CN102698259B - 一种鸡坏死性肠炎（a型）灭活疫苗制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用合成培养基生产鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗的方法。目前国内尚没有针对鸡坏死性肠炎的灭活疫苗，而针对其他动物的梭菌疾病灭活疫苗通常采用的是肉肝胃酶消化汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。而本发明所提供的合成培养基，克服了以上的缺陷，是进行细菌高细胞密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗生产提供了有力的保障。

Description

一种鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗制备方法。属于兽用生物制品制造领域。

背景技术

鸡坏死性肠炎又称为梭状芽孢杆菌肠炎（Clostridial enteritis），菌群失衡症（dysbacteriosis）或小肠细菌生长过度症（SIBO）。是由产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）A型或C型引起的一种疾病，A型产气荚膜梭菌产生α毒素，C型产生α和β毒素，这两种毒素是引起坏死性肠炎的主要毒素。病死禽以肝肿大、肠道出血和肠黏膜有麸皮样坏死灶为特征，正常鸡群的发病率为1.3%～37.3%，无特定病原鸡群的发病率可高达62%（王泽华，李灿恒.鸡坏死性肠炎的诊断与防治，中国禽业导刊，2002，19（14）：35-36）。

目前国内尚没有针对鸡坏死性肠炎的疫苗，治疗该病主要采用抗生素。国内A型梭菌类疫苗生产采用的是厌气肉肝汤和肉肝胃酶消化汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。大规模发酵用合成培养基按照产气荚膜梭菌营养代谢特点设计，添加了促进菌体增殖、提高保护性抗原含量的生长因子，具有产毒量高、质量稳定、操作简便等优点。合成培养基是细菌疫苗质量好坏的关键因素，有鉴于此，本发明旨在设计一种适合A型产气荚膜梭菌CVCC37株生长、产毒量高、成分相对确定、易于在线检测、监控和及时调整的合成培养基，制备A型产气荚膜梭菌灭活疫苗。

发明内容

将A型产气荚膜梭菌CVCC37株种子液按培养基总量的1%～2%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃厌氧培养/或静置培养6h，培养结束后经3000r/min离心30min，去除菌体，分别用8Ku截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行超滤浓缩，经0.6%的甲醛溶液灭活脱毒完全后，加入终浓度20%的氢氧化铝胶配制成疫苗。

本发明详细描述

1.疫苗生产用菌种

（1）来源产气荚膜梭菌CVCC37株菌种，原C57-1，F21A，强毒株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

（2）菌种特性

毒力：肉肝胃酶消化汤培养物上清静脉注射，0.05ml致死小白鼠；0.1～1.0ml致死家兔。

免疫原性：2.0ml浓缩铝胶苗免疫家兔可产生75%～100%保护。

2培养基采用本发明设计的合成培养基

（1）配方(W/V)如下：

蛋白胨1.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.25g，磷酸氢二钾0.45g，葡萄糖0.5g，氯化铁0.0001g，半胱氨酸盐酸盐0.05g，Vc0.001g，去离子水加至100ml。

（2）合成培养基配制方法

按配方称取各成分溶于去离子水中，用2mol/L的氢氧化钠调节pH值至8.0～8.5。116℃高压灭菌30min。

（3）合成培养基检验

1）性状溶液澄清透明、呈棕色。

2）无菌检验按中华人民共和国兽药典（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五版三部.中国农业出版社，2006,以下称《中国兽药典》）规定的方法进行，应无菌生长。

3）pH值应为8.0～8.5。

4）生长试验

⑴种子液制备

将A型产气荚膜梭菌菌CVCC37株（中国兽医药品监察所提供）冻干菌种用1ml普通肉汤（中国兽医药品监察所提供）稀释后，接种于10ml肉肝胃酶消化汤中，置37℃培养18～24小时，同时分别接种普通肉汤、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管0.2ml，培养48小时，纯粹检验合格后作为一级种子。在2～8℃保存，使用期不得超过15日。取一级种子0.1ml接种10ml肉肝胃酶消化汤，37℃培养6小时，纯粹检查合格后作为二级种子。（中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》）。

