CN102735653B - 一种利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法；所述检测方法包括下列步骤：1)用催化剂标记待测样品，所述催化剂对应于所要识别的目标核酸或者目标蛋白质；2)将标记的目标核酸或者目标蛋白质与SPR表面固定的探针结合；3)在SPR表面的样品池中通入对应于所述催化剂的底物，所述对应于所述催化剂的底物是能够与所述催化剂结合并产生气体的液体；4)检测经气泡放大的SPR特征参数的变化中。本发明的检测方法特异性和灵敏度高；适合进行快速检测；芯片可以重生使用。

Description

一种利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法

技术领域

本发明涉及表面等离子共振传感技术领域，具体地说，本发明涉及一种利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法。

背景技术

表面等离子共振(Surface Plasmon Resonances，SPR)传感技术是1980年代发展起来的生物化学光学传感技术。其原理是基于p偏振光在特定的波长和角度，经棱镜或光栅耦合入射到贵金属的表面，形成的倏逝波与贵金属表面的等离子振动发生共振，从而出现光波消失的现象。由于其发生表面等离子共振的条件对贵金属表面的折射率十分敏感，而生物化学作用会引起表面折射率的明显变化，因此SPR可以用于大分子免标记检测以及用于对分子间的反应动力学常数进行检测。自从1990年代SPR成功商业化以来，SPR生物传感器由于其突出的免标记、快速灵敏以及实时检测而得到一个飞速发展并得到广泛的应用。目前SPR生物传感器已经应用于蛋白质相互作用，核酸相互作用，大分子与大分子之间，小分子与大分子之间的相互作用，食品安全，农药残留，环境安全以及药物筛选，传染病快速灵敏检测等领域。

进一步地，人们在传统的SPR检测技术的基础上开发了表面等离子共振成像(Surface Plasmon Resonances Imaging，SPRI)技术，SPRI技术是将传统的SPR检测技术对于波长，角度或者相位的变化的实时监测转换为对于光的强度的实时观测，从而可以将传统只能实现对于一种或几种物质的同时检测转换为可以实现和生物芯片技术结合的高通量的检测技术。SPRI技术拥有免标记、快速和实时检测以及高通量的优点，对于蛋白质组、基因组传染病高通量检测，药物筛选，抗原决定簇谱学以及癌症研究都将有广泛的应用。

然而，目前所有SPR生物传感器，无论是角度，波长，相位还是强度检测方法，都存在的直接检测的灵敏度不足的问题。SPR直接检测方法中，反应物结合得到的信号都很小，而作为对照的没有反应物的样品产生的非特异性作用也会产生一定的明显信号，因此即使SPR分辨率达到很高也无法分辨低浓度的反应物的结合。因此目前多数的SPR检测方法都需要利用到各种信号放大方法对反应物结合的信号进行放大。

现有技术中，存在使用纳米金颗粒等纳米颗粒进行信号放大和使用酶标进行生成免疫底物的信号放大的方法。

其中，对于纳米颗粒进行信号放大方法，以纳米金颗粒为例，以利用免疫反应检测抗体的SPR技术为例进行说明。首先在发生SPR的基质上固定抗原，之后与抗体溶液孵育反应，利用纳米金颗粒标记的二抗进行检测，由于纳米金颗粒的质量和密度较大，仅仅孵育抗体引起的折射率的变化要比孵育金纳米颗粒标记的二抗的折射率的变化小约一个数量级，并且纳米金颗粒的等离子可以在一定的情况下与SPR再次共振从而增加信号的相应，进而实现信号的放大。其缺陷是放大效率仍然不足，一般情况下，其放大的效率只能达到5-20倍。并且，由于纳米颗粒孵育之后倾向于聚沉，使得芯片的重生存在缺陷。另外，上述信号放大方法中，纳米颗粒引起的非特异性信号会再次增强，因此该信号放大方法不适合复杂体系检测。

对于直接使用酶标进行生成免疫底物的信号放大方法，以利用免疫反应检测抗体的SPR技术为例进行说明。首先在发生SPR的基质上固定抗原，之后与抗体溶液孵育反应，利用酶标记的二抗进行检测，由于酶催化产生的沉淀的质量和密度较大，仅仅孵育抗体引起的折射率的变化要比孵育酶标记的二抗催化产生的沉淀折射率的变化小约一个数量级，从而实现信号的放大。但由于酶催化底物无法重生，导致SPR芯片的使用效率降低。

