CN102741411A

CN102741411A - 改良的油包囊蛋白及其应用

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Publication number: CN102741411A
Application number: CN2010800581550A
Authority: CN
Inventors: 尼古拉斯·约翰·罗伯茨; 理查德·威廉·斯科特; 宋路泰·威尼查亚库; 玛丽萨·罗丹
Original assignee: AGRES Ltd
Current assignee: AGRES Ltd
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2030-10-29
Also published as: UY32994A; NZ599429A; BR112012011464A2; AU2010313865B2; AU2010313865A1; EP2494051B1; WO2011053169A1; BR122019021594B1; CA2778150A1; MX2012004677A; CL2012001068A1; CA2778150C; CN102741411B; JP2013509178A; EP2494051A1; JP5934101B2; AR121305A2; TW201127957A; AR078858A1; ZA201203085B

Abstract

本发明提供了包括至少一个人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白。本发明提供了用于生产改良油质蛋白的方法及组合物。本发明提供了编码所述改良油质蛋白的多核苷酸，及包含所述多核苷酸的构建体和宿主细胞。本发明也提供了在活体内及活体外生产包含改良油质蛋白的油体的方法。本发明也提供了在宿主细胞及植物中生产油的方法。本发明也提供了包含本发明的油体、宿主细胞或植物的动物饲料和生物燃料源。

Description

改良的油包囊蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及用于生产和改良不同宿主细胞类型中的油体（oil bodies）的组合物和方法。

背景技术

在自然界中，开花植物通过在其种子中积聚油（即三酰基甘油（TAG））有效地储存能量，并通过将磷脂蛋白单层嵌入油体周围而在离散油体中储存能量。这些种子作物已作为饲料用于多种农业应用中，且近年来也已用作生物燃料的原料源。以单位重量计，脂质的能量含量大致为蛋白或碳水化合物的两倍，且因此格外关注提高各种物种（最值得注意地，植物）的油含量。除能量方面以外，油体自身也具有独特特性，且形成许多生物技术应用的基础，所述应用包括、但不限于重组蛋白的纯化、多聚蛋白复合物的形成、乳化作用及生物活性物的递送。

遗憾的是，植物种子占总植物生物量的极小百分比，且随着对改良农业生产率及替代性能量的需要，认识到当前由多种所投入的种子作物获得的油产量是不足的。研究工作已经不仅集中于提高植物种子内油生产的生产率，而且集中于提高其它细胞类型及物种中的油生产的生产率。

传统的育种及诱变已在此领域中获得愈来愈多的成功；但是，基因工程已在改良有机体以产生提高的油水平方面取得长足进步。尽管某些研究组已对油合成途径的不同部分进行研究以增量调节种子中的油产量，另其它研究组已经致力于增加占生物量的更大部分的细胞类型中的油。

虽然基因工程已在增加某些靶标中的油含量方面取得一些进展，但仍留有重要挑战。仍要实现种子中的油体生产的生产率的进一步提高，且尚未实现在其它细胞类型及物种中生产油体（类似于植物种子中的油体生产）的方法。

发明内容

本发明提供了用于生产具有不同稳定程度的油体的组合物及方法。本发明涉及生产具有人工引入的半胱氨酸残基的改良油质蛋白。优选地，在改良油质蛋白的N端及C端亲水臂中引入人工引入的半胱氨酸残基。

改良油质蛋白的表达允许在除维管植物的生殖组织以外的新细胞类型及甚至其它物种中生成稳定的油体。当与TAG合成酶组合时，本发明导致TAG作为稳定的油体在真核细胞中积聚及储存。与未改良的细胞或甚至仅表达TAG合成酶的细胞相比，本发明允许以其它方式实现TAG的过量积聚。例如，本发明已证实，可在除种子以外的维管植物的营养部分中积聚更高水平的稳定的油体。

在它们的营养组织中具有提高的TAG水平的植物，会提供用于动物原料和生物燃料原料应用的有用能源。

另外，从宿主细胞（诸如大肠杆菌、巴氏毕赤酵母、酿酒酵母、杜氏藻属、莱氏衣藻）纯化出的重组改良油质蛋白可用于生产人造油体。人造油体中的改良油质蛋白或由转化的细胞纯化获得的改良油质蛋白，可任选地经由在改良油质蛋白中的半胱氨酸残基进行交联。可以通过操纵氧化还原环境来控制交联度。也可通过改变改良油质蛋白中的半胱氨酸数量来调适交联度。

使用这些技术的组合，由改良油质蛋白形成的油体可针对其乳化特性进行调适，以调节热稳定性、化学稳定性及肽酶抗性。

改良油质蛋白也可与目标蛋白融合，以形成融合蛋白。融合蛋白（改良油质蛋白+目的蛋白）可在细胞或有机体中重组表达。以此方式，含有表达的融合蛋白的油体可用于纯化及递送目的蛋白，用于多种用途。

另外，油体可保护动物的胃和/或瘤胃内的TAG，或至少延迟TAG在其中的降解和/或生物氢化，使得来自TAG的完整离散脂质由动物的肠吸收。因此，本发明也可用于动物的膳食摄入方面，尤其通过改良油质蛋白在植物中的表达。

编码具有人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白的多核苷酸

在第一方面，本发明提供了编码包括至少一个人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白的多核苷酸。术语油质蛋白也包括油体固醇蛋白（steroleosin）及油体钙蛋白（caloleosin）。改良油质蛋白因此可选自改良油质蛋白、改良的油体钙蛋白或改良的油体固醇蛋白。在一个实施方案中，所述改良油质蛋白是改良油质蛋白。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白是改良的油体钙蛋白。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白是改良的油体固醇蛋白。每类油质蛋白（油质蛋白、油体钙蛋白和油体固醇蛋白）的实例均在本文中描述。

在一个实施方案中，所述改良油质蛋白包括至少两个半胱氨酸，其中至少一个经人工引入。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白包括至少两个至至少十三个（即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14个或更多个）人工引入的半胱氨酸。在一个实施方案中，所述半胱氨酸经人工引入在油质蛋白的N端亲水区中或油质蛋白的C端亲水区中。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白包括至少一个在N端亲水区中的半胱氨酸及至少一个在C端亲水区中的半胱氨酸。在另一个实施方案中，所述半胱氨酸基本上均匀地分布于油质蛋白的N端及C端亲水区。

在另一个实施方案中，所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包括与目的蛋白融合的改良油质蛋白。

构建体

在另一个方面，本发明提供了一种遗传构建体，其包含本发明的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了一种表达构建体，其包含本发明的多核苷酸。在一个实施方案中，构建体中的多核苷酸可操作地连接至启动子序列。在一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物营养组织中驱动所述多核苷酸的表达。在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物种子中驱动所述多核苷酸的表达。在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物花粉中驱动所述多核苷酸的表达。在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在大肠杆菌细胞中驱动所述多核苷酸的表达。在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在酵母细胞中驱动所述多核苷酸的表达。在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在藻类细胞中驱动所述多核苷酸的表达。

在另一个方面，本发明提供了一种构建体，其含有编码改良的中性脂质蛋白的多核苷酸。在一个实施方案中，所述构建体也含有编码三酰基甘油（TAG）合成酶的第二种多核苷酸。在不同的实施方案中，所述构建体可连接至能够在不同宿主细胞中驱动其表达的启动子序列。因此，本发明也提供了所述构建体用于诱导宿主细胞表达改良油质蛋白和/或TAG合成酶的用途。在不同的实施方案中，所述表达改良油质蛋白的构建体及所述表达TAG合成酶的构建体可由相同或不同的启动子驱动。在另一个实施方案中，所述构建体以适当位置及取向定位于适当功能性内源启动子中，以便进行构建体的表达。在不同的实施方案中，所述构建体可在细菌、植物、真菌或藻类细胞中表达。在一个实施方案中，在植物细胞中表达所述构建体的情况下，该细胞可为营养组织、种子、花粉或果实组织。

宿主细胞

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的构建体。在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其被遗传修饰成包含本发明的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其被遗传修饰成表达本发明的多核苷酸。

也表达TAG合成酶的宿主细胞

在另一个实施方案中，所述宿主细胞也被遗传修饰成表达三酰基甘油（TAG）合成酶。在另一个实施方案中，所述宿主细胞被遗传修饰成包含编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列。在另一个实施方案中，所述宿主细胞包含表达构建体，所述表达构建体包括编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列。

在另一个实施方案中，所述核酸可操作地连接至启动子序列。在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物营养组织中驱动所述核酸序列的表达。在一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物种子中驱动所述核酸序列的表达。在一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物花粉中驱动所述核酸序列的表达。

在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在大肠杆菌细胞中驱动所述多核苷酸的表达。在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在酵母细胞中驱动所述多核苷酸的表达。在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在藻类细胞中驱动所述多核苷酸的表达。

宿主细胞类型

宿主细胞可为任何类型的细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞及植物细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞为细菌细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞为酵母细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞为真菌细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞为昆虫细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞为藻类细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞为植物细胞。

植物

在另一个方面，本发明提供了一种植物，其包含本发明的植物细胞。在另一个方面，本发明提供了一种植物，其包含本发明的构建体。在另一个方面，本发明提供了一种植物，其被遗传修饰成包含本发明的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了一种植物，其被遗传修饰成表达本发明的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述植物表达由本发明的多核苷酸编码的改良油质蛋白。

在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白在植物营养组织中表达。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白在植物种子中表达。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白在植物花粉中表达。

也表达TAG酶的植物

在另一个实施方案中，所述植物也被遗传修饰成表达三酰基甘油（TAG）合成酶。在另一个实施方案中，所述三酰基甘油（TAG）合成酶在与改良油质蛋白相同的组织中表达。

在另一个实施方案中，所述植物被遗传修饰成包含编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列。在另一个实施方案中，所述植物包含表达构建体，所述表达构建体包括编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列。

在另一个实施方案中，所述核酸可操作地连接至启动子序列。

在另一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物营养组织中驱动所述核酸序列的表达。在一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物种子中驱动所述核酸序列的表达。在一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物花粉中驱动所述核酸序列的表达。

含有人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白多肽

在另一个方面，本发明提供了一种改良油质蛋白，其包括至少一个人工引入的半胱氨酸。在另一个方面，本发明提供了一种改良油质蛋白，其由本发明的多核苷酸编码。在一个实施方案中，所述改良油质蛋白包括至少两个半胱氨酸，其中至少一个经人工引入。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白包括至少两个至至少十三个（即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14个或更多个）人工引入的半胱氨酸。

在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白包括至少一个在N端亲水区中的半胱氨酸及至少一个在C端亲水区中的半胱氨酸。在一个优选的实施方案中，所述半胱氨酸经人工引入油质蛋白的N端亲水区中或油质蛋白的C端亲水区中。优选地，半胱氨酸基本上均匀地分布于油质蛋白的N端与C端亲水区之间。

含有包括人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白的融合蛋白

在另一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含本发明的改良油质蛋白及目的蛋白。所述融合蛋白因而包含改良油质蛋白部分及目的蛋白部分。

包含改良油质蛋白的油体

在另一个方面，本发明提供了一种油体，其包含本发明的改良油质蛋白。在另一个方面，本发明提供了一种油体，其包含本发明的至少两种改良油质蛋白。在一个实施方案中，至少两种改良油质蛋白经由在改良油质蛋白的半胱氨酸残基之间的二硫桥彼此交联。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白经由改良油质蛋白中的人工引入的半胱氨酸残基而交联。

在另一个实施方案中，所述油体另外包含融合蛋白，其中所述融合蛋白包括与目的蛋白融合的油质蛋白。在该实施方案中，融合蛋白中的油质蛋白无需包括人工引入的半胱氨酸。优选地，融合蛋白中的油质蛋白不包括人工引入的半胱氨酸。

此实施方案的油体可用于纯化及递送目的蛋白，如在Roberts等人,（2008）中所论述。

然而，在该实施方案中，可能通过改良油质蛋白在油体中的存在而任选地改变油体的稳定性/完整性，由此实现更严格的纯化及递送程序。

包含具有改良油质蛋白的融合蛋白的油体

在另一个方面，本发明提供了包含本发明的融合蛋白的油体，所述融合蛋白包含本发明的改良油质蛋白及目的蛋白。所述融合蛋白因此包含改良油质蛋白部分及目的蛋白部分。

在一个实施方案中，所述油体包含至少两种本发明的融合蛋白。

在一个实施方案中，所述至少两种融合蛋白经由在融合蛋白的改良油质蛋白部分中的半胱氨酸残基之间的二硫桥彼此交联。在一个实施方案中，所述融合蛋白经由在融合蛋白的改良油质蛋白部分中的半胱氨酸残基之间的二硫桥而交联。

在另一个实施方案中，所述油体包含至少一种本发明的改良油质蛋白。在另一个实施方案中，所述至少一种融合蛋白交联至至少一种改良油质蛋白，所述交联是经由在融合蛋白的改良油质蛋白部分中的半胱氨酸及在改良油质蛋白中的半胱氨酸。

同样，此实施方案的油体可用于纯化及递送目的蛋白，如在Roberts等人,（2008）中所论述。

乳剂

在另一个方面，本发明提供了一种乳剂，其包含本发明的改良油质蛋白。在一个实施方案中，所述乳剂包含所述改良油质蛋白和合适的载体。所述载体可经缓冲以具有适当的氧化还原环境，以保持希望的油质蛋白交联度。

为了将改良油质蛋白重新悬浮于载体中，可能需要声处理或高压匀浆化，接着暴露于适当氧化条件下。

组合物

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的改良油质蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包含所述改良油质蛋白和合适的载体。所述载体可经缓冲以具有适当的氧化还原环境，以达到希望的改良油质蛋白交联度。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的油体。在一个实施方案中，所述组合物包含所述油体和合适的载体。所述载体可经缓冲以具有适当的氧化还原环境，以保持希望的改良油质蛋白交联度。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的油体的组合物，其经调配以供施用于皮肤。

包含本发明的油体的植物及其部分

在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的植物或其部分。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的植物营养组织。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的植物种子。

包含本发明的油体的动物饲料

在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的动物饲料。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的植物或其部分的动物饲料。

生产油体的方法

在另一个方面，本发明提供了一种生产油体的方法，所述方法包括组合下述物质的步骤：

a）至少两种改良油质蛋白，其各自包括至少一个人工引入的半胱氨酸，

b）三酰基甘油，和

c）磷脂。

在一个实施方案中，所述改良油质蛋白各自包括至少两个半胱氨酸，其中至少一个经人工引入。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白各自包括至少一个在油质蛋白的N端亲水区中的半胱氨酸及至少一个在油质蛋白的C端亲水区中的半胱氨酸。

在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白包括至少两个至至少十三个（即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14个或更多个）人工引入的半胱氨酸。

在一个实施方案中，所述半胱氨酸经人工引入油质蛋白的N端亲水区中或油质蛋白的C端亲水区中。在另一个实施方案中，所述半胱氨酸基本上均匀地分布于油质蛋白的N端与C端亲水区之间。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白经由在油质蛋白的半胱氨酸残基之间的二硫桥而交联。在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白在油质蛋白的人工引入的半胱氨酸残基之间交联。

在一个实施方案中，所述改良油质蛋白为融合蛋白的一部分，其中所述融合蛋白包含改良油质蛋白及目的蛋白。

在一个实施方案中，所述方法包括下述额外步骤：通过控制所生产的油体的氧化还原环境来调节油体中改良油质蛋白的交联度。

在活体内组合的所有组分（活体内油体)

在一个实施方案中，在宿主细胞内组合a）、b）及c）的组分。在该实施方案中，所述改良油质蛋白优选地在宿主细胞中表达。

所述宿主细胞优选地优选地被遗传修饰成表达改良油质蛋白。

所述宿主细胞优选地包含本发明的构建体。所述宿主细胞优选地被遗传修饰成包含本发明的多核苷酸。所述宿主细胞优选地被遗传修饰成表达本发明的多核苷酸。

也表达TAG合成酶的宿主细胞

在另一个实施方案中，所述宿主细胞也被遗传修饰成表达三酰基甘油（TAG）合成酶。在另一个实施方案中，所述宿主细胞包含表达构建体，所述表达构建体包括编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列。

在另一个实施方案中，所述核酸序列可操作地连接至启动子序列。在一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物营养组织中驱动所述核酸序列的表达。在一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物种子中驱动所述核酸序列的表达。在一个实施方案中，所述启动子序列能够在植物花粉中驱动所述核酸序列的表达。

在另一个实施方案中，所述宿主细胞也被遗传修饰成包含编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列。在另一个实施方案中，所述宿主细胞也被遗传修饰成表达编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列。

本领域技术人员应理解，编码改良油质蛋白的多核苷酸及编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列可置于待转化进宿主细胞中的同一构建体或不同构建体中。各自的表达可由相同或不同启动子驱动，所述启动子可包括于待转化的构建体中。本领域技术人员也应理解，或者，可以将所述多核苷酸及核酸转化进不含启动子的细胞中，但所述多核苷酸及核酸中的任一个的表达可由转化的细胞的一个或多个内源启动子驱动。

在另一个实施方案中，所述宿主细胞构成有机体的一部分。在一个优选的实施方案中，所述有机体为植物。

在另一个实施方案中，在植物的营养组织中生产所述油。

在该方法的一个实施方案中，植物积聚比合适的对照植物多约50%至约400%的脂质。在该方法的另一个实施方案中，植物积聚比合适的对照植物多约100%至约300%的脂质。在该方法的另一个实施方案中，植物积聚比合适的对照植物多约150%至约250%的脂质。合适的对照植物包括其品种和/或物种与本发明方法中所用的转化植物相同的植物的未转化型或野生型型式。

在另一个实施方案中，所述植物被加工成动物饲料。

在另一个实施方案中，所述植物被加工成生物燃料原料。

纯化活体内生产的油体的额外方法步骤

在一个实施方案中，所述方法包括从细胞或有机体纯化所述油体的额外步骤。

改变活体内生产的纯化油体的交联度的额外方法步骤

在另一个实施方案中，所述方法包括通过控制活体内生产的纯化油体的氧化还原环境来调节纯化油体中的改良油质蛋白的交联度的额外步骤。在一个实施方案中，通过使用氧化环境来提高交联度。在另一个实施方案中，通过使用还原环境来降低交联度。

在活体外组合的组分（活体外/人造油体)

在某些实施方案中，可在活体外组合a）、b）及c）的组分。

在一个实施方案中，a）的改良油质蛋白已在本发明的宿主细胞中重组表达，且从所述宿主细胞纯化，随后与b）及c）的组分组合。

改变活体外/人造油体的交联度的额外方法步骤

在另一个实施方案中，所述方法包括通过控制在其中组合a）、b）及c）的组分的氧化还原环境来调节交联度的额外步骤。在一个实施方案中，通过在氧化环境中组合a）、b）及c）的组分来提高交联度。在另一个实施方案中，通过在还原环境中组合a）、b）及c）的组分来降低交联度。也可在油体形成之后通过控制容纳油体的氧化还原环境来调节交联度。

在另一个方面，本发明提供了一种生产比合适的对照植物积聚更多油的植物的方法，所述方法包括：提供用本发明的多核苷酸转化的植物，所述多核苷酸表达由所述多核苷酸编码的改良油质蛋白。

在一个实施方案中，也用编码TAG合成酶的多核苷酸转化植物，以表达TAG合成酶且由此合成TAG。

在一个实施方案中，通过用本发明的任一种多核苷酸及编码TAG合成酶的多核苷酸转化单一植物或植物细胞来生产所述植物。

在另一个实施方案中，如下生产所述植物：使被本发明的任一种多核苷酸转化的第一植物与被编码TAG合成酶的多核苷酸转化的第二植物杂交，生产被本发明的多核苷酸及编码TAG合成酶的多核苷酸转化的植物。

在另一个实施方案中，所述油为TAG。在另一个实施方案中，在植物的营养组织中生产所述油。

在该方法的一个实施方案中，所述植物积聚比合适的对照植物多约50%至约400%的脂质。在该方法的另一个实施方案中，所述植物积聚比合适的对照植物多约100%至约300%的脂质。在该方法的另一个实施方案中，所述植物积聚比合适的对照植物多约150%至约250%的脂质。

