CN102763660A - 一种用于豆类牙菜生长的水剂其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于豆类牙菜生长的水剂其制备方法。本发明水剂配方由活性成分赤霉素、6-苄氨基嘌呤、及表面活性剂吐温,有机溶剂、水组成；表面活性剂吐温加入,使得活性成分赤霉素、6-苄氨基嘌呤在水中分解减缓,保证了水剂稳定性；本发明还提供了水剂的制备方法及活性成分的检测方法，经实验证明，使用本发明水剂，能有效抑制豆芽须根生长，减少豆芽须根数量，缩短根长，豆芽粗壮，改善品质，取得有益效果；经产品残留研究与风险评估，证明该水剂用于豆类牙菜生长是安全的。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制植物生长调节剂，具体涉及一种用于豆类牙菜生长的水剂其制备方法。
背景技术
豆芽生产过程中，具有金黄的子叶，较短的根系，没有须根的豆芽收到消费者青睐。而在实际生产过程中，生产出的豆芽往往根系较长，须根较多；因此，在豆芽生产过程中使用好的豆芽生长调节剂进行调控，对优质的豆芽生产有着十分重要的意义。
目前，国内有多种豆芽生长调节剂，但值得推荐的是由赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分配制的生长调节剂。
赤霉素属抗生素类农药，是一种广谱植物生长调节剂，为五大植物激素之一。它能促进细胞、茎的伸长，增加植株高度，能促进遗传矮化植株的生长；打破某些蔬菜的种子、块茎和鳞茎等器官休眠，提高发芽率，起低温春化和长日照作用，促进和诱导长日照蔬菜当年开花；促进蔬菜坐果、保果和果实的生长发育。赤霉素在低温、干旱、弱光或短日照等逆境条件下应用效果更显著。
6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine）又称N-苄基腺苷，简称6-BA，是一种人工合成的植物生长激素，对植物的生长、发育有着促进与调节作用。
赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分配制的生长调节剂用于豆芽生长，能有效抑制豆芽须根生长，减少豆芽须根数量，缩短根长，适宜浓度下，显著提高豆芽产量，改善品质。
中国专利01128492.7公开了 赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分配制的生长调节剂，赤霉素、6-苄氨基嘌呤的质量比为1:2-5，该双组分为分别装袋的粉剂，使用时配制为水剂。配制方法为：在溶液中6-苄氨基嘌呤的配制浓度为20ppm,赤霉素40-100ppm；方法是，前者用盐酸或食用白醋助溶，后者用乙醇或白酒助溶，两者分别溶解后再混合定溶。
赤霉素、6-苄氨基嘌呤是在水中不太稳定的原料，因此，中国专利01128492.7将赤霉素、6-苄氨基嘌呤制成粉剂，但给使用者带来很大的麻烦，特别是，繁琐的配制因配制者的不同极易造成差错，配制过量的调节剂会对人体造成危害。
同时，赤霉素、6-苄氨基嘌呤的质量比为1:2-5没有经过豆芽中苄氨基嘌呤和赤霉酸膳食摄入风险评估。
因此，研制一种稳定的，食用安全的赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂，是我们急待解决的课题。
发明内容
本发明提供了一种稳定的，食用安全的赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂及新的配方，新的配方由活性成分赤霉素、6-苄氨基嘌呤、及表面活性剂,有机溶剂、水组成。
新配方的特点是：
1．赤霉素：6-苄氨基嘌呤＝4：2.9-3.1 w/w 。
2．水剂中加了表面活性剂吐温。表面活性剂吐温的加入，使得水剂稳定，上无浮油、下无沉淀，清澈、透明。其有益效果见实施例4。
3．更主要是：表面活性剂吐温的加入，使得活性成分赤霉素、6-苄氨基嘌呤在水中分解减缓，经对优选配方进行热储前后原药分解率的测定，水剂热储前后两种有效成分的分解率均＜5%，符合生产的要求，其有益效果见实施例5。
