CN102732641A - 筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片及其应用。本发明提供了鉴定或辅助鉴定桃潜隐花叶类病毒属类病毒的探针，由9条探针组成，所述9条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。还提供了筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明采用生物信息学方法对桃潜隐花叶类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片可用于桃潜隐花叶类病毒属类病毒的检疫鉴定。

Description

筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片及其应用

技术领域

本发明涉及生物信息学及生物检疫鉴定技术领域，尤其涉及筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片及其应用。

背景技术

桃潜隐花叶类病毒属类病毒（Pelamoviroid）属于鳄梨日斑类病毒科（Avsunviroidae），根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy ofViruses,ICTV）第八次分类报告，该属包括桃潜隐花叶类病毒（Peach latent mosaic viroid,PLMVd）和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid,CChMVd)。桃潜隐花叶类病毒分布于南北美洲、澳大利亚、奥地利、中国、克罗地亚、法国、希腊、日本、摩洛哥、罗马尼亚、塞尔维亚、西班牙及突尼斯等国家，在许多国家被确定为果树上最危险的系统侵染性病原之一，主要侵染桃、李、杏等核果类果树。侵染桃树一般表现为花叶，延迟发芽，严重时引起早衰、甚至死亡，造成严重的经济损失。该类病毒可经嫁接和桃蚜传染，随无性繁殖材料远距离传播，在桃树无性繁育和种苗调运过程中，很容易导致该病毒的扩散蔓延。菊花褪绿斑驳类病毒主要分布在丹麦、法国、印度、日本、韩国及中国，侵染菊花等使受害植株叶片呈现斑驳状，后完全褪绿；生长迟缓矮化。

随着我国对外交流的扩大，国际及国内种质交换日益频繁，加强检疫检验，对阻断该属类病毒(尤其是强毒株系)的传播将起到重要的作用。建立有效的筛查技术是提高类病毒检疫检验效果的关键，但目前国际上用于该属类病毒检测的方法主要有木本指示植物生物学鉴定、RT-PCR、LAMP和核酸分子杂交技术，这些技术只能对该属已知类病毒进行特异性检测，对于未知及新发的类病毒监测无能为力，所以容易造成危险性类病毒漏检并传播扩散，进而导致巨大的经济损失和不良的社会影响。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定桃潜隐花叶类病毒属类病毒的探针组。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定桃潜隐花叶类病毒属类病毒的探针组，由探针1-探针9共9条探针组成，所述探针1-探针9的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。

上述探针中，所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒。

本发明的另一个目的是提供一种筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的基因芯片。

本发明提供的筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针组固定在片基表面得到的基因芯片。

在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本发明的实施例中采用的是博奥生物有限公司微阵列基片,产品目录号:420022。

在上述基因芯片中，所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒。

本发明的第三个目的是提供一种筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。

上述试剂盒还包括用于扩增所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒cDNA的引物对，所述引物对具体为引物对1或引物对2；

所述引物对1由序列表中序列10和序列表中序列11所示的DNA分子组成（用于扩增桃潜隐花叶类病毒）；

所述引物对2由序列表中序列12和序列表中序列13所示的DNA分子组成（用于扩增菊花褪绿斑驳类病毒）；

所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒。

上述探针组、上述基因芯片或上述试剂盒在如下1）-4）中的应用，也是本发明保护的范围：

1）鉴定或辅助鉴定桃潜隐花叶类病毒属类病毒；

2）制备鉴定或辅助鉴定桃潜隐花叶类病毒属类病毒产品；

3）鉴定或辅助鉴定待测植物感染桃潜隐花叶类病毒属类病毒；

4）制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染桃潜隐花叶类病毒属类病毒产品。

上述应用中，所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒具体为桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒；所述待测植物为桃或菊花。

本发明的第四个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测植物感染桃潜隐花叶类病毒属类病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；

2）将步骤1）得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；

3）将步骤2）得到的杂交后芯片扫描，

若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于3.0，则待测植物感染或候选感染桃潜隐花叶类病毒属类病毒。