在另一个实施方案中，所述植物被加工成动物饲料。

在另一个实施方案中，所述植物被加工成生物燃料原料。

在另一个方面，本发明提供了一种在宿主细胞中生产油体的方法，所述方法包括：

a）将至少一个编码本发明的改良油质蛋白的核酸分子引入宿主细胞中；及

b）培养所述宿主细胞，以便表达改良油质蛋白。

a）将至少一个编码本发明的改良油质蛋白的核酸分子及编码TAG合成酶的核酸分子引入宿主细胞中；及

b）培养所述宿主细胞，以便表达改良油质蛋白及TAG合成酶。

所述宿主细胞可以是本文所述的宿主细胞。

油体

在另一个方面，本发明提供了通过本发明的方法生产的油体。

组合物

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的油体。在一个实施方案中，所述组合物包含所述油体和合适的载体。所述载体可经缓冲以提供适当的氧化还原环境，以保持希望的改良油质蛋白交联度。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的油体的组合物，其经调配以供施用于皮肤。

包含本发明的油体的植物及其部分

在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的植物或其部分。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的植物营养组织。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的植物种子。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的植物花粉。在另一个方面，本发明提供了包含本发明的油体的植物果实或子实体。

包含本发明的油体的动物饲料

在一个实施方案中，所述饲料适合于包括人类的哺乳动物。在另一个实施方案中，所述饲料适合于非人类哺乳动物。优选的动物包括农畜，诸如但不限于牛、绵羊、马、山羊、猪、鸡等。

植物

所述改良油质蛋白可为改良的天然存在的油质蛋白。可衍生出未改良的油质蛋白序列的植物可来自含有油质蛋白及编码油质蛋白的多核苷酸序列的任何植物物种。

在其中表达改良油质蛋白的植物细胞可来自任何植物物种。在其中表达改良油质蛋白的植物可来自任何植物物种。

在一个实施方案中，所述植物细胞或植物源自裸子植物物种。

在另一个实施方案中，所述植物细胞或植物源自被子植物物种。

在另一个实施方案中，所述植物细胞或植物源自双子叶植物物种。

在另一个实施方案中，所述植物细胞或植物源自单子叶植物物种。

其它优选的植物为来自包括、但不限于以下各属的草料植物物种：玉蜀黍属（Zea）、黑麦草属（Lolium）、大麦属（Hordium）、芒属（Miscanthus）、甘蔗属（Saccharum）、羊茅属(Festuca）、鸡脚茅属（Dactylis）、雀麦属（Bromus）、偃麦草属（Thinopyrum）、三叶草属（Trifolium）、苜蓿属（Medicago）、梯牧草属（Pheleum）、金丝雀草属（Phalaris）、绒毛草属（Holcus）、大豆属（Glycine）、莲属（Lotus）、车前草属（Plantago）及菊苣属（Cichorium）。

其它优选的植物为豆科植物。豆科植物或其部分可涵盖在豆科（Leguminosae或Fabaceae）植物科中的任何植物。例如，所述植物可选自草料豆科（legumes），包括苜蓿草、三叶草；银合欢；谷物豆科，包括豆、小扁豆、羽扇豆、豌豆、花生、大豆；开花豆科，包括羽扇豆；药用或工业用豆科；及休耕或绿肥豆科物种。

特别优选的属为三叶草属。优选的三叶草物种包括白三叶草（Trifoliumrepens）；兔足三叶草（Trifolium arvense）；亲和三叶草（Trifolium affine）；及类白三叶草（Trifolium occidentale）。尤其优选的三叶草物种为白三叶草。

另一个优选的属为苜蓿属。优选的苜蓿物种包括紫苜蓿（Medicago sativa）及蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）。尤其优选的苜蓿物种为紫苜蓿，常称为苜蓿草。

另一个优选的属为大豆属。优选的大豆物种包括大豆（Glycine max）及爪哇大豆（Glycine wightii）（也称为爪哇大豆（Neonotonia wightii））。尤其优选的大豆物种为大豆（Glycine max），常称为大豆（soy bean）。尤其优选的大豆物种为爪哇大豆，常称为野生大豆（perennial soybean）。

另一个优选的属为豇豆属（Vigna）。尤其优选的豇豆物种为豇豆（Vignaunguiculata），常称为豇豆（cowpea）。

另一个优选的属为黧豆属（Mucana）。优选的黧豆物种包括剌毛黧豆（mucanapruniens）。尤其优选的黧豆物种为剌毛黧豆，常称为黧豆（velvetbean）。

另一个优选的属为花生属（Arachis）。尤其优选的花生物种为多年生花生（Arachis glabrata），常称为多年生花生（perennial peanut）。

另一个优选的属为豌豆属（Pisum）。优选的豌豆物种为豌豆（Pisumsativum），常称为豌豆（pea）。

另一个优选的属为莲属。优选的莲物种包括百脉根（Lotus corniculatus）、长柄百脉根（Lotus pedunculatus）、窄叶百脉根（Lotus glabar）、细叶百脉根（Lotus tenuis）及大百脉根（Lotus uliginosus）。优选的莲物种为百脉根，常称为角果百脉根（Birdsfoot Trefoil）。另一优选的莲物种为窄叶百脉根，常称为窄叶角果百脉根。另一优选的莲物种为长柄百脉根，常称为湿地百脉根（Big trefoil）。另一优选的莲物种为细叶百脉根，常称为细长百脉根（Slendertrefoil）。

另一个优选的属为芸苔属（Brassica）。优选的芸苔物种为羽衣甘蓝（Brassica oleracea），常称为草料甘蓝菜（foragekale）及甘蓝（cabbage）。

其它优选的物种为含油种子作物，包括、但不限于以下各属：芸苔属、红花属（Carthumus）、向日葵属、玉蜀黍属及芝麻属（Sesamum）。

优选的含油种子属为芸苔属。优选的含油种子物种为甘蓝型油菜（Brassicanapus）。

优选的含油种子属为芸苔属。优选的含油种子物种为羽衣甘蓝（Brassicaoleraceae）。

优选的含油种子属为玉蜀黍属。优选的含油种子物种为玉米（Zea mays）。

优选的含油种子属为红花属。优选的含油种子物种为红花籽草（Carthamustinctorius）。

优选的含油种子属为向日葵属。优选的含油种子物种为向日葵（Helianthusannuus）。

优选的含油种子属为玉蜀黍属。优选的含油种子物种为玉米。

优选的含油种子属为芝麻属。优选的含油种子物种为芝麻（Sesamumindicum）。

优选地青贮料属为玉蜀黍属。优选地青贮料物种为玉米。

优选地谷物生产属为大麦属（Hordeum）。优选地谷物生产物种为大麦（Hordeum vulgare）。

优选地牧草属为黑麦草属。优选地牧草物种为黑麦草（Lolium perenne）。

优选地牧草属为黑麦草属。优选地牧草物种为黑麦草（Loliumarundinaceum）。

优选地牧草属为三叶草属。优选地牧草物种为白三叶草。

优选地牧草属为大麦属。优选地牧草物种为大麦。

优选地植物也包括草料，或动物原料植物。所述植物包括、但不限于以下各属：芒属、甘蔗属、黍属（Panicum）。

优选地生物燃料属为芒属。优选地生物燃料物种为巨芒（Miscanthusgiganteus）。

优选地生物燃料属为甘蔗属。优选地生物燃料物种为甘蔗（Saccharumofficinarum）。

优选地生物燃料属为黍属。优选地生物燃料物种为柳枝稷（Panicumvirgatum）。

具体实施方式

在本说明书中，在提及专利说明书、其它外部文献或其它信息来源的情况下，这通常是为了提供论述本发明特征的背景的目的。除非另外特别说明，否则对所述外部文献的提及不应解释为以任何权限承认所述文献或所述信息来源为现有技术或构成本领域的一般常识的一部分。

在本说明书中所用的术语“包含”是指“至少部分地由...组成”。当解释本说明书中包括术语“包含”的各句时，不同于以该术语为前言的一项或多项特征的特征也可能存在。诸如“包含”等相关术语欲以相同方式解释。

以重量比计，脂质的能量含量大致为蛋白或碳水化合物的两倍。大部分自然界的脂质是由植物生产，且脂质的最稠密形式为三酰基甘油（TAG）。双子叶植物可积聚多达其种子重量的约60%的TAG，所述TAG随后用作发芽的能源。因而，许多研究工作靶向使用富含油的种子，以持续生产用于动物及生物燃料原料的足够脂质。

倘若种子仅能生产有限量的TAG，则采用替代方案来在营养组织中生产额外脂质（优选地为TAG）。大部分这些方案已在植物的叶子中增量调节或过度表达Kennedy途径中的一种或几种酶，以合成TAG。然而，大部分通过此方案生产的额外脂质通常通过脂肪酶及β-氧化作用的组合在植物内再移动，使得脂质含量有限地增加（通常为2-4%的DM）。

在发育种子中生产的TAG通常容纳于称为油体（OB）的离散结构中，所述OB是高度稳定的，且保持为离散密封细胞器，甚至当细胞脱水或经历冷冻条件时也不聚结（Siloto等人,2006;Shimada等人,2008）。OB由嵌有蛋白乳化剂的磷脂单层围绕TAG核心组成。蛋白乳化剂占OB的0.5-3.5%；其中，80-90%为油质蛋白，其余主要由钙结合蛋白（油体钙蛋白）及固醇结合蛋白（油体固醇蛋白）组成（Lin和Tzen,2004）。油质蛋白的乳化特性来源于其三个功能域，所述功能域由两亲的N端臂、高度保守的中心疏水核心（约72个残基）及C端两亲臂组成。类似地，油体钙蛋白及油体固醇蛋白皆具有亲水的N端及C端臂及其自身保守的疏水核心。

先前已推测，具有TAG合成酶的油质蛋白或聚油质蛋白（油质蛋白的串联头尾相接融合体）在叶中的组成型表达，将导致稳定油体的形成，从而使得TAG积聚。然而，我们后来发现，当在植物叶子中与DGAT1共表达时，油质蛋白及聚油质蛋白是无效的，且促使TAG发生积聚（Roberts等人，数据未公开）。

本发明提供了改良油质蛋白，其含有一个或多个人工引入的半胱氨酸残基。用含有经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白包囊中性脂质，会提供在叶中积聚可评估数量的TAG同时无需等待至衰老且不生产极端表型的替代性机制。另外，改良油质蛋白具有许多其它应用，包含改进OB稳定性、乳剂特性以及重组蛋白的生产及纯化。

油体

OB的直径一般在0.5-2.5μm的范围内，且由嵌有蛋白乳化剂（主要为油质蛋白）的磷脂单层围绕TAG核心组成（Tzen等人,1993;Tzen,等人1997）。OB仅包括0.5-3.5%的OB；其中80-90%为油质蛋白，其余主要由钙结合蛋白（油体钙蛋白）及固醇结合蛋白（油体固醇蛋白）组成（Lin和Tzen,2004）。植物细胞内油质蛋白与TAG的比率会影响细胞内油体的尺寸及数量（Sarmiento等人,1997;Siloto等人,2006）。

虽然OB主要在许多植物的种子及花粉中天然生产，但其也见于一些其它器官（例如，特定块茎）中。

油质蛋白为比较小（15-24kDa）的蛋白，其嵌入OB的表面。

油体稳定性

油体及人造油体在上面所讨论的用途中的适用性至少部分受限于其稳定性以及其它。一种实现油体稳定性的方案是，生产包含所谓聚油质蛋白的油体。聚油质蛋白为两个或两个以上油质蛋白单元的头尾相接融合体（Roberts等人,2008）。改变油质蛋白单元的数量，能够调适油体的特性（热稳定性及降解速率）。聚油质蛋白在植物（planta）中的表达会导致聚油质蛋白单元按单一油质蛋白单元掺入油体中（Scott等人,2007）。使用呈串联头尾相接排列的多个油质蛋白单元来制造聚油质蛋白。单独的构建体（含有1至6个油质蛋白重复单元）经特别设计，用于在植物及大肠杆菌中表达。大部分重组聚油质蛋白积聚于转殖基因植物的油体中及大肠杆菌的包涵体中。使用经纯化的原核生物生产的聚油质蛋白生产人造油体。聚油质蛋白会提高蛋白酶-K中的油体及人造油体热稳定性及结构完整性。

然而，存在若干限制因素，其决定聚油质蛋白可提供的保护/稳定性程度；这些因素与可在翻译过程之前接合在一起的串联重复单元的数量有关，且油体靶向变得受限（Scott等人,2007）；而另一限制则来自通过产生具有头尾相接融合排列的转录物而实现的油质蛋白融合体的性质。这基本上为多聚的油质蛋白重复单元的线性蛋白，其在每一单个油质蛋白重复单元上具有许多共价连接及共价连接的位置（即在每个末端的最大值）。另外，此排列仅提供针对N端降解蛋白的保护，但其不提供针对识别特定内部肽序列的其它蛋白水解酶的任何额外保护。此外，在聚油质蛋白分子中的油质蛋白单元之间通过头尾相接串联重复单元形成的连接不易在原位改变。虽然特定蛋白酶特异性位点可经工程改造至接合区中以使嵌入油体或人造油体中的融合的聚油质蛋白分子分裂开，但它们不易再融合。

嵌入油体中的油质蛋白先前已通过添加诸如戊二醛或genepin等交联剂而共价交联（Peng等人,2004&2006），然而，此随机交联需要将交联剂添加至油体制品中，且不易逆转。

人造油体

原核表达的重组油质蛋白可用于生产人造油体（AOB），其特性与植物来源的OB极其相似（Peng等人2004;Roux等人2004;Chiang等人2005;Chiang等人2007）。

油体及人造油体的应用

油体及其组成性油质蛋白的独特特性，构成许多生物技术应用的基础，包括：纯化重组蛋白；形成多聚蛋白复合物；乳化作用；递送生物活性物；生产多价生物活性物，和甚至用作潜在香味增强剂（关于综述，参见Capuano等人,2007和Roberts等人,2008）。

乳剂

当一种或多种液体（其与另一液体不混溶）通常因不同极性及由此导致的不同疏水性而均匀悬浮于另一液体中时，产生乳剂。实例包括均匀分散于水中的油滴或均匀分散于油中的水滴。相对稳定的乳剂的产生需要使用乳化剂，所述乳化剂会降低液体之间的界面张力。一般根据在指定条件下保持均匀分散的持续时间来测量乳剂的稳定性。乳化剂常用于食品及化妆品产业中；所以需要具有高乳剂稳定性，且对于消费及局部施用而言是安全的。

含有油质蛋白的完整油体天然地形成不含表面活性剂的水包油乳剂。已经发现，完整油体或其中大部分TAG已经去除的油体在食品、局部个人护理（护肤霜）及药物制剂中具有广泛的乳化应用（Harada等人,2002;Deckers等人,2003;Hou等人,2003）。

生物氢化作用

已经证实，反刍动物饲料的脂质特性又会影响肉及乳制品的脂质特性（Demeyer及Doreau,1999）。不同植物具有不同脂质特性；通过仅用具有所要脂质特性的植物选择性地喂养动物，可能积极地影响下游肉及乳制品的脂质特性。在反刍动物中，肉及乳汁的最终脂质构成不仅受膳食脂质影响，而且受生物氢化作用显著影响（Jenkins和McGuire 2006;Firkins等人,2006;Lock和Bauman,2004）。生物氢化作用是在瘤胃中存在的生物群实现对非还原化合物（诸如不饱和脂肪）的氢化。通过将脂质包囊在提供微生物降解抗性的一种或多种蛋白中，可以防止/延迟生物氢化作用（Jenkins及Bridges 2007）。通过将三酰基甘油包囊于聚油质蛋白或油质蛋白中来在植物中防止生物氢化作用，参见Scott等人,（2007）,Cookson等人,（2009）和Roberts等人,（2008）。

油质蛋白

油质蛋白为比较小（15至24kDa）的蛋白，其使得OB成为密封的单个细胞器，当细胞脱水或经历冷冻条件时OB不聚结（Leprince等人，1998;Siloto等人，2006;Slack等人，1980;Shimada等人2008）。

油质蛋白具有三个功能域，所述功能域由两亲的N端臂、高度保守的中心疏水核心（约72个残基）及C端两亲臂组成。可接受的拓扑学模型为下述模型：其中N端及C端两亲臂位于OB外部，且中心疏水核心位于OB内部（Huang,1992;Loer和Herman,1993;Murphy 1993）。N端及C端两亲臂的带负电荷残基暴露于水相外部，而带正电荷残基暴露于OB内部且面向带负电荷脂质。因此，具有向外的负电荷的两亲臂负责维持OB为单个实体，这是通过活体内及离体标本中的空间位阻及静电排斥（Tzen等人,1992）。N端两亲臂是高度可变的，且因此没有特定二级结构可描述所有实例。相比而言，C端臂含有30-40个残基的α-螺旋域（Tzen等人,2003）。中心核心是高度保守的，且被认为是已知存在于自然界中的最长疏水区；在中心处有保守的12个残基的脯氨酸结基序，所述基序包括三个间隔的脯氨酸残基（关于综述，参见Frandsen等人,2001;Tzen等人,2003）。尚不清楚中心域的二级、三级及四级结构。存在许多不同排列的模型化、傅立叶变换-红外（FT-IR）及圆二色性（CD）证据（关于综述，参见Roberts等人,2008）。

主要油质蛋白的特性在植物之间是相对保守的，且表征如下：

●对应于约140-230个氨基酸残基的15-25kDa蛋白。

●所述蛋白序列可沿其长度分为几乎相等的4个部分，所述部分对应于N端亲水区、两个中心疏水区（由脯氨酸结或节接合）及C端亲水区。

●油质蛋白的拓扑学可归因于其物理特性，包括由亲水域侧接的折叠的疏水核心。此排列给油质蛋白赋予两亲性质，使得疏水域嵌入磷脂单层中（Tzen等人,1992），而侧接的亲水域暴露于细胞质的水性环境中。

●油质蛋白通常不含半胱氨酸。

用于本发明的优选油质蛋白为如下油质蛋白：其含有约70个非极性氨基酸残基（包括脯氨酸结）的中心域，该中心域未被任何带电残基中断，并侧接两个亲水臂。

本文中所用的术语“油质蛋白”也包括油体固醇蛋白及油体钙蛋白。

油体固醇蛋白

油体固醇蛋白包含N端锚定区段，该区段包含两个两亲的α-螺旋（每个螺旋有912个残基），它们由14个残基的疏水锚定区连接。可溶性的脱氢酶域含有NADP+结合子域及固醇结合子域。油体固醇蛋白-A与-B之间的明显区别在于它们的不同的固醇结合子域（Lin及Tzen,2004）。油体固醇蛋白在其疏水域中具有脯氨酸节，且在其一个亲水臂中含有固醇结合脱氢酶。

油体钙蛋白

油体钙蛋白（Frandsen等人,2001）具有与基础油质蛋白稍微不同的脯氨酸结，且在亲水臂中含有钙结合基序及若干潜在磷酸化位点。类似于油质蛋白，认为油体钙蛋白具有三个结构域，其中N端及C端臂为亲水性的，而中心域为疏水性的且用作油体锚定部。N端亲水域由28个残基的螺旋-转角-螺旋钙结合EF-手基序组成，该基序包括不变甘氨酸残基作为结构转向点，并包括5个保守含氧残基作为钙-结合配体（Chen等人,1999；Frandsen等人,2001）。

C端亲水域含有若干磷酸化位点，且靠近C端处为不参与任何二硫键内部或之间连接的不变半胱氨酸（Peng,2004）。油体钙蛋白的亲水N端及C端为油质蛋白的亲水N端及C端的约3倍（Lin及Tzen,2004）。认为疏水域由两亲α-螺旋及锚定区（其包括脯氨酸结）组成。

适于通过添加至少一个人工引入的半胱氨酸而改良的用于本发明的油质蛋白（油质蛋白、油体固醇蛋白和油体钙蛋白）序列的实例如下表1所示。（多核苷酸及多肽）序列提供于序列表中。

