CN102716157A

CN102716157A - 白花檵木总酚类提取物及其制备与应用

Info

Publication number: CN102716157A
Application number: CN2012102320467A
Authority: CN
Inventors: 冯育林; 杨世林; 张武岗; 简晖; 罗晓健; 陈兰英; 饶毅; 范玫玫
Original assignee: Jiangxi Bencao Tiangong Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangxi Bencao Tiangong Technology Co Ltd
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2012-10-10

Abstract

本发明涉及一种白花檵木总酚类为主的提取物及其制备方法与应用，白花檵木药材经8倍(药材/溶媒:g/L)60%乙醇回流提取，每次2h，共3次；提取液合并浓缩去醇后，上大孔吸附树脂，依次用水-乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为50~70%之间的洗脱液，合并，真空干燥即得本发明的提取物，其总酚类提取物的UV含量可达50%以上，主要含有没食子酸、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚等成分。药理实验显示其具有明显的止血等作用。

Description

白花檵木总酚类提取物及其制备与应用

技术领域

本发明属于中药领域，涉及白花檵木总酚类提取物制备工艺及其在开发止血新型药物中的应用。

背景技术

白花檵木Loropetalum chinense ( R. Brown) Oliv.为金缕梅科檵木属植物，始载于《植物名实图考》，具有“收敛止血、涩肠止泻、生肌、消炎、镇痛”之功效，应用于治疗创伤出血。在《福建民间草药》中也有记载，檵木叶具有“舒筋活血，解热止泻。治肚痛，闪筋，水泻，胼胝，外伤出血”。早在七十年代就有文献报道，檵木叶水浸出液具有抑菌、收缩血管、促进血液凝固等药理作用。药理实验表明白花檵木对小鼠有较强的止血作用，能明显的促进受损上皮组织的修复，对创面有较强的收敛作用。目前临床上多用于治疗外伤出血、产后宫缩不良与出血、各种类型子宫出血以及上消化道出血等外伤和体内出血性疾病，疗效确切；用于外科手术刀口，尤其对久治不愈的手术刀口，能显著促进手术部位组织愈合，并可缩短刀口拆线时间，疗效十分明显。特别是用于治疗烧伤、烫伤，痊愈速度快，不留疤痕。

然而，现实中白花檵木药材独特疗效及生物活性物质一直没有得到应有的重视。白花檵木生物活性物质及其制备方法的研究结果对白花檵木的系统研究开发及后续研制成具有相关药效作用的特色中药新产品具有重要意义。

发明内容

在白花檵木药材良好的止血活性基础上，针对目前其药理活性物质及制备方法的不明确问题，本发明主要采用药效活性成分总酚类物质为考察指标，对白花檵木药材进行提取、纯化，得到UV含量大于50%总酚类提取物。

本发明的白花檵木总酚类提取物，其特征在于提取物中含有没食子酸、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚成分。提取物以总酚类成分计算，UV含量为50%以上。

本发明的提取物通过以下步骤制备得到：

a)取白花檵木干燥药材，切段，用5~10倍体积的浓度为40~80%的乙醇在60~100℃下加热回流提取2~4次，每次1-3小时，过滤，合并得提取液A；

b)提取液A经40~60℃减压浓缩至0.1~0.5 g(生药材)·mL^-1，即得到浓缩液B；

c)浓缩液B直接经大孔树脂吸附，先用去离子水冲洗树脂，再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度为30 ~ 70%之间的洗脱液，合并，真空干燥，即得白花檵木总酚类提取物。过程避免了常用的调酸、调碱步骤，简化了公益，节约了时间，提高了效率。

为了达到更好的技术效果，步骤a)所述的乙醇浓度为60%。

大孔树脂选自HPD-300、HPD-400、HPD-450、HPD-600、HPD-826、DM-130、ADS-17、ADS-21、AB-8和D101。经过本发明人大量的实验研究发现，其中大孔树脂HPD-400具有非常优秀的实验效果。