⑵菌液培养及判定

将种子液按1%接种200ml液体培养基的500ml三角瓶，37℃静置培养6小时，同时设1个不接种阴性对照。分别取样3000r/min离心30min，取上清按现行《规程》进行毒力测定。毒力应达到50MLD/ml，且阴性对照应无菌生长。

5）贮藏与有效期液体培养基应现配现用，高压灭菌后放置室温即刻使用。

3疫苗制造

（1）种子液制备

将A型产气荚膜梭菌CVCC37株（中国兽医药品监察所提供）冻干菌种用1ml肉肝胃酶消化汤（中国兽医药品监察所提供）稀释后，接种于10ml肉肝胃酶消化汤中，置37℃培养18～24小时，同时分别接种普通肉汤、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管0.2ml，培养48小时，纯粹检验合格后作为一级种子。在2～8℃保存，使用期不得超过15日。取一级种子0.1ml接种10ml肉肝胃酶消化汤，37℃培养6小时，纯粹检查合格后作为二级种子（中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》）。

（2）疫苗制造

将种子液按培养基总量的1%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃厌氧培养/或静置培养6小时。培养结束后菌液3000r/min离心30min，取上清经8Ku截留分子量的超滤浓缩系统浓缩后，立即加入0.6%的甲醛溶液灭活脱毒4～6日，灭活脱毒完全后加入终浓度20%的氢氧化铝胶和0.006%硫柳汞制成灭活疫苗。

（3）成品检验

物理性状本品静置后，上层为黄褐色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后成均匀混悬液。

无菌检验按现行《中国兽药典》附注进行，无应菌生长。

安全检验皮下接种14日龄的肉鸡10只，每只2ml，观察10日，不应出现由疫苗引起的任何局部或全身反应。

效力检验皮下注射14日龄的肉鸡5只，每只0.5ml，14日后，连同条件相同的对照肉鸡5只，各静脉注射0.2ml（含1MLD）A型产气荚膜梭菌毒素，观察5日，免疫组至少4/5保护，空白对照组5/5死亡。

甲醛、硫柳汞含量测定按现行《中国兽药典》附录进行，制品中甲醛残留含量应不超过0.5%，硫柳汞残留含量应小于0.01%。

本发明涉及微生物的信息本发明涉及的A型产气荚梭菌菌株，菌号分别为CVCC37、CVCC52、CVCC2027、CVCC2030、CVCC2014，均来自中国兽医药品监察所中国兽医微生物保藏管理中心（中国兽医药品监察所中国兽医微生物保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版.中国农业科学技术出版社，2002,p41、p43、p44、p45、p44）。

本发明的积极意义目前国内尚无鸡坏死性肠炎灭活疫苗，而其他A型产气荚膜梭菌类疫苗通常采用的是肉肝胃酶消化汤或厌气肉肝汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。而本发明所提供的合成培养基，克服了以上的缺陷，是进行细菌高细胞密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的鸡坏死性肠炎灭活疫苗生产提供了有力的保障。

具体实施方式

实施例1

A型产气荚膜梭菌CVCC37株（原C57-1株）合成培养基的研究

通过静置培养A型产气荚膜梭菌CVCC37株筛选出该合成培养基配方，对该合成培养基的配制条件和培养条件进行优化，并与肉肝胃膜消化汤的产毒性能进行比较，结果该配方37℃静置培养6小时产毒性能达到50～100MLD/ml，产毒能力达到或超过肉肝胃膜消化汤。对该合成培养基的适应性进行研究，结果该合成培养基只适用于CVCC37株的培养。

1材料

1.1培养基原材料

胰酪蛋白胨（批号VM732731-644），购自MERCK公司；酵母浸粉（批号911948）购自OXOID公司；磷酸氢二钾、葡萄糖、氯化铁、半胱氨酸盐酸盐、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、V_B1、V_K1、Vc、甲硫氨酸均为分析纯化学试剂，购自北京化学试剂公司。