表1

油质蛋白、油体固醇蛋白和油体钙蛋白是本领域技术人员所熟知的。来自许多不同物种的其它序列可易于通过本领域技术人员所熟知的方法来鉴别。例如，使用术语油质蛋白、油体固醇蛋白和油体钙蛋白中的任一个,通过NCBIEntrez Cross-Database Search（获自http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery），可以容易地鉴别其它序列。

植物脂质生物合成

所有植物细胞均通过局限于质体中的共同路径从乙酰辅酶A生产脂肪酸。虽然新近合成的酰基链的一部分随后用于质体内的脂质生物合成（原核细胞路径），但大部分输入细胞溶质中以供在内质网（ER）或其它位点处进行甘油脂质装配（真核细胞路径）。此外，一些质体外甘油脂质返回到质体中，引起质体与ER脂质池之间值得注意的混合（Ohlrogge和Jaworski 1997）。

对脂肪酸生物合成的质体路径的最简单描述由两个酶系统组成：乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）及脂肪酸合酶（FAS）。ACCase催化从乙酰辅酶A形成丙二酰-CoA，FAS将丙二酰基部分转移至酰基载体蛋白（ACP）并催化用丙二酰基-ACP延伸增长的酰基链。

初始脂肪酸合成反应由3-酮酰基-ACP III（KAS III）催化，这导致乙酰辅酶A与丙二酰基-ACP的缩合。由KASI及KAS II催化后续缩合。在脂肪酸合成的下一循环开始之前，3-酮酰基-ACP中间体在剩余FAS反应中被还原为饱和的酰基-ACP，所述反应依次由3-酮酰基-ACP还原酶、3羟基酰基-ACP脱水酶及烯酰基-ACP还原酶催化。

FAS的最终产物通常为16:0及18:0-ACP，且植物细胞的最终脂肪酸组成在很大程度上由在脂肪酸合成的最终阶段使用这些酰基-ACP的若干酶的活性决定。硬脂酰基-ACP去饱和酶通过在C18:0-ACP的9位处插入顺式双键而修饰FAS的最终产物。通过水解或从ACP转移酰基链，终止脂肪酸合成反应。水解由酰基-ACP硫酯酶催化，所述硫酯酶存在两个主要类型：一种硫酯酶对18:1-ACP具有相对特异性，第二种硫酯酶对饱和的酰基-ACP具有更高特异性。已被硫酯酶从ACP释放的脂肪酸离开质体且进入真核细胞脂质路径中，在该路径中，脂肪酸主要在ER上酯化为甘油脂质。与硫酯酶相反，在质体中的酰基转移酶通过将来自ACP的酰基部分转酯至甘油来终止脂肪酸合成，且它们是引起质体甘油脂质装配的原核细胞脂质路径的基本部分。

三酰基甘油生物合成

TAG生物合成中的唯一关键步骤为最后一步，即第三脂肪酸添加至现存的二酰基甘油，由此产生TAG。在植物中，此步骤主要（但非排它地）由5种（主要局限于ER）TAG合成酶之一执行，所述TAG合成酶包括：酰基辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶（DGAT1）；不相关酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶（DGAT2）；与DGAT1或DGAT2具有小于10%同一性的可溶性DGAT（DGAT3）（Saha等人,2006）；磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶（PDAT）；及蜡合酶（WSD1,Li等人,2008）。DGAT1及DGAT2蛋白由两个不同的基因家族编码，其中DGAT1含有大约500个氨基酸及10个预测的跨膜域，DGAT2仅具有320个氨基酸及两个跨膜域（Shockey等人,2006）。

本文中所用术语“三酰基甘油合成酶”或“TAG合成酶”是指，能够催化第三脂肪酸添加至现存二酰基甘油上以由此产生TAG的酶。优选的TAG合成酶包括、但不限于：酰基辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶1（DGAT1）；二酰基甘油酰基转移酶2（DGAT2）；磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶（PDAT）和细胞溶质可溶形式的DGAT（可溶性的DGAT或DGAT3）。

倘若内源性的DGAT1及DGAT2在成熟及衰老的叶中发挥作用（Kaup等人,2002；Shockey等人,2006），则植物可能具有许多反馈机制来控制其活性。实际上，Zou等人（2008）最近在旱金莲（Tropaeolum majus）（园艺旱金莲）DGAT1（TmDGAT1）序列内鉴别出共同序列（X-Leu-X-Lys-X-X-Ser-X-X-X-Val），作为SNF1相关蛋白激酶-1（SnRK1）的成员特有的靶向基序，其中Ser为用于磷酸化的残基。SnRK1蛋白为一类Ser/Thr蛋白激酶，其已经日益涉入植物的碳代谢的全面调节中，例如通过磷酸化作用使磷酸蔗糖合酶灭活（Halford及Hardie,1998）。Zou等人（2008）接着证明，通过单点突变（TmDGAT1的Ser197Ala）消除DGAT1中的潜在SnRK1磷酸化位点，会造成在种子中积聚明显更高水平的TAG。此突变使活性提高38-80%，由这使得拟南芥属中的油含量以每一种子计增加20-50%。

磷脂:DGA酰基转移酶（PDAT）从一个磷脂分子及一个二酰基甘油分子形成TAG。PDAT当在酵母中表达时极具活性，但当在植物种子中表达时不能明显提高TAG产量。PDAT及所提出的DAG:DAG酰基转移酶为产生TAG的中性脂质合成酶，但不认为其是Kennedy途径的一部分。

蜡酯合酶与DGAT酶的组合（WS/DGAT）已见于迄今所研究的所有产中性脂质的原核生物中。WS/DAGAT对多种不常见脂肪酸、醇及甚至硫醇具有格外宽广的活性。此酶具有推定的跨膜区域，但不展示与来自真核生物的DGAT1及DGAT2家族或来自荷荷芭（荷荷芭为已发现的唯一积聚蜡酯的真核生物）的WE合酶的序列同源性。

应当指出，卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）和酰基-辅酶:胆固醇酰基转移酶（ACAT）为生产非TAG的固醇酯（中性脂质的一种形式）的酶。

在需要增加中性脂质的应用中，有证据表明，与DGAT2相比具有更高活性及更宽特异性的DGAT1为优选的。当特定脂肪酸（诸如长链PUFA）为优选的时，DGAT1仍适用，只要其接受所选的脂肪酸。植物一般在sn-2位中掺入长链PUFA。不知道这是否是因于LPAT对此基质的高活性或DGAT1对此基质的低活性。对于PUFA的提高的特异性而言，偏好这些脂肪酸的DGAT2可为优选的，或可使用定向进化或等效程序来改变DGAT1的特性。

来自若干植物物种的成员的适用于本发明的方法及组合物中的这些TAG合成酶的实例提供在下表2中。（多核苷酸及多肽）序列提供于序列表中。

表2

本发明也涵盖改良的TAG合成酶的用途，所述TAG合成酶被修饰（例如在其序列中的置换、插入或添加等）以改变其特异性和/或活性。

TAG在叶中的积聚

近来在美国中北部地区对302个被子植物物种进行的野外调查发现，24%在叶中具有明显的细胞溶质油滴，通常每个叶肉细胞具有一个大油滴（Lersten等人,2006[来自Slocombe等人,2009]）。认为细胞溶质叶TAG的作用涉入碳储存和/或膜脂质再造中（关于综述，参见Slocombe等人,2009）。实际上，在衰老的叶中，质体脂肪酸在进一步移动之前分配至TAG中，且认为DGAT1有助于此过程（Kaup等人,2002）。

已数次尝试工程改造植物以在其叶中积聚升高水平的TAG。这些尝试的成功已经或多或少地受限于所积聚的相对低水平的TAG，且在一些情况下，受限于仅在衰老叶中积聚的大部分TAG，由此限制收获的灵活性及在任一时刻积聚TAG的作物的比例（Bouvier-Nave等人,2001；Xu等人,2005；Winichayakul等人,2008；Andrianov等人,2010；Slocombe等人,2009及其中的参考文献）。

至今，在叶中积聚TAG的尝试主要集中于三个特定基因候选物，包括DGAT的过度表达（TAG生物合成）、TGD1或CTS的突变（从而防止脂质再移动）、及LEC1、LEC2及WRI1（涉入发育种子中的油储存及蛋白积聚的转录因子）的过度表达。TAG及其它中性脂质合成酶的过度表达依赖于足量基质在展叶和/或成熟叶中的存在，认为所述基质是由合成膜的脂质的质体（在叶的情况下，为叶绿体）提供。在拟南芥属的光合成叶中，据估计膜脂质的每日回转率为总脂肪酸的4%（Bao等人,2000）。在衰老的叶中，现存质体膜会提供在进一步移动之前分配至TAG中的大批脂肪酸。

拟南芥属DGAT1基因在烟叶中的过度表达会导致TAG积聚增加（Bouvier-Nave等人,2001），这在以后由Andrianov等人（2010）重复及定量。他们计算出TAG水平增加20倍，且造成在成熟叶中来自约3%至约6%的干物质的双倍脂质含量。通过使用诱导型Alc启动子在成熟叶中过度表达LEC2（种子成熟及种子油储存的一种主要调节物），进一步增加至6.8%（Andrianov等人,2010）。未对可提取的TAG作出估算，也未对TAG在展叶中的积聚进行任何计算。

在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的通透酶样蛋白TRI半乳糖基二酰基甘油（TGD1）中的突变会引起TAG、寡半乳糖脂及磷脂酸酯的积聚，这伴随胚不孕性的高发生率及相对较差的总体植物生长（Xu等人,2005）。

Winichayakul等人,（2008）在黑麦草（多年生黑麦草）的叶中过度表达拟南芥DGAT1，且发现这导致总可提取的叶脂质增加50%（干物质的约4%至6%）。此外，在通过间隔2-3周反复收获所产生的新叶中存在升高的脂质水平，表明新长出的叶也能够积聚额外脂质。然而，当叶龄超过2周时，在这些叶中升高的脂质水平通常开始降低至野生型水平，表明脂质正经由分解代谢而再移动（通过脂肪酶从甘油主链释放，随后β-氧化）。

Slocombe等人,（2009）证明，在CTS过氧化物酶体ABC运载体（cts-2）中的突变会导致至多1.4%TAG在叶中（尤其在衰老开始期间）积聚。它们也在衰老期间在cts-2背景下异位地表达LEC2；虽然这并不会由于cts-2突变而增加TAG的总积聚，但确实会增加TAG的种子油型物种在衰老组织中的积聚。虽然cts-2阻断脂肪酸分解，但它也造成严重表型。Slocombe等人,（2009）的结论是，再循环的膜脂肪酸可能能够通过在衰老组织中表达种子程序或通过阻断脂肪酸分解而重新导向TAG。

Scott等人,（2007）声称，三酰基甘油酯合成酶和聚油质蛋白（两个或更多个油质蛋白单元以串联头尾相接排列形式融合）的共表达，能实现脂质在植物细胞中的储存。类似地，Cookson等人,（2009）声称，在植物的营养部分内生产单一油质蛋白及TAG合成酶，会导致营养组织中的油体及TAG的数量增加。使用这些技术中的任一种，会使脂质含量（未必呈TAG形式）最多增加至多约50%。此外，该水平随着叶的成熟开始下降；通常在叶龄大于2周的叶中（资料未公开）。

因此，TAG在营养组织中可以积聚的程度似乎在某种程度上受限于下述事实，即内源地固定的碳回收机构分解代谢TAG。

叶衰老-脂质经由TAG中间体再循环

叶衰老为一系列高度受控的事件，最终导致细胞、组织及最终整个器官的死亡。这使得必须调节营养素的募集以及其自衰老组织向其它仍生长和发育的组织的移位。叶绿体为叶肉细胞中展示衰老征状的第一细胞器，且虽然在叶衰老级联的早期即引发类囊体膜的分解，但叶绿体包膜保持相对完整直至衰老的很晚阶段。DGAT1在拟南芥属叶的衰老期间被增量调节，且这临时与常见于叶绿体半乳糖脂中的含TAG的脂肪酸水平增加相关联。从衰老的叶（尤其衰老的叶绿体）募集膜碳至植物的生长部分，是叶衰老的关键特征，且它涉及类囊体脂质的脱酯作用及所得游离脂肪酸向韧皮部移动蔗糖的转化。类囊体脂质的脱酯作用似乎由一种或多种衰老诱导的半乳糖脂肪酶所介导。TAG的形成似乎是衰老期间膜脂质碳向韧皮部移动蔗糖移动的中间步骤（Kaup等人,2002）。

经工程改造以包括人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白

本发明的改良油质蛋白或用于本发明方法中的改良油质蛋白被改良成含有至少一个人工引入的半胱氨酸残基。优选地，经工程改造的油质蛋白含有至少两个半胱氨酸。

含有经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白对中性脂质的包囊，会提供在叶中积聚可评估数量的TAG同时无需等待至衰老且不生产极端表型的替代性机制。

本领域技术人员熟知的多种方法可用于生产具有人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白。

这样的方法包括定点诱变（US 6,448,048），其中编码油质蛋白的多核苷酸被改良以将半胱氨酸引入编码的油质蛋白中。

或者，可全部合成编码改良油质蛋白的多核苷酸。

在实施例部分中提供了用于生产本发明的改良油质蛋白及用于本发明方法中的改良油质蛋白的其它方法。

引入的半胱氨酸可以是额外的氨基酸（即插入），或可以替代现存的氨基酸（即替换）。优选地，引入的半胱氨酸替代现存的氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述被替代的氨基酸为带电残基。优选地，预测所述带电残基是在亲水域中，且因此可能位于油体的表面上。

使用标准的方法（例如：Kyte及Doolitle,（1982）），本领域技术人员可容易地鉴别油质蛋白的亲水及疏水区/臂。

本发明的改良油质蛋白的分子量优选地在5至50kDa、更优选10至40kDa、更优选15至25kDa的范围内。

本发明的改良油质蛋白优选地在100至300个氨基酸、更优选110至260个氨基酸、更优选120至250个氨基酸、更优选130至240个氨基酸、更优选140至230个氨基酸的尺寸范围内。

所述改良油质蛋白优选地包含N端亲水区、两个中心疏水区（由脯氨酸结或节接合）及C端亲水区。

所述改良油质蛋白优选地可沿其长度分为几乎相同的四个部分，所述部分对应于N端亲水区（或臂）、两个中心疏水区（由脯氨酸结或节接合）及C端亲水区（或臂）。

所述改良油质蛋白的拓扑学优选地归因于其物理特性，包括由亲水域侧接的折叠的疏水核心。

优选地，当与三酰基甘油（TAG）及磷脂组合时，所述改良油质蛋白可形成在油体中。

优选地，拓扑学给改良油质蛋白赋予两亲性质，从而使得疏水域嵌入油体的磷脂单层中，而侧接亲水域暴露于油体外部的水性环境，诸如在细胞质中。

在一个实施方案中，本发明的改良油质蛋白或用于本发明方法中的改良油质蛋白包含与以上表1中所提及的任一种油质蛋白蛋白序列的疏水域具有至少70%同一性的序列。

在一个实施方案中，本发明的改良油质蛋白或用于本发明方法中的改良油质蛋白包含与以上表1中所提及的任一种蛋白序列具有至少70%同一性的序列。

在另一个实施方案中，除额外人工引入的一个或多个半胱氨酸以外，所述改良油质蛋白与以上表1中所提及的任一种油质蛋白基本上相同。

在另一个实施方案中，本发明的改良油质蛋白或用于本发明方法中的改良油质蛋白包含与SEQ ID NO:16的油质蛋白序列具有至少70%同一性的序列。

在另一个实施方案中，除额外人工引入的一个或多个半胱氨酸以外，所述改良油质蛋白具有与SEQ I D NO:16相同的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述改良油质蛋白具有SEQ ID NO:16至20中的任一个的氨基酸序列。

具有改良油质蛋白的融合蛋白

本发明也提供了一种融合蛋白，其包括与目的蛋白融合的本发明的改良油质蛋白。

优选地，所述目的蛋白是在融合蛋白的N端或C端末端。

本领域技术人员熟知用于重组表达融合蛋白的方法（Papapostolou及Howorka,2009）。本发明的融合蛋白的生产通常可能包括，将目的蛋白的编码序列与改良油质蛋白的编码序列融合。

这样的融合蛋白可包括于或表达于本发明的油体中，且用于纯化及递送目的蛋白以供多种应用，如在Roberts等人,（2008）中所论述。

然而，本发明可能通过改良油质蛋白在油体中的存在而任选地改变油体的稳定性/完整性，由此实现更严格的纯化及递送程序。

具有未改良油质蛋白的融合蛋白

本发明也涉及融合蛋白的应用，所述融合蛋白包括与目的蛋白融合的未改良油质蛋白。本发明的融合蛋白的生产通常可能包括，将目的蛋白的编码序列与未改良油质蛋白的编码序列融合。

优选地，所述目的蛋白是在融合蛋白的N端或C端末端。

然而，本发明可能通过改良油质蛋白在本发明的油体中的存在而任选地改变油体的稳定性/完整性，由此实现更严格的纯化及递送程序。

营养组织

营养组织包括芽、叶、根、茎。优选的营养组织为叶。

营养组织特异性的启动子

营养特异性的启动子的实例参见：US 6,229,067；和US 7,629,454；和US7,153,953；和US 6,228,643。

花粉特异性的启动子

花粉特异性的启动子的实例参见：US 7,141,424；和US 5,545,546；和US5,412,085；和US 5,086,169；和US 7,667,097。

种子特异性的启动子

种子特异性的启动子的实例参见：US 6,342,657；和US 7,081,565；和US7,405,345；和US7,642,346；和US7,371,928。

果实特异性的启动子

果实特异性的启动子的实例参见：US 5,536,653；和US 6,127,179；和US5,608,150；和US 4,943,674。

多核苷酸和片段

本文中所用术语“多核苷酸”是指，任何长度但优选至少15个核苷酸的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括以下非限制性实例：编码及非编码的基因序列、有义及反义互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。

本文中提供的多核苷酸序列的“片段”是能够与目标靶物特异性地杂交的邻接核苷酸子序列，例如长度为至少15个核苷酸的序列。本发明的片段包含所公开的多核苷酸的邻接核苷酸中的15个核苷酸、优选至少16个核苷酸、更优选至少17个核苷酸、更优选至少18个核苷酸、更优选至少19个核苷酸、更优选至少20个核苷酸、更优选至少21个核苷酸、更优选至少22个核苷酸、更优选至少23个核苷酸、更优选至少24个核苷酸、更优选至少25个核苷酸、更优选至少26个核苷酸、更优选至少27个核苷酸、更优选至少28个核苷酸、更优选至少29个核苷酸、更优选至少30个核苷酸、更优选至少31个核苷酸、更优选至少32个核苷酸、更优选至少33个核苷酸、更优选至少34个核苷酸、更优选至少35个核苷酸、更优选至少36个核苷酸、更优选至少37个核苷酸、更优选至少38个核苷酸、更优选至少39个核苷酸、更优选至少40个核苷酸、更优选至少41个核苷酸、更优选至少42个核苷酸、更优选至少43个核苷酸、更优选至少44个核苷酸、更优选至少45个核苷酸、更优选至少46个核苷酸、更优选至少47个核苷酸、更优选至少48个核苷酸、更优选至少49个核苷酸、更优选至少50个核苷酸、更优选至少51个核苷酸、更优选至少52个核苷酸、更优选至少53个核苷酸、更优选至少54个核苷酸、更优选至少55个核苷酸、更优选至少56个核苷酸、更优选至少57个核苷酸、更优选至少58个核苷酸、更优选至少59个核苷酸、更优选至少60个核苷酸、更优选至少61个核苷酸、更优选至少62个核苷酸、更优选至少63个核苷酸、更优选至少64个核苷酸、更优选至少65个核苷酸、更优选至少66个核苷酸、更优选至少67个核苷酸、更优选至少68个核苷酸、更优选至少69个核苷酸、更优选至少70个核苷酸、更优选至少71个核苷酸、更优选至少72个核苷酸、更优选至少73个核苷酸、更优选至少74个核苷酸、更优选至少75个核苷酸、更优选至少76个核苷酸、更优选至少77个核苷酸、更优选至少78个核苷酸、更优选至少79个核苷酸、更优选至少80个核苷酸、更优选至少81个核苷酸、更优选至少82个核苷酸、更优选至少83个核苷酸、更优选至少84个核苷酸、更优选至少85个核苷酸、更优选至少86个核苷酸、更优选至少87个核苷酸、更优选至少88个核苷酸、更优选至少89个核苷酸、更优选至少90个核苷酸、更优选至少91个核苷酸、更优选至少92个核苷酸、更优选至少93个核苷酸、更优选至少94个核苷酸、更优选至少95个核苷酸、更优选至少96个核苷酸、更优选至少97个核苷酸、更优选至少98个核苷酸、更优选至少99个核苷酸、更优选至少100个核苷酸、更优选至少150个核苷酸、更优选至少200个核苷酸、更优选至少250个核苷酸、更优选至少300个核苷酸、更优选至少350个核苷酸、更优选至少400个核苷酸、更优选至少450个核苷酸和最优选至少500个核苷酸。多核苷酸序列的片段可用于反义、RNA干扰（RNAi）、基因沉默、三螺旋或核酶技术中，或用作引物、探针，包括在微阵列中，或用于本发明的基于多核苷酸的选择法中。