本发明还涉及白花檵木总酚类提取物在制备抗炎、止血的药物中的应用。

针对白花檵木药材主要药效成分不明确这一问题，本发明的白花檵木提取物制备工艺采用活性引导分级分离方法，并结合UV跟踪检测目标，选取HPD-400大孔吸附树脂吸附解析，无需调节酸碱，避免了目标成分流失，同时使药效成分的含量得到明显提高，所得提取物具备主要药效成分更明确、提取率高的优势。具体表现在：本发明白花檵木提取物经紫外分光光度计检测总酚类成分含量约50%，其中主要含有没食子酸、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚等成分。并且本发明所得的白花檵木提取物具有明显的止血药效作用，并无明显急性毒性作用。可见将其进一步开发成具有止血药物，具有广阔的市场前景。

因而，本发明的白花檵木总酚提取工艺在药材利用率、明确主要药效成分，减小日服剂量，提高疗效等方面具有明显的优势。

附图说明

图1 白花檵木总酚类成分测定标准曲线图。

图2 本发明白花檵木总酚提取物HPLC图。

图3 对照品HPLC图。

具体实施方式

实施例1、药效成分含量测定、条件优化

（1）白花檵木总酚类成分含量测定

对照品溶液制备

精密称取10mg没食子酸粉末，用60%乙醇溶解并定容至100 mL ，即得0.1 mg·mL-1 对照品溶液。

供试品溶液的制备

取白花檵木药材，粉碎后过3号筛，称取粉末1.0g，加30mL60%乙醇超声提取30min，滤过，定容至30mL，再将此溶液用60%乙醇稀释30倍，摇匀，即得。

测定波长的选择

精密取供试品溶液和对照品溶液适量，加入1.0mL的福林-酚试剂，静置5～7 min后分别加入1.0 mL 10 % Na2CO3溶液，混匀后用60%乙醇定容至25 mL，40℃水浴加热5 min，放置30min后在300～900 nm对供试品溶液和对照品溶液扫描。即得供试品和对照品均在775 nm处有最大吸收，故确定775 nm为测定波长。

标准曲线的绘制

分别精密吸取没食子酸对照品溶液0.5，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0 mL，加入2 mL的福林-酚试剂。静置5～7 min后分别加入2 mL 10 % Na2CO3溶液，混匀后用70%乙醇定容至25 mL，50 ℃水浴加热5 min，放置2 h后于775 nm波长处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，对照品体积(X)为横坐标绘制标准曲线，即得线性关系为A=0.4763X+0.0137，r=0.9992 (n=6)，没食子酸没食子酸在0.5～2.0 mg·mL-1呈良好的线性关系。标准曲线如附图1。

样品测定与对照品的测定方法相同。

（2）白花檵木总酚类有效成分分析

色谱条件：

仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪

色谱柱：COSMOSIL C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)；柱温：25℃；检测波长：272nm流速：1.0 mL·min-1 ；进样量：20 μL；洗脱梯度：甲醇-0.1%磷酸-水溶液梯度洗脱：0 min- 10 min- 15 min- 35- 45- 60 min，流动相A-B比例：8: 92- 15: 85- 23: 77- 40: 60- 45: 55- 80: 20。

主要成分分析

对供试品、各对照品及对照品混合液在选定好的色谱条件下进行HPLC分析，对比各个液相图谱，没食子酸的保留时间为：6.924，芦丁的保留时间为：22.453，杨梅素的保留时间为：29.071，槲皮素的保留时间为：30.770，山奈酚的保留时间为：45.799与对照品混合液HPLC色谱图中a～e峰的保留时间：6.882、23.474、28.356、30.561、44.570基本一致，初步确定白花檵木提取物中含有没食子酸、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚等成分，色谱图如图2。对照组HPLC图见图3。

（3）药理活性实验

①对小鼠出血时间的影响

取小鼠80只,雌雄各半, 体重18-22g, 随机分为8组,每组10只, 分别为空白对照组(0.5% CMC-Na), 云南白药组, 白花檵木总酚提取物组。将各供试品分别按0. 4mL /20 g每天灌胃给药1 次, 连续5 d。于第5天给药后1 h, 剪去鼠尾3 mm, 在有血液流出时开始计时, 每隔10 s用滤纸轻轻拭血1 次, 直至拭后不再出血为止, 从开始出血至停止出血的时间为小鼠出血时间。

