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CN102770438B - 通过在多个单体与特异性结合单体的粘合体的重复链的复合物中增加键桥的产量以生产二聚体和多聚体的方法 - Google Patents

通过在多个单体与特异性结合单体的粘合体的重复链的复合物中增加键桥的产量以生产二聚体和多聚体的方法 Download PDF

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CN102770438B CN200980163448.2A CN200980163448A CN102770438B CN 102770438 B CN102770438 B CN 102770438B CN 200980163448 A CN200980163448 A CN 200980163448A CN 102770438 B CN102770438 B CN 102770438B
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Abstract

本发明涉及生产多聚体的方法，在多聚体中多个单体通过键桥连接，该方法通过制备含有重复连接的特异性结合单体的粘合体的重复链，以及通过使用上述物质产生重复链/多个单体复合物(该复合物由重复链和多个单体产生)，从而有助于复合物中单体之间键桥的形成。更具体地，本发明涉及生产多聚体的方法，在多聚体中多个单体通过键桥连接，该方法通过制备由重复连接的特异性结合蛋白单体的粘合蛋白产生的重复链重组蛋白，以及通过使用上述物质产生重复链/多个单体复合物(该复合物由重复链和多个单体产生)，从而有助于复合物中单体之间键桥的形成。更具体地，本发明涉及生产多聚体的方法，在多聚体中多个单体通过二硫键桥连接，该方法通过制备由重复连接的特异性结合蛋白单体的粘合蛋白产生的重复链重组蛋白，以及通过使用上述物质产生重复链/多个单体复合物(该复合物由重复链和多个单体产生)，从而有助于复合物中单体之间二硫键桥的形成。更具体地，本发明涉及生产二聚体和多聚体的方法，在二聚体和多聚体中多个单体通过二硫键桥连接，该方法通过使用含有由链球菌蛋白G的域Ⅲ(Fab结合域)的重复连接产生的重组重复链蛋白的骨架，由抗体蛋白的单体产生重复链及其多个单体复合物，从而有助于复合物中单体之间二硫键桥的形成。本发明的方法可有利地用于大量生产二硫键桥二聚体，因为与现有技术中已知的重折叠方法相比，其在二硫键桥二聚体产量方面提供了高达200倍的改进。

Description

通过在多个单体与特异性结合单体的粘合体的重复链的复合物中增加键桥的产量以生产二聚体和多聚体的方法
技术领域
本发明涉及从基于增加产量的单体中制备二聚体和多聚体的方法。为了达到此目的，通过使用特异性结合单体的亲和域的重复链来生产重复链-多个单体复合物，并利用复合物中单体之间很容易形成单体间键桥的事实来生产多聚体。即，本发明涉及，通过使用重复链作为骨架以最大化地形成重复链-多个单体复合物，以及通过在形成的重复链-多个单体复合物中的单体之间增加单体间二硫键桥的形成，以制造大量二聚物和多聚体的方法。
背景技术
抗体毒素是通过将毒素添加到特异性结合癌细胞的抗体而产生的(Pastan I.等，医学年度评论(Annu Rev Med.)58(2007)221-237)。
单克隆抗体(MAb)、B3结合在结肠、胃、卵巢、乳房或肺癌的表面上过度表达的糖类抗原(LeY)(L.H.Pai等，美国科学院院刊(ProcNatl Acad Sci U S A)88(1991)3358-3362；I.Pastan等，癌症研究(Cancer Res.)51(1991)3781-3787)。PE38是假单胞菌属外毒素(PE)的一种衍生物(J.Hwang等，细胞(Cell).48(1987)129-136；V.K.Chaudhary等，生物化学杂志(J Biol Chem)265(1990)16306-16310)。
Fab，一种具有抗体的抗原结合部分的片段，包括Fd链(VH和CH1)和轻链(VL和CL)。Fab抗体毒素也包括Fd链(VH和CH1)和轻链(VL和CL)。Fab-毒素与单链Fv(scFv)-毒素相比具有两个优势。第一，Fab-毒素的产量比scFv-毒素高10倍(J.Buchner等，生物技术(Biotechnology)(NY).9(1991)157-162；J.Buchner等，生物技术(Biotechnology)10(1992)682-685)。第二，Fab-毒素的稳定性在小鼠血浆中得到改善(M.Choe等，癌症研究(CancerRes.)54(1994)3460-3467)。
据报道由单体间二硫键桥形成的二价Fab-毒素二聚体比单价scFv-毒素具有更高的细胞毒性(S.H.Choi等，韩国化学学会公报(Bull.Kor.Chem.Soc.)22(2001)1361-1365；J.H.Park等，分子细胞(MolCells)12(2001)398-402；M.H.Yoo等，微生物学与生物技术杂志(Microbiol.Biotechnol.)16(2006)1097-1103)。二硫化二聚体由两个Fab-毒素单体的单体内不配对(counterpartless)半胱氨酸(cys)残基的二硫键来形成。单体内不配对半胱氨酸残基位于Fab-毒素单体的Fab域和PE38之间。
