CN102759518A

CN102759518A - 肝素钠的共振光散射检测方法

Info

Publication number: CN102759518A
Application number: CN2012102671340A
Authority: CN
Inventors: 武丽萍; 赵华文; 杨旭; 贺建; 李兰兰; 刘欢
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2012-10-31

Abstract

本发明公开了一种肝素钠的共振光散射检测方法，在NaOH浓度为0.042mol/L的碱性条件下，Co(II)与钴试剂结合生成的配合物带正电荷，肝素钠带负电，二者通过静电结合形成三元复合物，使共振光散射强度显著增大，最大散射峰位于550nm，散射强度与肝素钠浓度在0.05-1.60μg/mL范围内呈良好的线性关系，检出限(3σ)为1.3ng/mL，所需检测设备简单、试剂易得、易于操作、检测时间短、线性范围较宽、灵敏度较高。本发明丰富了肝素钠的检测方法，利于满足不同条件下的检测需求。

Description

肝素钠的共振光散射检测方法

技术领域

本发明属于分析技术领域，涉及一种药物分析方法。

背景技术

心脑血管疾病是人类的头号疾病杀手。随着人们生活水平提高带来的营养过剩、全球环境恶化、生活节奏加快、人口老龄化加剧，全球心脑血管疾病的发病率和死亡率正逐年增高。肝素钠是目前世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要用于心脑血管疾病和血液透析治疗，且在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素钠除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂、抗中膜平滑肌细胞增生、促进纤维蛋白溶解等作用。而以肝素钠为原料进一步加工制成的低分子肝素钠则具有更为广泛的临床医学用途，已成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症（心绞痛、心肌梗塞）等疾病的首选药物。近年来国际市场对肝素钠原料药的需求十分强劲，肝素钠制剂用量稳中有升，低分子肝素钠的市场迅速扩容并保持高速增长趋势。

肝素钠的分子结构复杂，短期内无法人工化学合成，目前只有自猪或牛肠粘膜中提取的肝素钠能够用于临床治疗。由于肝素钠目前多采用注射给药的方式用于临床，从而要求肝素钠原料药必须具备很高的纯度，方可保证制剂的用药安全。此外，肝素钠临床上用药剂量过大时可引起自发性出血，如粘膜出血、关节积血、伤口出血等。因此，精确测定肝素钠的含量具有非常重要的意义。

目前肝素钠的测定方法有生物学方法和化学方法两大类。现行药典收载的测定方法为肝素生物测定法，系通过比较肝素标准品与供试品延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝结时间的作用，来测定供试品的效价。化学方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法、荧光法、光散射法、电化学分析法等。例如，刘绍璞等以碱性二苯基萘基甲烷染料和碱性三苯甲烷染料为探针，采用分光光度法或光散射法对肝素钠进行测定；孙伟等以中性红为光度试剂，在pH3.0的B-R缓冲溶液中，利用中性红与肝素钠相互结合导致溶液褪色的现象，采用分光光度法测定肝素钠；郭小群等以甲基红染料作增色剂，在近中性的B-R缓冲溶液中，利用肝素钠与甲基红染料形成离子缔合物后共振瑞利散射强度显著增强的现象，采用共振瑞利散射法测定肝素钠。虽然目前已有许多文献报道了多种肝素钠的测定方法，但出于进一步提高检测准确度、灵敏度和精确度，简化操作，丰富检测方法以满足不同条件下的检测需求等目的，仍有必要继续开发更多、更先进的肝素钠测定方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肝素钠的共振光散射（RLS）检测方法，设备简单、试剂易得、易于操作、检测时间短、线性范围较宽、灵敏度较高，以丰富肝素钠的检测方法，满足不同条件下的检测需求。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

