CN102747003A - 一株益生屎肠球菌的筛选及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用微生物添加剂制备技术领域，具体涉及一种分离筛选的对养殖动物常见肠道致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果的屎肠球菌菌株及应用。本发明的特征在于，所述的菌株是屎肠球菌菌株(Enterococcus faecium)HDRsEf1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2011031。该菌株具有生长速度快，产酸能力高，抗逆性强，安全、抗病和促生长特点，可用作畜禽饲用微生物添加剂。

Description

一株益生屎肠球菌的筛选及应用

技术领域

本发明属于兽用微生物添加剂技术领域，与抗生素添加剂领域有关，本发明涉及一种对常见肠道致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果的屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株的分离鉴定、安全性评价、抗逆性能及益生性能鉴定及作为饲料添加剂的用途。 

背景技术

自1946年Moore首次报道在饲料中添加抗生素能明显提高肉鸡的日增重以来，先后有60余种抗生素应用于畜牧业，在动物疾病防治、提高畜禽生产性能等方面发挥了重要作用。但随着抗生素的大量使用，特别是不科学的滥用，导致耐药菌株的大量产生、动物正常菌群失调、畜产品中药物残留等问题日益突显，严重危害养殖业健康发展，影响人类食品安全，引起世界各国政府及业内人士的高度重视。在这种背景下，益生菌以其无毒、无残留、无抗药性的特点，被认为是规模化养殖中抗生素的最佳替代品(Shanahan et al，2000；Park et al.，2002)。2008年，中国农业部发布了1126号公告，《饲料添加剂品种目录》明确规定饲用微生物添加剂的种类，屎肠球菌位列其中。 

尽管肠球菌被广泛应用于食品、医药及饲料行业，但其作为益生菌的使用一直是备受争议的话题，争议的核心是：抗生素抗性基因或编码毒力因子的基因可能转移给胃肠道的其它微生物(Franz et al，2003)。因此，在筛选益生肠球菌时，除了要对其益生特性先行筛选外，还必须对菌株进行毒力因子和抗生素抗性进行检测，以确保菌株的安全性。本发明在筛选菌株时，在国内首次对菌株益生特性、毒力因子和抗生素抗性同时进行考察检测，另外还考虑菌株来源动物品种的抗逆性能。这样的研究思路为最终得到优良菌株奠定了基础。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，分离筛选一株既安全又有明显益生特性的益生菌，该菌株对常见肠道致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果，经鉴定分离得到的该益生菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，对其微生物菌学特征利用16SrDNA进行了鉴定，对其安全性、抗逆性及益生性及作为饲料添加剂的用途进行了相关试验。 

本发明的技术方案如下： 

根据筛选目标和益生菌的生理生化特性及遗传学特性，以经典的生理生化手段及现代分子生物学方法，从抗逆性强的地方优良品种“通城猪”的直肠内容物中，经过大量分选，分离筛选得到一株屎肠球菌菌株，申请人将其命名为屎肠球菌(Enterococcus faecium)HDRsEf1， 已于2011年1月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2011031。 

屎肠球菌(Enterococcus faecium)HDRsEf1的菌学特性如下所述： 

该菌株为革兰氏阳性，呈单在、成双或短链排列的卵圆形球菌。在KF链球菌琼脂培养基上为红色，光滑凸起，周边整齐，1mm左右大小的菌落，菌落周围培养基颜色由紫色变为黄色。过氧化酶阴性。菌株能耐受6.5％NaCl、pH9.6的生长环境；可在45℃生长、60℃耐受30min、胆汁-七叶苷水解试验为阳性，能水解阿拉伯糖，说明该菌株属于肠球菌属屎肠球菌种；将其16S rRNA基因进行克隆测序，结果在NCBI进行Blastn比较，发现其16S rRNA与屎肠球菌(AB362603.1)的序列同源性最高，相似性为99％；另外，从该菌基因组中扩增出了屎肠球菌特异性片段ddl_E.faecium。 

该菌株在酸性和高胆盐环境中的生存能力强，能耐受0.5％胆盐，在pH2.5孵育2h后，其活菌数几乎没有下降；另外，该菌株对粘蛋白有明显的粘附性(p＜0.05)。由此推测，该菌株能够抵抗胃酸和小肠中高浓度胆盐的不利影响，粘附于肠道存活下来发挥益生作用，这在动物试验中也得到证实。 