本发明提供了一种稳定的，食用安全的赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂的配方：水剂配方中各组分用量（质量分数%）为：
原材料组成 用量（质量分数%）
赤霉素 1.6
6-苄基腺嘌呤 1.16-1.24
乙酸 25.0
乙醇 15.0
吐温 4.8-5.2
自来水 补齐至100 。
本发明提供了一种稳定的，食用安全的赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂，其制备方法如下：
配方：水剂配方中各组分用量（质量分数%）为：
原材料组成 用量（质量分数%）
赤霉素 1.6
6-苄基腺嘌呤 1.16-1.24
乙酸 25.0
乙醇 15.0
吐温 4.8-5.2
自来水 补齐至100 。
制备工艺：
（1）在不锈钢桶内，加入赤霉素 1.6份（质量），乙醇15.0 份（质量），搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（2）在不锈钢桶内，加入6-苄基腺嘌呤1.16-1.24份（质量），乙酸 25.0 份（质量），搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（3）在配料罐中，加入吐温4.8-5.2 份（质量），自来水补齐至溶液总量100份（质量），搅拌60分钟；
（4）过滤溶液；
（5）检验溶液、滤液灌装入输液瓶或袋中；
（6）将溶液灌装入容器中；
（7）包装。
本发明还提供了水剂活性成分的检测，其活性成分用高效液相色谱法进行检测，操作条件如下：
流动相：乙腈:0.1%冰醋酸水溶液（V：V）=40:60；
流量：1.0ml/min；
柱温：室温；
检测波长：赤霉素207nm，6-苄氨基嘌呤267nm；
进样体积：5μL；
保留时间(min):赤霉素2.9min，6-苄氨基嘌呤9.7min。
本发明提供了一种稳定的，食用安全的赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂，本发明水剂用于豆芽生长，能有效抑制豆芽须根生长，减少豆芽须根数量，缩短根长，适宜浓度下，显著提高豆芽产量，改善品质。其有益效果见实施例6。
本发明提供了一种稳定的，食用安全的赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂，对本发明水剂用于豆芽生长进行了安全性评估，证明本发明水剂是安全的，试验见实施例7。
本发明所指豆类牙菜，包括绿豆、黄豆、红豆、黑豆等豆类生成的牙菜。
具体实施方式
下面实施例用于进一步叙述本发明，但不作任何限制。
实施例1 水剂制备工艺之一
配方：水剂配方中各组分用量为：
原材料组成 用量
赤霉素 1.6公斤
6-苄基腺嘌呤 1.2公斤
乙酸 25公斤
乙醇 15公斤
吐温40 5.公斤
自来水 补齐至100公斤。
制备工艺：
（1）在不锈钢桶内，加入赤霉素1.6公斤，乙醇15公斤，搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（2）在不锈钢桶内，加入6-苄基腺嘌呤1.2公斤，乙酸 25公斤，搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（3）在配料罐中，加入5公斤吐温40，自来水补齐至溶液总量100公斤，搅拌60分钟；
（4）过滤溶液；
（5）检验溶液、滤液灌装入输液瓶或袋中；
（6）将溶液灌装入容器中；
（7）包装。
实施例2 水剂制备工艺之二
配方：水剂配方中各组分用量为：
原材料组成 用量
赤霉素 1.6公斤
6-苄基腺嘌呤 1.24公斤
乙酸 25公斤
乙醇 15公斤
吐温60 5.2公斤
自来水 补齐至100公斤。
制备工艺：