肝素钠的共振光散射检测方法，包括以下步骤：

a．标准曲线的制作

a1．在反应容器中加入Co(II)的水溶液和钴试剂的无水乙醇溶液，混匀，再加入NaOH的水溶液，混匀，再加入肝素钠的水溶液，用水稀释制成含有2.0×10^-5mol/L Co(II)、4.0×10^-5mol/L 钴试剂、0.042 mol/L NaOH和肝素钠浓度在0.05~1.60 μg/mL范围内呈梯度的系列标准溶液；

a2．按照步骤a1所述方法配制不加入肝素钠的空白对照溶液；

a3．取步骤a1配制的系列标准溶液，用荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描，获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度，记为I；另取步骤a2配制的空白对照溶液，同法测定550nm处的散射强度，记为I ₀；按照公式△I ₅₅₀= I- I ₀计算△I ₅₅₀，制作△I ₅₅₀对肝素钠浓度的标准曲线；

b．样品测定

b1．在反应容器中加入Co(II)的水溶液和钴试剂的无水乙醇溶液，混匀，再加入NaOH的水溶液，混匀，再加入未知肝素钠含量的样品的水溶液，用水稀释制成含有2.0×10^-5mol/L Co(II)、4.0×10^-5mol/L 钴试剂、0.042 mol/L NaOH和未知肝素钠浓度的待测溶液；

b2．按照步骤b1所述方法配制不加入肝素钠的空白对照溶液；

b3．取步骤b1配制的待测溶液，用荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描，获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度，记为I；另取步骤b2配制的空白对照溶液，同法测定550nm处的散射强度，记为I ₀；按照公式△I ₅₅₀= I-I ₀计算△I ₅₅₀，再依据步骤a3获得的△I ₅₅₀对肝素钠浓度的标准曲线，计算出样品中肝素钠的含量。

进一步，所述步骤a1是在反应容器中加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L CoCl₂水溶液和0.8 mL 5.0×10^-4mol/L 钴试剂无水乙醇溶液，混匀，再加入1.4 mL 0.3 mol/L NaOH水溶液，混匀，再加入10 μg/mL肝素钠水溶液，用水稀释至10 mL，制成含有2.0×10^-5mol/L Co(II)、4.0×10^-5mol/L 钴试剂、0.042 mol/L NaOH和肝素钠浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 μg/mL的系列标准溶液；

所述步骤b1是在反应容器中加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L CoCl₂水溶液和0.8 mL 5.0×10^-4mol/L 钴试剂无水乙醇溶液，混匀，再加入1.4 mL 0.3 mol/L NaOH水溶液，混匀，再加入未知肝素钠含量的样品水溶液，用水稀释至10 mL，制成含有2.0×10^-5mol/L Co(II)、4.0×10^-5mol/L 钴试剂、0.042 mol/L NaOH和未知肝素钠浓度的待测溶液。

本发明的有益效果在于：本发明建立了一种利用共振光散射技术定量测定肝素钠的方法，在NaOH浓度为0.042 mol/L的碱性条件下，Co(II)与钴试剂结合生成的配合物带正电荷，肝素钠带负电，二者通过静电结合形成三元复合物，使共振光散射强度显著增大，最大散射峰位于550 nm，散射强度与肝素钠浓度在0.05-1.60 μg/mL范围内呈良好的线性关系，检出限(3σ)为1.3 ng/mL，所需检测设备简单、试剂易得、易于操作、检测时间短、线性范围较宽、灵敏度较高。本发明丰富了肝素钠的检测方法，利于满足不同条件下的检测需求。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步描述，其中：

图1为Co(II)、钴试剂和肝素钠相互作用的共振光散射光谱，其中编号0是1.2μg/mL肝素钠溶液的共振光散射光谱，编号1至7是2.0×10^-5mol/L Co(Ⅱ)和4.0×10^-5mol/L钴试剂在0.042 mol/L NaOH存在下，分别与0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μg/mL肝素钠相互作用的共振光散射光谱。

图2为共振光散射强度随NaOH浓度变化图。

图3为共振光散射强度随Co(II)和钴试剂的摩尔比变化图。

图4为共振光散射强度对肝素钠浓度的标准曲线。

具体实施方式

以下将参照附图，通过具体实验对本发明进行详细的描述。

实验中使用的肝素钠固体为中国医药集团上海化学试剂公司产品（160 IU/mg），其溶液用水配制而得；Co(II)溶液为CoCl₂的水溶液；钴试剂为4-(5-氯-2-吡啶偶氮)-1,3-二氨基苯，缩写为5-Cl-PADAB，其溶液用无水乙醇配制而得。实验中涉及的共振光散射光谱及强度（I）均由F-4500荧光分光光度计（日立公司）测得。