该菌株繁殖能力很强，无迟缓期，很快进入对数增长期(0h～4h)，4h后进入稳定期，一直持续到18h，细菌数达到最大，为3.50×10⁹CFU/mL，18h后进入衰退期。 

该菌株虽然不产芽胞，但对高温的耐受能力相对较强，可耐受60℃，30min；65℃，10min存活率大于97％；这为该菌株作饲料添加剂的应用于生产实际奠定了良好基础。 

该菌株对常见肠道致病菌(金黄色萄萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)均有明显的抑菌活性。用PCR方法，评价了该菌株的安全性，发现该菌株仅含efaA_fm 1个毒力基因。对常用兽药如氨苄西林、万古霉素、四环素、诺氟沙星、呋喃妥因、氯霉素敏感，而对青霉素、红霉素表现耐药；对环丙沙星表现中等耐药。 

申请人应用将本发明的屎肠球菌HDRsEf1菌株通过液体发酵和固体发酵两种方式制作的微生态制剂，用作饲料添加剂，进行了抗生素替代试验，对断奶仔猪有明显的预治腹泻、促进食欲，促进生长的作用，达到了预期的效果，从而完成了本发明的任务。 

本发明的屎肠球菌具有如下优点： 

(1)菌株来源于抗逆性好的中国地方猪优良猪种-即湖北省“通城猪”--肠道的内容物，从大量候选菌株中分离和筛选得到，该菌株被命名为屎肠球菌HDRsEf1，其对常见肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)具有明显的抑菌效果，为替代抗生素添加剂提供了有力依据。 

(2)对菌株用分子生物学的方法进行了安全性淘选，因此安全性更高。 

(3)该菌株可完全耐受胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，且具有粘附能力，因此可在肠道定植发挥益生作用。 

(4)该菌株虽然不产芽胞，但对高温的耐受能力相对较强，可耐受60℃，30min；65℃，10min存活率大于97％；62℃，30秒制粒饲料中55％存活。90℃，30秒制粒饲料中30％存活；80℃，30秒制粒饲料中40％存活。这为该菌株作饲料添加剂的应用于生产实际打下了良好基础。 

(5)动物试验证明，可替代抗生素作畜禽饲料添加剂使用，生产及使用均十分简单，不仅可提高畜禽生产性能，更具有环境友好，对人畜安全的优点。 

将其制备为益生菌制剂，替代猪饲料中的抗生素添加剂，对养猪业起防病促生长作用，大大削减猪饲料中的抗生素所造成的对环境的破坏以及人类身体健康的影响，同进减少细菌抗药性的产生，以实现畜牧业、人类和环境的和谐、可持续发展。 

更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离株屎肠球菌株HDRsEf1的16S rDNA基因部分序列。 

图1：是本发明分离筛选的屎肠球菌株在KF链球菌琼脂平板上的生长状态。 

图1A是空白KF链球菌琼脂平板；图1B.是屎肠球菌株在KF链球菌琼脂平板上长成红色菌落，菌落周围的培养基变成红色。 

图2：是本发明分离筛选的屎肠球菌株革兰氏染色阳性反应(×1000) 

图3：16S rRNA基因PCR扩增检测结果。 

图中各泳道：M：DL2000DNA分子量标准；泳道1：阴性对照；泳道2：本发明菌株；泳道3：HB6肠球菌分离株；泳道4：TC12肠球菌分离株；泳道5：TC13肠球菌分离株 