（1）在不锈钢桶内，加入赤霉素1.6公斤，乙醇15公斤，搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（2）在不锈钢桶内，加入6-苄基腺嘌呤1.24公斤，乙酸 25公斤，搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（3）在配料罐中，加入5.2公斤吐温60，自来水补齐至溶液总量100公斤，搅拌60分钟；
（4）过滤溶液；
（5）检验溶液、滤液灌装入输液瓶或袋中；
（6）将溶液灌装入容器中；
（7）包装。
实施例3 水剂制备工艺之三
配方：水剂配方中各组分用量为：
原材料组成 用量
赤霉素 1.6公斤
6-苄基腺嘌呤 1.16公斤
乙酸 25公斤
乙醇 15公斤
吐温80 4.8公斤
自来水 补齐至100公斤。
制备工艺：
（1）在不锈钢桶内，加入赤霉素1.6公斤 ，乙醇15公斤，搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（2） 在不锈钢桶内，加入6-苄基腺嘌呤1.16公斤，乙酸 25公斤，搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（3）在配料罐中，加入吐温80 4.8公斤，自来水补齐至溶液总量100公斤，搅拌60分钟；
（4）过滤溶液；
（5）检验溶液、滤液灌装入输液瓶或袋中；
（6）将溶液灌装入容器中；
（7）包装。
实施例4 表面活性剂对水剂影响
按照本发明水剂的制备工艺，工艺中表面活性剂的量采用表1中量，对表面活性剂进行筛选。
目前国内食品乳化剂种类主要包括甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、大豆磷脂、硬脂酰乳酸钠（或钙）以及斯盘（Span）和吐温（Tween）系列，由于前四种乳化剂的生产成本较高，本实验选用斯盘和吐温系列乳化剂进行筛选，表面活性剂筛选见表1：
| 表面活性 | 用量（%） | 外观 |
| 空白对照 | 无 | 浑浊 |
| 斯盘40 | 4～8 | 浑浊 |
| 斯盘60 | 4～8 | 浑浊 |
| 斯盘80 | 4～8 | 浑浊 |
| 吐温40 | 4～8 | 清澈、透明 |
| 吐温60 | 4～8 | 清澈、透明 |
| 吐温80 | 4～8 | 清澈、透明 |
结论：表面活性剂吐温的加入，使得水剂稳定，上无浮油、下无沉淀，清澈、透明。
实施例5 表面活性剂吐温对水剂活性成分分解率影响
将按实施例1制备的水剂，进行稳定性试验，设为A组，对照组为没有加表面活性剂的水剂，其他成分与实施例1同，设B组。
将2组水剂同时进行热贮稳定性[(54±2) ℃，14 d]试验，即将A组、B组在(54±2) ℃的条件下，加热14天，热贮前后活性成分赤霉素、6-苄氨基嘌呤的分解率见表2：
| A组 | 热贮前含量（%） | 热贮后含量（%） | 分解率% |
| 赤霉素 | 1.61 | 1.57 | 2.48 |
| 6-苄氨基嘌呤 | 1.21 | 1.17 | 3.31 |
| B组 | 热贮前含量（%） | 热贮后含量（%） | 分解率% |
| 赤霉素 | 1.60 | 1.43 | 10.63 |
| 6-苄氨基嘌呤 | 1.19 | 10.30 | 13.45 |
结论：
从上表可以看出：表面活性剂吐温的加入，使得活性成分赤霉素、6-苄氨基嘌呤在水中分解减缓，经对加了吐温的优选配方进行热储前后原药分解率的测定，两种有效成分的分解率均＜5%，符合生产的要求，而对照组分解率大大高于加了吐温的A组。
原药分解率的测定方法：
1．试样用流动相溶解，以乙腈+0.1%冰醋酸水溶液为流动相，经硅胶柱分离，采用外标法进行紫外定量检测。
2．高效液相色谱操作条件
流动相：乙腈:0.1%冰醋酸水溶液（V：V）=40:60；
流量：1.0ml/min；
柱温：室温；
检测波长：赤霉酸207nm，6-苄氨基嘌呤267nm；
进样体积：5μL；
保留时间(min):赤霉酸2.9min，6-苄氨基嘌呤9.7min。
3．标样溶液的配制
