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CN102770553A - 用于测定包含tc1507事件的玉米的接合性的端点taqman法 - Google Patents

用于测定包含tc1507事件的玉米的接合性的端点taqman法 Download PDF

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CN102770553A
CN102770553A CN2010800642696A CN201080064269A CN102770553A CN 102770553 A CN102770553 A CN 102770553A CN 2010800642696 A CN2010800642696 A CN 2010800642696A CN 201080064269 A CN201080064269 A CN 201080064269A CN 102770553 A CN102770553 A CN 102770553A
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W.马奇奥尼
S.诺瓦克
M.古普塔
T.W.格里尼
S.库姆帕特拉
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Abstract

提供了一种用于对玉米Cry1F事件TC1507的接合性分析的方法。该方法提供了在端点二重TaqMan PCR测定法中使用的TC1507事件特异性和玉米内源参照基因特异性引物和TaqMan探针组合，其能够产生帮助TC1507分子育种的强力基因型调用(call)。

Description

用于测定包含TC1507事件的玉米的接合性的端点TAQMAN法
发明背景
I是一种对昆虫损害(特别是欧洲玉米螟的)有抗性的商业玉米产品，其包含Cry1F事件TC1507。该事件本身披露于例如美国专利No.7,605,310和7,449,564。
可以使用多种方法来检测玉米样品中的此事件的存在。一个例子是焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，如由Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所描述的。在此方法中，设计与相邻的基因组DNA和插入DNA连接重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(在插入序列中的一条引物和在侧翼基因组序列中的一条)杂交，并在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸酯和萤光素的情况中温育。个别添加DNTP，并且掺入导致测量的光信号。由于成功扩增、杂交、和单或多碱基延伸，光信号指示转基因插入/侧翼序列的存在。(此技术通常用于初始的测序，在特定基因已知时不用于其检测)。
荧光偏振是另一种可以用于检测扩增子的方法。遵循此方法，将寡核苷酸设计为与基因组侧翼和插入DNA连接重叠。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(在插入DNA中的一条引物和在侧翼基因组DNA序列中的一条)杂交，并在存在DNA聚合酶和经荧光标记的ddNTP的情况中温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。可以使用荧光计以偏振变化测量掺入。由于成功扩增、杂交、和单碱基延伸，偏振变化指示转基因插入/侧翼序列的存在。
TAQMAN(Life Technologies,Foster City,Calif.)是一种检测并量化DNA序列的存在的方法。简言之，将FRET寡核苷酸探针设计为转基因内的一种寡聚物和侧翼基因组序列中的一种以进行事件特异性检测。在存在热稳定性聚合酶和dNTP的情况中循环FRET探针和PCR引物(在插入DNA序列中的一条引物和在侧翼基因组序列中的一条)。FRET探针的杂交导致对荧光模块的切割和释放，远离FRET探针上的淬灭模块。由于成功扩增和杂交，荧光信号指示侧翼/转基因插入序列的存在。
已经描述了分子信标(Molecular Beacon)在序列检测中使用。简言之，设计与侧翼基因组和插入DNA连接重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有使荧光和淬灭模块保持极其接近的二级结构。在存在热稳定性聚合酶和dNTP的情况中循环FRET探针和PCR引物(在插入DNA序列中的一条引物和在侧翼基因组序列中的一条)。在成功的PCR扩增后，FRET探针与靶序列的杂交导致除去探针二级结构和空间分离荧光和淬灭模块。由于成功扩增和杂交，荧光信号指示侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
许多中的另一个考验是寻找适合于给定测试的参照基因。例如，如Czechowski等的摘要中所述的，“来自Affymetrix ATH1全基因组GeneChip研究的格外大的数据集提供了鉴定在模式植物物种拟南芥属(Arabidopsis)(拟南芥(Arabidopsis thaliana))中具有非常稳定的表达水平的新一代参照基因的手段。找到贯穿发育及在一系列环境条件下就表达稳定性而言胜过传统的参照基因的数百种拟南芥基因。”(Czechowski等(2005)Genome-wideidentification and testing of superior reference genes for transcript normalizationin Arabidopsis.Plant Physiol.139,5–17)。
Brodmann等(2002)涉及欧盟批准的4种不同玉米品种的食物中的转基因玉米含量的实时定量PCR检测。Brodmann,P.D.,P.D.,Ilg E.C.,Berthoud H.和Herrmann,A.Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods forFour Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food.J.of AOAC international 2002 85(3)。
Hernandez等(2004)提及与实时PCR一起使用的4种可能的基因。Hernandez,M.,Duplan,M.-N.,Berthier,G.,Vaitilingom,M.,Hauser,W.,Freyer,R.,Pla,M.和Bertheau,Y.Development and comparison of four real-timepolymerase chain reaction systems for specific detection and quantification ofZea mays L.J.Agric.Food Chem.2004,52,4632-4637。
Costa等(2007)考虑这4种基因(也在实时PCR背景中)，并且推断醇脱氢酶和玉米醇溶蛋白基因是用于检测转基因饲料混合组织的样品“事件”(凝集素基因)的最好的参照基因。Costa,L.D.和Martinelli L.Development of aReal-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining anUnexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components.J.Agric.Food Chem.2007,55,1264-1273。
Huang等(2004)使用质粒pMulM2作为参照分子来检测玉米中的MON810和NK603转基因。Huang和Pan,“Detection of Genetically ModifiedMaize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase ChainReaction Methods,”J.Agric.Food Chem.,2004,52(11),pp 3264–3268。
Gasparic等(2008)通过与循环探针技术、TaqMan、和各种实时PCR化学比较提示了LNA技术，以定量分析玉米事件(诸如MON810)。Cankar,和Gruden,“Comparison of different real-time PCR chemistries and theirsuitability for detection and quantification of genetically modified organisms,”BMC Biotechnol.2008;8:26。
US 20070148646涉及一种用于量化的引物延伸方法，其需要可以通过掺入的核苷酸量检测并量化的个别核苷酸的受控分配。这与使用内部参照基因的TaqMan PCR方法不同。
为了区别TC1507的纯合子和半合子基因型，已经为此事件成功使用Invader测定法。Gupta,M.,Nirunsuksiri,W.,Schulenberg,G.,Hartl,T.,Novak,S.,Bryan,J.,Vanopdorp,N.,Bing,J.和Thompson,S.A non-PCR-basedInvader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex PlantGenomes.Mol.Breeding 2008,21,173-181。
Huabang(2009)涉及转基因玉米的基于PCR的接合性测试。然而，似乎没有使用参照基因。Huabang,“An Accurate and Rapid PCR-Based ZygosityTesting Method for Genetically Modified Maize,”Molecular Plant Breeding,2009,Vol.7,No.3,619-623.