预期二聚体(二价的)抗体-毒素比单体(单价的)抗体-毒素具有更大的优势。例如，其具有更高的活动性，因为二聚体的两个抗原结合域提高了结合强度。而且，因为两个毒素域同时被二价二聚体的抗体毒素转移到靶细胞，有可能二价二聚体的抗体毒素可以用比单价单体的抗体毒素更高的细胞毒性杀灭靶细胞。并且，Fab-毒素具有比scFv-毒素更高的稳定性，后者经常用于生产重组抗体-毒素(D.Rothlisberger等，分子生物学杂志(J Mol Biol)347(2005)773-789)。
[B3(Fab)-ext-PE38]2，B3(Fab)-ext-PE38单体的二硫键，可以通过将单克隆抗体B3的Fab域和假单胞菌属外毒素A的衍生物PE38进行融合来形成(KR10-0566091)，而且据报道，当在CRL-1739胃癌培养细胞系上检测时，[B3(Fab)-ext-PE38]2具有比B3(Fab)-ext-PE38高11倍的细胞毒性(J.H.Park等.分子细胞(MolCells)12(2001)398-402)。
通常，二硫键连接的二聚体在重折叠后纯化(S.H.Choi等，韩国化学学会公报(Bull.Kor.Chem.Soc.)22(2001)1361-1365；J.H.Park等，分子细胞(Mol Cells)12(2001)398-402；M.H.Yoo等，微生物学与生物技术杂志(J.Microbiol.Biotechnol.)16(2006)1097-1103)。在以前的报道中，二硫键连接的二聚体的重折叠过程得到约0.014%～0.25%的产量。在重折叠过程中，这些二硫化二聚体通过位于两个单体的抗体-毒素的Fab域和PE38之间的单体内不配对半胱氨酸残基的随机接近而形成。尽管二硫键二聚体的产量通过重折叠过程的改进得到提高，但考虑到Fab-毒素的产量，二聚体的产量非常低，在重折叠过程期间主要生产的分子达到近10%。由于抗体毒素单体不具有在互相之间自身结合的亲和力，键桥连接的二聚体通过在重折叠过程期间抗体-毒素单体的单体内不配对半胱氨酸残基之间的随机碰撞而产生。即，单体内不配对半胱氨酸残基之间碰撞频率低导致在重折叠过程期间，在单体的接近的半胱氨酸残基之间形成单体间二硫键桥的效率不高，因此在重折叠过程期间产生的二聚体的产量非常低。
因此，发明人尝试了各种方法以生产二硫键连接的二聚体，其包括用于通过氧化-氧化、氧化-还原的再循环和化学交联剂由抗体-毒素单体生产二硫键二聚体的方法，但是使用这些方法，二聚体的产量没有改善。
因此，在寻找能生产更多[B3(Fab)-ext-PE38]2，即其中单体B3(Fab)-ext-PE38为二硫键连接的二聚体的方法时，发明人构建了重复链，该重复链为重组蛋白，其中链球菌蛋白G的Fab结合域重复两次以上，同时以该链为骨架，生产了Fab-毒素多聚体复合物，该复合物上同时结合有多个单体抗体-毒素。在以前的研究中，据报道蛋白G的第三域(域Ⅲ)能够结合IgG的Fab片段，而且Fab片段的CH1域对于蛋白G的域具有高的结合亲和力(J.P.等，自然(Nature)359(1992)752-754)。当与重折叠过程比较时，本发明的重复链具有如下优势：单体抗体-毒素显示出对重复链的域的高结合亲和力。在这方面，单体抗体-毒素的局部浓度在由重复链产生的重复链-多个单体复合物中很高。提高的局部浓度带来每个单体抗体-毒素的单体内不配对半胱氨酸残基中的高碰撞频率且加速了单体之间二硫键形成。因此，有可能生产大量的单体间二硫键桥连接的二聚体。本发明重复链类似作用的典型实例为通过酶反应动力学中的邻近效应使酶反应速率提高(Nicholas C.Price和Lewis Stevens，酶学基础(Fundamentals of Enzymology)，第三版.牛津大学出版社)。结果，发明人通过将重复链与单体抗体-毒素简单混合能够容易地制备抗体-毒素多聚体复合物，并证实通过复合物中单体抗体-毒素的单体内不配对半胱氨酸残基的氧化和还原更替反应，以加速在Fab域和PE38之间的半胱氨酸残基的二硫键形成来生产大量的[B3(Fab)-ext-PE38]2，从而完成本发明。
发明内容
本发明旨在提供由单体之间具有单体间键桥的单体大量生产多聚体的方法，使用单体-特异性亲和域的重复链为骨架以连接单体并以重复链-多个单体复合物的形式大量生产多聚体复合物，并且在重复链-多个单体复合物中的单体之间形成单体间桥键，且与生产单体间桥键连接的多聚体的低产量常用方法相比，本发明通过每个单体中的单体内不配对半胱氨酸残基之间提高的碰撞频率，以及随后单体之间的单体间二硫键桥的有利形成，提供了较高的和最大化的多聚体的生产方法。
为了实现上述目的，本发明提供生产单体间键桥连接的多聚体的方法，其包括以下步骤：
1)制备特异性结合单体的亲和域的重复链；
2)通过将步骤1)的重复链与单体混合制备重复链与单体的重复链/多个单体复合物；和
3)分离多聚体，所述多聚体中单体间的键桥形成于步骤2)的重复链/多个单体复合物中的单体之间。