图4屎肠球菌的种特异性基因ddl_E.faecium的PCR扩增检测结果。 

图中各泳道：M：DL2000DNA分子量标准；泳道1：屎肠球菌HDRsEf1株。 

图5是本发明菌株发酵上清液对常见肠道致病菌的体外抑菌性试验结果。 

图5A：对金黄色葡萄球菌的体外抑菌性试验； 

图5B：对大肠杆菌的体外抑菌性试验； 

图5C：对沙门氏菌的体外抑菌性试验。 

图6：屎肠球菌HDRsEf1毒力因子efaA_fmPCR检测结果。 

图中各泳道：M：DL2000DNA分子量标准；泳道1：屎肠球菌HDRsEf1。 

图7：是屎肠球菌TC3的生长曲线。 

图8：cylA的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。 

图中各泳道：M：DL2000DNA分子量标准；泳道1：HB6肠球菌分离株；泳道2：TC12肠球菌分离株；泳道3：TC13肠球菌分离株。 

图9：esp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。 

图中各泳道：M：DL2000DNA分子量标准；泳道1：HB6肠球菌分离株；泳道2：TC12肠球菌分离株；泳道3：TC13肠球菌分离株。 

图10：agg的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。 

图中各泳道：M：DL2000DNA分子量标准；泳道1：TC12肠球菌分离株。 

图11：efaAfs的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。 

图中各泳道：M：DL2000DNA分子量标准；泳道1：HB6肠球菌分离株；泳道2：TC12肠球菌分离株；泳道3：TC13肠球菌分离株。 

具体实施方案

实施例1：益生菌菌株的分离和鉴定 

一、菌株的分离 

样品取自100日龄、21日龄中国地方猪品种湖北“通城猪”(品种来源于湖北省通城县保种场)，用灭菌棉拭子从肛门采集猪的直肠内容物。样品采集后，用棉拭子在KF链球菌琼脂培养基(购自杭州微生物试剂有限公司)中划线培养，37℃、24h～48h培养后，选取红色，光滑凸起，周边整齐，1mm左右大小的菌落做纯培养。将纯培养物经菌落形态的观察、革兰氏染色、过氧化酶试验进行初步筛选。细菌呈单个、成双或短链排列的卵圆形革兰阳性球菌及过氧化酶试验阴性的菌株，均传代保存。该发明的菌株在KF链球菌琼脂培养基上的生长特性见图1，其革兰氏染色特性见图2。 

二、属的鉴定 

将上述分离的菌株(以下简称分离株)进行6.5％NaCl生长试验、pH9.6肉汤生长试验、45℃生长试验、60℃，30min生长试验、胆汁-七叶苷水解试验。能耐受6.5％NaCl、在pH9.6肉汤中生长、45℃能存活、60℃作用30min能存活、胆汁-七叶苷水解阳性的菌株即定为肠球菌属细菌。具体步骤是： 

(1)耐6.5％NaCl试验取幼龄分离株接种在适宜生长的含6.5％NaCl的TSB培养基(购自美国BD公司)试管中，37℃培养24h，与未接种的对照管对比，目测生长情况。混浊即为阳性，否则为阴性。 

(2)pH9.6肉汤生长试验将分离株接种于pH9.6TSB培养基中，37℃培养24h后，观察结果。培养基变混浊为阳性，否则为阴性。 

(3)45℃生长试验用接种环吊起一环24h培养的液体培养物，接入清亮的BHI肉汤中，45℃恒温水浴培养，培养基变混浊为阳性，否则为阴性。重复该试验3次，结果相同才确认。 

(4)60℃，30min生长试验挑取幼龄菌落，接种于TSA斜面，60℃培养30min后，转入37℃培养24h，有菌落生长判为阳性。 

(5)胆汁七叶苷水解试验将分离株接种于胆汁七叶苷培养基中，37℃孵育18-24h后，观察结果。培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。 

经过上述肠球菌属试验，筛选到4株肠球菌菌株，申请人将其分别命名为HB6，TC12，TC13，HDRsEf1。 

三、对分离株进行种的初步鉴定 

对筛选出的4株肠球菌菌株HB6，TC12，TC13，HDRsEf1进行体外抑菌试验，对抑菌效果较明显的菌株，通过一系列的生化实验，进一步进行种的鉴定。包括：葡萄糖、木糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、精氨酸双水解酶。将鉴定结果(见表1)与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)中关于肠球菌属种间鉴别的描述相对照，初步确定分离株HDRsEf1是屎肠球菌。 

表1屎肠球菌株HDRsEf1生化鉴定结果 

五、分离株种的确证 

在上述鉴定的基础上，进一步对上述肠球菌分离株HB6，TC12，TC13，HDRsEf1进行16SrRNA基因序列检测和种特异性基因检测，对菌株所属的种进行确证鉴定。 

(一)肠球菌分离株基因组提取步骤如下： 

(1)分别取1mL分离株纯培养物，加入1.5mL EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH8.0)中。 