综上所述，现有的SPR信号放大方法存在放大效率不足、无法重生等问题，进而导致SPR生物检测的通量偏低，灵敏度偏低，且难以实时检测，因此，当前迫切需要提供一种高通量、高灵敏、能够实时检测的SPR的检测方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种以纳米颗粒或者酶等催化剂催化产生的气体作为报告分子的高通量、高灵敏、能够实时检测的SPR的检测方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法，所述表面等离子共振生物传感器包括一SPR表面和制作于所述SPR表面一侧的样品池；所述检测方法包括下列步骤：

1)用催化剂标记待测样品，所述催化剂对应于所要识别的目标核酸或者目标蛋白质；

2)将标记的目标核酸或者目标蛋白质与SPR表面固定的探针结合；

3)在SPR表面的样品池中通入对应于所述催化剂的底物，对应于所述催化剂的底物是能够与所述催化剂结合并产生气体的液体；

4)检测经气泡放大的SPR表面的SPR特征参数的变化，SPR特征参数包括但不限于SPR共振角度，波长、强度或者相位。检测SPR特征参数的变化即可对待测样品作出定性或定量的判断。例如判断出所测的目标核酸或者目标蛋白质是否存在于所述待测样品中。

其中，上述步骤1)中，催化剂标记核酸的方法包括：

1.1)通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记；

1.2)或者通过引物实现对产物核酸的标记；

1.3)或者直接对核酸实现的标记。

其中，上述步骤1.1)中通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记方法的步骤包括：

1.1.1)制备催化剂溶液；

1.1.2)将催化剂溶液与寡核苷酸混合，比例为1-100∶1，反应获得含有催化剂的寡核苷酸接头；

1.1.3)提取需要标记的DNA，通过去磷酸化去除DNA的5’端的磷酸基团，防止其自身连接；

1.1.4)在连接酶的作用下，结合催化剂标记的寡核苷酸接头，获得催化剂标记的DNA。

其中，上述步骤1.2)中通过引物实现对核酸的标记方法中，采用通过PCR反应引物实现对产物DNA的标记的方法的步骤包括：

1.2.1)制备催化剂溶液；

1.2.2)将催化剂溶液与PCR引物混合，比例为1-100∶1，反应获得含有催化剂的PCR引物；

1.2.3)利用该标记的引物进行PCR反应，获得催化剂标记的DNA。

其中，上述步骤1.2)中通过引物实现对核酸的标记方法中，采用通过RT-PCR反应引物实现对产物DNA的标记的方法的步骤包括：

1.2.1)制备催化剂溶液；

1.2.2)将催化剂溶液与RT-PCR引物混合，比例为1-100∶1，反应获得含有催化剂的RT-PCR引物；

1.2.3)利用该标记的引物进行RT-PCR反应，获得催化剂标记的DNA。

其中，上述步骤1.3)中采用直接对核酸实现标记的方法为：通过与核酸末端基团反应，从而使核酸末端修饰有氨基，羧基，含硫或者含二酰亚胺类等化合物，该类化合物可以和催化剂中的酶，或者纳米颗粒作用，从而实现对催化剂的标记。

