CN102697760A

CN102697760A - 氯硝柳胺或其盐在制备预防和治疗肺纤维化药物中的应用

Info

Publication number: CN102697760A
Application number: CN2012101588026A
Authority: CN
Inventors: 张峻峰; 庞中化; 罗熠; 王敏
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2012-05-21
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明属于化学制药技术领域。具体涉及一种氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制备治疗肺纤维化疾病中的应用。本发明所述氯硝柳胺或其药学上可接受的盐，其化学式是C₁₃H₇Cl₂N₂O₃R，当R为羟基时，该化合物为已知化合物氯硝柳胺，当R基为铝或铵或钙或铜或亚铁或铁或锂或镁或锰或亚锰或钾或钠或锌时，化合物可以用氯硝柳胺为母核，进行简单的取代合成，制备成治疗肺纤维化疾病的药物。

Description

氯硝柳胺或其盐在制备预防和治疗肺纤维化药物中的应用

一、技术领域

本发明属于化学制药技术领域，具体涉及一种氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗肺纤维化药物中的应用。

二、背景技术

肺纤维化（Pulmonary fibrosis，PF）是各种不同病因的肺部疾病（如SARS、特发性肺纤维化、结节病、尘肺、过敏性肺炎、药物和放射线导致的纤维化，以及与胶原血管病有关的致纤维化肺泡炎等）共同结局，是弥漫性肺间质纤维化的简称，有狭义和广义两种概念，狭义肺纤维化一般是指病因不明的特发性肺间质纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）。广义肺纤维化包括特发性纤维化以及已知病因引起的继发性肺纤维化。

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）为间质性肺疾病（interstitial lungdisease）最为严重的一种表现形式，占所有肺间质纤维化的65%左右，是以弥漫性肺泡慢性炎症和间质纤维化，为主要病理特征的疾病。近年来间质性肺纤维化的发病率呈上升趋势。目前在世界范围内将近有500万人催患此症，该类患者平均寿命仅为2.8年，每年约40000患者因之而死亡。此病在我国发病率也有明显增加。

目前已知的引起肺纤维化的因素有：辐射和药物，主要见于癌症治疗中放射治疗和化疗药物引起的肺损伤；职业暴露，主要见于作业工人长期吸入粉尘所致的尘肺；遗传因素，主要有囊性肺纤维化；其它因素还有结节病（Sarcoidosis）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺结核、肺真菌感染、肺寄生虫病哮喘、SARS、流感和禽流感病毒人间感染等。肺纤维化具有潜在的庞大发病基础，许多常见的基础性疾病均有可能引起肺部的纤维化，应该引起医学制药领域的更大关注。而因职业和环境暴露引起的尘肺是相关从业人员的一大健康杀手。在我国，所有职业病中，危害最为严重的当数尘肺。对于矽肺、矿工尘肺等相对常见的尘肺，除了采取有效防护措施外，迄今仍缺乏可靠而有效的治疗方法。IPF的治疗是世界性的医学难题。

三、发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种新的治疗肺纤维化的药物。本发明所述肺纤维化治疗药物的化学式是C₁₃H₇Cl₂N₂O₃R，结构式为：

其中R为羟基或铝或铵或钙或铜或亚铁或铁或锂或镁或锰或亚锰或钾或钠或锌。

具体技术方案如下：

当R基团为羟基时，该化合物是氯硝柳胺，是一种已经存在的化合物，无需人工合成。

当R基团为铝、铵、钙、铜、亚铁、铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠、锌时，这些化合物可以通过氯硝柳胺为母核，通过与以上的无机碱反应形成。

下面以R基团为钠时，以氯硝柳胺为母核，进行C₁₃H₇Cl₂N₂O₃Na的合成。将800mg的氯硝柳胺溶解在5ml DMF中,加入1N的NaoH溶液2.5ml，室温搅拌4小时，分离得到有机层，用20ml双蒸水清洗2次，减压蒸馏除去溶剂，在得到的残渣中依次加入四氢呋喃6.2ml，乙酸2ml，环丙烷甲醛1.5ml，在室温下搅拌20分钟，在反应混合物中加入1N氢氧化钠水溶液5ml与叔丁基甲基醚6ml，在室温下搅拌，分离得到有机层，在外部温度为100℃下加热搅拌，在其中加入甲磺酸0.5mL,2mmo1，溶解，将该混合溶液进一步在外部温度为100℃下搅拌2分钟后，加入庚烷5ml，停止加热，搅拌。在室温下搅拌该混合溶液5小时，在减压下过滤得到生成的析出物，在20℃下减压干燥12小时，得到610mg黄色的氯硝柳胺的钠盐；

当R基团为铝、铵、钙、铜、亚铁、铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、锌时，步骤可以同C₁₃H₇Cl₂N₂O₃Na的合成步骤，只是将反应中的氢氧化钠替换成相对应的碱即可。

本发明的有益效果是本发明涉及的化合物可以有效的抑制肺纤维化疾病的恶化，降低肺部纤维原细胞的增值，减少胶原蛋白在肺部的沉积。所述化合物的有效治疗浓度是1×10^-8～10^-2M。本发明为肺纤维化疾病提供了一种全新的治疗药物，该药物制备工艺简单，成本低，效果显著。