(2)加入6μL 50mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h。 

(3)再加2MNaCl 50μL，10％十二烷基硫酸钠(即SDS)110μL，20mg/mL的蛋白酶K 3μL，50℃作用3h或37℃过夜。 

(4)将菌液均分到两个1.5mLEP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min；12000rpm离心10min；如此重复抽提两次。 

(5)加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。 

(6)用75％的乙醇洗涤沉淀。 

(7)风干后，溶于50μL ddH₂O中，加入1μL 10mg/mL RNase A，37℃消化2-3h。 

(8)取2-5μL电泳检测。贮存于-20℃备用，以下简称为“肠球菌基因组”。 

(二)扩增16S rRNA基因的引物设计： 

参照已发表的肠球菌16S rRNA基因序列(基因登录号AB362603.1)，应用Primer 5.0分析软件设计引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物的DNA序列如下所述： 

正向引物F：5′-CGT GCC TAA TAC ATG CAA GTC GAA C-3′， 

反向引物R：5′-ACG ACT TCA CCC CAA TCA TCT ATC C-3′。 

(三)PCR扩增16S rRNA基因 

以上述引物对分别扩增上述肠球菌分离株基因组的16S rRNA基因。反应体系见表2。PCR程序为：94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环后72℃延伸10min。取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，扩增的片段大小与预期相符，共1475个碱基对(见图3)。 

表2菌株HDRsEf16S rRNA PCR体系 

(四)16S rRNA基因PCR产物的克隆与测序 

用DNA纯化试剂盒(购自TIANGEN公司)回收DNA，具体步骤参照该试剂盒的说明书。PCR产物纯化后连接到pDM18-T载体(普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，转化DH5α感受态细胞，涂于含氨卡青霉素(Ampicillin，Amp)50μg/mL的琼脂平板上进行筛选。挑取白色菌落于含Amp(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床过夜，直接取菌液做模板进行PCR鉴定。对阳性克隆的菌液，送至金思特科技有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中进行Blast比较。检索发现，本发明分离的HDRsEf1菌株的16SrRNA与报道的屎肠球菌的序列(AB362603.1)同源性最高，相似性为99％，具体参见SEQ ID NO：1：本发明分离屎肠球菌菌株HDRsEf1的16S rRNA基因部分序列。 

(五)种特异性基因鉴定 

屎肠球菌的种特异性片段为ddl_E.faecium(Dutka-Malen et al.，1995)，据此片段设计引物，以肠球菌的基因组为模板，PCR扩增屎肠球菌种特异性片段。 

扩增ddl_E.faecium片段引物对的DNA序列如下： 

正向引物F1：5′-GCA AGG CTT CTT AGA-GA-3′ 

反向引物F2：5′-CAT CGT GTA AGC TAA CTT C-3′ 

PCR程序为：94℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环后72℃延伸10min。 

从所检测的4株肠球菌分离株HB6，TC12，TC13，HDRsEf1中，仅从本发明的菌株HDRsEf1 中扩增出了屎肠球菌的特异性片段ddlE.faecium(见图4)，进一步证明了分离株HDRsEf1为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。 

实施例2：屎肠球菌菌株HDRsEf1的抑菌性能试验 

以金黄色葡萄球菌(ATCC25923，购自卫生部临检中心)、猪霍乱沙门氏菌C78-1(购自中国兽医药品监察所)和猪致病性大肠杆菌O138:K88(C83902，购自中国兽医药品监察所)为指示菌，以本发明的HDRsEf1菌株发酵上清为抑菌剂，检测屎肠球菌菌株HDRsEf1的体外抑菌性能，具体操作如下： 

1)细菌发酵液的制备和处理：将新鲜屎肠球菌HDRsEf1菌液按2％(v/v)接种于MRS肉汤培养基(美国BD公司产品)中，静置培养18～24h，离心取上清液，10000rpm、30min离心，吸取上清；再离心一次；并测定各发酵液pH；4℃备用，该液体微生物发酵剂的活菌数为3.5×10⁹CFU/mL。 