术语“引物”是指，通常具有游离3’OH基团的短多核苷酸，其与模板杂交，且用于引发与靶物互补的多核苷酸的聚合。

术语“探针”是指，在基于杂交的试验中，用于检测与探针互补的多核苷酸序列的短多核苷酸。所述探针可由如本文所定义的多核苷酸的“片段”组成。

多肽和片段

本文中所用术语“多肽”包括任何长度但优选至少5个氨基酸的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键相连。本发明的多肽或用于本发明方法中的多肽可为纯化的天然产物，或可使用重组或合成技术部分地或整体地生产。该术语可指多肽、多肽的聚集体（诸如二聚体或其它多聚体）、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。

多肽的“片段”为多肽的子序列，其执行生物活性所需的功能和/或提供多肽的三维结构。该术语可指能够执行上述酶活性的多肽、多肽的聚集体（诸如二聚体或其它多聚体）、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。

当用于本文中所公开的多核苷酸或多肽序列时，术语“分离的”用于指从它们的天然细胞环境中取出的序列。分离的分子可通过任何方法或方法的组合获得，包括生物化学的、重组的及合成的技术。

术语“重组的”是指，从多核苷酸序列的天然背景所包围的序列中取出的多核苷酸序列，和/或与在其天然背景下不存在的序列重组。

通过从“重组的”多核苷酸序列翻译，生产“重组的”多肽序列。

就源自特定属或种的本发明的多核苷酸或多肽而言，术语“源自”是指，所述多核苷酸或多肽具有与在该属或种中天然发现的多核苷酸或多肽相同的序列。源自特定属或种的多核苷酸或多肽因此可以合成地或重组地生产。

变体

本文中所用术语“变体”是指，不同于特别鉴别出的序列的多核苷酸或多肽序列，其中缺失、置换或添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可为天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。变体可来自同一物种或来自其它物种，且可包括同系物、旁系同源物及直系同源物。在某些实施方案中，本发明多肽的变体具有与本发明多肽相同或类似的生物活性。就多肽而言，术语“变体”包括所有形式的多肽和如本文所定义的多肽。

多核苷酸变体

变体多核苷酸序列优选地与本发明的序列表现出至少50%、更优选至少51%、更优选至少52%、更优选至少53%、更优选至少54%、更优选至少55%、更优选至少56%、更优选至少57%、更优选至少58%、更优选至少59%、更优选至少60%、更优选至少61%、更优选至少62%、更优选至少63%、更优选至少64%、更优选至少65%、更优选至少66%、更优选至少67%、更优选至少68%、更优选至少69%、更优选至少70%、更优选至少71%、更优选至少72%、更优选至少73%、更优选至少74%、更优选至少75%、更优选至少76%、更优选至少77%、更优选至少78%、更优选至少79%、更优选至少80%、更优选至少81%、更优选至少82%、更优选至少83%、更优选至少84%、更优选至少85%、更优选至少86%、更优选至少87%、更优选至少88%、更优选至少89%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%和最优选至少99%同一性。在本发明的多核苷酸的至少20个核苷酸位置、优选至少50个核苷酸位置、更优选至少100个核苷酸位置且最优选整个长度的比较窗上，发现同一性。

可以如下方式测定多核苷酸序列同一性。在bl2seq（Tatiana A.Tatusova,Thomas L.Madden（1999）,“Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol Lett.174:247-250）中，使用BLASTN（来自BLAST程序套件，2.2.5版[2002年11月]），将主题多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较，所述bl2seq可从NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）公开获得。除应关闭对低复杂性部分的过滤以外，利用bl2seq的预设参数。

可使用以下unix命令行参数检验多核苷酸序列的同一性：

bl2seq–i nucleotideseq1–j nucleotideseq2–F F–p blastn

参数-F F关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。bl2seq程序在“Identities=”行中将序列同一性报告为相同核苷酸的数量及百分比。

使用总体序列比对程序（例如Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.（1970）J.Mol.Biol.48,443-453），也可以在候选序列与主题多核苷酸序列之间的重叠部分的整个长度上计算多核苷酸序列同一性。Needleman-Wunsch总体比对算法的一个完整实现，参见EMBOSS套件（Rice,P.Longden,I.and Bleasby,A.EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Trends inGenetics June 2000,第16卷，第6期，第276-277页）中的needle程序。该EMBOSS套件可从http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/得到。EuropeanBioinformatics Institute服务器也在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/上在线提供执行两个序列之间的EMBOSS-needle总体比对的工具。

或者，可使用GAP程序，其计算两个序列在无处罚末端空隙的情况下的最佳总体比对。GAP描述在以下论文中：Huang,X.（1994）On Global SequenceAlignment.Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。

计算多核苷酸%序列同一性的优选方法是基于使用Clustal X（Jeanmougin等人,1998,Trends Biochem.Sci.23,403-5.）对比待比较的序列。

本发明的多核苷酸变体也涵盖这样的变体：所述变体展现与可能保留那些序列的功能等效性的一个或多个特别鉴别的序列的相似性，且不能恰当地预期随机发生。使用从来从NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）的BLAST程序套件（2.2.5版[2002年11月]）可公开获得的bl2seq程序，可以测定有关多肽的这种序列相似性。

可使用以下unix命令行参数检验多核苷酸序列的相似性：

bl2seq–i nucleotideseq1–j nucleotideseq2–F F–p tblastx

参数-FF关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。该程序发现序列之间的相似性区域，且为每个这样的区域报导一个“E值”，所述E值为预期在含有随机序列的固定参考尺寸的数据库中找到该偶然匹配的预期次数。此数据库的尺寸是由bl2seq程序中的默认值设定。对于远小于1的小E值而言，E值大致为这样的随机匹配的机率。

当与任一个特别鉴别的序列相比较时，变体多核苷酸序列优选地表现出小于1x10^-6、更优选地小于1x10^-9、更优选地小于1x10^-12、更优选地小于1x10^-15、更优选地小于1x10^-18、更优选地小于1x10^-21、更优选地小于1x10^-30、更优选地小于1x10^-40、更优选地小于1x10^-50、更优选地小于1x10^-60、更优选地小于1x10^-70、更优选地小于1x10^-80、更优选地小于1x10^-90和最优选地小于1x10^-100的E值。

或者，本发明的变体多核苷酸或用于本发明方法中的变体多核苷酸在严谨条件下与指定的多核苷酸序列或其互补序列杂交。

术语“在严谨条件下杂交”及其语法等效描述是指，多核苷酸分子在限定的温度及盐浓度条件下与靶多核苷酸分子（诸如固定于DNA或RNA印迹（诸如DNA印迹或RNA印迹）上的靶多核苷酸分子）杂交的能力。通过最初在更低严谨性条件下杂交，随后将严谨性增加至希望的严谨性，可以测定在严谨杂交条件下杂交的能力。

关于长度大于约100个碱基的多核苷酸分子，典型的严谨杂交条件为，比天然双链体的解链温度（Tm）低不超过25至30℃（例如10℃）（一般参见，Sambrook等人编,1987,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版.Cold Spring Harbor Press；Ausubel等人,1987,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing）。大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可通过下式来计算：Tm=81.5+0.41%(G+C-log(Na+).(Sambrook等人，Eds,1987,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版.ColdSpring Harbor Press;Bolton and McCarthy,1962,PNAS 84:1390)。长度大于100个碱基的多核苷酸的典型严谨条件是这样的杂交条件，诸如在6×SSC、0.2%SDS的溶液中预洗涤；在65℃，在6×SSC、0.2%SDS中杂交过夜；随后在1×SSC、0.1%SDS中在65℃进行两次各30分钟的洗涤，并在0.2×SSC、0.1%SDS中在65℃进行两次各30分钟的洗涤。

关于长度小于100个碱基的多核苷酸分子，示例性的严谨杂交条件是，比Tm低5至10℃。平均而言，长度小于100碱基对的多核苷酸分子的Tm降低大约（500/寡核苷酸长度）℃。

关于称为肽核酸（PNA）的DNA模拟物（Nielsen等人,Science.1991年12月6日；254（5037）:1497-500），Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂交物的Tm值，且可使用Giesen等人,Nucleic Acids Res.1998年11月1日；26（21）:5004-6中所述的公式来计算。长度小于100个碱基的DNA-PNA杂交物的示例性的严谨杂交条件为，比Tm低5至10℃。

本发明的变体多核苷酸或用于本发明方法中的变体多核苷酸也涵盖这样的多核苷酸：其不同于本发明的序列，但因遗传密码的简并性而编码具有与由本发明的多核苷酸所编码的多肽相似的活性的多肽。不改变多肽的氨基酸序列的序列变化是“沉默变异”。除ATG（甲硫氨酸）和TGG（色氨酸）以外，同一氨基酸的其它密码子可通过本领域认可的技术发生改变，例如，以优化在特定宿主有机体中的密码子表达。

引起编码的多肽序列中的一个或若干个氨基酸的保守置换但不显著改变其生物活性的多核苷酸序列变化，也包括于本发明中。技术人员知晓制造表型沉默的氨基酸置换的方法（参见，例如，Bowie等人，1990,Science 247,1306）。

使用从NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）公开获得的来自BLAST程序套件（2.2.5版[2002年11月]）的bl2seq程序，通过先前所述的tblastx算法，可以测定由于编码的多肽序列中的沉默变异及保守置换而产生的变体多核苷酸。

多肽变体

就多肽而言，术语“变体”涵盖天然存在的、重组地和合成地生产的多肽。变体多肽序列优选地与本发明的序列表现出至少50%、更优选至少51%、更优选至少52%、更优选至少53%、更优选至少54%、更优选至少55%、更优选至少56%、更优选至少57%、更优选至少58%、更优选至少59%、更优选至少60%、更优选至少61%、更优选至少62%、更优选至少63%、更优选至少64%、更优选至少65%、更优选至少66%、更优选至少67%、更优选至少68%、更优选至少69%、更优选至少70%、更优选至少71%、更优选至少72%、更优选至少73%、更优选至少74%、更优选至少75%、更优选至少76%、更优选至少77%、更优选至少78%、更优选至少79%、更优选至少80%、更优选至少81%、更优选至少82%、更优选至少83%、更优选至少84%、更优选至少85%、更优选至少86%、更优选至少87%、更优选至少88%、更优选至少89%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%和最优选至少99%同一性。在本发明的多肽的至少20个氨基酸位置、优选至少50个氨基酸位置、更优选至少100个氨基酸位置且最优选整个长度的比较窗上，发现同一性。

多肽序列同一性可以如下方式测定。在bl2seq中使用BLASTP（来自BLAST程序套件，2.2.5版[2002年11月]）将主题多肽序列与候选多肽序列进行比较，bl2seq可从NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）公开获得。除应关闭对低复杂性区域的过滤以外，利用bl2seq的默认参数。

使用总体序列比对程序，也可在候选序列与主题多核苷酸序列之间的重叠部分的整个长度上计算多肽序列同一性。如上文所论述的EMBOSS-needle（可获自http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/）及GAP（Huang.X.（1994）On GlobalSequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences10,227-235.），也是适用于计算多肽序列同一性的总体序列比对程序。

用于计算多肽%序列同一性的优选方法，是基于使用ClustalX（Jeanmougin等人,1998,Trends Biochem.Sci.23,403-5）比对待比较的序列。

本发明的多肽变体或用于本发明方法中的多肽变体也涵盖这样的多肽变体：其展现与可能保留序列的功能等效性的一个或多个特别鉴别的序列的相似性，且不能恰当预期随机发生。使用从NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）公开获得的来自BLAST程序套件（2.2.5版[2002年11月]）的bl2seq程序，可以测定有关多肽的这种序列相似性。可使用以下unix命令行参数检验多肽序列的相似性：

bl2seq–i peptideseq1–j peptideseq2-F F–pblastp

当与任一个特别鉴别的序列相比较时，变体多肽序列优选地表现出小于1x10^-6、更优选地小于1x10^-9、更优选地小于1x10^-12、更优选地小于1x10^-15、更优选地小于1x10^-18、更优选地小于1x10^-21、更优选地小于1x10^-30、更优选地小于1x10^-40、更优选地小于1x10^-50、更优选地小于1x10^-60、更优选地小于1x10^-70、更优选地小于1x10^-80、更优选地小于1x10^-90和最优选地小于1x10^-100的E值。

参数-F F关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。该程序发现序列之间的相似性区域，且为每一个这样的区域报导一个“E值”，所述E值为预期在含有随机序列的固定参考尺寸的数据库中找到该偶然匹配的预期次数。对于远小于1的小E值而言，E值大致为该随机匹配的机率。

所述多肽序列的一个或若干个氨基酸的保守置换（不显著改变其生物活性）也包括于本发明中。技术人员知晓制造表型沉默的氨基酸置换的方法（参见，例如，Bowie等人,1990,Science 247,1306）。

构建体、载体及其组分

术语“遗传构建体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，其中可能已插入另一个多核苷酸分子（插入多核苷酸分子），例如，但不限于，cDNA分子。遗传构建体可含有允许转录插入多核苷酸分子且任选地将转录物翻译为多肽的必需元件。所述插入多核苷酸分子可源自宿主细胞，或可源自不同细胞或有机体，和/或可为重组多核苷酸。一旦在宿主细胞内，遗传构建体则可整合进宿主染色体DNA中。所述遗传构建体可连接至载体上。

术语“载体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，其用于将遗传构建体转运至宿主细胞中。所述载体可能能够在至少一个额外宿主系统（诸如大肠杆菌）中复制。

术语“表达构建体”是指这样的遗传构建体：其包括允许转录插入多核苷酸分子且任选地将转录物翻译为多肽的必需元件。表达构建体通常在5’至3’方向包含：

a）在宿主细胞（构建体将转化进其中）中具有功能的启动子，

b）待表达的多核苷酸，和

c）在宿主细胞（构建体将转化进其中）中具有功能的终止子。

术语“编码区”或“开放读码框”（ORF）是指，能够在适当调节序列控制下生产转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的有义链。在某些情况下，编码序列可通过5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在来鉴别。当插入遗传构建体中时，“编码序列”在可操作地连接至启动子及终止子序列的情况下能够被表达。

“可操作地连接”是指，将待表达的序列放置在调控元件的控制下，所述调控元件包括启动子、组织特异性调控元件、临时调控元件、增强子、抑制子及终止子。

术语“非编码区”是指，在翻译起始位点的上游并在翻译终止位点的下游的非翻译序列。这些序列也分别称为5’UTR和3’UTR。这些区域包括转录起始及终止、mRNA稳定性及调节翻译效率所需的元件。

终止子为终止转录的序列，且见于翻译序列的下游基因的3’不翻译端。终止子为mRNA稳定性的重要决定因素，且在有些情况下，已发现具有空间调节功能。

术语“启动子”是指，在编码区上游的调节基因转录的非转录顺式调控元件。启动子包含指定转录起始位点的顺式引发元件及保守盒（诸如TATA盒），及被转录因子结合的基序。编码序列内的内含子也可调节转录，且影响转录后加工（包括剪接、加帽及聚腺苷酸化）。

启动子可与待表达的多核苷酸同源。这意味着，在自然界中发现启动子与多核苷酸可操作地连接。

或者，启动子可与待表达的多核苷酸异源。这意味着，在自然界中未发现启动子与多核苷酸可操作地连接。

“转基因”是这样的多核苷酸：其取自一种有机体，且通过转化引入不同的有机体中。转基因可源自与引入该转基因的有机体物种相同的物种或不同的物种。

“反向重复序列”是存在重复的序列，其中重复序列的另一半是在互补链中，例如

（5’）GATCTA…….TAGATC（3’）

（3’）CTAGAT…….ATCTAG（5’）

通读转录将产生这样的转录物：其经历互补碱基配对，以形成发夹结构，条件是，在重复区之间存在3-5碱基对间隔物。

宿主细胞

宿主细胞可源自例如细菌、真菌、酵母、昆虫、哺乳动物、藻类或植物有机体。宿主细胞也可为合成细胞。优选的宿主细胞为真核细胞。特别优选的宿主细胞为植物细胞，尤其是在植物营养组织中的植物细胞。

“转基因植物”是指，含有经遗传操纵或转化而生产的新遗传物质的植物。所述新遗传物质可源自与所得转基因植物相同物种或不同物种的植物。

分离或生产多核苷酸的方法

使用本领域普通技术人员已知的多种技术，可以分离本发明的多核苷酸分子。作为实例，通过使用在Mullis等人编,1994The Polymerase ChainReaction,Birkhauser（通过引用并入本文）中所述的聚合酶链式反应（PCR），可以分离这样的多肽。使用源自本发明的多核苷酸序列的如本文所定义的引物，可以扩增本发明的多肽。

用于分离本发明的多核苷酸的其它方法包括：使用具有本文所述的序列的所有或部分多肽作为杂交探针。使标记的多核苷酸探针与固定在固体支持物（诸如硝化纤维素滤膜或尼龙膜）上的多核苷酸杂交的技术，可以用于筛选基因组或cDNA文库。示例性的杂交及洗涤条件为：在65℃，在5.0XSSC、0.5%十二烷基硫酸钠、1X登哈特溶液中杂交20小时；在1.0XSSC、1%（w/v）十二烷基硫酸钠中洗涤（在55℃进行三次各20分钟的洗涤），和任选地在60℃、在0.5×SSC、1%（w/v）十二烷基硫酸钠中洗涤一次（20分钟）。可选的进一步洗涤（20分钟）可在60℃、在0.1×SSC、1%（w/v）十二烷基硫酸钠的条件下进行。

通过本领域中熟知的技术，诸如限制性核酸内切酶消化、寡核苷酸合成及PCR扩增，可以生产本发明的多核苷酸片段。

可在本领域熟知的方法中使用部分多核苷酸序列来鉴别相应的全长多核苷酸序列。这样的方法包括基于PCR的方法、5’RACE（Frohman MA,1993,MethodsEnzymo l.218:340-56）及基于杂交的方法、基于计算机/数据库的方法。此外，作为实例，反向PCR允许获取未知序列，所述序列侧接本文中所公开的多核苷酸序列，从基于已知区域的引物起始（Triglia等人,1998,NucleicAcids Res16,8186,通过引用并入本文）。该方法使用若干限制酶，以在基因的已知区域中产生合适的片段。随后通过分子内连接环化该片段，且将其用作PCR模板。从已知区域设计不同引物。为了以物理方式装配全长克隆，可利用标准分子生物学方法（Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press,1987）。

当从特定物种生产转基因植物时，有益地用源自该物种的一个或多个序列转化这样的植物。所述益处可以是，减少公众对于生产转基因有机体中的跨物种转化的关注。另外，当基因减量调节是希望的结果时，可能必须利用与需要减少其表达的植物中的序列相同（或至少高度相似）的序列。尤其出于这些原因，希望能够在若干不同植物物种中鉴别及分离特定基因的直系同源物。

