昂贵的糖核苷酸，通常为核苷酸二磷酸糖或核苷酸单磷酸糖，其中核苷酸磷酸通过α键连接至糖的第1位。

有用的活化糖苷衍生物包括活化离去基团，例如氟、氯、溴、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等。优选的活化糖苷衍生物实施例包括氟代糖和糖基甲磺酸酯，尤其优选氟代糖。在氟代糖中，最优选α-氟代半乳糖、α-氟代甘露糖、α-氟代葡萄糖、α-氟代岩藻糖、α-氟代木糖、α-氟代唾液酸、α-N-氟代乙酰葡糖胺、α-N-氟代乙酰氨基半乳糖、β-氟代半乳糖、β-氟代甘露糖、β-氟代葡萄糖、β-氟代岩藻糖、β-氟代木糖、β-氟代唾液酸、β-N-氟代乙酰葡糖胺和β-N-氟代乙酰氨基半乳糖。

可从游离糖制备氟代糖，首先对该糖进行乙酰化，然后用HF/吡啶进行处理。乙酰化的氟代糖可通过与甲醇中的弱(催化性)碱(例如NaOMe/MeOH)反应而去保护。此外，许多氟代糖可商购获得。可使用本领域的技术人员已知的常规方法来制备其他活化糖基衍生物。例如，可通过以下方法制备糖基甲磺酸酯：先将完全苄基化的半缩醛形式的糖用甲磺酰氯进行处理，然后进行催化氢化以去除苄基。

该反应的另一个组分是催化量的核苷磷酸或其类似物。适用于本发明的核苷一磷酸包括例如一磷酸腺苷(AMP)、一磷酸胞苷(CMP)、一磷酸尿苷(UMP)、一磷酸鸟苷(GMP)、一磷酸肌苷(IMP)和一磷酸胸苷(TMP)。适用于本发明的核苷三磷酸包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸肌苷(ITP)和三磷酸胸苷(TTP)。优选的三磷酸核苷为UTP。优选地，核苷磷酸是指核苷二磷酸，例如二磷酸腺苷(ADP)、二磷酸胞苷(CDP)、二磷酸尿苷(UDP)、二磷酸鸟苷(GDP)、二磷酸肌苷(IDP)和二磷酸胸苷(TDP)。优选的核苷二磷酸为UDP。如上文所提到，本发明还可利用核苷磷酸的类似物进行实施。合适的类似物包括例如核苷硫酸盐和磺酸盐。其他类似物还包括简单磷酸盐，例如焦磷酸盐。

修饰例如鼠细胞(其中羟基化形式的唾液酸占绝大多数(NGNA))内产生的重组蛋白的一个方法，是用唾液酸酶来处理蛋白质，以去除NGNA型唾液酸，然后使用试剂UDP-Gal和β1，4半乳糖转移酶进行酶促半乳糖基化以产生高度同质的G2糖型。然后可任选地使用试剂CMP-NANA和α-2，3唾液酸转移酶来处理该制品，以产生高度同质的G2S2糖型。

处于本发明的目的，某种糖型实质同质应指该糖型占约85％或更大，优选地该糖型占约95％或更大。

蛋白酶和抗体的蛋白酶敏感性

胃蛋白酶在低pH下自动活化并具有活性，因为它是进食后分泌到胃腔中的胃液的正常组分。血清中可存在低含量的前体酶胃蛋白酶原，但因为活化和活性是酸依赖性的，所以在生理上与循环抗体无关。胃蛋白酶在下铰链的亮氨酸₂₃₄-亮氨酸₂₃₅之间将人IgG1切割。该切割位点处于含两个半胱氨酸残基的铰链核心(-C-P-P-C-)的下游，所述残基通过二硫键将两条重链连接在一起，形成用于结合抗原的两价F(ab’)₂分子。

下铰链和CH2区起始段P-A-P-E-F/L-L-G-G-P-S-V-F(SEQIDNO：1和2的残基5-16)包含基质金属蛋白酶MMP-3和MMP-12的切割位点。胃蛋白酶和MMP-7也在此区域(P-A-P-E-L*L-G)进行切割。此外，一组生理上相关的酶；中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、溶基质蛋白酶(MMP-3)和巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)也在几个位点切割IgG，以产生略有不同的F(ab’)₂、Fab和Fc片段(见表1)。