2)LB平板的制备每平板倒LB琼脂培养基(美国BD公司产品)约25mL(厚度约为4mm)，试验前使平皿干燥，以指示菌均匀涂布后无可见水滴为标准。 

3)指示菌菌液制备将指示菌分别划线培养，得到单菌落；挑取单菌落于LB液体培养基(美国BD公司产品)中，37℃摇床振荡培养12h用于本试验。 

4)指示菌菌液的稀释用麦氏比浊管调整指示菌菌液浓度为10⁸CFU/mL；再将菌液稀释10⁷CFU/mL。将稀释后的菌液用灭菌的棉签均匀涂布于LB平板上。 

5)待琼脂表面水分干燥后，用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取发酵上清液0.25mL至牛津杯中(注意不要将菌液溢出杯外)。 

6)平皿放置4℃冰箱扩散数小时，转入37℃温箱中。10-12h后观察试验结果并测定抑菌圈的大小。 

试验结果表明本发明菌株HDRsEf1的抑菌效果在所比较的菌株中效果最好，结果见图5和表3。 

表3屎肠球菌株HDRsEf1发酵上清液体外抑菌试验 

实施例3：屎肠球菌株的安全性评价 

一、毒力因子的扩增 

毒力因子的扩增主要包括cylA(登录号：AAA62652.1；Gilmore et al.，1994)、gelE(登录号：D85392；Mannu et al.，2003)、esp(登录号：AF034779；Shankar et al.，1999)、agg(无登 录号：Galli et al.，1990)、ace(登录号：AF26083；Mannu et al.，2003)、efaAfs(登录号：EFU03756)和efaA_fm(登录号：FJ609170.1；Mannu et al.，2003)。 

以前述制备的肠球菌基因组为模板，以各毒力因子的特异的引物对进行PCR扩增，各引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其序列、PCR产物大小、扩增条件及参考文献见表4，毒力基因PCR扩增体系见表5。 

表4试验用引物序列、PCR产物大小与扩增条件 

表5毒力基因PCR扩增体系 

取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳，在凝胶成像系统中观察并拍照。电泳结果显示：在4株肠球菌HB6，TC12，TC13，HDRsEf1中共扩增出了5种毒力基因cylA、esp、agg、efaAfs和efaA_fm，扩增出来的片段大小均与预期一致，gelE、ace均未扩增出来。HB6有3个毒力基因，为cylA⁺esp⁺efaA_fs ⁺；TC12有4个毒力基因，为agg⁺cylA⁺esp⁺efaA_fs ⁺；TC13有3个毒力基因，为cylA⁺esp⁺efaA_fs ⁺；本发明的屎肠球菌HDRsEf1仅含1个毒力因子efaA_fm ⁺，屎肠球菌HDRsEf1毒力因子efaA_fmPCR检测结果见图6，其它3株肠球菌HB6，TC12，TC13PCR检测结果见图8～图11。需要说明的是目前用PCR方法检测过的市场上销售的商业屎肠球菌均存在efaA_fm毒力因子(Kieun et al.，2008)，而实际使用的结果表明这种毒力因子的存在对人畜不表现出毒副作用，这在本说明书的实施例5中也得到证明。 

二、溶血试验和明胶水解试验 

将屎肠球菌株HDRsEf1接种在5％脱纤维兔血LB平板上，37℃培养18～24h，观察溶血情况，出现透明β溶血环为溶血表型阳性。金黄色葡萄球菌(ATCC25923)做阳性对照。 

将菌接种于含10g/L蛋白胨和30g/L明胶的BHI琼脂平板中，37℃培养18～24h后，然后将平板放于4℃、5h，菌落周围出现浑浊的晕即为阳性。以鸭疫里氏杆菌云梦分离株(做阳性对照。 

屎肠球菌株HDRsEf1在5％脱纤维兔血平板上不表现溶血反应，明胶水解试验也为阴性。 

三、抗生素敏感性试验 

选取青霉素、氨苄西林、万古霉素、红霉素、四环素、环丙沙星、诺氟沙星、呋喃妥因、氯霉素等9种药敏纸片自(杭州微生物试剂有限公司)进行药敏试验。用M-H培养基(购自英国BD公司)，标准敏感菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌，试验判断标准参照WHO提供的NCCLS最新版本的标准进行(2009版)。试验步骤如下： 