变体（包括直系同源物）可通过所述方法来鉴别。

鉴别变体的方法

物理方法

变体多肽可使用基于PCR的方法来鉴别（Mullis等人编,1994ThePolymerase Chain Reaction,Birkhauser）。通常，可用于通过PCR扩增本发明的多核苷酸分子的变体的引物的多核苷酸序列，可以是基于编码相应氨基酸序列的保守区的序列。

或者，可使用本领域技术人员熟知的文库筛选法（Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Pres s,1987）。当鉴别探针序列的变体时，通常相对地降低杂交和/或洗涤严谨性，直至找到确切序列匹配。

也可通过物理方法鉴别多肽变体，例如使用针对本发明多肽产生的抗体筛选表达文库（Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press,1987），或借助于这样的抗体鉴别来自天然来源的多肽。

基于计算机的方法

通过本领域技术人员熟知的基于计算机的方法，使用公共域序列比对算法及用于搜寻序列数据库的序列相似性搜寻工具（公共域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它），也可以鉴别本发明的变体序列（包括多核苷酸及多肽变体）。关于在线资源的实例，参见，例如，Nucleic Acids Res.29:1-10和11-16,2001。相似性搜寻会检索及比对目标序列，以供与待分析的序列（即，查询序列）进行比较。序列比较算法使用计分矩阵来为每一比对指派总分。

可用于鉴别序列数据库中的变体的程序的一个示例性家族为BLAST程序套件（2.2.5版[2002年11月]），包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX，它们可从（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）或国家生物技术信息中心（Nationa l Center for Biotechno logy Information，NCBI）、国立医学图书馆（National Library of Medicine,Building 38A,Room8N805,Bethesda,MD 20894 USA）公开获得。NCBI服务器也提供了使用程序来筛选许多可公开获得的序列数据库的设施。BLASTN对照核苷酸序列数据库比较核苷酸查询序列。BLASTP对照蛋白序列数据库比较氨基酸查询序列。BLASTX对照蛋白序列数据库比较在所有阅读框架中翻译的核苷酸查询序列。tBLASTN对照核苷酸序列数据库比较在所有阅读框架中动态翻译的蛋白查询序列。tBLASTX对照核苷酸序列数据库的六-框架翻译物比较核苷酸查询序列的六-框架翻译物。BLAST程序可以预设参数来使用，或可视需要改变参数以改进筛选。

算法的BLAST家族（包括BLASTN、BLASTP及BLASTX）的应用，描述于Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997的出版物中。

通过BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法产生的查询序列对一个或多个数据库序列的“命中”，会比对及鉴别序列的相似部分。以相似性程度及序列重叠部分的长度的顺序，排列命中。命中一个数据库序列，一般表示仅在查询序列的一小部分序列长度上具有重叠。

BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN及tBLASTX算法也产生比对的“预期”值。预期值（E）指示，当搜寻含有随机邻接序列的相同尺寸的数据库时，可“预期”偶然见到的命中数目。预期值系用作判定命中数据库是否表明真正相似性的有效阈值。例如，指派给多核苷酸命中的0.1的E值解释为是指，在所筛选数据库的尺寸的数据库中，可能预期在具有相似分数的序列的比对部分上仅偶然见到0.1匹配。对于在比对及匹配部分上具有0.01或小于0.01的E值的序列而言，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法发现数据库中偶然匹配的机率为1%或1%以下。

可以用CLUSTALW(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.(1994)CLUSTALW:improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting,positions-specific gap penaltiesand weight matrix choice.Nucleic Acids Research,22:4673-4680,http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html）或T-COFFEE（Cedric Notredame,Desmond G.Higgins,Jaap Heringa,T-Coffee:A novelmethod for fast and accurate multiple sequence alignment,J.Mol.Biol.(2000)302:205-217)），或使用渐进成对比对的PILEUP（Feng和Doolittle,1987,J.Mol.Evol.25,351），进行一组相关序列的多重序列比对。

可利用图样识别软件应用来找到基序或标签序列。例如，MEME（用于基序引出的多个Em）在一组序列中找到基序及标签序列，且MAST（基序比对及搜寻工具）使用这些基序在查询序列中鉴别相似或相同基序。提供MAST结果作为与适当统计资料及所找到基序的目视全览的一系列比对。在圣地亚哥的加利福尼亚大学（University of California,San Diego）开发出MEME和MAST。

PROSITE（Bairoch和Bucher,1994,Nucleic Acids Res.22,3583;Hofmann等人，1999,Nucleic Acids Res.27,215）是鉴别从基因组或cDNA序列翻译的未表征蛋白的功能的方法。PROSITE数据库（www.expasy.org/prosite）含有生物学显著图样及特性，且被设计成使得其可与适当计算工具一起使用，以向已知蛋白家族指派新序列或判定哪个已知域存在于该序列中（Falquet等人，2002,Nucleic Acids Res.30,235）。Prosearch是可以既定序列图样或标签搜寻SWISS-PROT及EMBL数据库的工具。

分离多肽的方法

本发明的多肽或用于本发明方法中的多肽（包括变体多肽）可使用本领域中熟知的肽合成方法来制备，诸如使用固相技术进行直接肽合成（例如Stewart等人,1969,Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co,San FranciscoCalifornia），或例如使用Applied Biosystems 431A肽合成仪（Foster City,California）进行自动合成。多肽的突变形式也可在所述合成期间产生。

本发明的多肽及变体多肽或用于本发明方法中的多肽及变体多肽也可使用本领域中熟知的多种技术（例如Deutscher编,1990,Methods in Enzymology,第182卷,Guide to Protein Purification）从天然来源纯化。

或者，本发明的多肽及变体多肽或用于本发明方法中的多肽及变体多肽可在合适的宿主细胞中重组表达，并与细胞分离，如下文所论述。

生产构建体及载体的方法

本发明的遗传构建体包含一个或多个本发明的多核苷酸序列和/或编码本发明的多肽的多核苷酸，且可用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物有机体。本发明的遗传构建体意欲包括如本文中所定义的表达构建体。

生产及使用遗传构建体及载体的方法是本领域中熟知的，且一般描述于：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Press,1987；Ausube1等人,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing,1987中。

生产包含多核苷酸、构建体或载体的宿主细胞的方法

本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的遗传构建体或载体。

包含本发明的遗传构建体（诸如表达构建体）的宿主细胞可用于本领域熟知的方法中（例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版Cold Spring Harbor Press,1987;Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing,1987），用于重组生产本发明的多肽。这样的方法可能包括，在适用于或有助于表达本发明的多肽的条件下，在适当介质中培养宿主细胞。随后，通过本领域熟知的方法（例如Deutscher编,1990,Methods in Enzymology,第182卷,Guide to ProteinPurification），可以将表达的重组多肽（其可以任选地分泌至培养物中）与介质、宿主细胞或培养基分离。

生产包含构建体及载体的植物细胞及植物的方法

本发明另外提供了包含本发明的遗传构建体的植物细胞，及修饰成改变本发明的多核苷酸或多肽或用于本发明方法中的多核苷酸或多肽的表达的植物细胞。包含这样的细胞的植物也形成本发明的一个方面。

用多肽转化植物细胞、植物及其部分的方法，参见：Draper等人，1988,Plant Genetic转化and Gene Expression.A Laboratory Manual.BlackwellSci.Pub.Oxford,第365页;Potrykus and Spangenburg,1995,Gene Transferto Plants.Springer-Verlag,Berlin.；和Gelvin 等人，1993,PlantMolecular Biol.Manual.Kluwer Acad.Pub.Dordrecht。对转基因植物（包括转化技术）的综述，参见：Galun和Breiman,1997,Transgenic Plants.Imperial College Press,London。

植物的遗传操纵方法

可利用许多植物转化策略（例如，Birch,1997,Ann RevPl ant Phys PlantMol Biol,48,297,Hellens RP,等人(2000)Plant Mol Biol 42:819-32,Hellens R等人Plant Meth 1:13）。例如，策略可设计成增加多核苷酸/多肽在通常表达所述多核苷酸/多肽的植物细胞、器官中和/或在特定发育阶段的表达，或在通常不表达所述多核苷酸/多肽的细胞、组织、器官中和/或在特定发育阶段异位表达所述多核苷酸/多肽。表达的多核苷酸/多肽可源自待转化的植物物种，或可源自不同植物物种。

转化策略可设计成减少多核苷酸/多肽在通常表达所述多核苷酸/多肽的植物细胞、组织、器官中或在特定发育阶段的表达。这样的策略称为基因沉默策略。

用于在转基因植物中表达基因的遗传构建体通常包括：用于驱动一个或多个克隆的多核苷酸的表达的启动子，终止子，及用于检测遗传构建体在转化植物中的存在的选择标记序列。

适用于本发明的构建体中的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中具有功能，且包括细胞特异性的、组织特异性的及器官特异性的启动子、细胞周期特异性的启动子、时间启动子、诱导型启动子、在大多数植物组织中具有活性的组成型启动子、及重组启动子。在必要时，启动子的选择将取决于克隆的多核苷酸的时间及空间表达。启动子可为通常与目标转基因有关的启动子，或源自其它植物、病毒及植物病原性细菌及真菌的基因的启动子。本领域技术人员无需过多实验就能够选出适用于使用包含本发明的多核苷酸序列的遗传构建体改良及调节植物特性的启动子。组成型植物启动子的实例包括：CaMV 35S启动子、胆脂碱合酶启动子及章鱼碱合酶启动子、及来自玉蜀黍的Ubi1启动子。在特定组织中具有活性的植物启动子，会对内部发育信号或外部非生物的或生物的应激做出响应，这描述于科学文献中。示例性的启动子描述于例如WO 02/00894中，该文献通过引用并入本文中。

常用于植物转化遗传构建体中的示例性的终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒（CaMV）35S终止子、根瘤土壤杆菌胆脂碱合酶或章鱼碱合酶终止子、玉蜀黍zein基因终止子、水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子及马铃薯（Solanumtuberosum）PI-II终止子。

常用于植物转化中的选择标记包括：赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因（NPT II）、赋予壮观霉素及链霉素抗性的aadA基因、赋予Ignite（AgrEvo）及Basta（Hoechst）抗性的草胺膦乙酰转移酶（bar基因）及赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）。

也预见到遗传构建体的应用，所述遗传构建体包含可用于植物及植物组织中的启动子表达分析的报告基因（表达对于宿主而言外来的活性、通常为酶活性和/或可见信号（例如荧光素酶、GUS、GFP）的编码序列）。报告基因文献论述于Herrera-Estrella等人，1993,Nature 303,209,和Schrott,1995,见:Gene Transfer to Plants（Potrykus,T.,Spangenberg编）Springer Verlag.Berline,第325-336页。

下面是公开了可用于遗传转化以下植物物种的遗传转化方案的代表性出版物：稻米（Alam等人,1999,Plant Cell Rep.18,572）、苹果（Yao等人,1995,Plant Cell Reports 14,407-412）、玉米（美国专利第5,177,010号及第5,981,840号）、小麦（Ortiz等人,1996,Plant Cell Rep.15,1996,877）、西红柿（美国专利第5,159,135号）、马铃薯（Kumar等人,1996Plant J.9,：821）、木薯（Li等人,1996Nat.Biotechnology 14,736）、莴苣（Michelmore等人,1987,Plant Cell Rep.6,439）、烟草（Horsch等人,1985,Science 227,1229）、棉花（美国专利第5,846,797号及第5,004,863号）、草类（美国专利第5,187,073号及第6.020,539号）、胡椒薄荷（Niu等人,1998,PlantCell Rep.17,165）、橘类植物（Pena等人,1995,Plant Sci.104,183）、香菜（Krens等人,1997,Plant Cell Rep,17,39）、香蕉（美国专利第5,792,935号）、大豆（美国专利第5,416,011号、第5,569,834号、第5,824,877号、第5,563,04455号及第5,968,830）、菠萝（美国专利第5,952,543号）、杨树（美国专利第4,795,855号）、单子叶统称（美国专利第5,591,616号及第6,037,522号）、芸苔属（美国专利第5,188,958号、第5,463,174号及第5,750,871号）、谷类（美国专利第6,074,877号）、梨（Matsuda等人,2005,Plant Cell Rep.24（1）:45-51）、李属（Ramesh等人,2006Plant Cell Rep.25（8）:821-8；Song及Sink 2005Plant Cell Rep.2006;25（2）:117-23；Gonzalez Padilla等人,2003Plant Cell Rep.22（1）:38-45）、草莓（Oosumi等人,2006Planta.223（6）:1219-30；Folta等人,2006Planta Apr 14;PMID:16614818）、玫瑰（Li等人,2003）、树莓（Graham等人,1995Methods Mol Biol.1995;44:129-33）、西红柿（Dan等人,2006,Plant Cell Reports V25:432-441）、苹果（Yao等人,1995,Plant Cell Rep.14,407-412）、芥花（大油菜（Brassicanapus L.）（Cardoza及Stewart,2006Methods Mol Biol.343:257-66）、红花（Orlikowska等人,1995,Plant Cell Tissue and Organ Cul ture 40:85-91）、黑麦草（Altpeter等人,2004Developments in Plant Breeding 11（7）:255-250）、稻米（Christou等人,1991Nature Biotech.9:957-962）、玉米（Wang等人,2009In:Handbook of Maize第609-639页）及毛花猕猴桃（Actinidia eriantha）（Wang等人,2006,Plant Cell Rep.25,5:425-31）。本发明也涵盖其它物种的转化。合适的方法及方案可获自科学文献中。

植物

术语“植物”意欲包括整个植物，植物的任何部分，植物的种子、果实、繁殖体及子代。

术语“繁殖体”是指植物中可用于繁殖或增殖的任何部分，其为有性或无性的，包括种子及插枝。

可培养本发明的植物，并自交或与不同植物品系杂交，且可鉴别具有希望的表型特征的所得杂种。可培养两代及两代以上，以确保主题表型特征稳定地维持及继承。由这样的标准育种方法得到的植物，也形成本发明的一个方面。

缩写

油质蛋白（或Ole）_0-0是指不含经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白。

油质蛋白（或Ole）_1-1是指在每个亲水臂中均具有一个经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白。

油质蛋白（或Ole）_1-3是指在N端亲水臂中具有一个经工程改造的半胱氨酸且在C端亲水臂中具有三个经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白。

油质蛋白（或Ole）_3-1是指在N端亲水臂中具有三个经工程改造的半胱氨酸且在C端亲水臂中具有一个经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白。

油质蛋白（或Ole）_3-3是指在N端亲水臂中具有三个经工程改造的半胱氨酸且在C端亲水臂中具有三个经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白。

油质蛋白（或Ole）_5-6是指在N端亲水臂中具有五个经工程改造的半胱氨酸且在C端亲水臂中具有六个经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白。

油质蛋白（或Ole）_6-7是指在N端亲水臂中具有六个经工程改造的半胱氨酸且在C端亲水臂中具有七个经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白。

附图说明

图1显示了油质蛋白_0-0及DGAT1（S205A）构建体的序列。CaMV35为花椰菜花叶病毒35S启动子。attB1为GATEWAY^TM重组位点。UBQ10为来自拟南芥UBQ10基因的内含子。OCS终止子为章鱼碱合酶终止子。

图2显示了转化进拟南芥中的油质蛋白_1-1及DGAT1（S205A）构建体排列。

图3显示了油质蛋白_1-3及DGAT1（S205A）构建体的序列。CaMV35为花椰菜花叶病毒35S启动子。attB1为GATEWAY^TM重组位点。UBQ10为来自拟南芥UBQ10基因的内含子。OCS终止子为章鱼碱合酶终止子。

图4显示了油质蛋白_3-1及DGAT1（S205A）构建体。CaMV35为花椰菜花叶病毒35S启动子。attB1为GATEWAY^TM重组位点。UBQ10为来自拟南芥UBQ10基因的内含子。OCS终止子为章鱼碱合酶终止子。

图5显示了油质蛋白_3-3及DGAT1（S205A）构建体。CaMV35为花椰菜花叶病毒35S启动子。attB1为GATEWAY^TM重组位点。UBQ10为来自拟南芥UBQ10基因的内含子。OCS终止子为章鱼碱合酶终止子。

图6显示了用于转化植物的构建体pRSh1的图谱。该图谱显示了油质蛋白的排列，其中人工引入的半胱氨酸（在此情况下Oleo_3-3）在CaMV35s启动子的控制下，以及拟南芥DGAT1（S205A）也在CaMV35s启动子的控制下。其它油质蛋白序列及TAG合成酶序列当然可分别取代Oleo_3-3及DGAT1。

图7显示了抗-芝麻种子油质蛋白抗体的斑点印迹比较，所述抗体结合至含有及不含经工程改造的半胱氨酸残基的经纯化重组芝麻种子油质蛋白上。

图8显示了在AOB中检测大肠杆菌表达的油质蛋白半胱氨酸蛋白的免疫印迹分析。将等体积的AOB（7.5μL，包括2×SDS装载染料，不含还原剂）加载于每个泳道上。GSSG的mM浓度在各泳道上方指示。

图9显示了大肠杆菌表达的Ole-0-0、Ole-1-1及Ole-3-3的SDS及SDS-UREAPAGE/免疫印迹分析。在还原剂（DTT及β-ME）或氧化剂（GSSG）存在及不存在下，从包涵体（IB）及人造油体（AOB）制备样品，其中将等量的蛋白加载于相邻泳道上。

图10显示了在CaMV35S启动子的控制下表达DGAT1（S205A）及芝麻油质蛋白的转基因拟南芥种子中的油质蛋白（Oleo_0-0、Oleo_1-3、Oleo_3-1和Oleo_3-3、SEQ ID NO 11-20）积聚的免疫印迹分析。

图11显示了在CaMV35S启动子的控制下表达DGAT1（S205A）及芝麻油质蛋白的转基因拟南芥的油体中的油质蛋白（Oleo_0-0、Oleo_1-3、Oleo_3-1及Oleo_3-3，SEQ ID NO 11-20）积聚的免疫印迹分析。在氧化剂存在下（+）寡聚油质蛋白条带（二聚的及三聚的）的出现，指示二硫键能够在天然油体的外部形成。

图12显示了在CaMV35S启动子的控制下表达DGAT1（S205A）及芝麻油质蛋白的转基因拟南芥的叶中的油质蛋白（Oleo_0-0、Oleo_1-3、Oleo_3-1及Oleo_3-3，SEQ ID NO 11-20）积聚的免疫印迹分析。

图13显示了在转基因拟南芥属叶中的重组油质蛋白积聚（黑色箭头）的免疫印迹。

图14显示了FAMES GC/MS结果，所述结果证实了额外脂质（黑色箭头）在过度表达DGAT1（S205A）及Ole_3,3的拟南芥属叶中积聚。

图15显示了含有DGAT1（S205A）及Ole_3,3的转基因拟南芥属的野生型及独立系（independent line）的总叶脂质特性的GC/MS结果。灰色箭头指示内部标准品。黑色箭头指示额外中性脂质（蜡酯、固醇酯及TAG）。空心箭头展现三个系（41S、18A及47C），它们与野生型（及系50A）相比在其叶中积聚大量中性脂质。

图16显示了GC/MS结果，所述结果表明野生型及转基因拟南芥属（含有DGAT1（S205A）及Ole_3,3）在发芽后2、3、4和5周的总TAG特性。黑色箭头指示在转基因叶中发现、而在非野生型叶中未发现的额外TAG。