糖型变体的生物学表征

可通过若干个熟知的体外测定法来比较含Fc的蛋白质的功能性。具体地说，所关注的是Fcγ受体的FcγRI、FcγRII和FcγRIII家族的成员的亲和力。可利用重组可溶形式的受体或细胞结合形式的受体进行这些测量。此外，例如可使用重组可溶性FcRn，通过BIAcore来测量FcRn的亲和力，FcRn这种受体起到延长lgG的循环半衰期的作用。利用基于细胞的功能性分析(例如ADCC测定法和CDC测定法)可深入了解特定变体结构的可能的功能结果。在一个实施例中，ADCC测定法被配置成将NK细胞作为主要的效应细胞，从而反映对FcγRIIIA受体的功能效应。吞噬作用测定法也可用于比较不同变体的免疫效应子功能，而测量细胞应答(例如过氧化物或炎性介质释放)的测定法也可用于进行比较。例如在使用抗CD3抗体的变体的情况中，也可使用体内模型来测量小鼠中T细胞活化，该活性依赖于接合特定配体(例如Fcγ受体)的Fc域。

蛋白生产方法

不同的涉及生产含Fc的蛋白的方法可影响Fc低聚糖结构。在一个例子中，将分泌含Fc的蛋白质的宿主细胞在血清的存在下进行培养，例如之前未经过高温热处理(例如，56℃下30分钟)的胎牛血清(FBS)。这可产生出不含或仅含有极少量唾液酸的含Fc的蛋白质，因为活性唾液酸酶天然存在于该血清中，该酶会将唾液酸从这些细胞所分泌的含Fc的蛋白质中移除。在另一个实施例中，将分泌含Fc的蛋白质的细胞在已经过高温热处理(借此灭活唾液酸酶)的血清存在下进行培养，或者在不存在血清或不存在可能含有唾液酸酶的其他介质组分的情况下进行培养，使得含Fc的蛋白质具有较高或较低含量的糖基化或糖基化变体。

在另一个实施例中，建立用于纯化和进一步处理含Fc的蛋白质的条件，这将有利于获得最佳的聚糖含量。在一个实施例中，所述条件可产生最大或最小的低聚糖含量，或导致主要糖型中已表达的含Fc的多肽的转化。例如，由于唾液酸对酸不稳定，因此长时间暴露在低pH环境下(例如从A蛋白色谱柱中洗脱出来或病毒灭活操作后)会造成唾液酸含量降低。在另一个实施例中，使用凝集素固定化载体材料对糖基化材料进行色谱分离，所述载体材料将选择性地结合带有特定糖类或低聚糖复合物的蛋白质或阻碍其穿过。在固定化凝集素的色谱柱的情况中，可将未结合的流出部分(T，through)或色谱柱未结合级分与结合结合级分(B，bound)分离，后者在洗脱缓冲液流经色谱柱时收集。还可分别收集弱结合级分或色谱柱阻碍级分(R，retarded)，例如通过收集用原始样品缓冲液持续洗涤色谱柱时所洗脱出来的含Fc的蛋白质来进行。可对唾液酸化或脱唾液酸化的含Fc的蛋白质进行富集的凝集素例子为山槐((Maackiaamurensis)(MAA)凝集素和麦胚凝集素(WGA)，前者可特异性地将低聚糖与末端唾液酸结合，后者可特异性地将低聚糖与末端唾液酸或末端N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)结合。另一个例子是将低聚糖与末端半乳糖结合的蓖麻凝集素I(RCA)。在后一个例子中，可富集未结合流出级分中的唾液酸化的含Fc的分子。本领域中已知的其他凝集素包括Vector实验室和EY实验室提供的那些凝集素。

宿主细胞选择或宿主细胞工程改造

如本文所述，选择用于表达重组的含Fc的蛋白质或单克隆抗体的宿主细胞对最终组成至关重要，包括但不限于免疫球蛋白CH2域中装饰蛋白质的低聚糖部分的组成的变化。因此，本发明的一个方面涉及选择适当的宿主细胞，用于使用和/或开发表达所需治疗性蛋白质的生产细胞。