(1)用接种环在MRS琼脂平板上挑取肠球菌菌落，接种于3～5mLMRS肉汤培养基中，放于37℃温箱静置培养； 

(2)培养2～8h，以有黑字的白纸为背景，调整浊度至0.5麦氏标准比浊管浊度。若菌液浓度太浓时，可用肉汤或生理盐水稀释(校正的菌液要在15min内使用)； 

(3)用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于M-H琼脂平板上，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，反复几次，保证涂均匀； 

(4)待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。 

(5)贴上纸片15min内，把平板倒放在37℃孵箱中；培养16～18h观察结果，测万古霉素需24h。 

试验结果见表6，屎肠球菌HDRsEf1对氨苄西林、万古霉素、四环素、诺氟沙星、呋喃妥因、氯霉素敏感；而对青霉素、红霉素表现耐药；对环丙沙星表现中等耐药。 

表6屎肠球菌株HDRsEf1的抗生素敏感性试验结果 

上述毒力因子检测、溶血试验和明胶水解试验及抗生素敏感性试验等结果，表明屎肠球菌株HDRsEf1是安全的。 

实施例4：屎肠球菌HDRsEf1的抗逆特性及生长特性 

一、抗逆性试验 

(一)胆盐耐受性试验 

将HDRsEf1活化2代后，取1mL接种于9mL含0％，0.15％，0.3％，0.5％胆盐MRS肉汤中，37℃培养12h，将培养液分别作连续10倍稀释，从每一稀释度取0.1mL涂于MRS平 

表7屎肠球菌HDRsEf1对胆盐的耐受性 

板，观察生长情况并进行菌落计数。结果显示HDRsEf1能耐受0.15％，0.3％，0.5％胆盐浓度(见表7)，其活菌数均达到10⁷CFU/mL以上。仔猪小肠内胆盐的含量在0.03％～0.3％范围波动，因此，HDRsEf1菌株能耐受肠道胆盐的环境。 

(二)耐酸试验 

将活化的屎肠球菌HDRsEf1以2％的接种量分别接种pH2.0，pH2.5的盐酸溶液及pH6.8双蒸水，37℃静置培养。取接种0h，0.5h，1h，1.5h，2h的培养液，分别作连续10倍稀释， 从每一稀释度取0.1mL涂于MRS平板，观察生长情况并进行菌落计数。 

表8屎肠球菌株HDRsEf1对不同pH值的耐受性 

结果见表8，HDRsEf1在pH2.5孵育2h后，活菌数为4.10×10⁷CFU/mL，与对照组相比，下降很小；在pH2.0孵育2h后，细菌数仅下降了一个数量级，为2.20×10⁶CFU/mL。 

仔猪出生时胃中pH值一般在5～6，后因乳酸菌的定植使pH值逐渐下降至4左右，2月龄前pH值保持在3左右。通常胃酸pH值在3.0左右，流体食物在胃中停留的时间为1～2h，进食后很短时间内，胃内pH值可以上升到6.0左右。益生菌通过胃肠道时，食糜作为一种保护剂使益生菌受到伤害的程度减小，一旦在穿越胃和十二指肠中能存活下来，随同食糜进入回肠、盲肠的细菌会急剧增加。由此可知，本发明的菌株HDRsEf1在低pH值胃酸环境下，存活机率很大，有足够多的细菌存活下来，进而顺利到达肠道。 

(三)高温耐受性试验。 

MRS肉汤中接种2％已活化的HDRsEf1菌株，37℃条件下培养3～4h。菌液经过60℃、65℃和70℃热处理0min，5min，10min，15min，20min，25min，37℃设为对照，然后将菌液作连续10倍稀释，用MRS平板测含菌数。含菌数以1g^CFU/mL表示，试验结果表明屎肠球菌HDRsEf1在65℃条件下10min存活率97％以上(见表9)。 

表9屎肠球菌HDRsEf1对高温的耐受性 

二、生长曲线的测定 

将活化好的屎肠球菌株HDRsEf1按1％(v/v)的接种量接入MRS肉汤中，37℃静置培养，每隔2h取样进行平板计数；以时间为横坐标，细菌的对数为纵坐标绘制生长曲线。 