称取标样0.05g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度,置于超声水浴中振荡,以保证标样完全溶解、脱气、冷却至室温，作为母液。用流动相将用上述母液依次稀释5、10、25、50、100 倍配制100mg/L、50mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L的标准溶液，摇匀，过0.45μm膜，进样，分别建立赤霉酸和6-苄氨基嘌呤的标准曲线。
4．试样溶液的配制
称取试样0.05g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中，加流动相至刻度，置于超声水浴中振荡，以保证试样完全溶解、脱气、冷却至室温，用移液管从中移取1mL于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，过0.45μm膜，待进样。
5．测定
在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各针相对响应值,待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定，每个浓度平行进三针。
6．计算
将标样6个浓度的峰面积分别求平均值后，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标在Excel表格中作图，分别建立赤霉素和6-苄氨基嘌呤的标准曲线回归方程：
C1=0.107A1-10.79 R2=0.9980…………………………………(1)
C2=0.0137A2+0.6386 R2=1.0000………………………………(2)
将赤霉素和6-苄氨基嘌呤的峰面积A1、A2 分别代入式(1)、式(2)计算二者的浓度。式中：
A1——试样溶液中，赤霉素原药峰面积的平均值；
A2——试样溶液中，6-苄氨基嘌呤原药峰面积的平均值；
C1——试样溶液中，赤霉素原药的浓度；
C2——试样溶液中，6-苄氨基嘌呤原药的浓度。
实施例6 赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂的有益效果
为了得到赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂的效果，进行下述试验：
将按实施例1制备的水剂，用于豆芽生长，设为A组，对照组没有加水剂，设为B组。
A组试验方法：
1. 试验材料：按实施例1制备的水剂，突泉明绿豆
2．试验方法
（1）器具消毒
将试验中用到的发芽器具用84消毒液消毒。
（2）药剂配制
将水剂原液稀释成11.1 mg/L，待用。
（3）绿豆预处理
选择颗粒饱满且有光泽的豆粒，将选好的的豆子进行称量，称取15g 。
（4）烫种与发芽
将洗好的绿豆进行烫种，清水中浸泡6h。
将经过浸泡的种豆，倒入发芽盒内，然后进行淋水，每6h淋一次水，注意保证每次淋水时淋水量都为100ml。
（5）药剂处理
分别在绿豆浸种后的18h,36h,后喷施稀释后的水剂每次30ml。
（6）数据统计
绿豆转移至恒温箱培养后，培养五天，培养过程中，对豆芽的一些表观指标进行观察，培养结束后，统计根长，芽长，下胚轴粗等数据。
B组试验方法：
试验中不加赤霉素、6-苄氨基嘌呤双组分水剂，其他同A组。
试验结果：
从A组、B组分别，随机得到20根豆芽，统计根长，冠层长度、全长，下胚轴粗、侧根数等数据，取其平均值，得表3：
结论：
从上表可以看出：本发明水剂用于豆芽生长，能有效抑制豆芽须根生长，减少豆芽须根数量，缩短根长，豆芽粗壮，改善品质。取得有益效果。
实施例7 含1.6%赤霉素和1.2% 6-苄氨基嘌呤的双组分水剂-产品残留研究与风险评估
一、 试验设计
1．生长调节剂：含1.6%赤霉素和1.2% 6-苄氨基嘌呤的双组分水剂
2．试验作物：黄豆芽、绿豆芽
3．试验方法：黄豆芽、绿豆芽的生产过程按实施例6，但增加了一次喷施稀释后的水剂（浸种后的54h）。
消解动态实验于最后一次施药后0、0.5d、1d、1.5d、2d、3d 采集豆芽样本，分别测定其中苄氨基嘌呤和赤霉酸的残留量。