在二聚体形成的该方法的一个实施方案中，其中抗体-毒素单体通过二硫键桥连接，抗体-毒素单体的单体间二硫键桥二聚体的产量增加至通常报道的重折叠方法的产量的约208倍，因此二聚体的形成产量得到很大提高。本发明生产的二聚体比以前报道的单体抗体-毒素具有更高的抗原结合强度、更高的细胞毒性和更高的稳定性，并且具体地显示出比胃癌细胞系高约11倍的细胞毒性。因此，二聚体的大量生产可以有效地用于癌症治疗药剂的开发。
附图说明
图1示出生产具有本发明键桥的多聚体的方法的示意图；
图2示出试验结果，其中本发明的纯化蛋白使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶确定，其中：
图2A示出试验结果，其中蛋白G的重组重复链蛋白与SDS-样品缓冲液混合，混合物在还原的16%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行分析，其中编号1-7的泳道分别为TR1～TR7；和
图2B示出根据本发明生产的B3(Fab)-ext-PE38(单体)和[B3(Fab)-ext-PE38]2(二聚体)抗体-毒素分子的分析结果，在非还原的8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，其中每个箭头从顶端开始依次表示[B3(Fab)-ext-PE38]2、B3(Fab)-ext-PE38和B3(Fd)-ext-PE38(由于(H6-B3(L)具有很小的分子量(即约25kDa)，因此在图中无法看到)；和
图3示出通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶，对在B3(Fab)-ext-PE38和TR1～TR7蛋白的复合物中形成的[B3(Fab)-ext-PE38]2进行分析的结果，其中：
图3A示出完成以下步骤后得到的结果：将蛋白复合物样品(每份10g)结合到金属螯合的琼脂糖珠(泳道1)；在室温下使用40mM2-巯基乙醇还原样品30分钟(泳道2)；在37℃使用5mM氧化的谷胱甘肽型的GSSG氧化蛋白复合物2小时(泳道3)；用非还原的8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离1/2的样品，其中从顶端开始每个闭合箭头表示[B3(Fab)-ext-PE38]2、B3(Fab)-ext-PE38和B3(Fd)-ext-PE38，开放箭头表示来源于复合物的TR蛋白；和
图3B示出用还原的12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离其余1/2样品的结果，其中两个箭头表示B3(Fd)-ext-PE38(顶部)和H6-B3(L)(底部)。箭头的头指示来源于复合物的TR蛋白(由于TR1蛋白(分子量为8kDa)太小而无法在图中显示出来)。
具体实施方式
下面通过参考附图对本发明的优选实施方案进行详细的描述，将会更加清楚地理解本发明的特点和优势。首先注意的是，基于发明人可以适当地定义术语的概念，从而最好地说明其发明的这一原则，此处所使用的术语和单词应理解为对应于本发明技术主旨的含义或概念。而且，应理解与本发明相关的熟知的功能和结构的详细描述将被省略，从而不会不必要地模糊本发明的重点。
下面详细描述本发明。
本发明的目的是生产大量的由单体间键桥形成的多聚体，以及提供提高键桥连接的多聚体产量的方法，其通过使用特异性结合单体的亲和域的重复链为骨架，并产生重复链与单体的复合物，从而增加复合物链上单体的局部浓度，增加单体之间的碰撞频率并促进单体间键桥的形成。
尽管键桥连接的多聚体通过单体间的键桥连接多个单体而产生，但是所产生的键桥连接的多聚体的量取决于键桥如何有效地形成。对于体内使用的物质，用于形成多聚体的桥键优选为共价键，以使得多聚体不分解为单体并且保持多聚体在体内的稳定性。为了形成共价键桥，需要在形成化学官能团的桥键之间接触。然而，蛋白中化学官能团的尺寸与蛋白大分子的总体尺寸相比非常小。因此，当大分子在反应溶液中自由移动时，小化学官能团互相接触的可能性很低且多聚体的大量形成几乎是不可能的，除非存在能大大增加官能团接触的方法。
为了增加单体之间键桥的形成，本发明制备特异性结合单体的亲和域的重复链并将多个单体与重复链结合，使单体之间的距离在几纳米之内，或者数十纳米或数百纳米之内，其为分子尺寸的规模。因此，单体不能在溶液中自由移动。即，单体被固定在有限的空间并通过在分子尺寸的空间内移动而互相接触。在这种条件下，在多个单体结合其上的每个重复链上单体的局部浓度非常高。因此，结合的单体之间的接触频率显著增加，并且能够形成键桥的化学官能团之间的接触也增加。因此，多聚体的形成显著增加。
本发明的目的不仅包括连接蛋白的二硫共价键桥，而且包括连接有机化合物单体、生物分子或蛋白或任何其它蛋白的包括酰胺键、酯键、糖苷键或醚键的共价键。
共价键桥可以是最优选的键桥以增加多聚体稳定性，但不限于此。即，当用键桥如离子键形成多聚体时，仍可以使用本发明的概念。另外，当通过在单体之间插入连接链，从而在单体之间形成桥，从而产生单体-连接链-单体结构而形成多聚体时，本发明的概念可用于改进单体的形成效率(Greg T.Hermanson,生物共轭技术(BioconjugateTechniques)，学院出版社公司,1995;Wong S.S.,蛋白共轭和交联化学(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking).CRC出版社公司,1991)。