发明概述
本发明部分涉及用于测定玉米中的事件TC1507的接合性的分子测定法。更具体地，本发明部分涉及利用玉米内源参照基因的用于玉米中的
Figure BDA00002030897300033
I事件TC1507的端点TaqMan PCR测定法。一些实施方案涉及能够高通量接合性分析的测定法。本发明进一步部分涉及用于测定接合性的优选参照基因的发现。
附图简述
图1显示了样品数目与SOB1/SOB2的绝对比率间的分布图的例子。
图2是TC1507与调查的不同参照基因的二重(biplex)组合的实时PCR扩增图。用Cry1F纯合子基因组DNA的2倍连续稀释液分别对TC1507与ivr(2a)、hmg(2b)、ivr104(2c)、和zein(2d)的二重显示实时PCR扩增图。用每个稀释液得到的Ct值在其相应的图内部显示。
图3是使用不同参照基因用端点TaqMan的Cry1F接合性测定的分布图。对于使用：ivr104(a)、ivr(b)、hmg(c)和zein(d)作为参照基因的测定法，小图如下。在完成PCR和荧光读数后，产生分布图：SOB1=FAM的高于背景的信号(于535nm的高于背景信号平均值的样品信号)、SOB2=Cy5的高于背景的信号(于670nm的高于背景信号平均值的样品信号)。对于ivr104(a)，可以进行基因型调用(call)，其中对于野生型，SOB1/SOB2<0.5，对于半合子，0.5<SOB1/SOB2<2，而对于纯合子，SOB1/SOB2>2。
图4显示了对三个群体(对于每个群体为2块96孔板的基因组DNA)使用ivr104作为参照基因用端点TaqMan测定法的Cry1F接合性测定的验证。在完成PCR和荧光读数后，产生分布图：SOB1=FAM的高于背景的信号(于535nm的高于背景信号平均值的样品信号的比率)、SOB2=Cy5的高于背景的信号(于670nm的高于背景信号平均值的样品信号的比率)。因而，用纯合子、半合子和野生型的独特簇进行基因型调用。图4a是对Cry34/35 PoCry1F叠加群体用端点TaqMan测定法的Cry1F接合性测定的分布图。图4b是对PoCry1F单一叠加群体用端点TaqMan测定法的Cry1F接合性测定的分布图。图4c(PoCry1F_NK603)仅具有两个簇(纯合子和半合子)，因为如预期的，WT植物未幸免于除草剂喷雾。
序列简述
SEQ ID NO:1是玉米事件TC1507的5’侧翼序列的序列。
SEQ ID NO:2是玉米事件TC1507的3’侧翼序列的序列。
SEQ ID NO:3是玉米事件TC1507的连续序列，其包含5’侧翼序列、cry1F插入物、和3’侧翼序列。
SEQ ID NOs:4-21是依照本发明使用的例示的引物和探针。
发明详述
本发明部分涉及基于荧光的端点TaqMan PCR测定法，其利用内源基因作为参照(拷贝数)对照以对TC1507(即一种玉米Cry1F事件)进行高通量接合性分析。本发明进一步部分涉及优选的参照基因转化酶的发现。将几种参照基因鉴定为可能的选项。
本发明还部分涉及用于TC1507事件特异性接合性分析的二重端点TaqMan PCR的开发。此外，本发明部分涉及TC1507育种测试试剂盒的开发。
端点TaqMan测定法基于+/-策略，根据该策略，“+”表示样品在测定的基因方面呈阳性，而“-”表示样品在测定的基因方面呈阴性。这些测定法通常利用分别用于鉴定TC1507转基因序列和野生型基因序列的两组寡核苷酸以及测量转基因和野生型序列含量的经双重标记的探针。
虽然Invader测定法已经是一种用于表征这些事件的稳健技术，但是它对DNA质量非常灵敏。另外，该测定法需要较高的DNA数量。Invader还需要额外的变性步骤，若不正确操作，它可使Invader测定法不成功。另外，Invader测定法的较长测定时间在其有效加工商业背景中分析的大量TC1507样品的灵活性上受到限制。本发明的一个主要优点是节省时间的且消除变性步骤。
用于检测TC1507事件的主题端点TaqMan分析提供与Invader相比的令人惊讶的优点，特别是在分析大量样品中。然而，其对TC1507的应用是复杂的。举例而言，TC1507的边界区不是实际的基因组序列。例如，它含有重复侧翼序列。它是一种含有转基因片段和反转录转座子的独特序列，其会被理解为一种执行此上下文中的端点Taqman测定法+/-策略的非常显著的障碍。
另外，例如，尝试多种引物和探针组合。然而，那些组合无一导致能够区别野生型等位基因和转基因的强力信号。
在一个实施方案中，TC1507事件特异性PCR反应扩增出对于事件独特的58-bp片段，其源自TC1507构建体盒对玉米基因组DNA的插入。TC1507靶物特异性寡核苷酸探针结合两种事件特异性PCR引物间的靶物，并且用荧光染料和淬灭剂标记。可能的荧光标记物包括在TC1507探针5’端作为报告物染料的FAM和在TC1507探针3’端作为淬灭剂的Black Hole Quencher 1(BHQ1)。
使用一批经验因素以及我们的判断，我们凭经验鉴定出如下的玉米内源基因，其能够单或低拷贝数PCR扩增，并且证明了其在许多栽培种中是保守的。大量参照基因是可能性。我们为了初始评估选择的参照基因作为TC1507接合性分析的可能的参照基因评估。选出5组寡聚物(表1)：ivr、ivr104(来自转化酶的79和104bp片段)、adh(来自adh1的136bp片段)、hmg(来自hmga的79bp片段)、和zein(来自玉米醇溶蛋白的72bp片段)。评估基因特异性引物和基因特异性探针(在一个实施方案中用探针5’端的Cy5和探针3’端的BlackHole Quencher 2(BHQ2)标记)以在作为TC1507接合性分析的可能的参照基因评估的玉米内源基因的快速量化中使用。
对Cry1F基因和玉米内源基因的基因特异性引物和探针测试PCR效率。对多重化(multiplexing)性能和端点TaqMan接合性测定法进一步利用测定为与Cry1F事件特异性引物和探针具有相对相似的PCR效率的玉米内源基因的引物和探针组合。
对所有寡聚物测试PCR效率。对多重化和端点TaqMan接合性测定法进一步利用与事件特异性寡聚物具有相对接近的PCR效率的寡聚物。
在一些实施方案中，此接合性测定法在相同扩增测定法中利用对TC1507事件和对玉米内源参照基因(在一些优选的实施方案中为转化酶)特异性的寡核苷酸的二重。通过与参照DNA相比，对事件TC1507特异性的荧光的相对强度来测定接合性。
在一些实施方案中，TC1507事件特异性测定法扩增出对于事件独特的58-bp片段，其源自TC1507构建体盒对玉米基因组DNA的插入。靶物特异性寡核苷酸探针结合两种事件特异性TC1507 PCR引物间的靶物，并且用两种荧光染料标记：在其5’端作为报告染料的FAM和在其3’端作为淬灭剂染料的BHQ。在最佳循环数后测量PCR产物，此时反应处于早期指数期。
在一些实施方案中，玉米特异性参照系统扩增出转化酶基因的104bp片段。使用一对转化酶特异性寡聚物和在3’端用Cy5和在5’端用BHQ标记的转化基因特异性探针进行快速定量。
在一些实施方案中，用于TC1507接合性分析的基于荧光的端点TaqMan测定法容许在读板仪中直接读取结果以鉴定玉米中的
Figure BDA00002030897300061
I事件TC1507和参照基因。
本发明包括育种应用诸如测试
Figure BDA00002030897300062
I对其它玉米系的基因渗入(introgression,渐渗入)。
可以使用本发明的检测方法和试剂盒来鉴定依照本发明的事件。可以使用本发明的方法和试剂盒进行加速的育种策略及建立连锁数据。本发明的检测技术与植物育种一起特别是有用的，以在将包含感兴趣事件的亲本植物与另一种亲本系杂交以在后代中赋予一种或多种感兴趣的其它性状后，测定哪些后代植物是否包含给定的事件。这些Taqman PCR分析法使玉米育种程序及质量控制受益，尤其对于商业化的转基因玉米种子。现在还可以生成并使用用于这些转基因玉米系的Taqman PCR检测试剂盒。这还可以使产品登记和产品管理受益。