图17显示了FAMES GC/MS结果，所述结果表明野生型及转基因白三叶草（含有DGAT1（S205A）及Ole_3,3）的总叶脂质特性。

图18显示了FAMES GC/MS结果，所述结果表明野生型及转基因白三叶草（含有DGAT1（S205A）及Ole_3,3）的C18:1及C18:2叶脂质特性。

实施例

现在将参考以下非限制性实施例来说明本发明。

实施例1：制造兔抗-芝麻种子油质蛋白抗体

生产兔抗-芝麻种子油质蛋白抗体

在大肠杆菌中表达含有C端His标签的全长芝麻种子油质蛋白（核苷酸序列显示于SEQ ID NO:1中），并通过标准技术制备包涵体。将包涵体溶解于结合缓冲液（100mM磷酸盐缓冲液pH8.0、500mM NaCl、8M尿素和10mM咪唑）中，并加载到含有平衡的离子金属亲和色谱法（IMAC）Ni琼脂糖（Invitrogen）的柱上。通过用6体积的洗涤缓冲液（100mM磷酸盐缓冲液pH8.0、500mM NaCl、6M尿素和50mM咪唑）洗涤，从所述柱去除未结合的蛋白。在1体积的洗脱缓冲液（100mM磷酸盐缓冲液pH8.0、500mM NaCl、6M尿素和250mM咪唑）等分试样中，洗脱蛋白。通过SDS-PAGE/考马斯染色，分析洗脱的级分，并使用布拉德福德氏试验测量蛋白浓度。将265μg IMAC-纯化的重组油质蛋白蛋白与等量弗氏完全佐剂混合，直至0.5mL的终体积。在收集预采血之后，将第一注射液施用进兔的颈后及肩部区域的多个部位中。在首次注射之后3周及7周，递送含有77μg经纯化油质蛋白的加强注射，且在第9周取出约3mL测试血，以供初步分析。通过添加0.25%v/v苯酚及0.01%v/v硫柳汞来保存血清，将所述血清分成200μL等分试样在-20℃储存。

通过免疫印迹，评估兔抗-芝麻种子油质蛋白抗体的敏感性，表明可以在1/2,000的抗体稀释度定期检测0.25ng芝麻种子油质蛋白（图7）。

实施例2：含有一个或多个人工引入的半胱氨酸残基的改良油质蛋白的设计和大肠杆菌表达

用于在大肠杆菌中表达的构建体设计

设计了许多改良油质蛋白构建体，以供在大肠杆菌中表达。这些构建体在N端及C端亲水臂上含有1或3个半胱氨酸残基。所述构建体是基于来自不含半胱氨酸残基的芝麻种子油质蛋白（GenBank克隆AF091840）的核苷酸序列及翻译的多肽序列（SEQ ID NO:16）。

使用经工程改造的NdeI/XhoI位点，将所有克隆亚克隆进pET29b中。此外，将ProTrp编码序列添加至C端亲水臂的3'末端的编码区上，以模仿由先前经Peng等人（2006）Stability enhancement of native and artificial oil bodiesby genipin crosslink（台湾专利I 250466）工程改造的NcoI位点所编码的氨基酸残基。

将本文中描述的经突变以在N端及C端亲水区中包括半胱氨酸残基的油质蛋白-半胱氨酸蛋白称为Ole-1-1、Ole-1-3、Ole-3-1和Ole-3-3（分别为SEQ IDNO 2、3、4及5），其中第一个及第二个数字分别对应N端及C端中的二硫键数目。使用不含半胱氨酸残基的标准油质蛋白作为对照，且称为Ole-0-0（SEQ IDNO 1）。

用半胱氨酸置换预测存在于油体表面上的带电残基，并列举如下。

N端单个半胱氨酸（Ole-1-x）Glu3Cys

N端三个半胱氨酸（Ole-3-x）Glu3Cys Arg12Cys Gln23Cys

C端单个半胱氨酸（Ole-x-1）Gln137Cys

C端三个半胱氨酸（Ole-x-3）Gln112Cys Lys123Cys Gln137Cys

将构建体设计成，经由NcoI/XhoI消化及连接，可以相对简单地从GENEART提供的主链（pCR4Blunt-TOPO）亚克隆进pET29b（Novogen）中。这将油质蛋白编码序列置于pET29N端S·标签融合体的下游及C端His标签的上游（图1-5及SEQ ID No 1-10）。所用油质蛋白及改良油质蛋白序列总结在序列表的概述中。

含有至少一个人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

通过SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色及SDS-PAGE/免疫印迹分析，使用针对芝麻种子油质蛋白产生的抗体，评估重组芝麻种子油质蛋白（含有及不含经工程改造的半胱氨酸）在大肠杆菌表达系统中的表达（描述于实施例1中）。

于新鲜接种的10mL大肠杆菌培养物（BL21Rosetta-Gami）中诱导重组改良油质蛋白的表达，所述大肠杆菌培养物含有在pET29表达载体中的油质蛋白（含有或不含经工程改造的半胱氨酸残基）编码序列。使培养物在37℃及220rpm下生长至对数中期（OD₆₀₀0.5-0.7）；通过添加IPTG至1mM最终浓度，诱导表达。在37℃及220rpm下温育诱导的培养物另外2-3小时。鉴于改良油质蛋白的特性，申请人并不试图以可溶性形式表达它，而宁愿选择从包涵体中提取它。将培养物的等分试样（1mL）转移至1.5mL微量离心管中，并通过离心（在4℃，2655×g，5分钟）使细胞沉淀。

以5mL/g湿细胞沉淀物，将沉淀的细胞重新悬浮于

试剂（Merck）中，添加DNA酶至40μg/mL，并在旋转器上温和地混合30分钟，然后在4℃、在8000g离心10分钟。用上述及DNA酶再处理所得细胞沉淀物。通过在4℃、在8000g离心10分钟，将剩余的可溶性蛋白及悬浮的细胞碎片与不溶性的包涵体分离。

使用由D’Andréa等人（2007）改编的规程，从所述包涵体进一步纯化重组油质蛋白。简而言之：通过再悬浮于200mM碳酸钠缓冲液pH11（5mL/g原始细胞沉淀物）中，洗涤包涵体制品，并通过在4℃、在8000×g离心10分钟，使其再沉淀。使洗涤过的包涵体沉淀物重新悬浮5mL 200mM碳酸钠缓冲液（每克沉淀物）中，并加入9体积的新鲜制备的氯仿:甲醇混合物（5:4v/v）中，产生5:4:1(氯仿:甲醇:缓冲液)的最终比率。将该悬浮液温和地混合5分钟，形成乳状单相混合物；将其在4℃、在10,000xg离心10分钟，将含有改良油质蛋白的上清液小心地与沉淀物分离，并转移至新试管中。在氮气流下干燥上清液的等分试样，并将蛋白再溶解于8M尿素中，通过y Qubit^TM（Invitrogen）进行定量。

实施例3：抗-芝麻种子油质蛋白抗体用于结合含有人工引入的半胱氨酸的芝麻种子油质蛋白的用途

使用斑点印迹法来比较实施例1中所述的抗-芝麻种子油质蛋白抗体（Ab）的结合不含半胱氨酸的油质蛋白相对于结合含有半胱氨酸的油质蛋白（实施例2中所述）的能力。将纯化的Ole-0-0、Ole-1-3及Ole-3-1以12至0.25ng的一系列稀释液印迹在预平衡的Hybond-P PVDF转移膜上。以1:2000，与作为第一抗体的抗-芝麻种子油质蛋白抗体一起温育它。然后，与适当的第二抗体一起温育所述印迹，并通过化学发光显影（图7）。结果表明，在免疫印迹上，抗-芝麻种子油质蛋白抗体对不含半胱氨酸残基的油质蛋白的敏感性比含半胱氨酸残基的油质蛋白的敏感性高至多一个数量级。由于具有不同敏感性，必须在供免疫印迹分析的凝胶上加载不同量的重组蛋白。尽管存在不均匀泳道加载，仍可能以单体形式与寡聚形式之间的相对分布的方式，比较泳道之间的不同油质蛋白。

实施例4：用大肠杆菌表达的含有至少一个人工引入的半胱氨酸且改变交联度的改良油质蛋白制造人造油体

人造油体的制备

随后通过干燥实施例3中所述的上清液的等分试样（经计算含有150μg或1mg的重组油质蛋白），制备人造油体（AOB）。

生成AOB的过程包括，组合PL、TAG及重组油质蛋白/改良油质蛋白。在强离液剂不存在下，从纯化的级分分离单个重组油质蛋白所需的断裂力，包括声处理与冷却的数个交替循环。这如下实现：将150μg及1mg油质蛋白/改良油质蛋白样品溶解于20μL含有150μg PL（Sigma，目录号P3644）的氯仿中，并与60μL纯化的芝麻种子油（Tzen及Huang 1992）及940μL AOB缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液pH8.0、100mM NaCl）混合。随后声处理全部混合物3次，各30秒（Sonics & Materials Vibra-Cell VC600,600W,20kHz；1/8"楔形微尖端探针，功率设定#3）。

申请人还发现，纯化程序可成功地放大，且当50g细胞沉淀物用作原料时，必须用旋转真空蒸发器替代氮气流，以去除氯仿及大部分甲醇。此时，大部分油质蛋白/改良油质蛋白从共沸溶剂中沈淀出，并通过在12,000g离心10分钟来分离。

将包涵体悬浮于1mL AOB缓冲液II（50mM磷酸钠pH8.0、100mM NaCl、20mMβ-巯基乙醇、10mM DTT和5%[v/v]芝麻油）中，随后声处理4次。通过在12,000rpm离心10分钟，浓缩AOB，这导致覆盖水性级分的AOB悬浮液的形成。通过移液器去除下层水性级分，并通过在1mL AOB缓冲液III（50mM磷酸钠pH8.0、100mM NaCl）中温和地搅动，洗涤剩余的AOB（以去除可溶性蛋白及还原剂）。洗涤之后，通过离心再浓缩AOB，且去除下层水性级分，随后通过在AOB缓冲液IV（50mM磷酸钠缓冲液pH8.0、100mM NaCl、1mM GSSG）中涡旋，使其再悬浮，且在4℃保存AOB以供进一步分析。

成功地在大肠杆菌包涵体中表达及定位重组Ole-0-0、及油质蛋白-半胱氨酸的所有变体（图9）。Ole-0-0主要以单体形式存在（在包涵体以及AOB中）；其比20kDa分子量标志物更快地分层迁移（在还原及非还原SDS及SDS-UREA PAGE中）。也存在两个约35及36kDa的更慢迁移的免疫反应带，它们可能对应二聚油质蛋白的两个形式。虽然未预测到Ole-0-0含有任何半胱氨酸残基，但两个可见二聚体的总强度及比率受还原剂（β-ME5%的样品加载缓冲液及10mMDTT）存在的影响。

在包涵体中，Ole-1-1的主要形式为单体。似乎仅存在一个二聚形式，且此形式不受还原剂或尿素的影响。来自AOB的Ole-1-1（在还原剂存在下且随后在氧化剂存在下产生）表现出二聚体与单体的比率大幅提高以及三聚、四聚及可能的五聚寡聚体（这些寡聚体的电泳聚焦在SDS-UREA凝胶中显著改善）的形成。GSSG的去除及还原剂再引入AOB中，会导致仅单体与二聚体以与在包涵体中所见相似的比例存在。用Ole-1-1产生的AOB（在还原剂及GSSG均不存在下）表明存在几乎相等部分的单体及二聚体及小量三聚体，这指示，形成AOB的条件具有一定还原电位。GSSG的后续添加会导致寡聚部分增加以及四聚形式的出现。

虽然单体为包涵体中Ole-3-3的主要形式，但也存在相当高百分率的多种寡聚形式。寡聚体的比例在添加还原剂之后下降至小范围，且在添加还原剂及离液剂之后稍微增加。当从AOB中提取重组蛋白时，比三聚体更大的Ole-3-3寡聚形式较差地溶解。GSSG的添加且在还原剂及离液剂不存在下，会促进大寡聚形式的生成，这些寡聚形式中的一部分未能进入浓缩胶中。总之，这些结果表明，在AOB上，Ole-3-3高度交联，且交联位置与从包涵体中回收的Ole-3-3相比更多变。这提示，尽管预存在相当多的交联（在包涵体内），但在AOB上，Ole-3-3可利用大量用于交联的潜在配偶体。类似地，对于Ole-1-3及Ole-3-1，当在1个或2个亲水区上存在一个以上半胱氨酸时，交联物质的数量增加（图8及9）。

可预期，在非还原SDS-PAGE中，含有相同数目的油质蛋白但具有在不同位置的二硫键的寡聚体将彼此不同地迁移。实际上，这可从图8中看出，该图中数据表明，油质蛋白臂的位置相对于彼此在油体上的不同位置处。例如，Ole-1-1每臂仅可形成一个二硫键，且该二硫键必须在相同位置处形成，因为三个半胱氨酸的存在能够使得一个以上二硫键形成，但其也使得二硫键以不同程度的亲水臂重叠以及多个油质蛋白结合至同一臂上来形成（图8及9）。

SDS及还原剂（DTT及β-ME）的添加会减少寡聚复合物的数量（图9）。SDS及尿素的添加会导致与单独的SDS类似的图样，例外是，先前溶解的多种二聚形式一致地迁移，且三聚及四聚形式似乎呈现更高丰度，大概因为它们也以单带形式迁移，由此相应地提高强度（图9）。相比而言，SDS、还原剂及尿素的存在导致形成更少的Ole-1-1及Ole-1-3寡聚形式，而Ole-3-1或Ole-3-3则不然（图9）。在Ole-3-1及Ole-3-3的情况下，尿素似乎不会使二硫化油质蛋白完全变性，且可能实际上防止二硫键完全还原。实情可为，在包涵体生成期间形成这些键（需视还原及非还原包涵体制品而定）。此外，在经工程改造的半胱氨酸残基不存在下形成的二聚油质蛋白的存在（图8及9）表明，一些低聚反应归因于其它类型的吸引，例如强疏水键合，其不会被SDS完全破坏，但可被SDS及尿素的组合几乎完全破坏（图8及9）。

可如下评估在油质蛋白肽中增加潜在交联位点的数量对AOB完整性及乳剂稳定性的影响。

AOB完整性的定量测定

使用吸光度（OD₆₀₀）、使用血球计数器的AOB直接计数、或通过显微术目测评价聚结来评估AOB稳定性及完整性，被证实具有高度可变性，且尤其受以下影响：预抽样搅动的程度；取出的样品的数量；在显微镜下保持的时间。为了避免此可变性，申请人设计出一种定量在多种处理期间从AOB释放至周围介质中的TAG的量的简单方法，作为比较完整性的手段。在250μL GC玻璃插入管中，使用AOB缓冲液（含有蛋白酶K[PNK]，适当时，在OB或AOB样品中以1:1的PNK：总蛋白比率），将基本上等量（基于TAG的FAMES-GC/MS估计及蛋白的布拉德福德测定）的AOB制品补足至200μL的总体积，并用塑料盖覆盖。在处理（高温或暴露于PNK）之后，将15μL鱼油（

Australia）添加至样品中，并通过涡旋进行混合，然后在5,200g离心1分钟。添加鱼油之后进行涡旋，能够使已经从AOB漏出的任何TAG与添加的鱼油混合，且通过短暂离心而漂浮。取出4μL油相样品，并进行脂肪酸甲基酯化（FAME），随后通过GC-MS（Shimadzu型号，装备有50mQC2/BPX70-0.25GC毛细柱（SGE），如由Browse等人（1986）所描述）来分析。在不添加鱼油的情况下，已经从AOB漏出的TAG的量极少，以致甚至在离心之后也不能形成可取样的可见层，在此情况下，最大体积将为6μL。鱼油与芝麻油的极其不同的脂质特性，使我们能够容易地区分漏出的TAG与添加的TAG。

使用内部C15:0及C17:0标准物，申请人可计算在处理后回收的C18:2（在芝麻种子油中的主要脂质）的绝对量。

在高温下测定AOB完整性及乳剂稳定性

水包油乳剂在高温下的稳定性较低；因此，研究具有变化数量的引入半胱氨酸的改良油质蛋白在高温下是否影响AOB完整性是有意义的。为了实现此目的，申请人测定了OB及AOB（含有不同的油质蛋白）在95℃在磷酸盐缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液pH8、100mM NaCl）中的完整性（使用上述方法）。加热AOB 2小时。如上所述测定完整性。

可如下评估更高比率的交联油质蛋白:TAG对瘤胃液中AOB的稳定性的影响。

测定在瘤胃液中的AOB完整性

二硫化物的目的之一是，提供一定程度的保护以免被瘤胃微生物群生物氢化。可如下评估在瘤胃液中的AOB稳定性。将AOB添加至等体积（25μL）的瘤胃液中。在39℃温育样品0、15、30、60、120及240分钟，在温育结束时，添加等体积的加载缓冲液（Invitrogen），混合，并在70℃加热10分钟。通过SDS-PAGE/免疫印迹，比较15μL各样品/加载缓冲液混合物。如上所述测定完整性。

分析在蛋白酶K中的AOB完整性

为了研究改良油质蛋白在可控的及可重复的高度降解环境中的影响，在37℃在含有1:1（g/g蛋白）蛋白酶K（Invitrogen）的磷酸盐缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液pH8、100mM NaCl）中温育4小时之后，测定AOB（含有不同改良油质蛋白）的完整性（使用上述方法）。虽然蛋白酶K的最大活性在低于65℃时实现，但使用更低的温度来减少温度对AOB不稳定性的影响。如上所述测定完整性。

实施例5：含有一个或多个人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白的设计及在植物中的表达

用于在植物中表达的构建体设计

申请人合成了在N端及C端臂中具有不同数量的半胱氨酸的芝麻种子油质蛋白（基于GenBank克隆AF091840）的单个编码序列。所述编码序列侧接5'NotI位点和3'NdeI位点。合成了含有以下位点的单独受体盒：attL1位点、NotI位点和NdeI位点，继之以nos终止序列、前向CaMV35s启动子、拟南芥DGAT1（S205A）（SEQ ID NO 11-20及图1-5）以及它自身的UBQ10内含子、attL2位点。经由NotI及NdeI位点，将具有不同数量的半胱氨酸的芝麻种子油质蛋白单个地转移至受体盒中。随后，通过LR重组反应，将这些完成的盒中的每一个转移至植物二元载体pRSh1中（图6（Winichayakul等人,2008））。这会将油质蛋白置于CaMV35s启动子（已包含于pRSh1内）的下游，且将nos终止子（已包含于pRSh1内）置于拟南芥属DGAT1（S205A）的下游（图1-5）。优化编码芝麻种子油质蛋白（含有半胱氨酸）的核苷酸序列及DGAT1以供在拟南芥中表达，这包括以下方面的优化：密码子频率、GC含量、去除隐蔽剪接位点、去除mRNA不稳定性序列、去除潜在聚腺苷酸化识别位点及添加四核苷酸终止密码子（Brown等人,1990；Beelman及Parker,1995；Rose,2004；Rose及Beliakoff,2000；Norris等人,1993）。

应当指出，所用油质蛋白序列仅为示例性的的。任何油质蛋白或油体固醇蛋白或油体钙蛋白序列均可经工程改造以含有交联区。对照原始油质蛋白翻译序列的重复序列，检查完整ORF的编码序列（剪接之后），且发现在油质蛋白编码区上是相同的。

用含有半胱氨酸的芝麻种子油质蛋白转化拟南芥

如先前所述（Scott等人,2007），（使用上述构建体）转化拟南芥变体Columbia，分析T2种子的改良油质蛋白，对含有具有不同数量半胱氨酸的芝麻种子油质蛋白的拟南芥油体进行免疫印迹分析。

花序浸渍法（floral-dip）（Clough,1998）及花序滴落法（floral-drop）（Martinez-Trujillo,2004）均用于转化拟南芥属，其中使用含有二元构建体的根瘤土壤杆菌GV3101。从处理过的植物收集T1种子，使其发芽，并通过在发芽后第14天及第21天用喷雾来选择。移植

抗性T1植物（分别是含有单一芝麻种子油质蛋白及改良油质蛋白构建体的71、62及23转化体），使其自体受精（self-fertilise），结种子，并收集T2种子。通过SDS-PAGE/免疫印迹，用抗-芝麻种子油质蛋白抗体分析从

抗性拟南芥属植物提取的等量种子；在大部分样品中，观察到适当尺寸的重组芝麻种子油质蛋白及改良油质蛋白（图10）。对选定的T2系执行DNA印迹分析，以测定插入位点的数量。