在抗体或Fc融合物的唾液酸含量降低的一个实施例中，宿主细胞是唾液酸转移酶天然不足或缺乏的细胞。在另一个实施例中，对宿主细胞进行遗传修饰，以使其缺乏唾液酸转移酶。在又一个实施例中，宿主细胞是经选择可表达含量减少的或含量检测不到的唾液酸转移酶的衍生宿主细胞系。在另一个实施例中，宿主细胞天然缺乏或经过遗传修饰后缺乏CMP唾液酸合成酶，该酶可催化CMP唾液酸的形成，而CMP唾液酸是唾液酸转移酶用于将唾液酸转移到抗体的唾液酸来源。在相关的实施例中，宿主细胞可天然缺乏或经过遗传修饰后缺乏丙酮酸合成酶，该酶可从丙酮酸形成唾液酸。

在一个另外的实施例中，宿主细胞可天然缺乏或经过遗传修饰后缺乏半乳糖基转移酶，使得所述细胞中表达的抗体缺乏半乳糖。没有半乳糖，唾液酸将无法连接。在又一个实施例中，宿主细胞可天然过表达或经过遗传修饰后过表达唾液酸酶，该酶可在生产期间从抗体移除唾液酸。这种唾液酸酶可在抗体被分泌之前在细胞内作用于抗体或者可分泌到培养基中并作用于已分泌到该培养基中的抗体并且还可包含半乳糖酶。已描述了选择具有已改造的糖基化酶并且表达含已改造的碳水化合物组分的糖蛋白的细胞系的方法(RipkaandStanley，1986.SomaticCellMolGen12：51-62；US2004/0132140(Ripka和Stanley，1986年，《体细胞与分子遗传学》，第12卷，第51-62页；US2004/0132140))。工程化改造宿主细胞以产生糖基化方式已改变的抗体而最终获得增强的ADCC的方法已在例如美国专利6,602,864中提出，其中所述宿主细胞内含编码至少一种糖蛋白修饰糖基转移酶的核酸，所述转移酶具体地讲是β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)。

其他通过操纵宿主细胞糖基转移酶对宿主细胞的糖基化性质进行基因工程改造的方法涉及消除或抑制活性，如EP1,176,195中所提出的，具体地讲是α1，6岩藻糖基转移酶(FUT8基因产物)。本领域技术人员会知道实施除上述具体例子中的方法之外的宿主细胞工程化改造方法。此外，已工程化改造的宿主细胞可来源于哺乳动物，或可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、293、HeLa，、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或它们的任何衍生的、永生的或转化的细胞。

在另一个实施例中，抑制或消除低聚糖附接所需的酶的活性的方法可选自基因沉默(例如通过使用siRNA)、基因敲除或添加酶抑制剂(例如通过共表达该酶特异性的可结合并阻断酶活性的胞内抗体或肽)，以及其他已知的基因工程技术。在另一个实施例中，增强能阻断糖类附接的酶或能移除已附接的糖的糖酶的表达或活性的方法可选自：用重组酶基因转染、能增强酶RNA合成的转录因子的转染和能增强酶RNA的稳定性的遗传修饰，所有这些方法都可增强酶(例如唾液酸酶)的活性，从而降低纯化产物中唾液酸的含量。在另一个实施例中，可将特定酶抑制剂添加到细胞培养基。作为另外一种选择，宿主细胞可选自不能使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，例如属于天然或已工程化改造的大肠杆菌属(E.colispp.)、克雷白氏杆菌属(Klebsiellaspp.)或假单胞菌属(Pseudomonasspp.)的那些原核细胞或生物体。

抗体

本专利申请所描述的抗体可包括或来源于任何哺乳动物，例如但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类、山羊或它们的任何组合，并且包括分离的人、灵长类、啮齿动物、哺乳动物、嵌合、人源化和/或CDR-移植抗体、免疫球蛋白、切割产物和其他指定部分和它们的变体。