此外，可以使用本发明来研究并表征转基因整合过程、基因组整合位点特征、事件分选、转基因及其侧翼序列的稳定性、和基因表达(尤其是涉及基因沉默、转基因甲基化模式、位置效应和潜在的表达相关元件诸如MARS[基质附着区]等)。
本发明进一步包括使用TC1507植物作为至少一个亲本进行杂交的方法。例如，本发明包括具有本文中例示的任何植物作为一个或两个亲本的F1杂种植物。本发明包括一种用于生产F1杂种种子的方法，其通过将例示的植物与不同(例如，近交亲本)植物杂交，收获所得的杂种种子，并测试依照本发明的种子/植物样品来进行。可以通过仔细考虑亲本植物来改善所得植物的特征。
可以如下育种昆虫抗性玉米植物，即首先将由自本文中提及的任一种系的种子种植的玉米植物组成的第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，由此生成多个第一后代植物；然后选出对昆虫有抗性(或拥有本发明的至少一个事件)的第一后代植物；并自交第一后代植物，由此生成多个第二后代植物；然后自第二后代植物选出对昆虫有抗性(或拥有本发明的至少一个事件)的第二后代植物。这些步骤可以进一步包括第一后代植物或第二后代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物的回交。然后，可以种植包含本发明的玉米种子的玉米作物或其后代。
还应当理解，也可以将两种不同转基因植物杂交以生成含有两个独立分离的添加的外源基因的后代。合适后代的自交可以生成在这两种添加的外源基因方面纯合的植物。因为是无性繁殖，所以也涵盖与亲本植物回交和与非转基因植物的异型杂交。通常用于不同性状和作物的其它育种方法是本领域中已知的。已经使用回交育种来将简单遗传的、高度可遗传性状的基因转移入期望的纯合栽培种或近交系(其作为回归亲本)中。要转移的性状的来源称作供体亲本。预期所得的植物具有回归亲本(例如栽培种)的属性和自供体亲本转移的期望的性状。在初始杂交后，将拥有供体亲本表型的个体选出并与回归亲本重复杂交(回交)。预期所得的亲本具有回归亲本(例如栽培种)的属性和自供体亲本转移的期望的性状。
本发明的DNA分子在标志物辅助育种(MAB)方法中可以作为分子标志物使用。本发明的DNA分子可以在鉴定遗传连锁的农艺学有用的性状的方法(诸如AFLP标志物、RFLP标志物、RAPD标志物、SNP、和SSR)中使用，如本领域中已知的。可以使用MAB方法在与本发明的玉米植物(或其后代及任何其它玉米栽培种或品种)的杂交后代中追踪昆虫抗性性状。DNA分子是此性状的标志物，并且可以使用本领域中公知的MAB方法来在玉米植物中追踪昆虫抗性性状，其中本发明的至少一种玉米系或其后代是亲本或祖先。可以使用本发明的方法来鉴定具有来自玉米系TC1507的昆虫抗性事件的任何玉米品种。
本发明的方法包括一种生成昆虫抗性玉米植物的方法，其中所述方法包括用本发明的植物育种。更具体地，所述方法可以包括杂交本发明的两种植物，或本发明的一种植物和任何其它植物，并追踪依照本发明的主题事件。优选的方法进一步包括通过对所述后代分析依照本发明可检出的事件来选择所述杂交的后代。
依照本发明繁殖并开发的一种优选的植物，或种子包含在其基因组中至少一种插入物序列(如表1中鉴定的)，以及在插入物的两侧上的至少20-500或更多个连续侧翼核苷酸(如表1中鉴定的)。除非另有指示，“事件TC1507”或类似的提及指SEQ ID NO:3的DNA，其包含通过与插入DNA紧密相邻的整个或部分SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2侧翼基因组序列两者(预期其会由于包含该事件的亲本系的有性杂交而转移至接受插入DNA的后代)鉴定的基因组位置中插入的异源DNA。
本文中提供了定义和例子以帮助描述本发明，并且指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有记录，应当依照相关领域普通技术人员的常规用法理解术语。使用DNA碱基的命名，如于37CFR§1.822列出的。
转基因“事件”如下产生，即用异源DNA，即包含感兴趣转基因的核酸构建体转化植物细胞、源自转基因插入植物基因组的植物群体的再生、并选择以插入特定的基因组位置中为特征的特定植物。术语“事件”指包含异源DNA的初始转化体和转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和包含基因组/转基因DNA的另一品种间的有性异型杂交产生的后代。即使在对回归亲本进行重复回交后，插入的转基因DNA和来自所转化亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)在杂交后代中也存在于相同的染色体位置。术语“事件”也指来自初始转化体及其后代的DNA，该DNA包含插入的DNA和紧邻插入DNA的侧翼基因组序列，由于包含所插入DNA的亲本系(例如初始转化体和自交后代)和不含所插入DNA的亲本系间的有性杂交，可以预期该DNA会转移到接受包含感兴趣转基因在内的插入DNA的后代中。
“连接序列”跨越插入基因组中的DNA与在插入点侧翼的玉米天然基因组的DNA连接的点，在植物遗传物质中鉴定或检测出一个或另一个连接序列便足以诊断该事件。包括跨越本文中所描述的玉米事件中的插入物和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断序列的具体例子；然而，与各插入物的连接，或插入物与基因组序列的连接重叠的其它序列也是诊断性的，并且可以依照本发明使用。
部分基于侧翼、连接、和/或插入序列设计依照本发明使用的引物、扩增子和探针。相关引物和扩增子可以作为本发明的组分包括在内。可以使用PCR分析方法来检测或鉴定源自主题专利转基因玉米系的商业化转基因玉米品种或系，所述PCR分析方法使用跨越整个插入DNA及其边界的扩增子。
HERCULEX I(TC1507事件)的5’侧翼序列的序列以SEQ ID NO:1提供。3’侧翼序列的序列以SEQ ID NO:2提供。侧翼有(SEQ ID NOs:1和2的)侧翼序列的cry1F插入物(与调节序列一起)的序列以SEQ ID NO:3提供。表1提供了就SEQ ID NO:3而言的插入物和侧翼序列的坐标。
Figure BDA00002030897300091
这些插入事件及其其它构件在例如美国专利Nos.7,605,310和7,449,564(见例如'564专利的图1)中进一步例示。基于这些插入和边界序列，生成并且可以生成事件特异性引物。PCR分析表明可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子在不同玉米基因型中鉴定这些玉米系。如此，可以使用这些和其它相关规程来独特地鉴定这些玉米系。
如本文中所使用的，“系”指一组在至少一种性状上个体之间展现出很少或没有遗传变异的植物。所述系可以通过几个世代的自花传粉和选择、或者使用组织或细胞培养技术自单一亲本进行营养繁殖来产生。
如本文中所使用的，术语“栽培种”和“品种”是同义的，指用于商业生产的系。
“稳定性”或“稳定的”就给定的组分而言意指组分在世代间且优选地至少三个世代以基本上相同的水平得到维持，例如优选地±15%，更优选地±10%，最优选地±5%。稳定性可以受到温度、位置、应激和种植时间影响。在田间条件下比较随后的世代应当以相似的方式生成组分。
“商业效用”定义为具有良好的植物活力和高能育性，使得农民可以使用常规的耕作设备生产作物，并且可以使用常规的破碎和提取设备自种子提取具有所描述组分的油。为了在商业上有用，产率(如通过每英亩生产的种子重量、油含量、和总油量测量的)在相同地区种植的没有优质价值性状的其它方面相当的商业芸苔品种的平均产率的15%内。