更具体地，本发明的方法可优选地包括下面的步骤，但不限于此：
1)制备特异性结合单体的亲和域的重复链；
2)通过将步骤1)的重复链与单体混合制备重复链和单体的重复链/多个单体复合物；和
3)分离多聚体，所述多聚体中键桥形成于步骤2)的重复链/多个单体复合物中的单体之间，但不限于此。
根据所述方法，单体和步骤1)的特异性结合单体的亲和域可优选地来源于蛋白，但不限于此。即，在其之间具有特异性结合亲和力的所有种类的分子都可以用作单体和亲和域。例如，蛋白和对其具有特异性结合亲和力的小的有机化合物可以用作根据本发明方法的单体和亲和域。
根据上文所解释的方法，制备特异性结合单体的亲和域的重复链(步骤1)可包括制备亲和域的重复链，其同在链上而具有不同的结合亲和力。因此，可以制备异-二聚体和异-多聚体，其中不同单体被特异性结合至不同的亲和域。
根据上文所解释的方法，在步骤1)中，蛋白单体和其上的具有特异性结合单体的亲和力的蛋白域可优选地来源于蛋白的天然形式，但不限于此。即，如果重组单体对配对物具有特异性结合的亲和力，则所述单体可用于生产根据本发明方法的具有键桥的多聚体。编码蛋白的基因信息的DNA片段可优选地通过使用正向和反向引物对，由染色体DNA或由表达蛋白的有机体mRNA进行PCR克隆来制备，但不限于此。
根据上文所解释的方法，步骤3)中的键桥不仅可包括连接蛋白的二硫共价键桥，而且包括连接有机化合物单体、生物分子或蛋白的包括酰胺键、酯键、糖苷键或醚键的共价键。然而，这并不局限于此，并且多聚体可以由离子键形成。
根据上文所解释的方法，步骤1)中的重复链可以通过包括下面步骤的方法制备，但不限于此：
1)通过重复克隆DNA片段制备具有重复的结合亲和力蛋白域的构建体(construct)，所述DNA片段在表达载体中编码亲和域和与亲和域连接的连接子(linker)；
2)通过用步骤1)的构建体转化宿主细胞制备转化体；和
3)培养步骤2)的转化体，采用层析法分离和纯化所表达的重复链蛋白，但不限于此。
所述构建体可以优选地具有其中亲和域在重复链中重复3次以上的结构，但不限于此。
关于所述构建体，亲和域可以由连接子连接，并且GGGGS可以用作G4S连接子，但不限于此。连接子可以延伸至，例如GGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS，但不限于此。G4S连接子具有非常灵活的结构(R.Arai等,Protein Eng14(2001)529-532)。
根据本发明，通过用NdeI和EcoRI切割编码亲和域和连接子的DNA片段，并在用相同酶切割的pCW1的载体部分上克隆该片段来制备质粒pTR1。
用NdeI和BspEI再次切割编码亲和域和pTR1的G4S连接子的DNA片段，以制备编码亲和域和作为其连接子的一个G4S的DNA片段的226bp的DNA片段；通过将制备的片段克隆到大的载体片段上而制备质粒pTR2，所述大的载体片段是通过用NdeI和AgeI切割质粒pTR1而获得的。重复7次上述克隆方法，从而制备质粒pTR7，其中pTR7具有亲和域被重复7次的构建体(见表1)。在转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)后蛋白被过度表达，使用螯合琼脂糖凝胶快速流动层析和尺寸-排阻层析进行分离和纯化。
根据所述方法，步骤2)的单体具有特异性结合亲和域的结合序列(B)。
关于步骤2)的重复链-多个单体复合物的形成，有可能制备由不同单体制成的异二聚体和异多聚体，每个不同单体通过使用具有不同结合特异性的亲和域的重复链，而特异性结合每个不同的亲和域。
根据所述方法，优选地，单体间不配对半胱氨酸对于从步骤2)的多个单体的复合物制备二硫键桥多聚体是必需的，但不限于此。即，不同种类的化学交联剂可以用于单体之间的键桥，以及不配对半胱氨酸之间的二硫键桥。如果单体具有任何用于键桥的不配对半胱氨酸，优选地，其中包括一个不配对半胱氨酸，但不限于此。
根据所述方法，步骤2)的单体可以用于通过使用扩展序列(Ext)将单体与功能性蛋白连接来制备新的种类的单体。
根据所述方法，功能性蛋白可包括所有生物化合物，如酶、毒素(功能性的)蛋白或病毒、具有药物活性的药物化合物、官能团如脂质体、生物传感器或前体药物。
扩展序列(Ext)连接单体和功能性蛋白，以融合单体和功能性蛋白，且扩展序列(Ext)可包括不配对半胱氨酸，但不限于此。不配对半胱氨酸在两个单体之间被氧化并形成二硫键桥；因此，形成了二聚体。而且，扩展序列(Ext)包括二硫键桥二聚体形成的最后一个不配对半胱氨酸与异官能团(F)之间的柔性氨基酸序列(Flx)。优选地，柔性序列(Flx)由包括不是大体积氨基酸的GASQEND氨基酸(即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸)的序列组成，但不限于此。
根据所述方法，优选地，步骤2)的混合通过与单体混合并在3～5℃孵育过夜且在35～40℃孵育1～2小时来实施。更优选地通过在4℃孵育过夜且在37℃孵育1小时来实施，但不限于此。