②对小鼠凝血时间的影响

取小鼠80只,雌雄各半, 体重18-22g, 随机分为8组,每组10只, 分别为空白对照组(0.5% CMC-Na), 云南白药组, 白花檵木总酚提取物组。将各供试品分别按0. 4mL /20 g每天灌胃给药1 次, 连续5 d。于第5天药后1 h, 用眼科弯镊迅速摘取一侧眼球, 即有血液流出, 在洁净载玻片的两端各滴1滴直径约5mm的血滴, 立即计时每隔10 s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻拨动1次, 并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝, 所历时间即为小鼠凝血时间。另一滴血供最后复验。

（4）大孔吸附树脂的筛选

精密称取已处理好的HPD-300、HPD-400、HPD-450、HPD-600、HPD-826、DM-130、ADS-17、ADS-21、AB-8和D101型10种大孔树脂，装柱（2cm×25cm，干重10g），精密吸取白花檵木60% 乙醇提取液（含生药量0.2g·mL^-1）10份，每份200mL，分别以2mL·min^-1的流速上柱预吸附1h，上样流出液重吸附1次，收集过柱残液。

先用水洗至洗脱液Molish反应为阴性，收集水洗液。然后用95% 乙醇洗脱至洗脱液无总酚检出（福林-酚试剂反应呈阴性），控制洗脱流速2mL·min^-1，收集乙醇洗脱液。分别测定上柱液、过柱残液、水洗液、乙醇洗脱液中总酚的含量，计算比上柱量、比吸附量、比洗脱量和洗脱率，结果见表1。

表1 树脂筛选结果 单位：mg·g^-1，以总酚计

树脂型号	比上柱量	比吸附量	比洗脱量	解吸率/%
					HPD-300	149.03	136.53	95.15	69.69
HPD-400	138.97	131.99	100.49	76.13
					HPD-450	154.55	140.24	101.38	72.29
HPD-600	105.12	99.94	66.75	66.79
					HPD-826	128.03	122.25	79.51	65.04
DM-130	113.47	118.84	82.89	69.75
					ADS-17	120.06	124.51	87.35	70.16
ADS-21	87.93	82.18	27.84	33.88
					AB-8	137.83	130.31	95.40	73.21
D101	109.03	104.00	72.89	70.09

注：比上柱量(saturationratio)：达吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成分的总和，S=(M上－M残)/M;

比吸附量(absorbtionratio)：单位质量干树脂吸附成分的总和，A=(M上-M残-M水洗)/M;

比洗脱量(eluationratio)：吸附饱和后，用一定溶剂洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量，E=M洗脱/M;

解吸率：洗脱剂中样品的量相对于树脂吸附量的百分率，R=M洗脱/W×100%；

式中：M——干树脂质量；M上——上柱液中成分的质量；M残——过柱流出液中成分的质量；M水洗——洗脱下来成分的质量；M洗脱——乙醇洗脱成分的质量；W——树脂负载总多酚的质量。

由表1可知，在筛选的10种树脂中，HPD-450和HPD-300对白花檵木总多酚的吸附性能最好， HPD-400型树脂虽然对白花檵木总多酚的吸附性能不及HPD-450和HPD-300，但是解吸率最高，且性价比高，故选择HPD-400型大孔吸附树脂为优选树脂。

（5）上样液pH的考察

精密吸取白花檵木60% 乙醇提取液（含生药量0.2g·mL^-1）三份,其中两份分别调pH至3、pH至9，另一份为未调节PH值的原液分别通过已预处理好的HPD-400大孔吸附树脂（相当于干树脂10g），进行动态吸附。树脂柱依次用水、95%乙醇洗脱至洗脱液无色。分别收集过柱液，测定A值，计算洗脱液中总酚含量。结果见表2。

表2 不同PH值上样液考察

样品名	总酚含量(g/mL)
		PH=3的水洗脱液	0.0041
PH=3的95%乙醇洗脱	0.4928
		PH=9的水洗脱	0.0078
PH=9的95%乙醇洗脱	0.6221
		原液的水洗脱	0.3079
原液的95%乙醇洗脱	1.8502