“农艺学良种”意指在由主题事件所致的昆虫抗性外，系具有期望的农艺学特征，诸如产率、成熟度、疾病抗性等。
如本领域技术人员会认可，根据本公开内容，检测试剂盒的优选的实施方案例如可以包含针对“连接序列”或“过渡序列”和/或包含“连接序列”或“过渡序列”的探针和/或引物(其中玉米基因组侧翼序列与插入序列相遇)。例如，这包括包含含有如表1中所指示的残基的序列的多核苷酸探针、引物、或扩增子。一些优选的引物可以包含相邻侧翼序列的至少约15个残基和相邻插入序列的至少约15个残基。可以靶向连接序列的200个碱基左右内的残基。凭借此排列，可以使用侧翼或插入区中的另一种引物来生成可检测的扩增子，其指示本发明的事件的存在。在一些优选的实施方案中，一种引物在侧翼区中结合，而一种在插入物中结合，并且可以使用这些引物来生成如下的扩增子，其跨越(并且包含)连接序列(残基2829-2030和/或9015-9016)，如上文指示的。可以比对SEQ ID NO:1和/或2与SEQ ID NO:3以例示此类连接。
本领域技术人员还会认可，引物和探针可以设计为在一系列标准的杂交和/或PCR条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3(或其互补物)的区段及其互补物杂交，其中引物或探针与例示的序列不完全互补。也就是说，可以容忍一定程度的错配。对于约20个核苷酸的引物，例如，若错配碱基是内部的或在扩增子相反的引物末端，则通常1或2个左右的核苷酸不需要与相反链结合。下文提供了各种合适的杂交条件。也可以在探针中使用合成的核苷酸类似物诸如肌苷。也可以使用肽核酸(PNA)探针及DNA和RNA探针。重要的是此类探针和引物诊断(能够独特地鉴定并区别)本发明事件的存在。
转基因“插入物”或构建体的构件披露于例如美国专利No.7,605,310和7,449,564(见例如'564专利的图1)。这些构件的多核苷酸序列或片段可以作为DNA引物或探针在本发明的方法中使用。
在本发明的一些实施方案中，提供了用于检测来自称作包含Cry1F事件TC1507的HERCULEX的玉米植物的植物和种子等中的转基因/基因组插入区的拷贝数的组合物和方法。提供了DNA序列，其包含SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:3中在本文中提供的至少一种转基因/基因组插入区连接序列、其区段、和例示序列的互补物及其任何区段。插入区连接序列跨越插入基因组中的异源DNA与在插入位点侧翼的来自玉米细胞的DNA间的连接。此类序列对于主题事件是诊断性的。
基于这些插入物和边界序列，生成事件特异性引物。本发明的TaqmanPCR分析表明可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子在不同玉米系和基因型中鉴定玉米事件TC1507。可以使用这些和其它相关的规程来独特地鉴定这些玉米系。
在一些实施方案中，包含转基因/基因组插入区的连续部分/区段(或者与其至少部分互补)的DNA序列是本发明的一方面。包括包含足够长度的转基因插入序列多核苷酸和足够长度的来自一种或多种主题玉米植物的玉米基因组序列的多核苷酸的DNA序列。
相关实施方案属于如下的DNA序列，其包含SEQ ID NO:3的DNA序列的转基因部分或其互补物的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25或更多个连续核苷酸，和选自下组的侧翼玉米DNA序列或其互补物的相似长度：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。此类序列可用作例如DNA扩增方法中的DNA引物。本发明的组分还包括通过此类DNA引物和同源引物生成的扩增子。
本发明还包括在来自本文中提及的至少一种玉米植物的样品中检测DNA存在的方法。此类方法可以包括：(a)使包含DNA的样品与引物对接触，所述引物此时在本发明的核酸扩增反应中与来自这些玉米事件的至少一种的DNA一起使用；(b)使用本文中鉴定的参照基因实施TAQMAN PCR扩增反应；并(c)分析结果。
在又一些实施方案中，本发明包括生成包含本发明的cry1F事件的玉米植物的方法，其中所述方法包括下列步骤：(a)将第一亲本玉米系(包含本发明的表达盒，其对所述系的植物赋予所述昆虫抗性性状)和第二亲本玉米系(其缺乏此昆虫耐受性性状)有性杂交，由此生成多个后代植物；并(b)基于本发明的至少一种测定技术的结果选择后代植物。任选地，此类方法可以包括将后代植物与第二亲本玉米系回交以生成包含所述昆虫耐受性性状的真实育种玉米植物的进一步的步骤。依照本发明的另一方面，提供了测定杂交后代的接合性的相关方法。
可以使用本文中公开的组合物和DNA检测领域中公知的方法开发DNA检测试剂盒。试剂盒可用于鉴定样品中的主题玉米事件DNA，并且可以应用于育种含有此DNA的玉米植物的方法。试剂盒含有与例如本文中公开的扩增子或与主题事件的转基因遗传元件中含有的DNA同源或互补的DNA序列同源或互补的DNA序列。这些DNA序列可以在DNA扩增反应中使用或者作为引物在DNA杂交方法中使用。试剂盒还可以含有实施检测方法必需的试剂和材料。
“探针”是一种分离的核酸分子，其附接有常规的可检测标记物或报告物分子(诸如放射性同位素、配体、化学发光剂、或酶)。此类探针与靶核酸的链，在本发明的情况中，与来自所述玉米事件之一的基因组DNA的链(无论来自玉米植物还是来自包含来自所述事件的DNA的样品)互补。依照本发明的探针不仅包含脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包含聚酰胺和其它探针材料，其特异性结合靶DNA序列，并且可以用于检测所述靶DNA序列的存在。
“引物”是通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物与靶DNA链间的杂合物，并且可以与聚合酶，例如DNA聚合酶一起使用的分离的核酸。本发明的引物对指其用于扩增靶核酸序列的用途，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法来实现。
一般地，探针和引物(和扩增子)的长度为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499或500个多核苷酸或更多。此类探针和引物在高严格性杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，依照本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列相似性，尽管可以通过常规方法设计与靶序列不同，且保留与靶序列杂交的能力的探针。
用于制备和使用探针和引物的方法记载于例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2板,第1-3卷,Sambrook等编,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。PCR引物对可以源自已知的序列，例如，通过使用意图出于所述目的的计算机程序来进行。