最终残留实验于豆芽收获期，豆芽生长第5、6、7天分别采集样本，分别测定其中6-苄氨基嘌呤苄和赤霉素的残留量。
二、检测方法
1. 仪器设备
Agilent 6410QQQ （Agilent Technologies，美国）。
2. 样本的制备
豆芽样本：每小区随机采集样本，捣碎后贮存在-20℃冰箱内待分析。
3. 分析步骤
（1）提取
准确称取10g样品（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加入5mL乙腈，振摇30s后涡旋1min 提取，然后在用5 mL乙腈提取一次，合并上清液，加入4g 无水MgSO4 和1g NaCl（精确至0.01g），立即剧烈振摇10s后置于冰水浴中冷却1～2min，然后再涡旋1min。放入离心机中，以3800r/min转速离心5min。过0.22μm 滤膜于色谱自动进样瓶中待测。
（2）分析测定
a）仪器条件
Agilent 6410QQQ （Agilent Technologies，美国）。
色谱柱：zorbax-C18；流动相：甲醇：水（含0.1%甲酸）=70：30；流速：0.3mL/min；柱温：25℃；进样量：5μL。
特征碎片离子：
6-苄氨基嘌呤： m/z226.1, m/z 91（定量）, m/z 148；
赤霉素：m/z345.1, m/z 143（定量）, m/z 239。
b）标准曲线
准确称取苄氨基嘌呤、赤霉酸标准品配制成1000mg/L乙腈贮备液， 吸取定量贮备液以乙腈稀释定容配得5mg/L和0.5mg/L标准工作溶液，再用黄豆芽和绿豆芽空白提取液系列稀释配得0.005、0.01、0.05、0.1、0.5mg/L系列基质标准溶液（苄氨基嘌呤），0.05、0.1、0.5、1、2mg/L系列基质标准溶液（赤霉素）进样5uL，以上述色谱-质谱条件进样测定，苄氨基嘌呤、赤霉素标准溶液浓度与峰面积呈线性关系。以苄氨基嘌呤、赤霉素标准溶液浓度与峰面积作标准曲线。线性方程见表4：
c）最低检出量：在上述色谱-质谱条件下，苄氨基嘌呤、赤霉素的最低检出量为0.25ng。
d）最低检测浓度：在上述色谱-质谱条件下，方法的苄氨基嘌呤、赤霉酸最低检测浓度：0.05mg/kg。
e）相对保留时间：在上述色谱-质谱条件下，苄氨基嘌呤、赤霉酸的相对保留时间分别为0.82、0.85min左右。
f）添加回收率
在空白样品中添加苄氨基嘌呤、赤霉酸标样，分别进行0.05，0.1，1mg/kg三个浓度的添加回收率试验，每个浓度重复5次，按上述方法进行提取、净化和LC-MS-MS分析。样品的平均回收率在74.9～106.3%。变异系数为0.8～11.8%，符合农药残留检测要求。
（3）图表
表5 苄氨基嘌呤和赤霉酸在黄豆芽和绿豆芽添加回收率：
表6 苄氨基嘌呤和赤霉酸在黄豆芽和绿豆芽中的消解动态：
表7：苄氨基嘌呤和赤霉素在黄豆芽和绿豆芽中的残留试验结果：
（4）豆芽中苄氨基嘌呤和赤霉酸膳食摄入风险评估
a）膳食摄入评估
长期膳食摄入评估是依据卫生部发布的《中国不同人群消费膳食分组食谱》或相关参考资料中的膳食结构数据，结合残留化学评估推荐的规范残留试验中值或已制定的最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRL），计算国家估算每日摄入量（National Estimated Daily Intake，NEDI），与毒理学评估推荐的每日允许摄入量进行比较。
短期膳食摄入评估是依据卫生部发布的《中国不同人群消费膳食分组食谱》或相关参考资料中的膳食结构数据，结合残留化学评估推荐的最高残留值或已制定的最大残留限量（MRLs），计算国家估算短期摄入量（National Estimated ShortTerm Intake, NESTI），与毒理学评估推荐的急性参考剂量进行比较。
根据毒理学、残留化学和膳食摄入评估结果，确定每日允许摄入量（ADI）、急性参考剂量（ARfD）以及残留试验中值（STMR）和最高残留值（HR），并向风险管理机构推荐最大残留限量值或风险管理建议。