其中，上述步骤1.3)中催化剂标记蛋白质的方法步骤为：

1.3.1)制备催化剂溶液；

1.3.2)将催化剂溶液与还原处理的蛋白质混合，比例不低于5∶1，反应获得含有催化剂的蛋白质；

其中，上述步骤2)中将标记的核酸与SPR表面固定的探针结合的方法步骤为：

2.1)对催化剂修饰的核酸进行变性处理；

2.2)将变性处理的催化剂修饰的DNA加到SPR芯片的表面，进行杂交反应；

2.3)清洗除去未杂交结合的催化剂标记的DNA；

2.4)干燥处理备用。

其中，上述步骤2)中将标记的蛋白质与SPR表面固定的探针结合的方法步骤为：

2.1)PBS处理生物芯片；

2.2)将催化剂修饰的蛋白质加到SPR芯片的表面，进行结合反应；

2.3)清洗除去未结合的催化剂标记的蛋白质；

2.4)干燥处理备用。

其中，上述步骤3)中将利用相应的催化剂的底物与标记的催化剂作用产生气体，产生的气泡用于放大SPR的光的共振角度，波长和强度的信号。其方法步骤为：

2.1)加入催化剂的底物溶液到SPR芯片的表面，进行孵育产生气泡；

2.2)对产生气泡的位置进行取样观察。

与现有技术相比，本发明具有下列技术效果：

1.本发明的特异性和灵敏度都非常的高。

2.本发明的反应速度非常的快，很适合进行快速检测。

3.本发明相对于传统的产生沉淀的方法，其芯片可以重生使用，大大提高了芯片的使用效率。

附图说明

图1示出了本发明一个实施例所使用的SPR检测系统及其测量方法示意图；

图2示出了本发明一个实施例中所测得的SPR峰偏移示意图；

图3示出了本发明另一个实施例所使用的SPRI检测系统示意图；

图4示出了本发明一个实施例所测得的抗原抗体结合曲线及信号放大曲线图；其中RU＝10^-6RIU，RIU是国际折射率单位；

图5示出了本发明另一个实施例所测得的抗原抗体结合曲线及信号放大曲线图。

具体实施方式

以下，结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

根据本发明的一个实施例，提供了一种利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法。

其中表面等离子共振生物传感器即SPR生物传感器，该传感器是SPR装置的用于测量的敏感部件。SPR装置包括基于角度检测的SPR装置，基于波长检测的SPR装置，基于强度检测的SPR装置，基于相位检测的SPR装置，同时还包括基于和微流控、自动进样系统结合的SPR装置，同时还包括基于SPR性质进行检测的其余SPR设备装置，同时还包括基于局域SPR装置，以及长程SPR装置，波导模式的SPR装置等。上述各类SPR装置中，均可称为SPR生物传感器。一般来说，SPR生物传感器包括一个用于实现SPR的SPR实现装置，在SPR表面设置样品池，用于容纳含有生物样品的液体，并且样品池具有液体入口和出口，可以持续流通液体。SPR实现装置用于引入入射光并检测反射光的信号，当满足SPR(表面等离子共振)条件时，反射光的强度急剧减小，根据这一性质，检测的反射光的变化即可获得接近SPR表面的折射率变化，用于判断生物样品中是否含有与表面的物质相互作用的分子。

下面举例说明上述SPR实现装置。图1示出了基于角度检测的Kretschmann结构的SPR实现装置(即SPR检测系统)。如图1所示，棱镜3与一侧镀有贵金属的玻璃芯片的玻璃一侧贴合；在镀有贵金属的一侧贴合一个封合的流通池，在该流通池两端开口，外接泵阀进行样品池流通液体，流体进样的区域。其中，玻璃芯片上所镀的贵金属形成SPR表面1，通过不同入射角度的p偏振光入射至棱镜3，其中部分连续角度的入射光与SPR表面1等离子耦合形成不同程度表面等离子共振，因此通过检测器5(可采用电荷耦合元件传感器)检测不同角度反射光的强度的变化，可以得到反射光角度与强度的关系，通过实时对SPR角度(反射光强度最低的角度)进行实时的读取，得到对于贴合样品池一侧的接近SPR表面1(一般小于200nm)的折射率变化。当接近SPR表面1的折射率由于各种原因随着时间发生变化时，可以得到实时的检测数据。当生物分子4与表面的物质之间发生反应时，将引起接近SPR表面1的折射率的变化，因此，可以通过检测器5的实时检测数据，反过来判断生物分子4与表面的物质是否发生反应，从而得到生物检测结果。例如有核酸结合的时候，会在SPR表面引起折射率变化，SPR共振角度由图1中细线的位置变为宽线的位置，从而实时观测到产生的结合反应和解离反应。进一步地，如果实时的对于共振角度进行信号处理，可以得到生物分子结合的动力学曲线。通过该检测系统可以实时观测SPR金属层表面由于结合和解离所引起的表面的折射率变化，进而引起的共振角度或者共振波长的变化。SPR检测系统包括两部分，其一是光路系统，其二是流体进样池。光路系统中，不同角度的入射光经过棱镜入射到镀金的基底(SPR芯片)上，在SPR芯片上发生不同情况的SPR共振，产生广角度的反射光经过棱镜入射到电荷耦合器件(CCD)等检测器上面，之后连接到电脑上进行实时的共振角度的记录和分析处理。