一、Co(II)、钴试剂和肝素钠相互作用的共振光散射光谱特征

在10.0 mL 试管中依次加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L Co(II)溶液、0.8 mL 5.0×10^-4mol/L 钴试剂溶液和1.4 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，每加一种试剂均充分混匀，再加入适量10 μg/mL肝素钠标准溶液（终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μg/mL），最后用水定容到10mL，充分混匀。用F-4500荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长（△λ = 0 nm）、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描获得共振光散射光谱。同时按照上述方法但不加入肝素钠配制空白对照，同法测定。

结果显示，Co(II)和钴试剂在碱性条件下作用形成一种带正电的配合物，由于肝素钠带负电荷，其可通过静电作用与上述带正电的配合物结合形成三元复合物，从而导致散射光增强。如图1所示，单独的肝素钠或Co(II)-钴试剂配合物的散射强度都很低，当二者反应形成三元复合物后，散射强度显著增强，并在波长280nm和550nm处出现两个特征散射峰，其中550nm处的散射增强更明显，而且散射强度随着肝素钠浓度（0.2-1.2μg/mL）的增加而增加，呈现出一定线性关系。

二、检测条件优化

1、NaOH浓度优化

在10.0 mL 试管中依次加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L Co(II)溶液、0.8 mL 5.0×10^-4mol/L 钴试剂溶液和适量0.3 mol/L NaOH溶液（终浓度分别为0、0.006、0.012、0.018、0.024、0.030、0.036、0.042、0.048、0.054 mol/L），每加一种试剂均充分混匀，再加入1mL 10 μg/mL肝素钠标准溶液，最后用水定容到10mL，充分混匀。用F-4500荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度。同时按照上述方法但不加入肝素钠配制空白对照溶液，同法测定。绘制散射强度随NaOH浓度变化图。

结果如图2所示，在不加NaOH的中性条件下，加入肝素钠后散射强度几乎无变化；随着加入NaOH浓度的增大，加入肝素钠后散射强度也逐渐增加，至NaOH浓度达到0.042 mol/L时，散射强度达到最大，之后又逐渐减弱。分析其原因，可能是当NaOH浓度低于0.042 mol/L时，由于肝素钠去离子化而不利于其与Co(II)-钴试剂配合物静电结合；当NaOH浓度逐渐增大时，肝素钠逐渐电离而带更多的负电荷，容易与带正电荷的配合物结合引起更强的散射信号。因此，NaOH浓度优选为0.042 mol/L。

2、Co(II)和钴试剂的摩尔比优化

在10.0 mL 试管中依次加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L Co(II)溶液、适量5.0×10^-4mol/L 钴试剂溶液（终浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0×10^-5mol/L）和1.4 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，每加一种试剂均充分混匀，再加入1mL 10 μg/mL肝素钠标准溶液，最后用水定容到10mL，充分混匀。用F-4500荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度。同时按照上述方法但不加入肝素钠配制空白对照溶液，同法测定。绘制散射强度随Co(II)和钴试剂的摩尔比变化图。

结果如图3所示，保持Co(II)浓度不变，逐渐增大钴试剂的浓度，散射强度呈现先增加后降低的趋势，当Co(II)和钴试剂的摩尔比为1:2时，散射强度最大。分析其原因，可能是由于一分子Co(II)可以与两分子钴试剂配位形成配合物，当二者摩尔比为1:2时，恰好形成分子结构较大的饱和配合物，再与肝素钠静电结合，所得三元复合物粒子体积较大，从而使散射信号增强。因此，Co(II)和钴试剂的摩尔比优选为1:2。

3、共存物质的影响

在10.0 mL 试管中依次加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L Co(II)溶液、0.8 mL 5.0×10^-4mol/L 钴试剂溶液和1.4 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，每加一种试剂均充分混匀，再加入1mL 10 μg/mL肝素钠标准溶液和适量共存物质（常见的金属离子、糖类、氨基酸或蛋白）溶液，最后用水定容到10mL，充分混匀。用F-4500荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度。同时按照上述方法但不加入肝素钠配制空白对照溶液，同法测定。计算加入共存物质前后RLS强度的变化百分率（△I _RLS%）。