可以使用基于本文中所公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针来确认(且若必要的话，校正)公开的序列，其通过常规的方法，例如通过对此类序列再克隆和测序来进行。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可以使用任何常规的核酸杂交或扩增方法来鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下与其它核酸分子特异性杂交。如本文中所使用的，若两个分子能够形成反平行的、双链核酸结构，则所述两个核酸分子被说成能够彼此特异性杂交。一个核酸分子被说成是另一个核酸分子的“互补物”，若它们展现出完全的互补性。如本文中所使用的，在分子之一的每个核苷酸与另一个的核苷酸互补时，分子被说成展现出“完全的互补性”。若两个分子能以足以容许它们至少在常规的“低严格性”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被说成是“最小程度互补的”。类似地，若分子能以足以容许它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被说成是“互补的”。常规的严格性条件由Sambrook等,1989描述。因此，偏离完全的互补性是可允许的，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的性能。为了使核酸分子充当引物或探针，它仅需要在序列上足够互补，使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。
如本文中所使用的，基本上同源的序列是如下的核酸序列，其会在高严格性条件下与其比较的核酸序列的互补物特异性杂交。术语“严格条件”就通过Sambrook等,1989,于9.52-9.55讨论的特定杂交规程实现的核酸探针与靶核酸(即，与感兴趣的特定核酸序列)杂交而言进行功能限定。还可见Sambrook等,1989，于9.47-9.52和9.56-9.58。因而，可以使用本发明的核苷酸序列来实现其与DNA片段的互补区段选择性形成双链体分子的能力。
根据想象的应用，可以使用不同杂交条件来实现探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高灵敏性的应用，通常会采用相对严格的条件来形成杂合物，例如会选择相对较低的盐和/或高温的条件，诸如通过约0.02M至约0.15M NaCl于约50°C至约70°C的温度提供。例如，严格条件可以牵涉用高严格性清洗缓冲液(0.2X SSC,0.1%SDS,65°C)将杂交滤膜清洗至少两次。促进DNA杂交的适当严格性条件，例如，6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)于约45°C，接着于50°C用2.0X SSC清洗是本领域技术人员已知的，6.3.1-6.3.6。例如，可以自约2.0X SSC于50°C的低严格性至约0.2X SSC于50°C的高严格性选择清洗步骤中的盐浓度。另外，清洗步骤中的温度可以自室温(约22°C)的低严格性条件提高至约65°C的高严格性条件。温度和盐两者可以有所变化，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而另一个变量是变化的。此类选择性条件耐受(tolerate)很少的(若有的话)探针与模板或靶链间的错配。经由杂交检测DNA序列是本领域普通技术人员公知的，并且美国专利Nos.4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法例示性的。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸会在高严格性条件下与本文中例示或提示的一种或多种引物(或扩增子或其它序列)，包括其互补物和片段特异性杂交。在本发明的一方面，本发明的核酸分子具有SEQ IDNOs:4-21中所列的核酸序列，或其互补物和/或片段。
在本发明的另一方面，本发明的标志物核酸分子与此类核酸序列共享80%-100%或90%-100%序列同一性。在本发明的又一方面，本发明的核酸分子与此类序列共享95%-100%序列同一性。可以在植物育种方法中使用此类序列，例如以鉴定遗传杂交的后代。可以通过本领域技术人员已知的许多方法来检测探针与靶DNA分子的杂交，这些可以包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签、和化学发光标签。
关于使用特定扩增引物对来扩增靶核酸序列(例如通过PCR进行)，“严格条件”指容许引物对仅与如下的靶核酸序列杂交，并且优选地生成独特的扩增产物，即扩增子的条件，所述靶核酸序列会与具有相应的野生型序列(或其互补物)的引物结合。
术语“(靶序列)特异性”指示探针或引物在严格杂交条件下仅与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。
如本文中所使用的，“扩增DNA”或“扩增子”指作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了测定源自有性杂交的玉米植物是否含有来自本发明玉米植物的转基因事件基因组DNA，可以使用引物对将自玉米植物组织样品提取的DNA进行核酸扩增方法，所述引物对包括源自植物基因组中在插入异源DNA的插入位点附近的侧翼序列的引物，和源自插入异源DNA的第二引物以生成诊断事件DNA存在的扩增子。扩增子具有一定的长度，并且具有也是事件诊断性的序列。扩增子的长度范围可以为引物对加一个核苷酸碱基对的组合长度和/或引物对加约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,or 500,750,1000,1250,1500,1750,2000或更多个核苷酸碱基对(加或减上文所列的任何增量)的组合长度。或者，引物对可以源自插入DNA两侧上的侧翼序列，从而生成包括整个插入核苷酸序列的扩增子。源自植物基因组序列的引物对成员可以位于离插入DNA序列一段距离。此距离范围可以为一个核苷酸碱基对多至约2万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用明确排除可以存在于DNA热扩增反应中的引物二聚体。
可以通过本领域中已知的多种核酸扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现核酸扩增。多种扩增方法是本领域中已知的，并且记载于美国专利No.4,683,195和美国专利No.4,683,202等。已经开发出PCR扩增方法来扩增出多至22kb的基因组DNA。这些方法及DNA扩增领域中已知的其它方法可以在本发明的实践中使用。可以通过使用源自本文中提供的序列的引物自所述事件扩增此类序列，接着对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序来确认(若必要的话，校正)来自主题玉米事件的异源转基因DNA插入物或侧翼基因组序列的序列。
可以通过多种技术来检测通过这些方法生成的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色是一种用于检测DNA扩增子的常见的公知方法。另一种此类方法是遗传比特分析(Genetic Bit Analysis)，其中设计如下的DNA寡核苷酸，其与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列两者重叠。将寡核苷酸在多孔板的孔中固定化。在感兴趣区域的PCR后(使用插入序列中的一条引物和相邻侧翼基因组序列中的一条引物)，单链PCR产物可以与固定化的寡核苷酸杂交，并且充当使用DNA聚合酶和对预期的下一个碱基特异性的经标记ddNTP进行的单碱基延伸反应的模板。读出可以是荧光的或基于ELISA的。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，信号指示插入物/侧翼序列的存在。