表10屎肠球菌株HDRsEf1在不同时间的生长情况 

结果表明，本发明分离的屎肠球菌株HDRsEf1生长无迟缓期，很快进入对数增长期(0h～4h)，4h后进入稳定期，一直持续到18h，细菌数达到最大，为3.50×10⁹CFU/mL。该菌株繁殖能力很强，有利于工业化的大规模发酵生产，其生长曲线见图7及表10。 

三、粘附性试验 

用辣根过氧化物酶标记的粘蛋白Mucin(Mucin-HRP，Sigma公司)作粘附性试验，辣根过氧化物酶标记的牛血清白蛋白(BSA-HRP)作对照，用ELISA方法(Repentigny L，2000)测定屎肠球菌株HDRsEf1对粘蛋白的粘附性，结果显示，其OD₄₅₀可以达到0.062，与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)(见表11)，本发明分离的屎肠球菌与粘蛋白有明显的粘附性，这为屎肠球菌株HDRsEf1在肠道的定植存活，发挥其益生作用奠定了基础。 

表11屎肠球菌HDRsEf1粘附于粘蛋白的实验结果 

注：与对照相比^*：p＜0.05 

抵抗pH较低的胃酸环境以及对胆汁的耐受是筛选益生菌的首要指标，益生菌通过胃肠道时，食糜作为一种保护剂使益生菌受到酸伤害的程度减小，一旦在穿越胃和十二指肠后存活下来，随同食糜进入回肠、盲肠的细菌会急剧增加。本发明的屎肠球菌HDRsEf1在很低pH值胃酸环境下，存活机率很大，有足够多的细菌存活下来，进而顺利到达肠道，而本菌对肠道胆盐的耐受使其可在宿主肠道中最后顺利定殖并发挥益生作用。 

另外，益生菌在菌液浓缩或制粒过程中，都要进行高温加热处理，因此，对高温的耐受性成为选择益生菌菌株的另一个关键指标。本发明的屎肠球菌株HDRsEf1虽然不能产芽胞，却能够在65℃条件下10min存活率在97％以上；这为屎肠球菌株HDRsEf1发挥益生作用提供了又一个有利条件。 

实施例5：本发明的应用实施例 

一、哺乳仔猪、断奶仔猪饲喂试验 

用屎肠球菌株HDRsEf1替代乳猪料中的抗生素添加剂，饲喂本菌株的宿主动物(猪)，目的是部分验证本发明菌株的体内益生特性。 

1.试验材料与分组 

先取长白猪和大白猪的二元杂交仔猪(来自华中农业大学试验猪场，为常规商品杂交品种)为试验动物，以窝为单位饲养，每窝10±2头。同组的为同一天出生，不同组的仔猪日龄相差1-3天。所用用饲料及分组情况见表12，其中组3饲料每克含屎肠球菌HDRsEf15×10⁶CFU。艾立饲料(教槽料和保育料)由武汉艾立动物营养有限公司生产提供，含抗生素的饲料中添加了抗敌素40ppm、吉他霉素20ppm。 

表12试验分组 

2.试验过程 

饲喂试验的时间跨仔猪生长发育的哺乳和断奶两个阶段，具体从7日龄开始到37日龄结束，可分为教槽前期：7-22日龄和教槽后期：22-37日龄两个时期。试验期间动物均以自由采食方式饲喂，并进行如下疫苗接种如下： 

10日龄：副猪嗜血杆菌灭活苗(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司产品)，支原体灭活苗(购自先灵葆雅公司生产的产品)一免； 

15日龄：支原体灭活苗二免，圆环病毒2型灭活苗(购自美国普泰克国防有限公司产品)； 

20日龄：猪瘟细胞苗(购自广东永胜生物制品有限公司产品)一免。 

3.测定指标 

记录每天饲料实际消耗，计算平均耗料量；试验开始(7日龄)、中期(22日龄)及结束(37日龄)时均空腹称重，计算平均日增重；根据饲料消耗和仔猪增重计算饲料转化率(即料肉比)；记录死亡头数并计算死亡率；试验结束后(即35日龄)，按20％比例采血，用相应的ELISA抗体检测试剂盒检测猪瘟、圆环病毒2型疫苗免疫后的抗体水平，所有的两种试剂盒均由武汉科前动物生物制品有限责任公司生产。 