1.2肉肝胃膜消化汤肉汤（批号为0130、0227、0307、0115、0119、0205），A型试管使用规格25ml、三角瓶使用规格500ml，中国兽医药品监察所培养基组提供。

1.3菌种

产气荚膜梭菌CVCC37株、CVCC52株、CVCC2027株、CVCC2030株、CVCC2014株，0.3ml/支，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

1.4动物

小鼠：ICR系，30～35日龄、体重16～20g，SPF级，由中国兽医药品监察所实验动物组采购并提供。

2方法与结果

2.1基础配方筛选

从不同组合配方中，通过培养产气荚膜梭菌CVCC37株，进行产毒效果比较，筛选基础配方。

称取氯化钠2.5g、磷酸氢二钾4.5g，溶于1000ml去离子水中，用2mol/L的氢氧化钠调pH值为8.0～8.5。将蛋白胨与酵母粉按不同比例（W/V）设计成9个配方，标记为1～9（具体比例及编号结果见表1），用上述缓冲液分别定容至100ml，116℃灭菌30分钟，同时设立肉肝胃酶消化汤对照。按1%加入种子液，37℃静置培养6小时，取培养好的菌液3000r/min离心30min，取上清测毒。结果见下表1。

表1 9组基础配方产毒性能测毒结果

*将毒素用明胶缓冲液适当稀释，将稀释液0.2ml静脉接种2只小鼠，24小时内，使小鼠2/2全部死亡的最高稀释倍数乘以5，即为每ml毒素的最小致死量（MLD）数。以下同。

从表1中配方6和配方8产毒性能较高，较接近肉肝胃酶消化汤。

2.2生长因子的筛选

选取产毒性能接近肉肝胃酶消化汤的2组基础配方，制成液体培养基，116℃灭菌30分钟，待其降至室温，分装到灭菌的A型试管中。在A型试管中分别加入经0.22μm过滤除菌的葡萄糖、氯化铁、半胱氨酸盐酸盐、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、V_B1、V_K1、V_C、甲硫氨酸等生长因子（W/V比例见表2），同时设立肉肝胃酶消化汤对照。按1%加入种子液，37℃静置培养6小时，取培养好的菌液3000r/min离心30min，取上清测毒。结果见下表2。

表2 培养基生长因子筛选试验测毒结果（MLD/ml）

从表2结果可看出，葡萄糖、氯化铁、半胱氨酸盐酸盐及Vc培养基产毒有一定促进作用，基础配方8优于配方6。

2.3合成培养基组合筛选

将各生产因子按不同组合设计成几个配方分别添加到基础培养基中，按1%加入种子液，37℃静置培养6小时，取样测定其产毒性能。结果见表3。

表3 基础配方添加生长因子组合(W/V)筛选比较试验测毒结果

*代表在10^×稀释毒素，静脉接种小鼠0.2ml，小鼠2/2死亡；而20^×稀释毒素，小鼠1/2死亡，因此将毒力定为50～100(MLD/ml)。以下“～”中的概念与同此表述。

从表3结果看出：适合的培养基配方(W/V)为1.5%蛋白胨+0.5%酵母粉+0.25%氯化钠+0.45%磷酸氢二钾+0.5%葡萄糖+0.0001%氯化铁+0.05%半胱氨酸盐酸盐+0.001%Vc。

2.4合成培养基配制条件的优化

对合成培养基高压条件、pH值和培养温度进行优化，确定最适灭菌条件为116℃、30min，最适pH值范围为8.0～8.5，最适配制用水为去离子水。结果见表4、表5、表6。