本实施例中，选择相应的催化剂和底物，使得当催化剂修饰的核酸或者蛋白质被表面可以与之反应的物质捕获后，所述催化剂能够催化底物并在其被捕获的位置处产生气体。此时该位置(催化剂被捕获的位置)的SPR峰会由水溶液的SPR峰变换为气体情况下的SPR峰。而空气和水溶液的折射率分别为1.0和1.33，因此在有气泡的地方(即产生气体的地方)和水溶液流经的地方产生的SPR峰是明显不同的。图1中，实线显示的空气情况下的SPR峰，虚线显示的是水溶液情况下的SPR峰。由SPR原理可知，由于空气的SPR峰与水溶液产生的SPR峰的共振角度的位置差别为常规可检测信号的三十倍以上，因此，共振角度的位置会剧烈减小，从而使得表面捕获催化剂标记的核酸或蛋白质引起的细微变化转换为产生气泡的情况可以引起极大的信号增强。

更具体地，在一个实施例中，利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法包括下列步骤1)至4)：

步骤1)用催化剂标记待测样品。

所述催化剂对应于所要识别的目标核酸或者目标蛋白质。在一个优选实施例中，所测的生物样品可以是核酸或者蛋白质。所述核酸包括DNA、RNA、cDNA和肽核酸。所述蛋白质包括各种抗原、抗体、多肽。用于标记核酸或者蛋白质的催化剂包括纳米颗粒和酶。所述纳米颗粒是直径在0.1-1000nm的具有催化性质的纳米颗粒，其实例包括金铂合金\铂壳纳米颗粒等，还包括修饰有氨基、羧基、巯基、酰基、胺基、生物素、小分子、多肽或者蛋白质的纳米颗粒。本发明可以优选100nm的金核铂壳的纳米颗粒。所述酶是可以催化底物产生气体的酶或者核酶，其实例包括过氧化氢酶等，还包括拥有过氧化氢酶活性的肽段或者突变体。本发明可以优选牛肝过氧化氢酶。需指出的是：利用酶联免疫进行检测(主要指传统基于辣根过氧化物酶以及碱性磷酸酶)是生物领域目前常规的检测方法，而利用纳米颗粒的催化活性代替酶的作用进行标记也已经报道了很多。例如在2008年Nature Nanotechnology杂志就有报道Fe₃O₄纳米颗粒拥有过氧化物酶的活性，将其与辣根过氧化物酶进行，活性相似，而纳米颗粒还具有稳定保存的优势，从而可以成为代替辣根过氧化物酶的非常好的替代品。

上述步骤1)中，催化剂标记核酸的方法包括：

1.1)通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记；

1.2)或者通过引物实现对产物核酸的标记；

1.3)或者直接对核酸实现的标记。

更进一步地，在一个优选实施例中，上述1.1)中通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记方法的步骤包括：

1.1.1)制备催化剂溶液；

1.1.2)将催化剂溶液与寡核苷酸混合，比例为1-100∶1，反应获得含有催化剂的寡核苷酸接头；

1.1.3)提取需要标记的DNA，通过去磷酸化去除DNA的5’端的磷酸基团，防止其自身连接；

1.1.4)在连接酶的作用下，结合催化剂标记的寡核苷酸接头，获得催化剂标记的DNA。

在一个优选实施例中，上述1.2)中通过引物实现对核酸的标记方法中，采用通过PCR反应引物实现对产物DNA的标记的方法的步骤包括：

1.2.1)制备催化剂溶液；

1.2.2)将催化剂溶液与PCR引物混合，比例为1-100∶1，反应获得含有催化剂的PCR引物；

1.2.3)利用该标记的引物进行PCR反应，获得催化剂标记的DNA。

在另一个优选实施例中，上述1.2)中通过引物实现对核酸的标记方法中，采用通过RT-PCR反应引物实现对产物DNA的标记的方法的步骤包括：

1.2.1)制备催化剂溶液；

1.2.2)将催化剂溶液与RT-PCR引物混合，比例为1-100∶1，反应获得含有催化剂的RT-PCR引物；

1.2.3)利用该标记的引物进行RT-PCR反应，获得催化剂标记的DNA。

在一个优选实施例中，上述1.3)中采用直接对核酸实现标记的方法为：通过与核酸末端基团反应，从而使核酸末端修饰有氨基，羧基，含硫或者含二酰亚胺类等化合物，该类化合物可以和催化剂中的酶，或者纳米颗粒作用，从而实现对催化剂的标记。