实施例6：从拟南芥种子提取及纯化具有含有至少一个人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白的油体

来自拟南芥种子的粗油体制品

从如实施例5中所述生产的植物种子，如下制备粗OB制品：用含有刮勺尖量的沙及750μL提取缓冲液（10mM磷酸盐缓冲液pH 7.5，含有600mM蔗糖）的研钵及研杵研磨200mg种子，或使用Wiggenhauser D-130匀浆器在300μL提取缓冲液中匀浆化25mg种子。添加另外750μL提取缓冲液，且将研钵中的浆料转移至2mL微量离心管，而在1mL提取缓冲液中冲洗匀浆器尖端，并将此体积添加至匀浆化的种子中。随后在20,000×g离心样品5分钟；由此产生沉淀物及水性上清液，所述水性上清液上面被含有完整及破碎油体以及游离TAG的不混溶油层覆盖。将上覆油层轻轻推向试管的侧边，丢弃水层及沉淀物。随后通过在提取缓冲液中涡旋，使油层从试管的侧边再悬浮，并置于新的2mL微量离心管中。用提取缓冲液将终体积补足至0.5mL。

来自拟南芥种子的纯化的油体制品，及经工程改造油质蛋白之间的交联半胱氨酸残基

使用Wiggenhauser D-130匀浆器，在300μl提取缓冲液（10mM磷酸盐缓冲液pH 7.5，含有600mM蔗糖）中研磨25mg（如实施例5中所述的转化植物的）拟南芥属种子。研磨种子直至碾碎，样品呈现“乳油状”且起泡，因为淀粉自种子中释放出来。在1ml缓冲液中冲洗匀浆器尖端，并将此体积加入碾碎的种子。制备四批样品直至此时，随后在14,000rpm离心5分钟。使用薄凝胶加载尖，将油层轻轻推向试管的侧边，且将水层移至新试管中。使用提取缓冲液，从试管的侧边再悬浮油层，且置于新的2ml试管中。用提取缓冲液将终体积补足至0.5ml（由试管的侧面读取），将样品分成两份，并将氧化剂（3mMGSSG）加入一个试管中，并在室温下温育10分钟。随后将油体制品添加至等体积的2×凝胶加载缓冲液中，并煮沸5分钟，然后加载于凝胶上。

在标准凝胶装备系统（Bio-Rad）上的预制的NuPAGE Novex 4-12%Bis-TrisMidi凝胶（Invitrogen）上，或在

Novex 12%Bis-Tris梯度凝胶1.0mm（15孔，目录号NP0343BOX)(含有

MESSDS电泳缓冲液（仅对于Bis-Tris凝胶）（20X），目录号NP0002-02）上，或在手灌Tris-HCl凝胶上，使样品泳动。通过SafeStain（Invitrogen）染色凝胶，以展现使用iBlot系统（Invitrogen）加载或印迹于硝化纤维素膜上的总蛋白。在各情况下，阴性对照为从野生型Columbia种子提取的样品，阳性对照为对野生型芝麻种子执行相同提取方法（但通过研钵及研杵研磨）。将10μl每个样品及阴性对照加载于凝胶上，将5μl用于阳性对照。

在印迹之后，在12.5%脱脂奶粉于TBST（50mM Tris pH7.4、100mM NaCl、0.2%吐温）中的溶液中封闭膜至少1.5小时。随后在TBST中洗涤膜3×5分钟，然后以1/1000与第一抗体（抗芝麻）一起于TBST中在室温温育1小时。在用TBST洗涤另外3次之后，以1/5000与第二抗体（抗兔）一起在室温温育1小时。洗涤膜另外3次，然后使用标准化学发光方案，使信号显影。

图11显示了在CaMV35S启动子的控制下芝麻种子油质蛋白单元在油体上的积聚。可以看出，发现重组油质蛋白及聚油质蛋白在拟南芥的种子中积聚，且正确地靶向油体（图11）。此外，可以看出，在氧化剂存在下历时10分钟，含有半胱氨酸的重组油质蛋白形成交联，如在这些样品中寡聚体出现及单体形式相应消失所证实，而在野生型或非氧化转基因油体中则不然。

可如下评估增加油质蛋白肽中的潜在交联位点的数量对植物中OB完整性及乳剂稳定性的影响。

OB完整性的定量测定

使用吸光度（OD₆₀₀）、使用血球计数器的AOB直接计数、或通过显微术目测评价聚结来评估OB稳定性及完整性，被证实具有高度可变性，且尤其受以下影响：预抽样搅动的程度；取出的样品的数量；在显微镜下保持的时间。为了避免此可变性，申请人设计出一种定量在多种处理期间从OB释放至周围介质中的TAG的量的简单方法，作为比较完整性的手段。在250μL GC玻璃插入管中，使用AOB缓冲液（含有蛋白酶K[PNK]，适当时，在OB样品中以1:1的PNK：总蛋白比率），将基本上等量（基于TAG的FAMES-GC/MS估计及蛋白的布拉德福德测定）的OB制品补足至200μL的总体积，并用塑料盖覆盖。在处理（高温或暴露于PNK）之后，将15μL鱼油（

Australia）添加至样品中，并通过涡旋进行混合，然后在5,200g离心1分钟。添加鱼油之后进行涡旋，能够使已经从OB漏出的任何TAG与添加的鱼油混合，且通过短暂离心而漂浮。取出4μL油相样品，并进行脂肪酸甲基酯化（FAME），随后通过GC-MS（Shimadzu型号，装备有50mQC2/BPX70-0.25GC毛细柱（SGE），如由Browse等人（1986）所描述）来分析。在不添加鱼油的情况下，已经从OB漏出的TAG的量极少，以致甚至在离心之后也不能形成可取样的可见层，在此情况下，最大体积将为6μL。鱼油与芝麻油的极其不同的脂质特性，使我们能够容易地区分漏出的TAG与添加的TAG。

在高温下测定OB完整性及乳剂稳定性

水包油乳剂在高温下的稳定性较低；因此，研究具有变化数量的引入半胱氨酸的改良油质蛋白在高温下是否影响OB和AOB完整性是有意义的。为了实现此目的，申请人测定了OB（含有不同的油质蛋白）在95℃在磷酸盐缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液pH8、100mM NaCl）中的完整性（使用上述方法）。加热AOB 2小时。如上所述测定完整性。

可如下评估更高比率的交联油质蛋白:TAG对瘤胃液中OB的稳定性的影响。

测定在瘤胃液中的OB完整性

二硫化物的目的之一是，提供一定程度的保护以免被瘤胃微生物群生物氢化。可如下评估在瘤胃液中的OB稳定性。将OB添加至等体积（25μL）的瘤胃液中。在39℃温育样品0、15、30、60、120及240分钟，在温育结束时，添加等体积的加载缓冲液（Invitrogen），混合，并在70℃加热10分钟。通过SDS-PAGE/免疫印迹，比较15μL各样品/加载缓冲液混合物。如上所述测定完整性。

分析在蛋白酶K中的OB完整性

为了研究改良油质蛋白在可控的及可重复的高度降解环境中的影响，在37℃在含有1:1（g/g蛋白）蛋白酶K（Invitrogen）的磷酸盐缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液pH8、100mM NaCl）中温育4小时之后，测定AOB（含有不同改良油质蛋白）的完整性（使用上述方法）。虽然蛋白酶K的最大活性在低于65℃时实现，但使用更低的温度来减少温度对OB不稳定性的影响。如上所述测定完整性。

实施例7：在拟南芥的叶中生产油体

为了在营养组织中生产油体，必须在这样的组织（例如叶）中生产三酰基甘油。

在植物的营养部分中生产三酰基甘油

在大多数植物（包括多年生黑麦草）中，大部分叶脂质附着于甘油主链上，且作为二酰基甘油存在。将所述叶脂质掺入脂质双层中，叶脂质在这里充当多个亚细胞细胞器的膜或充当细胞本身的膜。叶中的大部分脂质双层为叶绿体类囊体膜。更小量的叶脂质作为叶表皮蜡质存在，且甚至更小百分比的叶脂质以三酰基甘油（TAG）形式存在。

大多数植物在发育胚及花粉细胞中合成及储存TAG，随后在所述发育胚及花粉细胞中利用TAG来提供在发芽及花粉管生长期间可分解代谢的能量。双子叶植物可积聚高达种子重量的约60%的TAG。通常，在主要能量储存形式为碳水化合物（例如淀粉）的单子叶植物种子中，该水平显著更低。在TAG生物合成中灼唯一关键步骤为最后一步，即第三脂肪酸添加至现存二酰基甘油上，由此产生TAG。在植物中，通过下述三种酶之一来执行该步骤，所述酶包括:酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶（DGAT1）、不相关酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶（DGAT2）及磷脂：二酰基甘油酰基转移酶（Zou等人,1999；Bouvier-Navé等人,2000；Dahlqvist等人,2000；Lardizabal等人,2001）。这些基因中的任一个的转录区在植物的营养部分中的过度表达，会导致在叶细胞的细胞质中形成TAG液滴，如以下的过度表达所证实：在烟草中的拟南芥属DGAT1（Bouvier-Navé等人,（2000））；在酵母及烟草中的油桐树DGAT2（Shockey等人,（2006））；在拟南芥属中的拟南芥属PDAT（Stahl等人,（2004））。在有些情况下，拟南芥属DGAT1的过度表达经证实在例如百脉根（Lotusjaponicus）毛根（Bryan等人,2004）及多年生黑麦草叶（Cookson等人,2009）中增加总脂质水平，但不一定通过TAG的积聚来实现。

为了证明TAG在这些植物的叶中的积聚，可以比较从这些植物的叶中提取的脂质总量与未转化植物或用空二元载体转化的植物的脂质总量。确保植物在相同环境条件下生长，并且叶样品在生理学上是等效的。使用FAMES GC-MS分析，用适当的内部标准品，可以实现全部脂质提取物的定量（参见Winichayakul等人,2008Delivery of grasses with high levels of unsaturated,protectedfatty acids.Proceedings of the New Zealand Grass land Association,70:211-216）。或者，使用Folsch方法（Folsch等人,1957J.Folsch,M.Lees及G.A.Slone-Stanley,Asimple method for the determination of totallipid extraction and purification,Journal of Biological Chemistry 226（1957）,第497-507页），可以提取全部脂质，并通过装备有Restek（RestekCorp.,Bellefonte,PA）RTX65TG柱的GC-MS，使用适当的内部标准品来定量。

从过度表达拟南芥DGAT1（S205A）及芝麻种子油质蛋白构建体（Oleo_0-0或Oleo_1-1或Oleo_1-3或Oleo_3-1或Oleo_3-3，SEQ ID NO 11-20，图1-5）的植物，取出叶样品，并使用多克隆抗-芝麻种子油质蛋白抗血清，通过SDS-PAGE/免疫印迹进行分析。可以看出，发现重组油质蛋白在拟南芥的叶中积聚（图12）。

油质蛋白/改良油质蛋白蛋白在同一细胞（例如叶细胞）中的同时表达及积聚，将导致产生被嵌有油质蛋白的磷脂单层包囊的甘油三酯油体；这已经在酵母中（Ting等人,1997）及在种子中（Abell等人,2004）由未改良油质蛋白证明。

来自转基因拟南芥的叶的油体制品

从表达DGAT1（S205A）及芝麻种子油质蛋白构建体（Oleo_0-0或Oleo_1-1或Oleo_1-3或Oleo_3-1或Oleo_3-3，SEQ ID NO 11-20，图1-5）的转基因拟南芥的叶，可以提取油体。

通过如实施例6中所述测量OB完整性及乳剂稳定性，可以评估在油质蛋白肽中增加潜在交联位点的数量对这样的植物的OB的影响。

在每个亲水臂中含有三个以上半胱氨酸残基的油质蛋白的设计及构建

当与DGAT1（S205A）共表达时，ole-3,3系具有相当高水平的脂质（呈TAG形式）水平增加，而含有ole-0,0的系不具有高于过度表达DGAT1的对照系的脂质水平增加。ole-1,1、ole-1,3和ole-3,1表明，在叶中脂质积聚水平与经工程改造至每个臂中的半胱氨酸数量的增加之间存在关联（表3）。

表3.表达载体对照、单独的DGAT1（S205A）或DGAT1（S205A）和不同形式的油质蛋白（不含有额外的半胱氨酸，或在每个亲水臂中含有最多3个额外半胱氨酸）的拟南芥属叶的脂肪酸组成（表示为%干重）

总脂质（经证实为TAG）的增加与经工程改造至亲水域中的半胱氨酸的数量之间的相关性指示，半胱氨酸的数量可为影响所希望的TAG水平的手段。因此，设计每个亲水臂含有超过3个半胱氨酸的新构建体。每个亲水臂不可能放置无限数量的半胱氨酸；这些限制包括：

●臂的长度——如果添加额外残基为半胱氨酸制造空间，则最终疏水域相互作用的程度将降低，因为它们的接触半胱氨酸的能力将受它们移至OB上的自由度的限制。

●维持+、-及两亲残基的比例——如果这些残基的平衡及这些残基的分布显著地变化，则亲水臂可能实际上不与OB的表面相互作用，并因而不能提供任何保护对抗脂肪酶或聚结。

●硫可用性——如果硫是有限的，则增加每个油质蛋白分子中的半胱氨酸的数量可能使植物处于营养应激下。

通过置换氨基酸及主要预测为中性或带电而非疏水的那些氨基酸，将原始半胱氨酸-油质蛋白工程改造成在每个臂中携带3个相对均匀间隔的未配对半胱氨酸。

据推断，油质蛋白需要具有特定水平的负电荷，且在C端中，这似乎可通过K（Lys）来实现，因此继续执行用额外半胱氨酸交换带电或中性残基的策略，可能在防止聚结方面造成较差稳定性。此外，在N端亲水区中，经工程改造的半胱氨酸之间留下的残基似乎太少，以致不能在维持带正电与带负电氨基酸之间的间距和摆动的同时进一步进行残基置换。因此，向N端及C端添加额外残基（半胱氨酸），而非用半胱氨酸置换现存残基。或者，已经使用具有更长亲水臂的油质蛋白。

还设计了两种额外的构建体（Ole-5,6和Ole-6,7）。这些构建体的每个臂中的半胱氨酸残基并非故意不平衡，而是经编排，以试图在每个半胱氨酸之间通常得到4-5个残基。实际上，为了将N端臂中的半胱氨酸增加至6个，必须生成额外残基（与现存残基的置换相反）；这是通过从Ole-3,3复制前6个残基来实现。

与其设计全新的核苷酸序列，不如（适当时）添加编码半胱氨酸的三联体TGT，以生成Ole_5,6。就额外谷氨酰胺残基而言，使用密码子三联体GGA。就在Ole_6-7上的额外N端6个残基而言，复制ole_3,3的N端，并融合在读码框中。

将亚克隆策略设计成与初始半胱氨酸油质蛋白相同，即通过NotI/NdeI亚克隆进油受体中。随后，通过LR反应将其重组至pRSH1中（Winichayakul等人,2008）。拟南芥属DGAT1（S205A）及油质蛋白基本上置于它们自身的CaMV35s启动子及OCS终止子下。DGA1及油质蛋白克隆都含有UBQ10内含子。

使用NetGene2来预测Ole_5,6及Ole_6,7的剪接图样。预测Ole_5,6及Ole_6,都在指导链上仅具有一个供体及受体位点（预测二者具有极高识别机率），且在互补链上无位点。

数据表明，含有1,3或3,1半胱氨酸的油质蛋白确实积聚可检测水平的TAG，但这当然小于3,3半胱氨酸油质蛋白（1,1积聚痕量，而0,0不积聚）。这甚至更有力地提示，5,6及6,7油质蛋白可能比3,3构建体积聚甚至更多TAG。不久将获得来自5,6及6,7构建体的第一资料。

将含有经工程改造的半胱氨酸及DGATI的油质蛋白转化进野生型拟南芥中

将5个二硫化物-油质蛋白/DGAT1（S205A）基因构建体及一个对照（含有DGAT1（S205A）、但不含有油质蛋白的构建体）转移至植物二元载体pRSh1中（Winichayakul等人,2008），并使用土壤杆菌介导的转化，转化进野生型拟南芥中。

遵照传统花序浸渍方法的修改版，因为已经报道，花序浸渍趋向于损伤发育中的长角果，这是由于去污剂存在于接种物中（Martinez-Trujillo等人,2004）。因此，使用微量移液器向每个花逐滴接种。一周之后，重复该接种操作，以将接种物引入新近发育的花中。当长角果已干枯时，收集种子，随后洗净，并种植，以供筛选转化体。

通过BASTA选择，执行转化体的筛选，并使用分离比率分析，针对BASTA抗性来选择纯合的转化体。

将含有经工程改造的半胱氨酸及DGATI的油质蛋白转化进野生型白三叶草中

根据Voisey等人,（1994）的规程，执行向白三叶草中的转化。

称量种子，以提供约400-500个子叶（即200-250个种子），以供解剖用（0.06克=100个种子）。在离心管中，用70%乙醇冲洗种子1分钟。通过在漂白剂（5%有效氯）中在圆筒式混合器上震荡15分钟，进行表面杀菌，然后在无菌水中洗涤四次。使种子在4℃膨润过夜。

在土壤杆菌品系GV3101中维持用于转化拟南芥属（上述）的相同构建体，且将其接种至含有浓度为100mg/L的壮观霉素的25mL MGL培养液（表4）中。在28℃，在旋转式震荡器（200rpm）上使培养物生长过夜（16小时）。通过离心（3000×g，10分钟），收获细菌培养物。去除上清液，并在5mL 10mMMgSO₄溶液中再悬浮细胞。

使用解剖显微镜，从种子剖开子叶。首先，去除种皮及胚乳。用解剖刀，通过将刀刃置于子叶之间且切割其余主茎，使子叶与根部分离。将子叶外植体收获在无菌滤盘上的CR7培养基中。

为了转化，向每个剖开的子叶分配3ul土壤杆菌悬浮液的等分试样。密封平板，并在25℃、在16小时光周期下培养。在72小时共培养期之后，将转化的子叶转移至含有补充有草胺膦（2.5mg/L）及特美汀（300mg/L）的CR7培养基的平板中，并返回到培养室中。

在芽再生之后，将外植体转移至补充有草胺膦（2.5mg/L）及特美汀（300mg/L）的CR5培养基中。将再生芽每周继代培养3次至含有选择物的新鲜CR5培养基中。

随着根形成发生，将小苗转移至含有CR0培养基（含有草胺膦选择物）的盆中。在此阶段，将大块再生物分成单个小苗。随后，将在选择压力下生长的整个生根植物罐装于无菌泥炭块（peat plug）中。植物一旦在泥炭块中生长，随后转移至温室中。

表4.用于白三叶草转化的培养基组成

FAMES GC/MS结果表明，与野生型相比，转基因白三叶草（含有DGAT1（S205A）及Ole_3,3或Ole_5,6或Ole 6,7）具有升高的总叶脂质特性（图17）。叶脂质的最高水平与经工程改造至油质蛋白中的半胱氨酸的最高数量之间具有一般的相关性。

FAMES GC/MS结果表明，与野生型相比，转基因白三叶草（含有DGAT1（S205A）及Ole_3,3或Ole_5,6或Ole6,7）具有升高的C18:1及C18:2叶脂质特性（图18）（也如在拟南芥属中所见）。在用含有最高数量的经工程改造的半胱氨酸的油质蛋白转化的植物中，发现了叶C18:1及C18:2的最高水平。

叶（及种子）中的油体装配的测定

使用免疫印迹分析（用抗-芝麻种子油质蛋白抗体，Scott等人,2007），进行其它筛选，以测定过度表达油质蛋白蛋白的系。使用此方法，使用蔗糖密度梯度从推定转化体的T2种子提取油体（OB），或在变性/还原缓冲液中从叶提取总蛋白，并在SDS-PAGE中分离蛋白，转移至硝化纤维素膜，用针对芝麻油质蛋白产生的抗体进行挑战（Scott等人,2007）。