表4 不同高压条件A型合成培养基的产毒结果（MLD/ml）

表5 不同pH值条件A型合成培养基的产毒结果（MLD/ml）

表6 不同配制用水条件下A型培养基产毒结果（MLD/ml）

2.5合成培养基培养条件的确定

按合成培养基配方分别配制6甁300ml的培养基，按1%的量分别接种产气荚膜梭菌CVCC37株种子液，其中1甁置37℃培养20h，期间分别于4、6、8、10、12、14、16、18和20h先后取样5ml；另外配制5甁培养基，分别置35℃、36℃、37℃、38℃和39℃培养6h后取样5ml，取其上清进行毒力测定，以确定最佳的产毒时间和培养温度，结果表明，合成培养基培养CVCC37株在6h后毒力达到0.01～0.02ml/MLD，随着培养时间的延长，毒力不再增强，当培养温度在36℃～37℃时，培养基的产毒效果最佳。结果见表7、表8。

表7 不同培养时间产毒性能测毒结果

表8 不同培养温度下产毒性能测毒结果

2.6合成培养基与肉肝胃膜消化汤的比较试验结果见表9。

表9 合成培养基和肉肝胃酶消化汤毒力比较结果（MLD/ml）

从表9结果看出，A型合成培养基可替代传统培养基。

2.7合成培养基扩大培养试验

在小量培养成功的基础上，进一步扩大培养体积，使培养体积分别达到1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000和10000ml，分别在6、12、18和24小时取样，对培养基的产毒性能进行测定，结果表明当培养体积扩大时，培养基的产毒性能不变，所产毒素的毒力均达到50MLD/ml。结果见表10。

表10 不同培养体积在不同培养时间的产毒性能测毒结果（MLD/ml）

2.8合成培养基对不同A型菌株的培养试验

为确定合成培养基对不同A型产气荚膜梭菌菌株的培养情况，取5株A型产气荚梭菌菌株，菌号分别为CVCC37、CVCC52、CVCC2027、CVCC2030、CVCC2014，在35℃和37℃进行培养，分别在5小时和7小时取样，对其产毒性能进行测定，结果仅CVCC37株在该培养基上生长良好，产气较多，培养5～7小时毒力能达到50MLD/ml。其余4株菌产气少或不产气，培养5～7小时，毒力均不能达到50MLD/ml。结果见表11。

表11 合成培养基对不同A型菌株培养产毒性能测毒结果(MLD/ml)

注：-，代表不产气；“+”～“+++”分别代笔产气量从小至大。#代表10^×稀释毒素，静脉接种小鼠0.2ml，小鼠均0/2死亡；低稀释倍数测毒未进行。因而毒力0～50(MLD/ml)。

从表11可看出：合成培养基仅对A型产气荚膜梭菌CVCC37株有效。

3.结论

该合成培养基配方为蛋白胨1.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.25g，磷酸氢二钾0.45g，葡萄糖0.5g，氯化铁0.0001g，半胱氨酸盐酸盐0.05g，Vc0.001g，去离子水加至100ml。，产毒性能与肉肝胃膜消化汤基本一致，能达到50～100MLD/ml，但该培养基仅适用于产气荚膜梭菌CVCC37株的培养。

实施例2

合成培养基培养A型毒素浓缩工艺试验

α毒素是A型产气荚膜梭菌主要分泌毒素，也是主要免疫原，其分子量大约43Ku。将培养好的A型产气荚膜梭菌CVCC37株菌液，经3000r/min离心30min，去除菌体，分别用不同截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行超滤浓缩，然后进行浓缩前、后体积定量，并取浓缩前、后及透出液样品各10ml毒力测定。10Ku截留分子量的收获率为40%，其透出液静脉接种0.2ml,小鼠2/2死亡；而8Ku收获率达75%，其透出液透出液静脉接种0.2ml,小鼠0/2死亡；因此8Ku截留分子量的膜包适宜对A型菌培养毒素的浓缩（见表12）。

表12 不同截留分子量的膜包浓缩结果

实施例3

疫苗制造

（1）种子液制备

将A型产气荚膜梭菌CVCC37株（中国兽医药品监察所提供）冻干菌种用1ml肉肝胃酶消化汤（中国兽医药品监察所提供）稀释后，接种于10ml肉肝胃酶消化汤中，置37℃培养18～24小时，同时分别接种普通肉汤、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管0.2ml，培养48小时，纯粹检验合格后作为一级种子。在2～8℃保存，使用期不得超过15日。取一级种子0.1ml接种10ml肉肝胃酶消化汤，37℃培养6小时，纯粹检查合格后作为二级种子（中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》）。