在另一个优选实施例中，上述1.3)中催化剂标记蛋白质的方法步骤为：

1.3.1)制备催化剂溶液；

1.3.2)将催化剂溶液与还原处理的蛋白质混合，比例不低于5∶1，反应获得含有催化剂的蛋白质。

本发明所使用的学术用语“寡核苷酸接头”是指由1-2000个碱基组成的一段核酸物质，包括进行了修饰有如巯基、氨基、酰基等基团的核酸物质。

本发明所用的学术用语“引物”“PCR”“RT-PCR”的定义参考：《PCR技术实验指南》，C.W，迪芬巴赫，G.S.得维克斯勒。科学出版社，1998年8月第一版。

本发明所使用的学术用语“产物核酸”是指由PCR或RT-PCR反应生成的核酸物质，如DNA，cDNA。

步骤2)将标记的目标核酸或者目标蛋白质与SPR表面镀有金属的一侧固定的探针结合。

在一个优选实施例中，表面固定探针的方法包括基于物理吸附，化学共价作用，静电吸附，氢键或者其它弱作用力或者上述作用力的任意几种的组合的固定方法。进一步地，在另一个优选实施例中，所述SPR表面包括各种金属以及合金的表面，以及镀有各种贵金属的各种玻璃及石英等无机材质的表面，还包括镀有各种贵金属的高分子诸如聚二甲基硅氧烷以及聚苯乙烯等的表面。同时还包括镀有各种贵金属的粗糙的表面，包括经过微纳处理和修饰的分子的镀有各种贵金属的表面如不同材料的镀有各种贵金属的电纺丝无纺布表面等。

在一个优选实施例中，上述步骤2)中将标记的核酸与SPR表面固定的探针结合的方法步骤为：

2.1)对催化剂修饰的核酸进行变性处理；

2.2)将变性处理的催化剂修饰的DNA加到SPR芯片的表面，进行杂交反应；

2.3)清洗除去未杂交结合的催化剂标记的DNA；

2.4)干燥处理备用。

在另一个优选实施例中，上述步骤2)中将标记的蛋白质与SPR表面固定的探针结合的方法步骤为：

2.1)PBS处理生物芯片；

2.2)将催化剂修饰的蛋白质加到SPR芯片的表面，进行结合反应；

2.3)清洗除去未结合的催化剂标记的蛋白质；

2.4)干燥处理备用。

3)在SPR表面的样品池中通入对应于所述催化剂的底物。

对应于所述催化剂的底物是能够与所述催化剂结合并产生气体的液体。

在一个优选实施例中，所述的催化剂的底物，包括包含有催化剂底物的试剂，如过氧化氢酶底物H₂O₂可以在纯水中，在磷酸盐缓冲液(PBS)，碳酸盐缓冲液等。本发明优选的是不同浓度的过氧化氢。

在一个优选实施例中，上述步骤3)中将利用相应的催化剂的底物与标记的催化剂作用产生气体，产生的气泡用于放大SPR的光的共振角度，波长和强度的信号。其方法步骤为：

3.1)加入催化剂的底物溶液到SPR芯片的表面，进行孵育产生气泡；

3.2)对产生气泡的位置进行取样观察。

4)检测经气泡放大的SPR特征参数的变化，判断出所测的目标核酸或者目标蛋白质是否存在于所述待测样品中。SPR特征参数包括但不限于SPR共振角度、波长、强度或者相位。