4结果 

表13的数据显示，试验初重各组的差异不显著；经哺乳和前期教槽饲养后，平均体重由 高到低：组3＞组1＞组2，后期教槽饲养的结果：组3＞组1＞组2，组3和组1的平均体重显著高于组2。 

两个阶段中，教槽前期，头均日增重由高到低排列：组3＞组1＞组2，组3显著高于组2，组1和组2差异不显著。教槽后期，组3＞组1＞组2，组3和组1均显著高于组2。 

从头均日采食量看，教槽前期，组3＞组1＞组2，其中组3比其他二组高出一个数量级。教槽后期，组3＞组1＞组2，组3极显著高于其他二组。料/肉比方面，由于哺乳时期，仔猪的增重与母乳营养和多少有关，采食的饲料很少，因此不比较教槽前期的料肉比。断奶后，仔猪增重完全靠采食饲料，组3＞组2＞组1，但各组差异不显著；组1的料肉比最低，而组3料肉比最高。 

试验期间，有仔猪发生死亡，统计死亡率，依次为组1＞组3＞组2。 

表13仔猪生长性能比较 

表14猪瘟及圆环病毒2型疫苗免疫后抗体水平 

表14的结果显示，猪瘟抗体水平由高到低依次为组3＞组1＞组2，但各组差异不显著；圆环病毒2型抗体水平由高到低依次为组3＞组1＞组2。可以看出组3两种抗体的水平均最高。 

猪瘟抗体阳性率是组3＞组2＞组1；圆环病毒2型抗体阳性率是组3＞组1＝组2。结果显示：组3的猪瘟抗体阳性率100％，组3的阳性率高于组1和组2。圆环病毒2型抗体阳性率虽然低，但组3的阳性率仍高于其他各组。 

试验从7日龄教槽开始，22日龄断奶，持续到37日龄。从生长性能的统计结果看，组3采食量均显著高于其他二组，且其头均日增重也高于其他组，但料肉比上不及其他组。但对于处于哺乳和保育前期的仔猪而言，采食量和日增重显得最重要，因为仔猪的体格状况对日后的育肥非常关键，料肉比却不是育苗时期考虑的重点。 

抗体检测数据表明，使用本发明微生态制剂的组3，抗体阳性率均高于两个对照组。尤其组3在两种抗体水平和阳性率均属最高，可见，本发明的屎肠球菌株HDRsEf1能增强疫苗免疫效果，提高机体保护力；而使用抗生素的组1，虽然可以促生长，但不能有效刺激机体免疫机能的提高。 

综上所述，添加本发明的屎肠球菌株HDRsEf1不仅能显著提高仔猪的生长性能，还可以提高机体的免疫功能。可望作为一种抗生素替代技术，在养猪业中推广应用，推荐在仔猪日粮中本发明屎肠球菌株HDRsEf1的制剂的添加量为5×10⁶CFU/g。 

二、肉鸡饲喂试验 

1日龄三黄鸡104只，随机分为两组，饲料为武汉正大饲料集团有限公司803、813型，饲喂40d。分组情况见表15，其中试验组饲料每克含屎肠球菌HDRsEf15×10⁶CFU 

试验开始和试验结束时的空腹称重，计算平均日增重；根据饲料消耗和肉鸡增重计算料肉比。 

表15试验分组 

表16屎肠球菌HDRsEf1对肉鸡生长性能的影响 

屎肠球菌HDRsEf1对肉鸡生长性能的影响见表16，试验组料肉比为1.972，对照组为2.145，两者差异显著(P＜0.05)，表明日粮中添加屎肠球菌HDRsEf1对于提高肉鸡生长性能作用显著，推荐在肉鸡日粮中本发明屎肠球菌株HDRsEf1制剂的添加量为5×10⁶CFU/g。 

参考文献 

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12 Su Y A，Sulavik M C，He P，Makinen K K，et al.Nucleotide sequence of the gelatinase gene(gelE)from Enterococcus faecalis subsp.liquefaciens.Infect Immun，1991，59：415-420 

Claims (1)

1.一种分离筛选的对致病金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果的屎肠球菌菌株，其特征在于，所述的菌株是屎肠球菌菌株(Enterococcus faecium)HDRsEf1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC N0：M2011031。

权利要求1所述的屎肠球菌菌株在制备畜禽饲用微生物添加剂中的应用。

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