根据所述方法，步骤3)的复合物的固定优选地通过将结合重复链的单体的蛋白复合物固定在金属螯合琼脂糖珠上来实施，但不限于此。当蛋白复合物固定在所述珠上时，其优选地在10℃实施1小时，但不限于此。
根据所述方法，关于键桥的形成，键桥-异多聚体可以通过在异-多个单体的复合物中的不同单体之间形成键桥来制备，所述异-多个单体的复合物由具有不同结合特异性的亲和域的重复链形成。
根据所述方法，步骤3)的键桥可以通过采用各种现有方法形成(Greg T.Hermanson,生物共轭技术(Bioconjugate Techniques).学院出版社公司,1995;Wong S.S.,蛋白共轭和交联化学(Chemistry ofProtein Conjugation and Cross-Linking)，CRC出版社公司,1991)。如果使用二硫键桥，不配对半胱氨酸的官能团首先被还原。该还原优选地通过将蛋白复合物添加到含有2-巯基乙醇的还原缓冲溶液中来实施，但不限于此。即，对于所述还原，用于单体的半胱氨酸残基完全还原的2-巯基乙醇的添加量优选为20～40mM，但不限于此。
根据所述方法，如果使用二硫键桥来形成步骤3)的键桥，则具有二硫键桥的多聚体通过每个单体的还原的半胱氨酸残基的氧化来产生。单体之间的氧化优选地通过将还原的蛋白复合物添加到含有谷胱苷肽氧化型(GSSG)氧化缓冲溶液中来实施，但不限于此。
在本发明中，蛋白复合物的还原优选地通过在室温下添加其中加入了2-巯基乙醇的Tris-HCl(pH8.2)来实施，但不限于此。还原的蛋白复合物优选地用含有MOPS(pH6.5)的缓冲溶液洗涤，但不限于此。用Tris-HCl(pH8.2)再洗涤复合物3次；加入含有GSSG和Tris-HCl(pH8.2)的氧化缓冲溶液，用于氧化；将其在37℃下孵育2小时。根据所述方法，孵育的温度和时间优选地分别为37℃和2小时，但不限于此。
根据所述方法，优选地，采用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析步骤3)的键桥多聚体，但不限于此。通常用于蛋白分离和纯化的所有方法都可以使用。
根据所述方法，步骤3)的多聚体优选为二聚体，其中单体通过二硫键连接，但不限于此。单体可以是以“结合域(B)-扩展序列(Ext)-功能性蛋白(F)”形式的融合蛋白分子。如果扩展序列包括不配对半胱氨酸，则在两个结合域(B)-扩展序列(Ext)-功能性蛋白(F)分子的不配对半胱氨酸之间形成二硫键桥；因此，二聚体以[结合域(B)-扩展序列(Ext)-功能性蛋白(F)]2的形式形成。
为了完成本发明，发明人使用具有作为单体靶结合域(B)的抗体的Fab蛋白片段的抗体-毒素，作为“结合域(B)-扩展序列(Ext)-功能性蛋白(F)”形式的单体和链球菌蛋白G的Fab结合域，该结合域作为与抗体-毒素的Fab域具有特异性结合亲和力的亲和域。含有抗体Fab片段作为其部分的所有种类的抗体分子(抗体衍生的分子单体)都可以用作单体以及抗体-毒素形式的单体。为了最大化地形成具有单体间二硫键桥的二聚体([抗体衍生的分子单体]2)，制备重组重复链蛋白，其中链球菌蛋白G的Fab结合域重复2次以上，并且所制备的蛋白用作制备[抗体衍生的分子单体]2的骨架。更具体地，将重复链和抗体衍生的分子单体蛋白混合，以制备重组重复链-抗体衍生的分子单体的复合物，其中很多抗体单体结合到具有非共价键的一个重组链蛋白上，且抗体单体的半胱氨酸残基经还原和氧化，以形成半胱氨酸残基的二硫键，其位于Fab片段和抗体衍生的分子单体的毒素之间，因此制备了[抗体衍生的分子单体]2。
为了比较基于本发明和基于以前的重折叠方法的[抗体衍生的分子单体]2的形成水平，本发明的发明人采用SDS-PAGE并通过测量SDS-PAGE带的密度，分析了[抗体衍生的分子单体]2的产量，结果是基于本发明的[抗体衍生分子单体]2的产量明显高于所报道的基于重折叠方法实施的产量。即，[抗体衍生的分子单体]2的产量范围为结合重组重复链蛋白的全部抗体衍生的分子单体的36%-52%，其中链球菌蛋白G的Fab结合域重复2次以上。因此，可确定该产量范围比现有重折叠方法所报道的产量高约144-208倍。
因此，可确定来源于结合的抗体衍生的分子单体的二硫键桥二聚体可以使用蛋白G的Fab结合域的重复链来形成，而且重复链的使用大幅度增加了[抗体衍生的分子单体]2的形成。通过使用蛋白G的Fab结合域的重复链和其与抗体分子单体的结合特异性，简单的还原和氧化能够产生大量的[抗体衍生的分子单体]2。
另外，本发明提供了编码特异性结合单体的亲和域的重组重复链蛋白表达的基因构建体。
本发明制备了编码蛋白G的域Ⅲ(Fab结合域)的重组重复链蛋白的基因构建体。
重组重复链蛋白优选地包括在两个Fab结合域之间的一个连接子，G4S(GGGGS)，但不限于此。
重组重复链蛋白优选地具有其中蛋白G的域Ⅲ(Fab结合域)重复3-7次的结构，但不限于此。
而且，本发明提供了包括基因构建体的表达载体。
表达载体优选地连接到期望的特定核酸序列的基因上，所述核酸序列具有用于控制基因向mRNA转录和翻译为蛋白的信息，以提供所期望的蛋白的良好表达并增加蛋白形成的可能性。