当待测样品中存在目标核酸或者目标蛋白质时，催化剂将催化底物并在其被捕获的位置处产生气体(即产生气泡)，导致SPR表面相应位置(催化剂被捕获的位置)处的SPR峰由水溶液的SPR峰变换为气体情况下的SPR峰，即SPR峰发生明显偏移，这样，当SPR实现装置检测到SPR峰发生明显偏移时，就可以反过来推知待测样品中存在目标核酸或者目标蛋白质。SPR实现装置可以通过SPR共振角度、波长、强度或者相位的变化来检测SPR峰的偏移，这是本领域技术人员公知的，因此更加具体的检测过程这里不再赘述。

下面，通过更加具体的四个对比实验证明本发明的利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法对目标核酸或者目标蛋白质的识别。结合下述对比实验，可以更好地理解步骤4)。

对比实验1

本实验中，通过铂金纳米颗粒修饰蛋白质进行SPR共振角度信号的放大。采用的实验装置如图1所示，其原理已在前文介绍，这里不再赘述。

本对比实验的具体步骤如下：

1.在SPR的芯片表面固定1mg/ml的人免疫球蛋白G，在参考管道固定1mg/ml的兔血清白蛋白作为参考信号。

2.将芯片固定在SPR装置上，经过程序选择人免疫球蛋白G和兔血清白蛋白所固定位置进行共振角度的观测，将表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描，如图4基线所示，其中，虚线表示兔血清白蛋白，实线表示人免疫球蛋白G。

3.制备铂金纳米颗粒溶液。

将铂金纳米颗粒溶液与还原处理的蛋白质G混合，比例为2∶1，反应获得含有铂金纳米颗粒标记的蛋白质。

4.通入铂金纳米颗粒标记的蛋白质，孵育10分钟，如图4结合曲线所示。

5.通入磷酸缓冲液进行清洗直到基线平稳，如图4解离曲线所示。

6.通入1％H₂O₂溶液，观测人免疫球蛋白G和兔血清白蛋白所在位置的共振角度的变化。由此，可以得到在兔血清白蛋白的位置基本上没有任何的共振角度的变化，但是在人免疫球蛋白G所在的位置有非常大的共振角度变化，本实验通过铂金纳米颗粒修饰蛋白质进行SPRI信号的放大。

对比实验2

本实验也是通过铂金纳米颗粒修饰蛋白质进行SPR共振波长信号的放大。其原理与对比实验1一致，这里不再赘述。

本实验的具体步骤如下：

1.在SPR的芯片表面固定1mg/ml的人免疫球蛋白G，在参考管道固定1mg/ml的兔血清白蛋白作为参考信号。

2.将芯片固定在SPR装置上，经过程序选择人免疫球蛋白G和兔血清白蛋白所固定位置进行共振波长的观测，将表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描，如图4基线所示，其中，虚线表示兔血清白蛋白，实线表示人免疫球蛋白G。

3.制备铂金纳米颗粒溶液；

将铂金纳米颗粒溶液与还原处理的蛋白质G混合，比例为2∶1，反应获得含有铂金纳米颗粒标记的蛋白质；

4.通入铂金纳米颗粒标记的蛋白质，孵育10分钟，图4中示出了结合曲线。

5.通入磷酸缓冲液进行清洗直到基线平稳，如图4解离曲线所示。

6.通入1％H₂O₂溶液，观测人免疫球蛋白G和兔血清白蛋白所在位置的共振角度的变化。由此，可以得到在兔血清白蛋白的位置基本上没有任何的共振波长的变化，但是在人免疫球蛋白G所在的位置有非常大的共振波长变化，本实验通过铂金纳米颗粒修饰蛋白质进行SPRI信号的放大。

对比实验3

本实验通过铂金纳米颗粒修饰核酸进行SPRI信号的放大。其原理如下：

SPRI装置如图3所示，通过该装置可以观测到的金片表面由于折射率变化引起的光的强度的变化。SPRI装置包括光路部分和流体进样池37。

光路部分将发光二极管(LED)光源或者激光器作为原始光源31，原始光源31提供的光束经过准直透镜32和滤光片33产生单色光，经过棱镜34入射到镀金的基底(SPR芯片36)上，在SPR芯片36上不同位置发生不同情况的SPR共振，产生不同强度的反射光经过棱镜入射到电荷耦合器件35(CCD)上面，之后连接到电脑上进行强度图像的记录和处理。