上述方法中，步骤1）中，所述标记为以所述cDNA为模板，以上述的试剂盒中的所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物；

步骤2）中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h；

在所述步骤2）后和步骤3）前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；所述至少一条所述探针为上述探针组中的任意一条；

所述组织为叶片；

所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒、所述引物对和所述待测植物如下1）或2）：

1）所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为桃潜隐花叶类病毒，所述引物对为所述引物对1；所述待测植物为桃；

2）所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为菊花褪绿斑驳类病毒，所述引物对为所述引物对2；所述待测植物为菊花。

本发明的实验证明，本发明提供的筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒芯片中的探针具有桃潜隐花叶类病毒属类病毒属水平上的高兼容性和属内的特异性，所需的样品量少，一般仅需0.1g。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对桃潜隐花叶类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该属的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的属芯片可用于桃潜隐花叶类病毒属类病毒的检疫鉴定。

附图说明

图1为桃潜隐花叶类病毒属类病毒筛查芯片探针点阵示意图（10×12）

图2为应用菊花褪绿斑驳类病毒样品验证桃潜隐花叶类病毒属类病毒筛查芯片的结果

图3为筛查芯片灵敏度检测结果

图4为PCR灵敏度检测结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片的制备

1、属级高兼容性寡核苷酸探针的设计

从美国国立生物技术信息中心（NCBI）及国际病毒学分类委员会(ICTV)数据库下载类病毒属全基因组及核酸序列；去除90%以上长度与其它序列有95%相似度的核酸序列；以5个碱基作为间隔，连续提取所有40mer的核酸序列；以40%≤GC含量≤60%、单个碱基含量≤50%、连续重复碱基数目≤4，且无大于6个碱基的发卡结构为标准对核酸序列进行筛选，并在NCBI数据库中进行同源性比较以保证所获得探针的特异性。

根据上述原则设计了桃潜隐花叶类病毒属类病毒的9条探针（探针1-探针9），其核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1-9所示。

可以人工合成上述9条探针。

2、芯片的制备

将上述1得到的9条探针分别用点样缓冲液（博奥生物有限公司

芯片点样液,产品目录号:440010）溶解，浓度为50μM，每条探针横向重复3点点在醛基化玻璃片基芯片（博奥生物有限公司

微阵列基片,产品目录号:420022）上，每点约0.25nL，点直径约180μm，点间距为300μm，点样均匀度的标准方差为15％。将芯片点有探针的一面在65℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离为3cm，在空气中室温自然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42℃预热，0.5％SDS清洗10min。将芯片转移到42℃预热蒸馏水中清洗2min。把芯片放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心1min，以去除芯片表面的液体，获得筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片。

筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片如图1所示，图1中1-9为桃潜隐花叶类病毒属类病毒筛查芯片探针1-9（对应序列1-9），Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控。

实施例2、筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的芯片的应用

一、筛查芯片检测样品

1、用于检测的样品总RNA提取

1）取感染桃潜隐花叶类病毒的桃树叶片（桃潜隐花叶类病毒拉丁名Peach latentmosaic viroid，记载在：桃潜隐花叶类病毒中国分离株P3的克隆与序列分析.2005,植物病理学报35(4):300-304.，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。）和菊花褪绿斑驳类病毒的菊花叶片（菊花褪绿斑驳类病毒Chrysanthemum chlorotic mottle viroid.购自American type culture collection简称ATCC,PV-120）各0.1g样品，加入1mL研磨缓冲液[Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g、KH₂PO₄0.27g、NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂SO₃ 1.3g、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)MW 24-40 000 20g、NaN₃ 0.2g、鸡卵蛋白(pow dered egg albumin)2.0g、Tween-20 20.0mL，溶于1000mL去离子水，调节pH值为7.5]，研磨均匀后移入1.5mL离心管中，6000r/min离心5min，取上清；

2）在PCR管中用去离子水清洗纳米磁珠2次，弃去离子水后加入100μL的上清，混匀后置于室温下结合10min，其间颠倒混匀样品数次。磁铁吸附纳米磁珠后弃上清,加入200μL PBS[NaCl 8.0g、Na₂HPO₄、1.15g、KH₂PO₄ 0.2g、KCl 0.2g，加入900mL蒸馏水溶解，调节pH值到7.4，加蒸馏水定容至1L]清洗纳米磁珠；