而且，本发明提供了由宿主细胞中的表达载体产生的转化体。
将表达载体诱导进入宿主细胞是通过适合的方法之一实施的，其包括转化、转染、结合(conjugation)、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀或直接微注射。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选真核细胞。真核细胞是哺乳动物的细胞，如CHO细胞。这些细胞优选为在正确位置提供正确折叠的细胞或者为在产生蛋白后包括糖基化的转化蛋白分子的细胞，但不限于此。
本发明证实了使用重组重复链蛋白作为骨架，[抗体衍生的分子单体]2能够由抗体衍生的分子单体大量生产，其中链球菌蛋白G的Fab结合域在重组重复链蛋白中重复3-7次。
因此，具有特异性结合亲和力的亲和域的重复链可以用于改进单体之间二聚体和多聚体的形成。而且，编码这些重复链的基因构建体、包括基因构建体的表达载体和用表达载体转化的转化体对于抗体衍生的分子单体之间的键桥多聚体的大量形成是非常有用的。
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如下面实施例中所示，对本发明实际的和目前优选的实施方案进行说明。
然而，可以理解的是本领域技术人员在考虑这些公开内容之后，可以在本发明的精神和范围内做出修改和改进。
<实施例1>由链球菌蛋白G制备Fab结合域的重复链构建体
发明人从韩国标准菌株收藏中心(KCTC)获得蛋白G的域Ⅲ，并用来自链球菌的染色体DNA的P1[5'-GGGCA TATGC ATCACCATCA CCATC ACACC GGTAC ACCAG CCGTG ACAA-3'(SEQ IDNo:1)]和P2[5'-CCCGA ATTCT TATCC GGACC CGCCT CCACCTTCAG TTACC GTAAA-3'(SEQ ID No:2)]引物进行PCR克隆。用NdeI和EcoRI切割PCR产物(243bp)，将其克隆到用相同物质切割的载体pCW1中。域Ⅲ的编码序列由双脱氧法-DNA-测序确定。用于每个域Ⅲ的G4S连接子作为间隔物加入，由此获得pTR1。质粒pTR1再次用NdeI和BspEI切割，编码域Ⅲ和一个G4S的225bp片段被连接到用NdeI和AgeI切割的相同pTR1质粒的大片段上，因此获得了编码域Ⅲ的两次串联重复(Tandem Repeat)的pTR2。质粒pTR2再次用NdeI和AgeI切割，将大片段连接到225bp片段以产生新的质粒“pTR3”。当重复上述克隆方法10次后，制备了高达10次重复的蛋白G(pTR1-pTR10)的域Ⅲ(见表1)。基于现有方法，制备了编码H6-B3(L)的pMC75H(见KR10-0566091)。
[表1]
本发明中所用的质粒和蛋白
a.SKPSIST：野生型铰链序列的改良序列(CKPCICT)；
ext：SKPSIST-KASG4C(G4S)2GGPE:具有半胱氨酸残基(Cys残基)的扩展肽链；
G4S：GGGGS的氨基酸序列；
PE38：38kD截短的假单胞菌外毒素；
b.(His)6：6个组氨酸标签；和
c.DⅢ：链球菌蛋白G的域Ⅲ。
基于现有方法，重复链被过度表达(J.H.Park等，分子细胞(MolCells)12(2001)398-402)。
用螯合琼脂糖快速流动层析(Amersham生物科学，瑞典)分离纯的溶解产物，并用Hiload Superdex-75pg或Hiload Superdex-200pg(26/60(Amersham生物科学，瑞典)进行尺寸排阻层析。所有构建体的蛋白均被纯化为达95%以上的纯度(见图2A)。
<实施例2>B3(Fab)-ext-PE38和[B3(Fab)-ext-PE38]2的制备
基于现有方法，发明人进行B3(Fab)-ext-PE38和H6-B3(L)内含体的过度表达、制备和重折叠(J.H.Park等，分子细胞(Mol Cells)12(2001)398-402)。重折叠的蛋白经Q-琼脂糖FF、Hitrap蛋白G HP和Hiload Superdex-200pg(26/60)(Amersham生物科学,瑞典)层析进行纯化。
更具体地，B3(Fab)-ext-PE38通过B3(Fd)-ext-PE38和H6-B3(L)之间的链间二硫键制备。与链间二硫键相关的两个半胱氨酸残基，一个位于B3(Fd)-ext-PE38的CH1域上，另一个位于H6-B3(L)的CL域上。而且，在重折叠过程中，[B3(Fab)-ext-PE38]2通过位于B3(Fab)-ext-PE38单体的扩展位置上的两个半胱氨酸残基之间的单体间二硫键产生。在实施尺寸排阻层析后，通过使用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶的光密度分析来测量B3(Fab)-ext-PE38和[B3(Fab)-ext-PE38]2的纯度，它们显示出95%以上的纯度(见图2B)。[B3(Fab)-ext-PE38]2的重折叠产量约为0.06%。
<实施例3>B3(Fab)-ext-PE38单体与来自蛋白G域Ⅲ的重复链构建体的结合