通过提及而将本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物以它们不与本申请的明确教导矛盾的程度完整收入。
实施例
实施例1：总基因组DNA的分离及量化和PCR引物扩增。如下自个别样品分离来自Cry1F纯合子、半合子和野生型样品的基因组DNA，即每份样品对8个叶盘冲孔，并使用Genogrinder 2000将盘研磨成细粉末。使用定制的
Figure BDA00002030897300181
gDNA植物试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)或Qiagen DNeasy96孔试剂盒(Valencia,CA)提取DNA。在PCR前，用Quant-iTTM
Figure BDA00002030897300182
量化试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)使用制造商的用法说明书量化DNA样品。
寡核苷酸引物和具有FAM和Black Hole Quencher 1(BHQ1)的经双重标记的TaqMan探针由MWG Biotech(High Point,NC)合成（表1b）。
表1b：引物和经双重标记的TaqMan探针的序列
Figure BDA00002030897300183
Figure BDA00002030897300191
具有Cy5和BHQ2的经双重标记的TaqMan探针由IDT(Integrated DNATechnologies,Coralville,IA)合成。将所有引物在1x Tris-EDTA中以200μM溶解，并将探针以100μM溶解。将引物和经双重标记的TaqMan探针的工作储液用分子级水稀释10倍。
对于一重反应使用2.5mM至5.5mM的MgCl2浓度依照表2a,2b和2c设立PCR反应。
表2a：具有25μl终体积的每个反应的PCR混合物(2.5mM MgCl2)。
Figure BDA00002030897300192
表2b：具有25μl终体积的每个反应的PCR混合物(4mM MgCl2)。
Figure BDA00002030897300193
表2c：具有25μl终体积的每个反应的PCR混合物(5.5mM MgCl2)。
Figure BDA00002030897300194
Figure BDA00002030897300201
依照表3设立多重反应的PCR反应。使用来自Qiagen的HotStar Taq DNA聚合酶(HotStar Taq、10x PCR缓冲液、和25mM MgCl2)(Valencia,CA,产品目录编号203203或203205)和来自Applied Biosystems的10mM dNTP核苷酸混合(Foster City，CA,产品目录编号N8080260)。在iCycler光学系统(BioRad,Hercules,CA)上实施实时PCR反应，如推荐的，以于95°C变性15分钟开始，接着是95°C持续15秒、60°C持续1分钟的50个循环。在每个循环结束时记录荧光信号。
依照表3设立端点TaqMan PCR测定法。使用ABI
Figure BDA00002030897300202
PCR系统9700(Applied Biosystems,Foster City，CA)扩增。在测定为28个循环的最佳循环数后通过4%E-凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)或者通过荧光分光光度计(Tecan GENios,
Figure BDA00002030897300203
Switzerland)测量PCR产物(表4)。
表3：具有25μl终体积的每个二重反应的PCR混合物。
Figure BDA00002030897300204
表4：用于读取PCR产物的具有推荐的波长的仪器设置。
Figure BDA00002030897300211
通过iCycler软件(第3.0a版)自动计算实时PCR阈值，其具有略高于背景的荧光数值。通过产生高于建立的阈值的荧光需要的循环数确定阈值循环(Ct值)。基于输入基因组DNA和Ct值评估PCR效率。
计算FAM对Cy5的高于背景的信号的比率。在Excel中对每个群体将比率的绝对值绘图。基因型调用(Genotype calls)基于对照(纯合子、半合子和野生型)及分离群的簇分布。
实施例2：玉米内源基因的PCR效率测试。开发端点TaqMan接合性测定法中的一个方面是选择最合适的内源基因作为参照基因。我们选择物种特异性的且在基因组中具有低拷贝数的转化酶，即一种合适的参照基因。最初在数千个可能性中调查4种玉米内源基因，即醇脱氢酶1(adh1)、高速泳动族蛋白a(hmga)、转化酶(ivr)、和玉米醇溶蛋白(zein)作为事件TC1507中的玉米Cry1F的可能的参照基因。
选择合适的参照基因的过程牵涉首先合并30ng提取的Cry1F纯合子、半合子和野生型玉米基因组DNA对照(依照本实施例中描述的分离规程提取)以评估所有引物的PCR效率。依照表2c设立TC1507和5种最初选定的参照基因(ivr、ivr104、adh、hmg、zein)的PCR。然后，在4%E-凝胶上显现32个循环后的PCR产物。所有引物扩增的预期大小片段和4种参照基因都具有相似强度的条带。与其它最初选定的参照基因测定法相比，参照基因选项adh的测定法生成更少的产物。TC1507事件特异性寡聚物仅在纯合子和半合子对照中生成扩增子，其中纯合子样品的条带更亮。
对于端点TaqMan测定法，在单一反应(多重的)中扩增转基因和参照基因反应两者。尝试对这两种基因实现最佳的PCR效率，使用实时PCR对30ng来自纯合子样品的基因组DNA用不同浓度的MgCl2一式三份测试所有引物(见表2a,2b和2c)。
表5提供了以不同浓度的MgCl2用30ng Cry1F纯合子基因组DNA的针对ivr、adh、ivr104、hmg、zein和TC1507的实时PCR的Ct值。
表5
Figure BDA00002030897300221
最初选定的参照基因玉米醇溶蛋白和TC1507的循环阈值(Ct)的均值数值在高浓度的MgCl2(4mM和5.5mM)时是相似的(约21)，而最初选定的参照基因ivr和hmg的均值数值具有更高的Ct值(约23至约25)。最初选定的参照基因adh具有大于26的Ct值，并且排除作为选项。MgCl2浓度5.5mM对于所有测试基因的扩增反应具有最低的Ct值，并且如此在随后的实验中使用。
依照表3用来自合并的纯合子的DNA的1:2连续稀释液(一式三份实施)使用实时PCR将最初选定的参照基因ivr、ivr104、hmg和zein的引物与TC1507多重化(multiplex)。
再次使用Ct值来比较PCR的效率。图2显示了TC1507与调查的不同参照基因的二重组合。TC1507的Ct值表明每个稀释间约一个循环的差异。TC1507的PCR效率是100%。在大多数稀释液中实施参照基因及TC1507反应。
实施例3：用于接合性基因型分型的端点TaqMan测定法的测试。使用端点TaqMan PCR(表3)，使用具有分离TC1507的Cry1F单一叠加群体(singlestack population)(Q:07K:PF04DS_ZYGO)来测试一种参照基因(ivr,ivr104,hmg或zein)与TC1507的多重化。在端点TaqMand PCR前，相对于10ng/μl标准化DNA。将TaqMan PCR反应于28个循环终止，然后用荧光分光光度计测量。计算高于背景(H2O)的FAM(TC1507)(作为高于背景的信号1(SOB1))，和高于背景的Cy5(参照基因)2(SOB2)的荧光信号。在Excel中以散布图将SOB1/SOB2的比率绘图。在分离群体中，应当获得数据点的三个簇，容许视觉测定截留点。发现了仅在本文中公开的反应条件下与TC1507多重化的Ivr104可以产生明确的基因型调用。其它最初选定的参照基因反应(ivr、hmg和zein)不能在纯合子和半合子间产生足够的分离以产生明确的基因型调用。