通过本领域所熟知的若干方法可衍生本文描述的抗体、含Fc的蛋白质或Fc片段。在一个方面，从利用目标肽、细胞或组织提取物对小鼠或其他动物进行免疫而制得的杂交瘤中便利地获得抗体。因此可利用本领域熟知的任何杂交瘤技术来获得抗体，参见例如Ausubel，etal.，ed.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook，etal.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，2^ndEdition，ColdSpringHarbor，NY(1989)；HarlowandLane，antibodies，aLaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NY(1989)；Colligan，etal.，eds.，CurrentProtocolsinImmunology，JohnWiley&Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colliganetal.，CurrentProtocolsinProteinScience，JohnWiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)，eachentirelyincorporatedhereinbyreference.(Ausubel等人(编辑)，《现代分子生物学实验技术》，JohnWiley&Sons，Inc.，NY，NY，1989年；Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》，第2版，ColdSpringHarbor出版社，NY，1989年；Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，ColdSpringHarbor出版社，NY，1989年；Colligan等人(编辑)，《最新免疫学实验室指南》，JohnWiley&Sons，Inc.，NY，1994-2001年；Colligan等人，《最新蛋白质科学实验指南》，JohnWileySons，Inc.，NY，NY，1997-2001年)，各个文献均以引用的方式并入本文。

所述抗体或Fc融合蛋白或它们的组分和域也可通过从此类域或组分的库(例如噬菌体库)中选择来获得。可通过插入随机寡核苷酸的库或含所关注序列的多核苷酸的库来构建噬菌体库，如来自免疫的动物或人的B细胞(Smith，G.P.1985.Science228：1315-1317(Smith，G.P.，1985年，《科学》，第228卷，第1315-1317页))。抗体噬菌体库在一个噬菌体中含有重链(H)和轻链(L)可变区对，从而可表达单链Fv片段或Fab片段(Hoogenboom，等人，2000，Immunol.Today21(8)371-8(Hoogenboom等人，2000年，《今日免疫学》，第21卷，第8期，第371-378页))。可操纵噬菌粒库的多样性来增加和/或改变该库中单克隆抗体的免疫特异性，以生产和随后鉴定另外的期望的人单克隆抗体。例如，可将重链(H)和轻链(L)免疫球蛋白分子编码基因随机混合(改组)，以在装配的免疫球蛋分子中产生新的HL对。另外，可在免疫球蛋白多肽可变区的互补决定区(CDR)中对重链和轻链编码基因中的一条和两条进行诱变，随后进行筛选以获得期望的亲和力和中和能力。还可如下以合成法产生抗体库：选择一个或多个人构架序列，并引入源自人抗体谱(repertoires)的CDR基因盒的集合或通过所设计的变型(KretzschmarandvonRuden2000，CurrentOpinioninBiotechnology，13：598-602(Kretzschmar和vonRuden，2000年，《生物技术新见》，第13卷，第598-602页))。多样性的位置不限于CDR，而是还可包括可变区的构架区段或可包括除抗体可变区之外的区段，例如肽。

其他可包括除抗体可变区之外的区段的靶结合组分的库为核糖体展示、酵母展示和细菌展示。核糖体展示是一种将mRNA翻译为它们的同源蛋白质的同时保持蛋白质附接到RNA的方法。通过RT-PCR回收核酸编码序列(Mattheakis，L.C.等人，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，9022(Mattheakis，L.C.等人，1994年，《美国科学院院刊》，第91卷，第9022页))。酵母展示是基于膜相关α-凝集素酵母粘着受体aga1和aga2的融合蛋白的构建，是杂交型系统的一部分(Broder，等人，1997.NatureBiotechnology，15：553-7(Broder等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第553-557页))。细菌展示是基于靶标与输出的与细胞膜或细胞壁缔合的细菌蛋白的融合(ChenandGeorgiou2002.BiotechnolBioeng，79：496-503(Chen和Georgiou，2002年，《生物技术与生物工程》，第79卷，第496-503页))。

相比杂交瘤技术，噬菌体和其他抗体展示方法可操纵在体外对抗原靶标的选择，没有宿主可能影响抗原的这一限制，或反之亦然。

本发明还提供编码本发明的组合物的核酸，其作为分离的多核苷酸或作为表达载体的部分，所述表达载体包括与所述组合物或它们的定向诱变剂的原核生物、真核生物或丝状噬菌体表达、分泌和/或展示相容的载体。