如图2所示，空气和水溶液的折射率分别为1.0和1.33，因此在有气泡的地方和水溶液流经的地方产生的SPR峰是明显不同的。实线显示的空气情况下的SPR峰，虚线显示的是水溶液情况下的SPR峰。由SPRI原理可知，在检测表面折射变化时，选取竖直虚线所显示入射角度位置进行强度变化的观测。正常情况下由于SPRI装置是用来观测水溶液在金片表面引起的折射率变化的，所以选择的观测位置是图示水平虚线和竖直虚线交汇的地方。当由于催化剂修饰的核酸或者蛋白质被表面可以与之反应的物质捕获后，会催化底物产生气体，该气体在被捕获的位置产生，因此，此时该位置的SPR峰由水溶液的变换为气体情况下的SPR峰，而由于观测的位置是不变的，因此此时的反射光的强度值变换为接近100％，由此，表面捕获催化剂标记的核酸或蛋白质引起的细微变化转换为产生气泡的情况可以引起极大的信号增强。

本实验的具体步骤如下：

1.在SPRI的芯片表面固定1μM 40个碱基的DNA序列-1和序列-2，序列-1和序列-2是不相同且没有匹配关系的序列。

2.将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择DNA序列-1和序列-2所固定位置进行强度的观测，将表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描，如图5基线所示。

3.制备铂金纳米颗粒溶液；

将其与DNA序列-1的互补序列的PCR引物混合，比例为1∶1，反应获得含有铂金纳米颗粒的PCR引物；

利用该标记的引物进行PCR反应，获得铂金纳米颗粒标记的DNA序列-1的互补序列。

4.通入铂金修饰的DNA序列-1的互补序列，孵育10分钟，如图5结合曲线所示。

5.通入磷酸缓冲液进行清洗直到基线平稳，如图5解离曲线所示。

6.通入1％H₂O₂溶液，观测序列-1和序列-2所在位置的强度的变化。可以得到在序列-2的位置基本上没有任何的强度的变化，但是在序列-1所在的位置有非常大的强度变化，由此，本实验通过铂金纳米颗粒修饰核酸进行SPRI信号的放大。图5中，虚线表示序列-2，实线表示序列-1。

对比实验4

本实验通过过氧化氢酶修饰蛋白质进行SPRI信号的放大。其原理与对比实验3一致，这里不再赘述。

本实验的具体步骤如下：

1.在SPRI的芯片表面固定1mg/ml的人免疫球蛋白G，以1mg/ml的兔血清白蛋白作为参考信号。

2.将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择人免疫球蛋白G和兔血清白蛋白所固定位置进行强度的观测，将表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描，如图5基线所示。

3.制备10mg/ml过氧化氢酶溶液；

将10mg/ml过氧化氢酶溶液与还原处理的蛋白质G混合，比例为2∶1，反应获得含有过氧化氢酶标记的蛋白质；

4.通入过氧化氢酶标记的蛋白质，孵育10分钟，如图5结合曲线所示。

5.通入磷酸缓冲液进行清洗直到基线平稳，如图5解离曲线所示。

6.通入1％H₂O₂溶液，观测人免疫球蛋白G和兔血清白蛋白所在位置的强度的变化。可以得到在兔血清白蛋白的位置基本上没有任何的强度的变化，但是在人免疫球蛋白G所在的位置有非常大的强度变化，由此，本实验通过过氧化氢酶修饰蛋白质进行SPRI信号的放大。图5中，虚线表示兔血清白蛋白，实线表示人免疫球蛋白G。

上述实施例仅仅是对本发明示例性的说明，本领域技术人员易于理解，产生气泡的方式除了可以用于放大SPR的光的共振角度、波长和强度信号外，还可以用于放大SPR的光的共振相位的信号。

本发明中，通过催化剂产生气泡进行的SPR的信号放大方法，可是使得SPR生物检测方法不仅拥有了免标记和实时测试的优点，还具有了高灵敏化，特异性好，快速检测有点。可以应用于传染病的快速和准确检测，还可以进行蛋白质-蛋白质相互作用的高通量筛选，药物和大分子的相互作用等领域。由于该方法实现的条件简单，以及产生的气泡的灵敏度极高，因此也很适合普通实验室和野外的快速测试使用。将会产生较好的经济和社会效益。