对于蛋白G域Ⅲ的纯化的重复链构建体和B3(Fab)-ext-PE38之间的结合反应，发明人将B3(Fab)-ext-PE38(715μg)和TR蛋白(各28μg)混合，在4℃下孵育过夜，然后在37℃下孵育1小时。反应混合物经尺寸排阻层析(Superdex-200TM HR)进行分离。将蛋白复合物的洗脱曲线与仅B3(Fab)-ext-PE38(Kav=0.33)或仅[B3(Fab)-ext-PE38]2(Kav=0.20)作为对照的洗脱曲线进行比较。用[公式1]计算洗脱蛋白峰的Kav值。
[公式1]
Kav = ( Ve - Vo ) ( Vt - Vo )
其中Ve为峰的洗脱体积，Vo为柱的空隙体积，其为蓝色葡聚糖2000的洗脱体积；且Vt为Superdex-200柱的柱床体积。
结合TR3的B3(Fab)-ext-PE38(Kav=0.22)给出了与[B3(Fab)-ext-PE38]2相似的洗脱体积。其它复合物具有同时结合除TR2外的TR链的2个或更多的B3(Fab)-ext-PE38单体分子。TR3-TR6复合物为B3(Fab)-ext-PE38单体的二聚体，且TR7～TR10复合物为三聚体。
<实施例4>由蛋白G域Ⅲ的重复链和B3(Fab)-ext-PE38单体的复合物制备[B3(Fab)-ext-PE38]2二聚体
为了在纯化的TR1～10链蛋白和与其结合的B3(Fab)-ext-PE38单体的复合物中产生[B3(Fab)-ext-PE38]2二聚体，发明人用氧化形式的谷胱甘肽(GSSG)对链上结合的单体分子进行了氧化反应，产物经非还原的(图2A)和还原的(图2B)SDS-PAGE进行分离。
更具体地，在10℃下蛋白复合物(10μg)与金属螯合琼脂糖珠(20μg)在微管中混合1小时。金属螯合琼脂糖珠存在于用100mMTris-HCL缓冲液(pH8.2)平衡的50%悬浮液中。通过在室温下加入40mM2-巯基乙醇的100mM Tris-HCL缓冲液(pH8.2)中而还原固定的蛋白复合物。在用于确定2-巯基乙醇(其对于还原B3(Fab)-ext-PE38的半胱氨酸残基是必需的)浓度的准备实验中，发现通过加入20～40mM2-巯基乙醇能实现半胱氨酸残基的全部还原。在还原后，被还原的蛋白复合物用含有100Mm MOPS(pH6.5)的洗涤缓冲液洗涤1次，并用100mM TrisHCL(pH8.2)洗涤3次以上。经洗涤的蛋白复合物用含有5mM GSSG和100mM TrisHCL(pH8.2)的氧化缓冲液进行氧化，并在37℃下孵育2小时。在氧化后，加入2×SDS样品缓冲液，产物经染色和分析，并用SDS-PAGE和考马斯亮蓝进行染色。[B3(Fab)-ext-PE38]2的产量通过可测量SDS-PAGE样品上蛋白的量的光密度分析法进行分析。使用来自SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的电泳数据，用[B3(Fab)-ext-PE38]2的带密度除以全部带密度计算[B3(Fab)-ext-PE38]2的产量，所述全部带密度是[B3(Fab)-ext-PE38]2密度和B3(Fab)-ext-PE38密度的总和(见表2)。仅B3(Fab)-ext-PE38与结合TR1的B3(Fab)-ext-PE38用作对照。
[表2]
[B3(Fab)-ext-PE38]2的产量
与TR链复合的抗体-毒素 产量(%)
B3(Fab)-ext-PE38 N/A
B3(Fab)-ext-PE38：TR1 N/A
B3(Fab)-ext-PE38：TR2 N/A
B3(Fab)-ext-PE38：TR3 47%±0.25
B3(Fab)-ext-PE38：TR4 44%±0.19
B3(Fab)-ext-PE38：TR5 48%±0.12
B3(Fab)-ext-PE38：TR6 36%±0.02
B3(Fab)-ext-PE38：TR7 52%±0.11
在上面的试验结果中，3个样品中没有检测到[B3(Fab)-ext-PE38]2(即，仅B3(Fab)-ext-PE38、TR1和TR2)。通过具有TR3～TR7链的复合物中单体的相互作用产生了显著量的单体间二硫键桥连接的二聚体。在TR3～TR7复合物样品中，[B3(Fab)-ext-PE38]2的产量分别是47%、44%、48%、36%和52%。加入氧化剂后2小时内产生[B3(Fab)-ext-PE38]2，延长孵育后未观察到显著增加。可以证实，当被结合到TR链蛋白时，B3(Fab)-ext-PE38分子的扩展序列中的半胱氨酸残基彼此紧密接触。在非还原凝胶中观察到非常接近[B3(Fab)-ext-PE38]2的薄带。已证实薄带是[B3(Fab)-ext-PE38]2的另一种形式，其在长重B3(Fd)-ext-PE38链和短轻H6-B3(L)链之间具有不完全的链间二硫键，从而形成一个无链间二硫键的B3(Fab)-ext-PE38单体，其在非还原的SDS-PAGE中失去一个短轻H6-B3(L)链。这在以前关于对纯化抗体的还原分解研究的报道中已被证实(T.Brody,et al.,分析生物化学(Anal Biochem)247(1997)247-256)。
[工业实用性]