含Fc的分子的用途

通过任何上述方法生产的组合物(抗体、Fc融合物、Fc片段)可用于诊断、治疗、检测或调节人疾病或细胞、组织、器官、体液或通常是宿主的具体病理。如本文所提到，抗体Fc部分、Fc融合蛋白或Fc片段的糖基化修饰可抑制已知存在于体液、隔室、组织或器官等治疗靶标中的蛋白酶的蛋白水解消化，从而可用于生产治疗性分子；这些分子可保留其原始靶向特性并且不容易被这些蛋白酶所降解。

要抑制其切割活性的蛋白酶选自胃蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、基质金属蛋白酶、丝氨酸内肽酶和半胱氨酸蛋白酶，其来源于宿主或病原体，病原体可以为寄生虫、细菌或病毒。在具体的实施例中，蛋白酶是基质金属蛋白酶，所述基质金属蛋白酶选自明胶酶A(MMP2)、明胶酶B(MMP-9)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、溶基质蛋白酶(MMP-3)和巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)。改变分子的Fc部分或Fc分子(使用EU编号)的糖基化的修饰可选自移除CH2域中的糖基化位点(Asn297的置换)、通过在359位置换Asn和在361位置换Thr来在CH3域中加入N连接糖基化位点、通过在382位置换Asn和在384位置换Thr来在CH3域中加入N连接糖基化位点，以及通过在419位置换Asn和在421位置换Thr来在CH3域中加入N连接糖基化位点。向CH3域加入糖基化位点预期可增加所得分子的水化体积以及增加在身体中的持久性。

可使用本发明提供的组合物来治疗的疾病或病理包括但不限于：癌症或增殖性疾病、炎性或风湿性疾病、自体免疫疾病、神经性疾病、纤维变性、心血管疾病、皮肤病和传染病，以及烧伤或创伤引发的病症。

可用本发明的组合物来治疗的癌症或增殖性疾病选自实体瘤、转移性肿瘤、液体瘤和良性瘤，例如淋巴瘤、淋巴母细胞性或骨髓性白血病、(ALL)、B细胞、T细胞或FABALL、急性骨髓性白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴增殖性疾病、何杰金氏病、巨大淋巴结增生症、恶性淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波济氏肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增生症、腺癌、鳞状细胞癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、尤其是转移性黑色素瘤，以及血管瘤。

可用本发明的组合物来治疗的炎性或免疫系统介导疾病选自类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、全身发病型幼年类风湿关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎、胃溃疡、关节病和关节镜式斑块(arthroscopicplaque)、骨关节炎、炎性肠疾病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、葡萄膜炎、视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎、韦格纳肉芽肿、结节病、睾丸炎、过敏性和特应性疾病、哮喘和特应性哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、过敏性结膜炎、超敏性肺炎、器官移植排斥反应、移植物抗宿主疾病，以及全身性炎症反应综合征。

可用本发明的组合物来治疗的其他疾病或病症为天疱疮、硬皮病、慢性阻塞性肺疾病、革兰阴性或革兰氏阳性细菌感染、病毒感染(如流感和HIV)、寄生虫感染，如疟疾或利什曼病、麻风病、脑炎、念珠菌病、淀粉样变性、阿尔茨海默氏症、心肌梗死、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风和出血。

如本文具体例证，在Fc区的CH3域中加入N连接聚糖(通过在359位置换Asn残基和在361位置换Thr残基(EU编号))，所制备的肽Fc融合蛋白类化合物不易受基质金属蛋白酶(MMP-3)和丝氨酸内肽酶(NE)的影响，同时还能保持该分子的FcRn结合亲和力和ADCC/CDC活性。

虽然已概括地描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公开，所述实例不应理解为对权利要求所保护的范围的限制。

实例1.Fc糖基化变体的构建

对美国专利7,393,662(SEQIDNO：88)中被描述为EPOMIMETIBODY^TM构建体(Fc融合物)的EMP-1Fc融合物(CNTO530)以及WO/05097175中描述的GLP-1MIMETIBODY^TM构建体(Fc融合物)(CNTO736)进行实验。两个构建体均包含衍生自人IgG4抗体的Fc区，如图1所示。

CNTO530变体

编码CNTO530的质粒p2630用作使用标准重组PCR和克隆方法制备NEM2631的原料。为将T359N/N361T置换引入到EPOMIMETIBODY^TM构建体CNTO530中，将编码CH3的限制片段从NEM2631T359N/N361T质粒p3051分离并进行克隆以取代编码CNTO530的质粒p2630中的相应片段。所得质粒p3201编码蛋白质CNTO530T359N/N361T，本文称为CNTO5303(参见图2和表1)。