3）清洗后，加入50μL ddH₂O重新悬浮纳米磁珠，95℃处理5min；磁铁吸附纳米磁珠后吸取上清液即为RNA，-20℃保存备用。

2、样品标记与杂交

将上述得到的RNA反转录得到cDNA。

PCR扩增，即在0.2mL的反应管中加入cDNA产物2μL、上游引物0.5μL（终浓度为0.5mmol/L）、下游引物0.5μL（终浓度为0.5mmoL/L）、dNTP Mix（10mmol/L）0.5μL、Taq酶（5U/μL）0.5μL、PCR缓冲液（10×）2μL及DEPC-H₂O 14μL，然后按照PCR反应程序进行扩增。

上下游引物由分别用于扩增桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒的引物对组成。

上述用于扩增桃潜隐花叶类病毒的引物对包括

上游引物：5’-CCAGGTAACGCCGTAGAAACTG-3’（序列10）；

下游引物：5’-ATCACACCCTCCTCGGAACCAA-3’（序列11）；

其PCR反应程序为：95℃ 3min;94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 30s;30循环;72℃10min。

上述用于扩增菊花褪绿斑驳类病毒的引物对包括

上游引物：5’-GGCACCTGATGTCGGTGT-3’（序列12）；

下游引物：5’-GACCTCTTGGGGGTTTCAAAC-3’（序列13）；

其PCR反应程序为：94℃ 5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s;30循环;72℃8min。

Klenow酶标记体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入PCR产物5μL，9N随机引物（invitrogen，Cat.No.48190-011）（100μmol/L）2μL及H₂O 12μL，95℃变性3min，冰浴5min。然后向反应管中加入10×Klenow酶缓冲液2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，cy3-dCTP 0.5μL（Amersham,Cat.No.PA 53021终浓度为5nmol/L），klenow酶（5U/μL）1μL。37℃反应1.5h，70℃变性5min，冰浴5min，得到标记样品。

杂交：体系为16μL，包括2.4μL SSC（终浓度3×）、0.32μL SDS（终浓度0.2％）、4μL甲酰胺（终浓度25%）、1.6μL Denhardt’s（Ameresco，Cat.No.E717，终浓度5×）和标记样品7.68μL。95℃变性3min，冰浴5min，瞬时离心。将杂交液加到芯片上，盖玻片盖好，42℃水浴杂交过夜（12h），分别得到杂交后的芯片（桃潜隐花叶类病毒）和杂交后的芯片（菊花褪绿斑驳类病毒）。

3、洗涤、扫描

清洗体系及程序如下：

先将洗液I、II放在微波炉中预热到42℃，转移到清洗盒中。杂交结束后，将杂交后的芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片清洗后，放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心1min，除去芯片表面的液体，分别得到待检测芯片（桃潜隐花叶类病毒）、待检测芯片（菊花褪绿斑驳类病毒）。

将上述待检测芯片（桃潜隐花叶类病毒）、待检测芯片（菊花褪绿斑驳类病毒）置于扫描仪中进行扫描分析；PMT设为900，获得各点荧光强度及背景强度等数据。

使用博奥生物公司LuxScan 3.0芯片扫描仪从芯片中提取数据，探针的信号值为探针前景值的中位值减去背景值的中位值。信噪比为图像对应点内所有信号值中位值与背景值中位值的比值。

若至少一条所述探针的信号值≥600且信噪比≥3，判为阳性（为桃潜隐花叶类病毒属类病毒感染）；探针的信号值＜600且信噪比＜2，判为阴性（不为桃潜隐花叶类病毒属类病毒感染）；其余情况判为可疑，需重复验证。

图2的探针排列与图1相同，阳性探针为1-9。

菊花褪绿斑驳类病毒的验证结果如图2所示，探针7、8、9所在位置的信号值分别为1992、20970、18483，均大于600；信噪比分别为6、52、48，均大于3，说明本发明可以检测桃潜隐花叶类病毒属类病毒的菊花褪绿斑驳类病毒；