结果如表1所示，在上述检测体系中，K⁺、Na⁺、Ba²⁺等离子的允许量相对较高，而Ag⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Mg²⁺、Al³⁺等离子的允许量相对较低，这是因为对肝素钠的测定是在碱性条件下进行的，这些离子容易形成氢氧化物沉淀而干扰共振光散射信号；此外，常见糖类和氨基酸的允许量相对较高，而蛋白的允许量相对较低，这是因为在碱性条件下，pH值通常大于蛋白的等电点，而使蛋白带负电荷，且蛋白的结构相对复杂，其也会与带正电荷的Co(II)-钴试剂配合物发生静电结合后，也会形成结构较大的复合物从而干扰肝素钠的测定。但总的来说，上述允许量相对较低的干扰物质在实际样品（如肝素钠注射液）中的浓度通常都是低于表1所示浓度的，因此不会干扰肝素钠的测定。

表1 共存物质的影响

三、线性范围和检出限

在10.0 mL 试管中依次加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L Co(II)溶液、0.8 mL 5.0×10^-4mol/L 钴试剂溶液和1.4 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，每加一种试剂均充分混匀，再加入适量10 μg/mL肝素钠标准溶液（终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 μg/mL），最后用水定容到10mL，充分混匀。用F-4500荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度，记为I。同时按照上述方法但不加入肝素钠配制空白对照溶液，同法测定550nm处的散射强度，记为I ₀。计算△I ₅₅₀= I- I ₀，制作△I ₅₅₀对肝素钠浓度的标准曲线。

结果如图4所示，在优化检测条件下，肝素钠浓度在0.05-1.60μg/mL范围内与△I ₅₅₀呈良好的线性关系，线性方程为△I = -306.1 + 2249.1 c，检出限(3σ)为1.3 ng/mL，相关系数为0.9950。

四、实际样品测定

取市售的两个不同厂家（天津生化制药厂和江苏万邦生化股份有限公司）生产的肝素钠注射液，采用本发明方法检测肝素钠的含量。在10.0 mL 试管中依次加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L Co(II)溶液、0.8 mL 5.0×10^-4mol/L 钴试剂和1.4 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，每加一种试剂均充分混匀，再根据样品的肝素钠标示量加入适量样品（使肝素钠终浓度在0.05-1.60 μg/mL范围内），最后用水定容到10mL，充分混匀。用F-4500荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度，记为I。同时按照上述方法但不加入肝素钠配制空白对照溶液，同法测定550nm处的散射强度，记为I ₀。计算△I ₅₅₀= I- I ₀，再根据前面获得的△I ₅₅₀对肝素钠浓度的标准曲线，计算出样品的肝素钠含量。

结果如表2所示，采用本发明方法测定两个不同厂家肝素钠注射液（标示量均为12500 IU/2mL）的含量，平均回收率分别为104.0%（RSD 2.6%）和101.0%（RSD 2.1%），说明本发明方法是一种准确、可靠的肝素钠定量测定方法。

表2肝素钠注射液的含量测定结果 (n=5)

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.肝素钠的共振光散射检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a．标准曲线的制作

a2．按照步骤a1所述方法配制不加入肝素钠的空白对照溶液；

a3．取步骤a1配制的系列标准溶液，用荧光分光光度计在220-700 nm范围内、激发波长等于发射波长、狭缝10 nm的条件下进行同步扫描，获得共振光散射光谱，测定550nm处的散射强度，记为I；另取步骤a2配制的空白对照溶液，同法测定550nm处的散射强度，记为I ₀；按照公式△I ₅₅₀= I-I ₀计算△I ₅₅₀，制作△I ₅₅₀对肝素钠浓度的标准曲线；

b．样品测定

b2．按照步骤b1所述方法配制不加入肝素钠的空白对照溶液；

2.根据权利要求1所述的肝素钠的共振光散射检测方法，其特征在于，所述步骤a1是在反应容器中加入1.0 mL 2.0×10^-4mol/L CoCl₂水溶液和0.8 mL 5.0×10^-4mol/L 钴试剂无水乙醇溶液，混匀，再加入1.4 mL 0.3 mol/L NaOH水溶液，混匀，再加入10 μg/mL肝素钠水溶液，用水稀释至10 mL，制成含有2.0×10^-5mol/L Co(II)、4.0×10^-5mol/L 钴试剂、0.042 mol/L NaOH和肝素钠浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 μg/mL的系列标准溶液；