为制备具有相同的T359N/N361T置换但在第297位处缺乏天然Fc糖基化的CNTO530变体，用诱变寡核苷酸对质粒p3201的适当部分进行PCR扩增并克隆以实现T299N密码子置换(即从₂₉₇NST₂₉₉更改为₂₉₇NSN₂₉₉)。所得质粒为编码蛋白质CNTO530T359N/N361T/T299N(本文称为CNTO5304)的p3576。

CNTO736变体

为将T359N/N361T置换引入到CNTO736中，将编码CH3的限制片段从NEM2631T359N/N361T质粒p3051分离并进行克隆以取代编码CNTO736的质粒p2538中的相应片段。所得质粒为编码CNTO736T359N/N361T(本文称为CNTO7363)的p3349(表1)。

为制备具有相同的T359N/N361T置换但在第297位处缺乏天然Fc糖基化的CNTO736变体，对质粒p3349的适当部分进行PCR扩增并克隆以实现T299N密码子置换。所得质粒为编码蛋白质CNTO736T359N/N361T/T299N(本文称为CNTO7364)的p3577。

表1.

^*从转染的细胞中观察到的生产水平

表达和纯化用编码CNTO5303的p3201质粒稳定转染CHO-K1SV细胞(C1013A)，从而分离出产CNTO5303的细胞系C1514A。用上述编码CNTO5304、CNTO7363和CNTO7364的质粒稳定转染小鼠NS0细胞，从而分别分离出转染的细胞系C1670A、C1528A和C1671A(表1)。通过标准的A蛋白色谱从转染的细胞上清液中纯化所有四种MIMETIBODY^TM构建体变体。由于A蛋白和FcRn都在Fc域的CH2-CH3接合处结合，因此使用A蛋白色谱柱成功进行纯化表明，新的糖基化位点不会影响与FcRn的结合(见下文)。

实例2.Fc糖基化变体的表征

对实例1的表达的构建体进行了一系列的分析测试、生物物理测试和生物活性测试。

进行MALDI-TOF-MS分析以表征MIMETIBODY^TM构建体变体的聚糖结构并确定在新位点上发生糖基化的重链的比例。

对完整的MIMETIBODY^TM构建体的MALDI-TOF-MS分析表明，CNTO5303、CNTO5304、CNTO7363和CNTO7364样品在新位点处被聚糖占据达75-95％。这些样品的聚糖分析表明，相比CNTO530和CNTO736MIMETIBODY^TM构建体聚糖，它们的异质性更高，第359位处的聚糖含有二、三和四分支结构。CNTO5303和CNTO7363中第297位处的天然Fc聚糖在结构上分别与CNTO530和CNTO736中的天然Fc聚糖相同，仅能观察的差别在于原始MIMETIBODY^TM构建体中的半乳糖基化稍高(如，CNTO530约有50％G0，CNTO5303约有70％)。

通过SDS-PAGE分析大小和迁移率

通过SDS-PAGE来分析经纯化的CNTO530、CNTO5303和CNTO5304，方法为：在非还原性条件下，在厚度为1.0mm的BisTris4-12％梯度凝胶上按1μg/泳道上样，并在MOPSSDS电泳缓冲液中在200V的电压下进行分级分离50分钟。用考马斯亮蓝G250(SimplyBlueSafeStain，Invitrogen)对凝胶进行染色，然后用AlphaImager2200成像系统(AlphaInnotech)获取所得图像(图4)。

SDS凝胶中所观察到的迁移符合预期，即，相比具有2个N-糖基化位点的CNTO530和CNTO5304，具有总计4个N-糖基化位点的CNTO5303迁移较慢，表观分子量增加3-4kDa。尽管CNTO5304与CNTO530具有相同数量的糖基化位点，但CNTO5304的迁移速度似乎更慢些。这是因为相对于CNTO530上的天然糖基化，CNTO5304上的新糖基化位点具有更高水平的半乳糖基化和唾液酸化，并且具有更多的三分支和四分支结构。CNTO530、CNTO5303和CNTO5304的分子量估计值分别为57.5、61.5和59.5kDa。

通过FcRn结合分析来评估生物活性.