b)我国人群对于豆芽的摄入量调查结果为15g/(day·person)。根据上文规范残留试验最终残留量的统计。苄氨基嘌呤和赤霉酸在黄豆芽上按照GAP即试验设计的低浓度施药2次的残留试验中值（STMR）分别为0.117和0.142；最高残留值（HR）分别为0.137和0.177；在绿豆芽上的残留试验中值（STMR）分别为0.092和0.029；最高残留值（HR）分别为0.121和0.041。苄氨基嘌呤和赤霉酸在黄豆芽上按照临界GAP 即试验设计的低浓度及高浓度施药2 次及3 次的残留试验中值（STMR）分别为0.123和0.169；最高残留值（HR）分别为0.146 和0.281；在绿豆芽上的残留试验中值（STMR）分别为0.083和0.043；最高残留值（HR）分别为0.121和0.046。
c）苄氨基嘌呤和赤霉素的ADI值分别为0.05mg(kgbw·d)和3 mg/(kgbw·d)。我国苄氨基嘌呤和赤霉素的MRL值分别为0.2mg/kg 和0.5mg/kg。豆芽中苄氨基嘌呤和赤霉素残留慢性风险评估见表8 和表9。不同的慢性风险商RQc 和急性风险商RQa 均< 100%。表明膳食摄入风险是可以接受的。
表8豆芽中苄氨基嘌呤和赤霉酸残留慢性风险评估：
表9 豆芽中苄氨基嘌呤和赤霉酸残留急性风险评估：
结论：以本发明水剂中使用的最大浓度11.1mg/L进行风险评估，证明用本发明的生产豆芽方法及水剂是很安全的。
Claims (7)
1.一种用于豆类牙菜生长的水剂，由活性成分赤霉素、6-苄氨基嘌呤、及表面活性剂、有机溶剂、水组成。
2.根据权利要求1所述的水剂，其特征在于：赤霉素：6-苄氨基嘌呤＝4：2.9-3.1 w/w 。
3.根据权利要求1所述的水剂，其特征在于：表面活性剂为吐温40、吐温60、吐温80。
4.根据权利要求1所述的水剂，其特征在于：有机溶剂为乙醇、乙酸。
5.根据权利要求1所述的水剂，其特征在于：水剂配方中各组分用量（质量分数%）为：
原材料组成 用量（质量分数%）
赤霉素 1.6
6-苄基腺嘌呤 1.16-1.24
乙酸 25.0
乙醇 15.0
吐温 4.8-5.2
自来水 补齐至100 。
6.一种如权利要求1至5任一项用于豆类牙菜生长的水剂，其制备方法如下：
配方：水剂配方中各组分用量（质量分数%）为：
原材料组成 用量（质量分数%）
赤霉素 1.6
6-苄基腺嘌呤 1.16～1.24
乙酸 25.0
乙醇 15.0
吐温 4.8～5.2
自来水 补齐至100 ；
制备工艺：
（1）在不锈钢桶内，加入赤霉素 1.6份（质量），乙醇15.0 份（质量），搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（2）在不锈钢桶内，加入6-苄基腺嘌呤1.16～1.24份（质量），乙酸 25.0 份（质量），搅拌溶解，溶液进入配料罐；
（3）在配料罐中，加入吐温4.8～5.2 份（质量），自来水补齐至溶液总量100份（质量），搅拌60分钟；
（4）过滤溶液；
（5）检验溶液、滤液灌装入输液瓶或袋中；
（6）将溶液灌装入容器中；
（7）包装。
7.根据权利要求1所述的水剂，其活性成分用高效液相色谱法进行检测，操作条件如下：
流动相：乙腈:0.1%冰醋酸水溶液（V：V）=40:60；
流量：1.0ml/min；
柱温：室温；
检测波长：赤霉素207nm，6-苄氨基嘌呤267nm；
进样体积：5μL；
保留时间(min):赤霉素2.9min，6-苄氨基嘌呤9.7min。
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| Publication number | Publication date |
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| CN102763660B (zh) | 2013-04-24 |
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