上述芯片的固定阳性质控、杂交阳性质控及杂交阴性质控表现良好，标准样品杂交信号强，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。

二、筛查芯片与PCR检测灵敏度比较

准确称取0.1g感染桃潜隐花叶类病毒的桃树组织，提取总RNA，分别用于桃潜隐花叶类病毒属类病毒筛查芯片检测和PCR检测，两者所用的RNA均进行10¹和10²倍梯度稀释。

芯片检测的方法同上述的一，结果如图3所示，图3的探针排列与图1相同，其中A：10¹稀释；B：10²稀释。A中探针1、2所在位置的信号值分别为3913、1004，均大于600；信噪比均分别为8、3，均≥3；所以探针1、2判为阳性。B中探针1所在位置的信号值为1531，大于600；信噪比为4；可以判定探针1为阳性。因此，桃潜隐花叶类病毒属类病毒筛查芯片可检测到待检对象的最高稀释倍数为10²。

PCR检测的引物为

上游引物：5’-CCAGGTAACGCCGTAGAAACTG-3’；

下游引物：5’-ATCACACCCTCCTCGGAACCAA-3’。

PCR检测的结果如图4所示，1：10¹稀释；2：10²稀释；3：空白对照；M：MarkerDL2000，可以看出，10¹和10²稀释模板均得到337bp的产物（Genbank号GU290549的第1-337位核苷酸），可检测到待检对象10²稀释倍数。

因此，桃潜隐花叶类病毒属类病毒筛查芯片灵敏度与PCR方法灵敏度相当。

Claims (10)

1.一种鉴定或辅助鉴定桃潜隐花叶类病毒属类病毒的探针组，由探针1-探针9共9条探针组成，所述探针1-探针9的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。

2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于：所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒。

3.一种筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的基因芯片，为将权利要求1或2所述的探针组固定在片基表面得到的基因芯片。

4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于：所述片基为醛基化玻璃片基；所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒。

5.一种筛查桃潜隐花叶类病毒属类病毒的试剂盒，包括权利要求3或4所述的基因芯片。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒cDNA的引物对，所述引物对具体为引物对1或引物对2；所述引物对1由序列表中序列10和序列表中序列11所示的DNA分子组成；

所述引物对2由序列表中序列12和序列表中序列13所示的DNA分子组成；

所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒。

7.权利要求1或2所述探针组、权利要求3或4所述的基因芯片、权利要求5或6所述的试剂盒

在如下1）-4）中的应用，也是本发明保护的范围：

1）鉴定或辅助鉴定桃潜隐花叶类病毒属类病毒；

2）制备鉴定或辅助鉴定桃潜隐花叶类病毒属类病毒产品；

3）鉴定或辅助鉴定待测植物感染桃潜隐花叶类病毒属类病毒；

4）制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染桃潜隐花叶类病毒属类病毒产品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒具体为桃潜隐花叶类病毒或菊花褪绿斑驳类病毒；所述待测植物为桃或菊花。

9.一种筛查或辅助筛查待测植物感染桃潜隐花叶类病毒属类病毒的方法，包括如下步骤：

1）将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；

2）将步骤1）得到的标记后产物与权利要求3或4所述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；

3）将步骤2）得到的杂交后芯片扫描，

若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于3.0，则待测植物感染或候选感染桃潜隐花叶类病毒属类病毒。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述标记为以所述cDNA为模板，以权利要求6所述的试剂盒中的所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物；

步骤2）中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h；

在所述步骤2）后和步骤3）前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；

所述至少一条所述探针为上述探针组中的任意一条；

所述组织为叶片；

所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒、所述引物对和所述待测植物如下1）或2）：

1）所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为桃潜隐花叶类病毒，所述引物对为所述引物对1；所述待测植物为桃；

2）所述桃潜隐花叶类病毒属类病毒为菊花褪绿斑驳类病毒，所述引物对为所述引物对2；所述待测植物为菊花。

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