由于选择新糖基化引入位点的一个因素是希望避开FcRn结合区域，因而利用AlphaScreen将CNTO5303与FcRn的结合和CNTO530与FcRn的结合进行比较。首先按照包装说明书使用Slide-A-LyzerMINI透析装置(10KMWCO；ThermoScientific(Pierce))，在pH6.0的测定缓冲液(0.05MMES，0.025％BSA，0.001％Tween20，pH6.0)中在4℃下对两个MIMETIBODY^TM构建体样品透析过夜。通过OD₂₈₀测定抗体浓度。然后将下列组分在96孔、半区、平底、非结合的白色聚苯乙烯测定板中在室温下在混合状态下共温育1小时：生物素酰化人IgG1mAb(CNTO6234；最终浓度为4μg/ml)、系列稀释的试样、多聚组氨酸标记的人FcRn(最终浓度为8μg/ml)、AlphaScreen镍螯合物受体微珠(最终浓度为100μg/ml)和AlphaScreen链霉亲和素包被的供体微珠(最终稀释度为1∶250)。使用如上所述的测定缓冲液来稀释所有的材料。温育结束后，使用AlphaScreen方案在EnVision仪器上读板。结果(图5)显示CNTO5303与FcRn的结合亲和力与CNTO530相似(K_D仅比CNTO530小两倍)，表明CNTO5303中保留了FcRn结合。

蛋白酶敏感性评估。

随后评估经纯化的MIMETIBODY^TM分子对两种人蛋白酶、重组基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的相对敏感性。据认为在下铰链中的₂₂₈SCPAP序列后进行切割的MMP-3已由Centocor公司如下制备：在HEK细胞中瞬时表达成多聚组氨酸标记的MMP-3前体，然后通过Talon亲和色谱柱进行纯化并按等分试样进行冷冻。从AthensResearchandTechnologies(Athens，GA)获得人NE，其通常主要在₂₂₀CDKT上铰链序列后进行切割，但也可在下铰链中的第二位点处进行切割(见下文)。

蛋白酶敏感性

MMP-3。将冷冻的MMP-3进行解冻，然后在55℃下温育25分钟以将其活化，然后再进行MMP-3消化。用在含2mM氯化钙的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)中的活化MMP3(1∶50，w/w)，在37℃下处理约1mg/ml的纯化MIMETIBODY^TM构建体样品。在固定的时间间隔内(0、0.5、1、2、4、6、8和24小时)提取等分试样(约2μl)并立即将其与2μl的基质溶液(通过将10mg的芥子酸溶解于含0.1％三氟乙酸的1.0ml50％乙腈水溶液内来制备基质溶液)进行混合。将2μl的此溶液上样到MALDI靶板上并让其风干，然后如下所述进行质谱分析。

嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。由于MIMETIBODY^TM构建体的N端肽部分对NE消化极为敏感(因此使对完整分子的定量复杂化并干扰研究铰链Fc抗性)，同时因为已观察到第二NE切割位点存在于下铰链区的别处，特别是在非糖基化的IgG中，因此先从每种MIMETIBODY^TM构建体样品制备木瓜蛋白酶产生的Fc片段。用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)中的NE(1∶50，w/w)，将浓度为约1mg/m的每种lMIMETIBODY^TM构建体的那些Fc片段在37℃下进行处理。在固定的时间间隔内(0、0.5、1、2、4、6、8和24小时)提取等分试样(约2μl)并立即将其与2μl的基质溶液(通过将10mg的芥子酸溶解于含0.1％三氟乙酸的1.0ml50％乙腈水溶液来制备基质溶液)进行混合。将2μl的此溶液上样到MALDI靶板上并让其风干，然后进行质谱分析。