本发明涉及通过键桥形成的多聚体的形成。使用具有特异性结合亲和力的亲和域的重复链，可实现重复链/多个单体复合物的形成，由此形成的重复链/多个单体复合物可用于产生由键桥连接的多聚体。通过本发明的方法提供了非常高的形成率并导致大量用键桥连接的二聚体形成；因此，本发明在工业上是实用的。
单体也可以使用多种物质制成，所述物质包括配体，或者具有结合亲和力的配体的部分片段，如TGFα、TGFβ、IL2、IL6、TNF或GMSCF，以及各种配体受体或具有结合亲和力的配体受体的部分片段，如TBP1、TBP2、IFNα或β，或促性腺激素受体。(Nienhaus,G.Ulrich.蛋白-配体的相互作用：方法和应用Humana Press,2005)。
另外，可采用下面的方式形成单体：各种酶催化前体药物的转化或检测、底物的分解和形成、包括细胞毒性毒素官能团的蛋白、有机体如用于基因治疗的病毒、用于DNA传送的阳离子跟踪化合物、由用于药物传输递送的化学工程方法产生的脂质体、用于实时检测靶分子或前体药物或其它官能团的生物传感器[参考文献:(Farah,R.A.等，Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.8,321-356,1998)(Trail,P.A.等，科学(Science)261,212-215,1993)(Hinman,L.M.等，癌症研究(Cancer Res.).53,3336-3342,1993)(Pastan,I.Biochim.Biophys.Acta1333,C1-C6,1997)(Kreitman,P.J.等，J.Clin.Oncol.18,1622-1636,2000)(Zalutsky,M.R.&Vaidyanathan,G.Curr.Pharm.Des.6,1433-1455,2000)(Goldenberg,抗体临床应用中的D.M.(D.M.in Clinical Uses ofAntibodies)(eds Baum,R.P.等)1-13(Kluwer academic,荷兰,1991))(Lode,H.N.&Reisfeld,R.A.免疫学研究(Immunol.Res.)21,279-288,2000)(Penichet,M.L.&Morrison,S.L.J.免疫学方法(Immmunol.Methods)248,91-101,2001)(Lasic,D.D.&Papahadjopoulos,D.科学(Science)267,1275-1276,1995)(Park.J.W.等，美国科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA)92,1327-1331,1995)(Niculescu-Davaz,I.等，抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)14,517-538,1999)(SToldt,H.S.等，Eur.J.Cancer33,186-192,1997)]。
在自然界，存在各种相互间具有结合亲和力关系的物质。配体和受体、抗体和抗原、同二聚体、异二聚体或形成多聚体的蛋白都是已知物质。通过使用具有相互间结合亲和力的这些物质作为单体和亲和域，可以根据本发明的方法由单体大量制备用键桥连接的多聚体。
在本发明中，具有特异性结合亲和力的重复链的特征在于形成重复链/多个单体复合物。因此，当在树脂上固定所述重复链时，有可能实施高效的亲和纯化，以用于生物技术和医药工业中单体或多聚体形式的有用蛋白分子的纯化(Zachariou M.,亲和层析:方法和方案(分子生物学方法)Humana Press;第2版)。

Claims (6)

1.一种生产多聚体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备包含抗体亲和域或Fab亲和域的重组重复链蛋白的重复链，所述抗体亲和域或Fab亲和域对单体具有特异性结合亲和力，其中所述重复链是通过重复所述重组重复链蛋白三次以上而制得；
其中所述单体是抗体或具有Fab的抗体片段；
2)通过将步骤1)的所述重复链和所述单体混合来制备重复链-单体复合物；以及
3)在步骤2的所述重复链-单体复合物中的单体之间形成键桥，并且从具有键桥的重复链-单体复合物中分离重复链。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体与包括酶、病毒、具有药物活性的化合物、脂质体、生物传感器或前体药物的官能团融合。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述重组重复链蛋白为蛋白G。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述亲和域为蛋白G的片段。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述蛋白G的片段为蛋白G的抗体结合域。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述蛋白G的抗体结合域为域III。
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