（2）疫苗制造

将种子液按培养基总量的1%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃静置培养6小时（或厌氧培养）。培养结束后菌液3000r/min离心30min，取上清经8Ku截留分子量的超滤浓缩系统浓缩后，立即加入0.6%的甲醛溶液灭活脱毒4～6日，灭活脱毒完全后加入终浓度20%的氢氧化铝胶和0.006%硫柳汞制成灭活疫苗。

（3）成品检验

物理性状本品静置后，上层为黄褐色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后成均匀混悬液。

无菌检验按现行《中国兽药典》附注进行，无应菌生长。

安全检验皮下接种14日龄的肉鸡10只，每只2ml，观察10日，未出现由疫苗引起的任何局部或全身反应。

效力检验皮下注射14日龄的肉鸡5只，每只0.5ml，14日后，连同条件相同的对照肉鸡5只，各静脉注射0.2ml（含1MLD）A型产气荚膜梭菌毒素，观察5日，免疫组4/5保护，空白对照组5/5死亡。

甲醛、硫柳汞含量测定按现行《中国兽药典》附录进行，制品中甲醛残留含量均符合规定。

实施例4

鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗的研究

将培养好的CVCC37株菌液，3000r/min离心30min取上清，经超滤浓缩系统浓缩后，用0.6%的甲醛溶液灭活脱毒，灭活脱毒完全后加入终浓度20%的氢氧化铝胶和0.006%的硫柳汞配制成苗。皮下接种14日龄肉鸡5只，每只0.5ml，14日后连同空白对照静脉注射0.2ml（含1MLD）的A型毒素进行攻毒，观察5日，结果免疫组4/5保护，对照组全部死亡，表明疫苗的免疫原性良好。其结果见下表13。

表13 A型毒素对28日龄肉鸡的测毒结果

从表13结果可以看出该A型毒素对28日龄肉鸡的最小致死量为每1ml含10MLD，即0.1ml/MLD。

表14 3批疫苗免疫攻毒结果

从表14可以看出，合成培养基培养的A型产气荚膜梭菌CVCC37株的灭活疫苗免疫原性良好。

实施例4

鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗安全性试验

将制备的3批鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗，分别皮下注射14日龄肉鸡，每组10只，每只2ml（含4个使用剂量），另设5只作为空白对照，观察10日，未出现疫苗引起的任何局部和全身不良反应，疫苗组和空白对照组平均增重无显著差异。结果见下表15、16。

表15 3批鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗安全性试验结果

表16 3批鸡坏死性肠炎（A型）灭活疫苗安全性试验体增重结果

附注：

毒素毒力测定的方法：将毒素用明胶缓冲液适当稀释，每个稀释度尾静脉注射体重16～20g的小白鼠2只，每只0.2ml，以24小时内小白鼠2/2全部死亡的最高稀释倍数乘以5为该每1ml毒素的所含的最小致死量（MLD）数。

Claims (1)

1.一种鸡坏死性肠炎A型灭活疫苗的制备方法，其特征在于将A型产气荚膜梭菌CVCC37株种子液按培养基总量的1％～2％接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃厌氧发酵培养/或静置培养6小时，培养结束后经3000r/min离心30min，去除菌体，分别用8Ku截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行超滤浓缩，经0.6％的甲醛溶液灭活脱毒完全后，加入终浓度20％的氢氧化铝胶配制成疫苗；

其中所使用合成培养基的配方(W/V)是：蛋白胨1.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.25g，磷酸氢二钾0.45g，葡萄糖0.5g，氯化铁0.0001g，半胱氨酸盐酸盐0.05g，Vc0.001g，去离子水加至100ml。