用MALDI-TOF-MS分析对蛋白水解消化物中的IgG和IgG片段进行分析。使用VoyagerDEBiospectrometry工作站(AppliedBioSystems(FosterCity，CA))在延时引出的线性或反射正离子([M+H]⁺)模式下进行MALDI-TOF-MS分析。用蛋白质校准试剂盒(Sigma)对该仪器进行外部校准。结果表明，Asn359处存在的N-连接糖基化明显使得对MMP-3(图5A、5C、5E)和NE(图5B、5D、5F)的抗性提高，这两种蛋白酶是在下铰链区中对这些底物进行切割。经过与MMP-3共同温育8个小时后，不到20％的原始CNTO530保持完整，而超过60％的CNTO5303保持完整。在CNTO7363和CNTO736中也观察到类似的结果。经过与NE温育8个小时后，不到10％的CNTO530Fc保持完整，而50％的CNTO5303Fc保持完整，从CNTO7363和CNTO736的Fc片段中也同样观察到类似的结果。在第359位处具有新的糖基化但在第297位处缺乏天然Fc糖基化的CNTO5304和CNTO7364变体，表现出对MMP-3中度敏感(图5E)，但对NE的敏感性明显更大(图5F)。还要确定的是，天然Fc糖基化的缺乏对NE敏感性的直接影响程度，或在不存在天然糖基化的情况下造成的上端Fc域错折叠对NE敏感性的间接影响程度。由于MMP-3和NE均在MIMETIBODY^TM构建体铰链区的附近进行切割，因此所引入的远离切割位点的新糖基化位点(见图2)对蛋白质构象具有明显的变构效应，如置换一些氨基酸时所观察到的。但无法排除的是T359N或N361T置换本身可能造成这种变构效应。

实例3.Fc糖基化变体的体内行为

在本研究中，在小鼠中对CNTO530的糖基化变体的药代动力学进行比较。按重量将得自CharlesRiversLaboratories(Raleigh，NC)的正常健康的8-12周龄雌性Balb/c小鼠(约18-22g)随机放入塑料的顶部带过滤器的笼子内分组圈养(4只小鼠/笼)，并随意提供市售的啮齿动物食物和酸化水。在小鼠(每个试验物品4只)的腹腔内注射10ml/kg剂量的以0.1mg/ml在Dulbecco’sPBS中配制的CNTO530或CNTO5303，以达到1mg/kg的剂量。

在第2、7、16、26和35天收集血样，在前26天是通过一系列眼眶后放血从每只CO₂麻醉的小鼠收集。在第35天是通过心脏穿刺从CO₂麻醉的小鼠中收集最终血样。按照样品来源动物来标记所有的样品，从而可对各只动物进行时程分析。

让所有血样在室温下放置至少30分钟，但不超过1小时，然后在3500rpm的转速下离心15分钟并分离血清。将血清样品储存在-20℃，直到本研究结束为止，此时对所有样品一起进行分析。

通过标准的ELISA方法对所有小鼠的血清样品进行人Fc的分析，该方法需要如下几个步骤：用多克隆山羊抗人IgGFc片段包被96孔EIA板，将血清样品的哥哥稀释液进行温育，用HRP缀合的多克隆山羊抗人IgG检测结合的人IgG，然后加入适当的显色底物。使用掺入到正常血清中的试验物品的滴定量来建立标准曲线，以用于定量目的。

将对各个血清样品所测定的人Fc浓度归一化到第2天的血清含量并作图。结果显示，CNTO5303糖基化变体的药代动学分布图与CNTO530的药代动学分布图基本没什么区别，这表明新型聚糖在正常健康的小鼠中对半衰期无有害影响(图7)。

Claims

1.一种分离的对蛋白酶的抗性提高的含Fc的分子，所述分子包含具有N-糖基化位点的人IgG抗体Fc域，所述Fc域在与EU编号相关的残基359和361处具有N-糖基化位点，其中残基359从Thr变为Asn，残基361从Asn变为Thr。

2.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述Fc域为IgG4。

3.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述N-糖基化位点远离蛋白水解切割位点，且在CH3域中。

4.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述Fc域来自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4分子中的任何一种。

5.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子是抗体或Fc融合蛋白。

6.根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶，所述基质金属蛋白酶选自溶基质蛋白酶MMP-3和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。

7.糖基化的含Fc的蛋白制剂在制备用于治疗特征在于蛋白酶的释放的疾病的药物中的用途，所述蛋白包含具有N-糖基化位点的人IgG抗体Fc域，所述Fc域在与EU编号相关的残基359和361处具有N-糖基化位点，其中残基359从Thr变为Asn，残基361从Asn变为Thr。