实施例4：用不同群体的方案的使用。已知可以通过植物的遗传背景影响基于Invader和PCR的接合性分析(5)。通过来自不同遗传背景的具有三个群体的植物的遗传背景对用于Herculex I事件TC1507的端点TaqMan接合性测定法测试效果。每种背景由184份样品(两块96孔板的DNA)组成。三个群体是：Cry34/35_PoCry1F和PoCry1F_NK603双重叠加和PoCry1F单一叠加。如图4a和图4b中显示的，Cry34/35_PoCry1F和PoCry1F两者产生典型的三个簇，纯合子在顶部，半合子在中间，而野生型(WT)在底部。而PoCry1F_NK603(图4c)仅具有两个簇(纯合子和半合子)，因为如预期的，WT植物未幸免于除草剂喷雾。与Invader测定法比较结果，98.8%的得分在两次分析间是相同的。在得分上具有矛盾的7种植物中，在Invader测定法中的6个纯合子在使用端点TaqMan分析时变为半合子。一个半合子变为纯合子。
一种强力的接合性测定法需要在分离群体中清楚区分感兴趣基因的两种等位基因。如本研究中所描述的，不同参照基因也可以促成结果的显著差异。此外，基因型调用应当基于来自每个群体数据的簇。
测定了玉米内源基因转化酶是适合于玉米中的TC1507事件的参照基因。因此，依照实施例5开发用于TC1507事件特异性接合性分析的高通量二重端点TaqMan PCR，其能够产生强力的基因型。
实施例5：在高通量二重端点TaqMan PCR中使用转化酶以测定玉米中 的
Figure BDA00002030897300231
I事件TC1507的接合性。通常建立PCR和热循环条件，其以可接受的相对荧光单位(RFU)在已知的基因组DNA模板中扩增转基因和/或参照序列两者。若没有扩增内源参照基因或者若没有以比转基因对照高0.5-1个单位的荧光读数扩增转基因序列，则可以进行通过改变引物浓度和/或其它参数的优化。
模板DNA：对每个样品的8个叶盘取样，并依照制造商的用法说明书制备模板DNA(基因组DNA提取试剂盒(DNeasy 96孔试剂盒,Qiagen,Valencia,CA,产品目录编号69181)或等同物)。(一些其它材料及其来源的进一步描述可见实施例1)。一般地，每25μl反应的30ng总基因组DNA产生最佳的结果。
测试和对照物质：阴性对照玉米DNA样品是不含
Figure BDA00002030897300232
I事件TC1507的非转基因或转基因玉米叶DNA。
I事件TC1507玉米DNA样品是含有
Figure BDA00002030897300234
I事件TC1507的转基因玉米叶DNA样品，其是半合子或纯合子的。若通过组合等比例的阴性对照DNA与纯合I玉米DNA不可获得半合子样品，则可以生成半合子样品。
表6中显示阳性和阴性对照。
表6
Figure BDA00002030897300236
Figure BDA00002030897300241
DNA提取、纯化、和定量的规程。以连续的次序进行下列步骤。
每份样品对8个叶盘冲孔，并转移入Qiagen收集管中。在每次取样后用70%乙醇清洁冲孔器，接着在水中快速漂洗，然后擦干。
依照制造商的推荐制备DNA提取缓冲液。
遵循制造商的推荐分离DNA。
使用Quant-iTTM
Figure BDA00002030897300242
量化试剂盒和分光光度计或等同物测定DNA浓度。
PCR条件。以连续的次序进行下列步骤。
以含有除了DNA模板外的所有组分的Master混合物制备下列反应混合物。在制备混合物时，确保它对于比实际需要多10%的反应是足够的。
以下是含有
Figure BDA00002030897300243
I事件TC1507和内源基因转化酶寡核苷酸的二重反应的组分(将所有DNA样品的浓度随机化)：
Figure BDA00002030897300251
如下制备并利用引物和探针。
表7：引物和探针序列的列表。
表8：引物储备溶液(200μM)的制备
Figure BDA00002030897300261
将引物储液等分取样，并用H2O以1:10稀释至工作终浓度20μM。
表9：探针储备溶液(100μM)的制备。
Figure BDA00002030897300262
将探针储液等分取样，并用H2O以1∶10稀释至工作终浓度10μM。探针是光敏感的，并且应当尽可能在黑暗中贮存。应当生成每种探针的多个等分试样以使冷冻和融化循环的数目最小化。
用合适的对照设立PCR测定法。在使用96孔板时，推荐对对照使用下列孔：H11-H12=阴性对照(试剂但无DNA)，
Figure BDA00002030897300263
I TC1507玉米基因组DNA的纯合阳性对照；
Figure BDA00002030897300264
I事件TC1507的半合子阳性对照；
Figure BDA00002030897300265
I事件TC1507的玉米基因组DNA的阴性对照，及A4–H10=未知样品。
在下列条件下在GenAmp PCR系统9700中扩增DNA：
Figure BDA00002030897300266
如下分析样品。
仪器设置：读取PCR结果的推荐波长如下。
不含
Figure BDA00002030897300272
I事件TC1507基因组DNA的样品仅会产生参照基因PCR产物的荧光读数。含有半合子或纯合子I事件TC1507基因组DNA的样品会产生比阴性背景对照高至少0.5-1个单位的FAM探针的RFU读数。若样品不产生转基因或内源基因等位基因的PCR产物，则DNA可能不是足够质量或量的。在该情况中，应当实施新的DNA制备或新的反应。在如下时，结果是可接受的：
*已知的半合子和纯合子对照对
Figure BDA00002030897300274
I事件TC1507和参照基因转化酶显示预期的高荧光读数。0.5-1.0个单位的读数应当分开两个对照间的SOB1/SOB2比率。
*阴性对照必须对I事件TC1507和参照基因两者显示非常低的荧光读数。
*非转基因DNA对照必须仅对参照基因显示荧光读数。
在完成TaqMan PCR和荧光读数后，产生表和分布图(表10，图1)。相似遗传背景的“野生型”(Wt)、“半合子”、和“纯合子”对照可以充当阴性和阳性对照。在分离的群体中，应当获得数据点的三个簇，容许视觉测定截留点。这些截留点是任意的，并且簇之间的分开通常是约0.5-1个单位。然而，由于测定法的变化性，数据点应当是分散的。对于下文例示的例子，数据点的三个簇是明显可见的。野生型的数据点小于0.5，“半合子”样品的那些数据点的范围为0.5-1.1，并且“纯合子”的那些数据点高于1.1。
表10数据表的例子。报告物1＝FAM读数，报告物2=Cy5读数，SOB1＝FAM的高于背景的信号(于535nm的高于背景信号平均值的样品信号的比率)、SOB2=Cy5的高于背景的信号(于670nm的高于背景信号平均值的样品信号的比率)、比率=SOB1/SOB2(绝对值)，
Figure BDA00002030897300276
I事件TC1507的野生型(比率<0.5)、半合子(比率>0.5，但<1.1)、和纯合子(比率>1.1)样品的解读。
表10
  样品   孔   报告物1   SOB1   样品#   报告物2   SOB2   比率   调用
  Sam1   A5   10807   -16.9   5   35670   114.3   0.1481   Wt