在500μL OB缓冲液（10mM磷酸钠pH 7.5，含有600mM蔗糖）中，从25mg种子提取粗油体（OB）。在13,000×g离心之后，小心地抽出水层，并使脂肪垫层再悬浮于200μL OB缓冲液中，而不干扰底部的沉淀物。向20μL每种OB提取物中加入4×加载染料及10×还原剂，加热至70℃5分钟，并加载于4-12%聚丙烯酰胺凝胶上，以供免疫印迹分析。在α-芝麻油质蛋白抗体（第一抗体）中以1:750稀释度温育印迹1小时，并在第二抗体中（1:10,000）再温育1小时。

油质蛋白在种子中天然地表达，而在叶中则不然。然而，因为我们已在CaMV35s启动子的控制下共表达DGAT1及油质蛋白，所以可预期到，这将使得在叶中积聚可检测水平的油质蛋白。使用针对芝麻油质蛋白产生的抗体，通过免疫印迹，分析来自在种子中高度表达重组油质蛋白（通过免疫印迹分析鉴别）的转化系的叶。

下表5总结了所产生的推定转化体的数量及在种子及叶中表达重组油质蛋白的植物的数量。

表5

应指出，积聚在叶中的重组油质蛋白的水平显著低于种子中的水平。然而，在叶中积聚可检测水平的单个系的比例比单独表达油质蛋白时大得多（RobertsLab，未公开资料），这表明，DGAT1与油质蛋白在叶中的共表达已导致更高水平的油质蛋白的积聚。

分析来自共表达DGATI（S205A）及二硫化油质蛋白的转基因植物的叶

使来自在种子中过度表达油质蛋白蛋白的纯合系的种子发芽，以允许生长2、3、4或5周。收获足量叶材料，以用于FAMES GC-MS以及使用RTX 65-TG Restek柱的GC-MS，它们能够在无衍生作用下分离及鉴别游离的脂肪酸、二酰基甘油、蜡酯、固醇酯及三酰基甘油。

用于FAMES-GC/MS分析的材料的制备

将10mg冷冻干燥的叶粉末置于13×100mm螺旋帽试管中，向其中加入10μL未甲基化的内部标准品（C15:0FA，4mg/mL，溶解于庚烷中）。向该混合物中，加入1mL经过5%2,2-二甲氧基丙烷处理的盐酸的甲醇溶液试剂（使用无水甲醇将1mL的3M溶液稀释至1M），作为水清除剂。随后用N2气冲洗该试管，之后立即以特氟隆-衬里的盖子密封，且在80℃加热1小时。在试管已冷却至室温之后，添加10μL预甲基化的标准物（4mg/mL溶解于庚烷中的C17:0）。向此混合物中添加0.6mL庚烷及1.0mL 0.9%（w/v）NaCl，并通过涡旋彻底混合。在室温、在500rpm离心1分钟之后，收集100μL顶层（含有庚烷），将其转移至放入棕色小瓶中的平底玻璃插入物中，以供GC/MS分析。

FAMES GC/MS分析

使用SGE毛细柱BPX70（50mx0.22mmx0.25μm），分析FAMES GC/MS。GC-MS的条件如下：温度程序化成以15℃/分钟的速率从80℃达到150℃，随后以8℃/分钟的速率达到250℃，且保持等温10分钟。以分割模式注入样品；总流量为28.4mL/min；柱流量为0.82mL/min；且清洗流量为3.0mL/min。压力保持在150kPa；离子源温度为200℃，且界面温度保持在260℃。通过质谱法，以始于50m/z且终于350m/z的扫描模式，获取目标化合物。

TAG及极性脂质提取

使用Ruiz-López等人,（2003）的修改方法，提取TAG。简而言之，为进行各TAG分析，将34-80mg冷冻干燥的叶粉末置于去了皮重的13-mm螺旋帽试管中，并称重，添加2.4mL 0.17M NaCl的MeOH溶液，并通过涡旋进行混合。在添加4.8mL庚烷及10μL内部标准品（C14:0，10μg/μL）之后，轻轻混合悬浮液，并在80℃水浴中在无震荡的情况下温育2小时。在冷却至室温以后，将上相（含有脂质）转移至新的螺旋帽试管中，在氮气流下蒸发至干燥。最终，将干燥粉末再悬浮于100μL庚烷中，充分混合，随后转移至放入棕色玻璃小瓶中的平底玻璃插入物中，以供TAG分析。

TAG GC-MS分析

在Hewlett Packard（HP）GC及Shimadzu Scientific Instruments Inc.MS（QP2010）上执行TAG分析。用RESTEK毛细柱MXT-65TG（65%二苯基-35%二甲基聚硅氧烷，30.0m×0.10μm厚度×0.25mm直径），以电子碰撞（EI）电离模式执行所有分析。氦用作载运气体。将所有样品以无分流模式注入1.0μl等分试样中，柱流量为1.2mL/min。气相色谱仪程序化成以15℃/min的速率从200达到370℃，并在370℃保持等温15分钟。将样品注射器口温度保持在350℃，柱炉温为200℃，压力为131.1kPa，清洗流量为3.0mL/min。质谱分析条件如下：在GC-MS操作期间，离子源温度保持在260℃，在70eV的电离电压、60μA的发射电流及350℃的界面温度，获得质谱。截获模式为，以5000的速度，每次扫描0.25秒进行扫描。始于9min且终于25min，收集具有45m/z至1090m/z的质荷比的色谱峰。

实施例8：经工程改造以在N端及C端亲水臂中含有额外半胱氨酸残基的其它油质蛋白、油体钙蛋白及油体固醇蛋白

申请人已对芝麻种子油质蛋白登录号AAD42942（即，置换预测在具有半胱氨酸的OB的表面上的带电残基）使用相同策略，以将半胱氨酸工程改造进油质蛋白、油体钙蛋白及油体固醇蛋白的N端及C端亲水臂中。在有些情况下，可能仅置换相对均匀间隔开的带负电荷的氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）。在芝麻油质蛋白AAD42942的情况下，有时必须损害电荷置换。应指出，在以下实施例中，两种油体钙蛋白（AAB71227及AAF13743）在它们的C端臂中含有两个内源性的半胱氨酸。这些物质未经工程改造。

为了确定氨基酸置换的位置，将每种蛋白与呈原始形式以及在每个亲水臂中含有1或3个半胱氨酸的形式（即，ole_0,0;ole_1,1;ole_3,1;ole_1,3;ole_3,3）的芝麻油质蛋白（AAD42942）相比对。随后用灰色框突出每个亲水臂的N端或C端中的潜在谷氨酸和天冬氨酸（通过疏水性绘图判定），相关的赖氨酸、精氨酸和谷氨酰胺残基也如此处理（它们在芝麻油质蛋白（AAD42942）中全部成功地改变）。随后考虑这些残基向半胱氨酸的突变以及它们彼此之间的间距。然后，仅用原始肽序列及经工程改造的序列展现最终置换。在此情况下，仅有3个半胱氨酸被工程改造至每个臂中，然而，该数量可能更大或更少。一种替代方案必须与分离的每种蛋白一起使用，且简单地通过用疏水性绘图鉴别亲水区起始，随后开始用最适当的带电氨基酸进行置换的过程。

下表6显示了已被申请人改良以将半胱氨酸引入亲水部分中的额外油质蛋白及油体钙蛋白

表6.

蛋白类型	植物来源	登录号	SEQ ID NO
				油质蛋白	羽衣甘蓝（花粉油质蛋白）	CAA65272.1	90
油质蛋白	玉蜀黍	NP_001147032.1	91
				油质蛋白	稻	AAL40177.1	92
油体钙蛋白	芝麻	AAF13743	93
				油体钙蛋白	大豆	AAB71227	94
油体钙蛋白	玉蜀黍	NP_001151906	95
				油体固醇蛋白	芝麻	AAL13315	96
油体固醇蛋白	甘蓝型油菜	ACG69522	97
				油体固醇蛋白	玉蜀黍	NP_001152614.1	98

下表7提及在改良油质蛋白中的SEQ ID NO

蛋白类型	植物来源	登录号	SEQ ID NO
				油质蛋白	羽衣甘蓝（花粉油质蛋白）	X96409	99
油质蛋白	玉蜀黍	NP_001147032.1	100
				油质蛋白	稻	AAL40177.1	101
油体钙蛋白	芝麻	AAF13743	102
				油体钙蛋白	大豆	AAB71227	103
油体钙蛋白	玉蜀黍	NP_001151906	104
				油体固醇蛋白	芝麻	AAL13315	105
油体固醇蛋白	甘蓝型油菜	ACG69522	106
				油体固醇蛋白	玉蜀黍	NP_001152614.1	107

可如以上实施例中所述，表达改良的序列，以生产油体、乳剂、转基因宿主细胞、植物等，并测试各自的特性。

无意将本发明的范围仅限制为上述实施例。本领域技术人员应了解，在不偏离本发明的范围的情况下，许多变化是可能的。

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序列表的总结

Claims

编码具有人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白的多核苷酸

1.一种多核苷酸，其编码包括至少一个人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述改良油质蛋白包括至少两个半胱氨酸，其中至少一个为人工引入。
3.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述改良油质蛋白各自包括：

i）至少两个人工引入的半胱氨酸，

ii）至少三个人工引入的半胱氨酸，

iii）至少四个人工引入的半胱氨酸，

iv）至少五个人工引入的半胱氨酸，

v）至少六个人工引入的半胱氨酸，

vi）至少七个人工引入的半胱氨酸，

vii）至少八个人工引入的半胱氨酸，

viii）至少九个人工引入的半胱氨酸，

ix）至少十个人工引入的半胱氨酸，

x）至少十一个人工引入的半胱氨酸，

xi）至少十二个人工引入的半胱氨酸，

xii）至少十三个人工引入的半胱氨酸，或

xiii）至少十四个人工引入的半胱氨酸。
4.根据权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述改良油质蛋白包括至少一个在N端亲水区中的半胱氨酸及至少一个在C端亲水区中的半胱氨酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述半胱氨酸基本上均匀地分布于所述油质蛋白的N端与C端亲水区之间。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包括与目的蛋白融合的所述改良油质蛋白。

构建体
7.一种遗传构建体或表达构建体，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的遗传构建体或表达构建体，其中所述多核苷酸构建体可操作地连接至启动子序列。
9.根据权利要求8所述的遗传构建体或表达构建体，其中所述启动子序列能够在植物中驱动所述多核苷酸的表达。

宿主细胞
10.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸。
11.一种宿主细胞，其被遗传修饰以表达根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，或所述多核苷酸的表达产物。
12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求7至9中任一项所述的构建体。

也表达TAG合成酶的宿主细胞
13.根据权利要求10至12中任一项所述的宿主细胞，其也被遗传修饰以表达三酰基甘油（TAG）合成酶。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其包含表达构建体，所述表达构建体包括编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸序列。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述核酸可操作地连接至启动子序列。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述与编码三酰基甘油（TAG）合成酶的核酸连接的启动子序列能够在植物中驱动所述核酸序列的表达。

宿主细胞类型
17.根据权利要求10至16中任一项所述的宿主细胞，其为选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞和植物细胞的宿主细胞。
18.根据权利要求10至16中任一项所述的宿主细胞，其为植物细胞。

植物
19.一种植物，其包含根据权利要求18所述的植物细胞。
20.根据权利要求19所述的植物，其表达由根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸编码的改良油质蛋白。
21.根据权利要求19所述的植物，其在所述植物的营养组织中表达所述改良油质蛋白。
22.根据权利要求19所述的植物，其在所述植物的种子中表达所述改良油质蛋白。
23.根据权利要求20所述的植物，其在所述植物的花粉中表达所述改良油质蛋白。

也表达TAG酶的植物
24.根据权利要求20至23中任一项所述的植物，其也被遗传修饰以表达三酰基甘油（TAG）合成酶。
25.根据权利要求24所述的植物，其中所述三酰基甘油（TAG）合成酶在与所述改良油质蛋白相同的组织中表达。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的植物，其与合适的对照植物相比，表达约0.5至约4.0倍的总脂质。

具有人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白多肽
27.一种改良油质蛋白，其由根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸编码。
28.一种改良油质蛋白，其包括至少一个人工引入的半胱氨酸。
29.根据权利要求28所述的改良油质蛋白，其包括至少两个半胱氨酸，其中至少一个为人工引入。
30.根据权利要求29所述的改良油质蛋白，其包括：

i）至少两个人工引入的半胱氨酸，

ii）至少三个人工引入的半胱氨酸，

iii）至少四个人工引入的半胱氨酸，

iv）至少五个人工引入的半胱氨酸，

v）至少六个人工引入的半胱氨酸，

vi）至少七个人工引入的半胱氨酸，

vii）至少八个人工引入的半胱氨酸，

viii）至少九个人工引入的半胱氨酸，

ix）至少十个人工引入的半胱氨酸，

x）至少十一个人工引入的半胱氨酸，

xi）至少十二个人工引入的半胱氨酸，

xii）至少十三个人工引入的半胱氨酸，或

xiii）至少十四个人工引入的半胱氨酸。
31.根据权利要求29或30所述的改良油质蛋白，其包括至少一个在N端亲水区中的半胱氨酸和至少一个在C端亲水区中的半胱氨酸。
32.根据权利要求31所述的改良油质蛋白，其中所述半胱氨酸基本上均匀地分布于所述油质蛋白的N端与C端亲水区之间。

含有包含人工引入的半胱氨酸的改良油质蛋白的融合蛋白
33.一种融合蛋白，其包含根据权利要求27至32中任一项所述的改良油质蛋白及目的蛋白。

包含改良油质蛋白的油体
34.一种油体，其包含根据权利要求27至32中任一项所述的改良油质蛋白。
35.一种油体，其包含至少两种根据权利要求27至32中任一项所述的改良油质蛋白。
36.根据权利要求35所述的油体，其中所述至少两种改良油质蛋白经由在所述改良油质蛋白的半胱氨酸残基之间的至少一个二硫桥彼此交联。
37.根据权利要求35所述的油体，其中所述改良油质蛋白不交联。
38.根据权利要求34至36中任一项所述的油体，其另外包含融合蛋白，所述融合蛋白包括与目的蛋白融合的油质蛋白。
39.根据权利要求38所述的油体，其中所述融合蛋白中的所述油质蛋白不包括人工引入的半胱氨酸。

包含具有改良油质蛋白的融合蛋白的油体
40.根据权利要求38所述的油体，其中所述融合蛋白中的所述油质蛋白包括在其油质蛋白部分中的人工引入的半胱氨酸。
41.根据权利要求40所述的油体，其包含至少两种融合蛋白，所述至少两种融合蛋白各自包括人工引入的半胱氨酸。
42.根据权利要求41所述的油体，其中所述至少两种融合蛋白经由在所述融合蛋白的所述改良油质蛋白部分中的半胱氨酸残基之间的二硫桥彼此交联。

乳剂（包含改良油质蛋白）
43.一种乳剂，其包含根据权利要求27至32中任一项所述的改良油质蛋白。

乳剂（包含油体)
44.一种乳剂，其包含根据权利要求34至42中任一项所述的油体。

组合物（包含改良油质蛋白）
45.一种组合物，其包含根据权利要求27至32中任一项所述的改良油质蛋白。

组合物（包含油体)
46.一种组合物，其包含根据权利要求34至42中任一项所述的油体。
47.根据权利要求46所述的组合物，其包含所述油体及合适的载体。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述载体经缓冲以具有适当氧化还原环境，以便达到所述改良油质蛋白的希望交联度。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的组合物，其经配制以供皮肤施用。

包含本发明的油体的植物及其部分
50.一种植物或其部分，其包含根据权利要求34至42中任一项所述的油体。
51.一种植物营养组织，其包含根据权利要求34至42中任一项所述的油体。
52.一种植物种子，其包含根据权利要求34至42中任一项所述的油体。

包含本发明的油体的动物饲料
53.一种动物饲料，其包含根据权利要求34至42中任一项所述的油体。
54.一种动物饲料，其包含根据权利要求19至26和50至52中任一项所述的植物或其部分或组织。

方法

用于生产油体的方法
55.一种用于生产油体的方法，所述方法包括下述步骤：组合

a）至少两种根据权利要求27至32中任一项所述的改良油质蛋白、三酰基甘油，和

b）磷脂。
56.根据权利要求55所述的方法，其包括通过控制所生产油体的氧化还原环境来调节所述油体中改良油质蛋白的交联度的额外步骤。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述改良油质蛋白中的至少一些为融合蛋白的一部分，其中所述融合蛋白包含改良油质蛋白及目的蛋白。

体内组合的所有组分(体内油体)
58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中在宿主细胞内组合a）、b）及c）的组分。
59.根据权利要求58所述的方法，其中在所述宿主细胞中表达所述改良油质蛋白。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中宿主细胞被遗传修饰以表达所述改良油质蛋白。

其中宿主细胞也表达TAG酶的方法
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞也被遗传修饰以表达三酰基甘油（TAG）合成酶。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞形成有机体的一部分。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述有机体为植物。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述植物积聚的脂质比合适的对照植物多约50%至约400%。

纯化体内生产的油体的额外方法步骤
65.根据权利要求58至64中任一项所述的方法，其包括从所述细胞或有机体纯化所述油体的额外步骤。

改变体内生产的经纯化油体的交联度的额外方法步骤
66.根据权利要求58至65中任一项所述的方法，其包括通过控制经纯化油体的氧化还原环境来调节所述体内生产的经纯化油体中改良油质蛋白的交联度的额外步骤。

体外组合的组分(体外/人造油体)
67.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中体外组合a）、b）及c）的组分。

改变体外/人造油体的交联度的额外方法步骤
68.根据权利要求67所述的方法，其包括通过控制在其中组合a）、b）及c）的组分的氧化还原环境来调节交联度的额外步骤。
69.根据权利要求68所述的方法，其中在所述油体形成之后通过控制容纳所述油体的氧化还原环境来调节交联度。

油体
70.一种油体，其通过根据权利要求65至69中任一项所述的方法来生产。

油生产方法
71.一种生产油的方法，所述方法包括：在有助于生产油的条件下，培养根据权利要求10至18中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求19至26中任一项所述的植物。
72.一种生产比合适的对照植物积聚更多油的植物的方法，所述方法包括：提供用根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸转化的植物，所述多核苷酸表达由所述多核苷酸编码的改良油质蛋白。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述植物也被编码TAG合成酶的多核苷酸转化，以表达所述TAG合成酶且由此合成TAG。
74.根据权利要求73所述的方法，其中通过用根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸及编码TAG合成酶的多核苷酸转化单个植物或植物细胞来生产所述植物。
75.根据权利要求72所述的方法，其中如下生产所述植物：通过使经过根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸转化的第一植物与经过编码TAG合成酶的多核苷酸转化的第二植物杂交，以生产用根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸及编码TAG合成酶的多核苷酸转化的植物。
76.根据权利要求72至75中任一项所述的方法，其中所述植物积聚的脂质比合适的对照植物多约50%至约400%。
77.根据权利要求71至76中任一项所述的方法，其中所述油为TAG。
78.根据权利要求71至77中任一项所述的方法，其中在所述植物的营养组织中生产油。
79.根据权利要求71至78中任一项所述的方法，其中所述植物被加工成动物饲料。
80.根据权利要求71至78中任一项所述的方法，其中所述植物被加工成生物燃料原料。
81.一种用于在宿主细胞中生产油体的方法，所述方法包括：

a）将至少一种根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸引入宿主细胞中；以及

b）培养所述宿主细胞，以表达所述改良油质蛋白。
82.一种用于在宿主细胞中生产油体的方法，所述方法包括：

a）将至少一种根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸及编码TAG合成酶的核酸分子引入宿主细胞中；以及

b）培养所述宿主细胞，以表达所述改良油质蛋白及所述TAG合成酶。
83.根据权利要求71、77、81或82的方法，其中所述宿主细胞被加工成油级分。
84.根据权利要求83中任一项所述的方法，其中所述油被加工成燃料、油化学品或营养油或化妆油、多不饱和脂肪酸（PUFA）或它们的组合。