CN102732512B - 一种寡核苷酸标签及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种寡核苷酸标签。本发明的寡核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。实验证明，本发明得到的寡核苷酸标签与人基因组的相似性明显低于对照，因此本发明标签在基因芯片中的探针臂、多种高通量检测技术的接头、多种多重检测技术的“条码”(barcode)等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种寡核苷酸标签及其应用

技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸标签及其应用。

背景技术

与已知生物基因组序列无相似性(同源性)的寡核苷酸标签(oligonucleotidetag)在现代分子生物学应用中扮演越来越重要的作用。例如，在RNA模板特异性PCR扩增(RS-PCR)中，就是在反转录中使用了一种5’端带有一段寡核苷酸标签的反转录引物，在完成反转录反应后，以这段寡核苷酸标签为引物进行PCR扩增，就可以只扩增RNA的反转录产物，而不会扩增污染的基因组DNA，实现RNA模板的特异性PCR扩增，避免了假阳性的出现。其中，所使用的寡核苷酸标签必须与该生物基因组没有显著的序列相似性。

在单核苷酸多态性分型(SNP genotyping)研究中，也经常使用一种“tag-antitag”系统。即，在核酸扩增中将每种可能的SNP类型和一种特定的寡核苷酸标签相连接，这种带有寡核苷酸标签的SNP序列将会和DNA微阵列或微球上的tag互补序列(antitag)相结合，从而判别出是否存在某种类型的SNP。

与生物基因组无显著相似性的寡核苷酸标签还被广泛应用于基因芯片中的探针臂和多种高通量检测技术的接头、多种多重检测技术的“条码”(barcode)等等，这些现代高通量检测技术的检测效果高度依赖于所用寡核苷酸标签的质量，其中衡量寡核苷酸标签质量的最重要的指标就是该标签与生物基因组的相似性是否足够低，如果相似性不够低，就会出现交叉杂交、非特异性扩增等问题，严重干扰这些检测技术的准确性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与人基因组相似性低的寡核苷酸。

本发明所提供的寡核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述寡核苷酸在以RNA为模板进行PCR扩增中的应用也属于本发明的保护范围。

上述寡核苷酸在检测寡核苷酸多态性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述寡核苷酸在作为基因芯片中的探针臂中的应用也属于本发明的保护范围。

上述寡核苷酸在作为高通量检测技术的接头中的应用也属于本发明的保护范围。

上述寡核苷酸在作为多重检测技术的条码中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明得到的寡核苷酸标签与人基因组的相似性明显低于对照，因此本发明标签在基因芯片中的探针臂、多种高通量检测技术的接头、多种多重检测技术的“条码”(barcode)等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为PCR扩增结果。

图2为杂交结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、寡核苷酸的制备及验证

通过生物信息学方法得到了一种与人基因组和微生物基因组无显著相似性的寡核苷酸标签，并进行了实验验证，证明了本发明的寡核苷酸标签与人基因组的相似性比目前广泛使用的寡核苷酸标签更低，是高质量的寡核苷酸标签序列。

一、制备

人工合成本发明的寡核苷酸标签tag2，对照寡核苷酸标签tag2003，以及GADPH引物的序列具体如下：

表1

二、验证I

klenow酶(Takara公司)，hotstar taq(Qiagen公司)，DNA纯化试剂盒(MN公司)，dNTP mix(10mM)(Takara公司)、dNTP mix(2.5mM)(Takara公司)。

以目前被广泛采用的一个寡核苷酸标签(tag2003)为对照。

在5’端加标签序列的9N随机引物(记作tag-9N)。随机引物的序列就是NNNNNNNNN。

1、方法

步骤1：以人基因组DNA为模板，合成5’端带有tag序列的DNA

人基因组DNA为人白细胞的基因组DNA。

取1微克人基因组DNA，加入1微升浓度为100mM的tag-9N，灭菌去离子水补齐至19微升。95℃变性3分钟后冰浴3分钟。加入以下组分：10×klenow buffer2.5微升，DNTPmix(2.5mM)2.5微升，klenow酶1微升；混匀后进行反应：37℃90分钟，70℃10分钟。

所得产物以DNA纯化试剂盒进行过柱纯化，以去除溶液中残留的tag-9N和盐分等杂质。

步骤2：以tag为引物，进行PCR扩增并电泳检测

以上述反应中得到5’端带tag的DNA为模板，以对应的tag为引物进行PCR反应。

PCR体系如下：

反应程序：94℃变性30秒；退火30秒(退火温度为tagTM值-5℃)；72℃延伸60秒。

每个tag分别做20、25、30、35、40个循环的PCR反应，产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

2、结果与分析

实验结果如图1所示。该图显示了以tag为引物，分别进行了20、25、30、35、40个循环的扩增后，扩增产物的情况。图中M为DL2000 marker。

从上图可以看出，本发明所涉及的tag在40个循环内都没有形成扩增产物，而目前被广泛采用的tag2003在35个循环就开始出现扩增产物。这表明，本发明所涉及的tag与人基因组的相似性要显著低于目前被广泛采用的tag2003。并且，本发明所涉及的tag2的扩增产物中没有引物二聚体，表明tag2是一种非常优秀的tag序列，它既与人基因组的相似性非常低，又非常适合用作PCR反应的产物，可以适用于所有基于寡核苷酸标签的技术应用。

三、验证II

(一)原料

1、人工合成的5’端标记有荧光素TAMRA的待测寡核苷酸标签，其中包括本发明新设计的tag2，已知相似性高的标签为人GADPH基因引物；已知相似性低的标签为目前被广泛使用的tag2003。

2、点有人基因组DNA的基因芯片(博奥生物有限公司定制)。

3、杂交缓冲液(购自博奥生物有限公司)

(二)方法

取人工合成的5’端标记有荧光素TAMRA的待测寡核苷酸标签1nmol，加水稀释到7.5微升，再加入7.5微升的杂交缓冲液，95℃热变性3分钟(在PCR仪中)，冰浴骤冷1min，加入到基因芯片中杂交。

(三)结果及分析

基因芯片杂交结果如图2所示。从图2可看出，GADPH引物、tag2003这两种寡核苷酸杂交后有信号，GADPH引物杂交后有显著信号，tag2003杂交后有微弱信号。本发明新设计的寡核苷酸tag2杂交后无信号。表明本发明新设计的寡核苷酸tag2和人基因组没有相似性，并且优于目前被广泛采用的寡核苷酸标签tag2003，核酸杂交实验结果和基于PCR的检测结果相符。

四、序列比对

利用NCBI的megablast程序(http://blast.nebi.nlm.nih.gov/)，将表1中的各个Tag序列与NCBI中的人基因组数据库进行比对，以统计各个Tag序列与人基因组的相似性，其匹配结果如下：

表2、与人基因组blast结果

上述比对结果是基于数学运算的相似性判断结果，只能作为参考，真正的序列相似情况及其在生物学中的应用潜力还需要如上述实验这样进行实验验证。

Claims (6)

1.一种与人基因组无显著相似性的寡核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的寡核苷酸在以RNA为模板进行PCR扩增中的应用。

3.权利要求1所述的寡核苷酸在检测寡核苷酸多态性中的应用。

4.权利要求1所述的寡核苷酸在作为基因芯片中的探针臂中的应用。

5.权利要求1所述的寡核苷酸在作为高通量检测技术的接头中的应用。

6.权利要求1所述的寡核苷酸在作为多重检测技术的条码中的应用。

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