  Sam2   A6   24314   86.9   6   33617   101.9   0.8525   Hemi
  Sam3   A7   25918   99.2   7   35358   112.4   0.8829   Hemi
  Sam4   A8   26255   101.8   8   35989   116.2   0.8764   Hemi
  Sam5   A9   37931   191.6   9   37283   124.0   1.5455   Hmz
  Sam6   A10   37176   185.8   10   37269   123.9   1.4997   Hmz
  Sam7   A11   35059   169.5   11   35899   115.6   1.4657   Hmz
  Sam8   A12   45525   250.0   12   43689   162.4   1.5388   Hmz
  Sam9   B1   30329   133.1   13   39359   136.4   0.9759   Hemi
  Sam10   B2   28052   115.6   14   38354   130.4   0.8869   Hemi
  Sam11   B3   33754   159.5   15   37700   126.5   1.2610   Hmz
  Sam12   B4   31538   142.4   16   33828   103.2   1.3801   Hmz
  Sam13   B5   31319   140.8   17   33242   99.7   1.4120   Hmz
  Sam14   B6   26514   103.8   18   36459   119.0   0.8724   Hemi
  Sam15   B7   24997   92.2   19   35733   114.7   0.8038   Hemi
  Sam16   B8   27446   111.0   20   37665   126.3   0.8790   Hemi
  Sam17   B9   34671   166.5   21   34785   109.0   1.5284   Hmz
  Sam18   B10   30456   134.1   22   41250   147.8   0.9075   Hemi
  Sam19   B11   26476   103.5   23   37491   125.2   0.8268   Hemi
  Sam20   B12   26262   101.9   24   36842   121.3   0.8398   Hemi
在完成PCR和荧光读数后，产生分布图，如上文所描述的。见图1。
Figure IDA00002030897700011
Figure IDA00002030897700021
Figure IDA00002030897700031
Figure IDA00002030897700041
Figure IDA00002030897700051
Figure IDA00002030897700061
Figure IDA00002030897700071
Figure IDA00002030897700081
Figure IDA00002030897700091
Figure IDA00002030897700101
Figure IDA00002030897700111

Claims (22)

1.一种用于测定玉米组织中的TC1507事件的接合性的方法，所述TC1507事件包含含有cry1F基因的转基因构建体，所述方法包括使用基于荧光的端点Taq PCR测定法来检测所述TC1507事件和内源参照基因，
所述方法包括：
自所述玉米组织获得基因组DNA的样品，
使所述样品与下列各项接触：
a.事件正向引物和事件反向引物，其中至少一种所述事件引物特异性结合所述转基因构建体，且其中在存在于所述样品中时，所述引物生成所述事件诊断性的事件扩增子，
b.参照正向引物和参照反向引物，其自所述内源参照基因生成参照扩增子，
c.荧光事件探针，其与所述事件扩增子杂交，
d.荧光参照探针，其与所述参照扩增子杂交，
定量与所述事件扩增子杂交的所述荧光事件探针，
定量与所述参照扩增子杂交的所述荧光参照探针，
比较杂交的荧光事件探针与杂交的荧光参照探针的量；并
通过比较杂交的荧光事件探针和杂交的荧光参照探针的荧光比率来测定TC1507的接合性。
2.权利要求1的方法，其中一种事件引物与TC1507侧翼序列杂交，而一种事件引物与所述转基因构建体杂交。
3.权利要求2的方法，其中所述TC1507侧翼序列选自下组：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
4.权利要求2的方法，其中所述转基因构建体是SEQ ID NO:3的残基2830-9015。
5.权利要求1的方法，其中所述参照基因是内源玉米转化酶基因。
6.权利要求2的方法，其中所述侧翼序列是SEQ ID NO:3的残基2629-2829。
7.权利要求2的方法，其中所述侧翼序列是SEQ ID NO:3的残基9016-9216。
8.权利要求5的方法，其中所述方法用于所述TC1507事件对另一种玉米系的育种基因渗入。
9.权利要求8的方法，其中所述另一种玉米系是空TC1507玉米系。
10.权利要求1的方法，其中所述事件扩增子是58个碱基对。
11.权利要求5的方法，其中所述参照基因包含选自下组的序列或与选自下组的序列杂交：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、和SEQ ID NO:9。
12.权利要求1的方法，其中所述参照引物包含SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8，且所述参照探针包含SEQ ID NO:9。
13.权利要求1的方法，其中所述探针是用荧光染料和淬灭剂标记的。
14.权利要求13的方法，其中所述事件探针包含在所述事件探针的5’端作为所述荧光染料的FAM和在所述事件探针的3’端上作为所述淬灭剂的Black Hole Quencher 1(BHQ1)。
15.权利要求1的方法，其中所述参照基因是能够单或低拷贝数PCR扩增的保守玉米内源基因。
16.权利要求13的方法，其中所述参照探针在所述参照探针的5’端用Cy5并在所述参照探针的3’端用Black Hole Quencher 2(BHQ2)标记。
17.权利要求12的方法，其中所述参照扩增子是通过所述引物扩增的104个碱基对的片段。
18.权利要求1的方法，其中所述参照探针包含SEQ ID NO:9。
19.权利要求1的方法，其中所述参照正向引物包含SEQ ID NO:7，且所述参照反向引物包含SEQ ID NO:8。
20.权利要求1的方法，其中在读板仪中直接读取所述方法的结果。
21.权利要求1的方法，其中自田间的玉米植物获得所述样品。
22.一种用于实施权利要求1的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
a.事件正向引物和事件反向引物，其中至少一种所述事件引物特异性结合所述cry1F转基因构建体，且其中在存在于所述样品中时，所述引物生成所述事件诊断性的事件扩增子；
b.参照正向引物和参照反向引物，其自所述内源参照基因生成参照扩增子；
c.事件探针，其与所述事件扩增子杂交；和
d.参照探针，其与所述参照扩增子杂交。
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