实验结果表明，采用原液直接上样时，所得到的乙醇洗脱液中总酚含量最大，故确定直接用提取液原液上HPD-400树脂分离纯化白花檵木提取液中总酚。

实施例2

取白花檵木干燥药材1000g，切断（2~5cm），用5倍的40%乙醇，加热回流提取3次，过滤，合并得提取液A，60℃减压浓缩至0.1g(生药材)·mL^-1，即得到浓缩液B。将浓缩液B经已处理好的大孔吸附树脂HPD-300，依次用4BV的去离子水、4BV10%、3BV30%和2BV95%乙醇溶液以3mL·min^-1的流速进行洗脱，收集50%乙醇洗脱物，经真空干燥，即得白花檵木总酚类提取物20g，其UV含量55%。药理活性实验结果显示，与空白组比较，总酚提取物组均能显著缩短小鼠断尾出血时间( P < 0. 01)，其缩短率为28.12%，云南白药的缩短率为48.92%；并且总酚提取物组均能显著缩短小鼠凝血时间( P < 0. 01) ，其缩短率为10.78%，云南白药的缩短率为27.76%。

Figure 2012102320467100002DEST_PATH_IMAGE001

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实施例3

取白花檵木干燥药材1000g，切断（2~5cm），用5倍的80%乙醇，加热回流提取3次，过滤，合并得提取液A，60℃减压浓缩至0.3g(生药材)·mL^-1，即得到浓缩液B。将浓缩液B经已处理好的大孔吸附树脂HPD-450，依次用4BV的去离子水、4BV10%、3BV50%和2BV95%乙醇溶液以3mL·min^-1的流速进行洗脱，收集50%乙醇洗脱物，经真空干燥，即得白花檵木总酚类提取物15g，其UV含量60%。药理活性实验结果显示，与空白组比较，总酚提取物组均能显著缩短小鼠断尾出血时间( P < 0. 01)，其缩短率为40.33%，云南白药的缩短率为48.92%；并且总酚提取物组均能显著缩短小鼠凝血时间( P < 0. 01) ，其缩短率为17.09%，云南白药的缩短率为27.76%。

Figure 2012102320467100002DEST_PATH_IMAGE002

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实施例4

取白花檵木干燥药材1000g，切断（2~5cm），用5倍的60%乙醇，加热回流提取3次，过滤，合并得提取液A，60℃减压浓缩至0.5g(生药材)·mL^-1，即得到浓缩液B。将浓缩液B经已处理好的大孔吸附树脂HPD-400，依次用4BV的去离子水、4BV10%、3BV70%和2BV95%乙醇溶液以3mL·min^-1的流速进行洗脱，收集70%乙醇洗脱物，经真空干燥，即得白花檵木总酚类提取物10g，其UV含量65%。药理活性实验结果显示，与空白组比较，总酚提取物组均能显著缩短小鼠断尾出血时间( P < 0. 01)，其缩短率为45.75%，云南白药的缩短率为48.92%；并且总酚提取物组均能显著缩短小鼠凝血时间( P < 0. 01) ，其缩短率为27.34%，云南白药的缩短率为27.76%。

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Claims

1. 白花檵木总酚类提取物，其特征在于提取物中活性成分含有没食子酸、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚成分；提取物以总酚类成分计算，UV含量为50%以上。

2.权利要求1所述白花檵木类提取物的制备方法，其特征是所述提取物通过以下步骤制备：

a.取白花檵木干燥药材，切段，用5~10倍体积的浓度为40~80%的乙醇在60~100℃下加热回流提取2~4次，每次1-3小时，过滤，合并得提取液A；

b.提取液A经40~60℃减压浓缩至0.1~0.7 g(生药材)·mL^-1，即得到浓缩液B；

c.浓缩液B直接经大孔树脂吸附，先用去离子水冲洗树脂，再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度为50 ~ 70%之间的洗脱液，收集乙醇浓度为40 ~ 70 %之间的洗脱液，合并，真空干燥，即得白花檵木总酚类提取物。

3.根据权利要求2所述的白花檵木总酚类提取物的制备方法，其特征在于步骤a所述的乙醇浓度为60%。

4.权利要求2所述的白花檵木总酚类提取物的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂选自HPD-300、HPD-400、HPD-450、HPD-600、HPD-826、DM-130、ADS-17、ADS-21、AB-8和D101。

5.权利要求2或4所述的白花檵木总酚类提取物的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂为HPD-400。

6.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求1所述的提取物和药学上可接受的辅料。

7.权利要求1所述的白花檵木总酚类提取物在制备止血药物中的应用。