最后，上述的实施例仅用来说明本发明，它不应该理解为是对本发明的保护范围进行任何限制。而且，本领域的技术人员可以明白，在不脱离上述实施例精神和原理下，对上述实施例所进行的各种等效变化、变型以及在文中没有描述的各种改进均在本专利的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法，包括下列步骤：

1）用催化剂标记待测样品，所述催化剂对应于所要识别的目标核酸或者目标蛋白质；

2）将用所属催化剂标记的待测样品与SPR表面固定的探针结合；

3）在SPR表面的样品池中通入对应于所述催化剂的底物，所述对应于所述催化剂的底物是能够与所述催化剂结合并产生气体的液体；

4）检测经气泡放大的所述SPR表面的SPR特征参数的变化。

2.根据权利要求1所述的生物检测方法，其特征在于，上述步骤1）中，所述待测样品为核酸，催化剂标记核酸的方法包括：

1.1）通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记；

1.2）或者通过引物实现对产物核酸的标记；

1.3）或者直接对核酸实现的标记。

3.根据权利要求2所述的生物检测方法，其特征在于，上述步骤1.1）中通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记方法的步骤包括：

1.1.1）制备催化剂溶液；

1.1.2）将催化剂溶液与寡核苷酸混合，比例为1-100：1，反应获得含有催化剂的寡核苷酸接头；

1.1.3）提取需要标记的DNA，通过去磷酸化去除DNA的5’端的磷酸基团，防止其自身连接；

1.1.4）在连接酶的作用下，结合催化剂标记的寡核苷酸接头，获得催化剂标记的DNA。

4.根据权利要求2所述的生物检测方法，其特征在于，上述步骤1.2）中通过引物实现对核酸的标记方法中，采用通过PCR反应引物实现对产物DNA的标记的方法的步骤包括：

1.2.1）制备催化剂溶液；

1.2.2）将催化剂溶液与PCR引物混合，比例为1-100：1，反应获得含有催化剂的PCR引物；

1.2.3）利用该标记的引物进行PCR反应，获得催化剂标记的DNA。

5.根据权利要求2所述的生物检测方法，其特征在于，上述步骤1.2）中通过引物实现对核酸的标记方法中，采用通过RT-PCR反应引物实现对产物DNA的标记的方法的步骤包括：

1.2.1）制备催化剂溶液；

1.2.2）将催化剂溶液与RT-PCR引物混合，比例为1-100：1，反应获得含有催化剂的RT-PCR引物；

1.2.3）利用该标记的引物进行RT-PCR反应，获得催化剂标记的DNA。

6.根据权利要求2所述的生物检测方法，其特征在于，上述步骤1.3）中采用直接对核酸实现标记的方法为：通过与核酸末端基团反应，从而使核酸末端修饰有氨基，羧基，含硫或者含二酰亚胺类等化合物，该类化合物可以和催化剂中的酶，或者纳米颗粒作用，从而实现对催化剂的标记。

7.根据权利要求2所述的生物检测方法，其特征在于，上述步骤2）中将标记的核酸与SPR表面固定的探针结合的方法步骤为：

2.1）对催化剂修饰的核酸进行变性处理；

2.2）将变性处理的催化剂修饰的DNA加到SPR芯片的表面，进行杂交反应；

2.3）清洗除去未杂交结合的催化剂标记的DNA；

2.4）干燥处理备用。

8.根据权利要求2所述的生物检测方法，其特征在于，上述步骤1.3）中,所述待测样品为蛋白质，催化剂标记蛋白质的方法步骤为：

1.3.1）制备催化剂溶液；

1.3.2）将催化剂溶液与还原处理的蛋白质以不低于5：1的比例混合，反应获得含有催化剂的蛋白质。

9.根据权利要求8所述的生物检测方法，其特征在于，上述步骤2）中将标记的蛋白质与SPR表面固定的探针结合的方法步骤为：

2.1）PBS处理生物芯片；

2.2）将催化剂修饰的蛋白质加到SPR芯片的表面，进行结合反应；

2.3）清洗除去未结合的催化剂标记的蛋白质；

2.4）干燥处理备用。