四、附图说明

图1是不同浓度氯硝柳胺抑制小鼠成纤维细胞（3T3）分泌胶原的结果。柱状图为胶原col1a1基因的表达量。从左到右依次为：阳性参照组，1.0mg/L组,0.5mg/L组,0.1mg/L组,0.01mg/L组,0.001mg/L组,0.0001mg/L组。

图2是200mg剂量氯硝柳胺治疗肺纤维化小鼠后，不同组别小鼠体重变化评价结果：A博莱霉素造模模型组，B氯硝柳胺治疗组，C正常小鼠对照组。

图3是200mg剂量氯硝柳胺治疗肺纤维化小鼠后，不同组别小鼠死亡曲线的治疗评价结果：A博莱霉素造模模型组，B氯硝柳胺治疗组，C正常小鼠对照组。

图4是200mg剂量氯硝柳胺治疗肺纤维化小鼠后，小鼠肺部H&E的染色结果：A博莱霉素造模模型组，B氯硝柳胺治疗组，C正常小鼠对照组。

图5是200mg剂量氯硝柳胺治疗肺纤维化小鼠后，小鼠肺部α-SMA免疫组化结果：A博莱霉素造模模型组，B氯硝柳胺治疗组，C正常小鼠对照组。

图6是200mg剂量氯硝柳胺治疗肺纤维化小鼠后，小鼠肺部马森氏的染色结果：A博莱霉素造模模型组，B氯硝柳胺治疗组，C正常小鼠对照组。

五、具体实施方式

下面的实验例用以解释本发明，但是并非对本发明实质内容的限制

实施例1氯硝柳胺钠盐的合成方法及结晶过程研究

将800mg的氯硝柳胺溶解在5ml DMF中,加入1N的NaoH溶液2.5ml，室温搅拌4小时，分离得到有机层，用20ml双蒸水清洗2次，减压蒸馏除去溶剂，在得到的残渣中依次加入四氢呋喃6.2ml，乙酸2ml，环丙烷甲醛1.5ml，在室温下搅拌20分钟。在反应混合物中加入1N氢氧化钠水溶液5ml与叔丁基甲基醚6ml，在室温下搅拌，分离得到有机层。在外部温度为100℃下加热搅拌。在其中加入甲磺酸0.5mL,2mmo1，溶解。将该混合溶液进一步在外部温度为100℃下搅拌2分钟后，加入庚烷5ml，停止加热，搅拌。在室温下搅拌该混合溶液5小时，在减压下过滤得到生成的析出物。在20℃下减压干燥12小时，得到610mg黄色的氯硝柳胺的钠盐。

实施例2不同浓度氯硝柳胺对肺部纤维原细胞（NIH-3T3）的影响研究。

以双蒸水为溶剂，配置1.5mgL,1.0mg/L,0.5mg/L,0.1mgL,0.01mg/L,0.001mg/L,0.0001mg/L的氯硝柳胺溶液。将3T3细胞系从培瓶中消化下来，放于10ml离心管中，1000rpm， 5min。之后按照2×10⁵种于6孔板中，培液为DMEM+胎牛血清。24h后分别向六孔板中加入1.5mg/L,1.0mg/L,0.5mg/L,0.1mg/L,0.01mg/L,0.001mg/L,0.0001mg/L，各100ul，每个浓度三个平行样品。对照组加入100ul的PBS。24小时后收样，根据Trizol步骤提取细胞总RNA。将提取的RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，以胶原蛋白的引物为上下游引物，GAPDH为内参，进行Q-PCR，条件如下：94℃ 10min；94℃ 30s，60℃ 60s 40cycles；4℃ forever。

结果分析：在肺纤维化过程中，纤维原细胞由正常变成不正常，并且大量的增殖，同时分泌大量的胶原蛋白填满整个肺组织，从而导致肺纤维化，因此，如果能特异性的抑制纤维原细胞的增殖并能阻断纤维原细胞分泌胶原蛋白，便可以缓解肺纤维化病人的痛苦，使病人呼吸顺畅，进而达到对肺纤维化的治疗的目的。如图1结果所示，随着氯硝柳胺药物浓度的提高，氯硝柳胺对纤维原细胞分泌胶原的抑制程度也在不断的加强，并且呈现出剂量依赖效应，在1.0mg/L的溶液中达到最大的抑制效果（1.5mg/L的样品由于氯硝柳胺浓度过大，该孔样品细胞全部漂浮死亡，没有计算在内），治疗组胶原的分泌量显著低于阳性对照组。由此我们也可以得出结论：氯硝柳胺可以显著的抑制纤维原细胞对胶原的分泌，从而达到对纤维化的治疗作用。

实施例3氯硝柳胺在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中治疗作用的评价。

根据文献所述的造模方法对小鼠进行肺纤维化模型的制造：60只C57雌性小鼠，6-8周，体重18-20g左右，用生理盐水配制5mg/ml的戊巴比妥钠溶液，每只小鼠0.2ml腹腔注射，对小鼠进行麻醉。将小鼠仰卧固定在实验台上，颈部去毛后70%乙醇消毒，用手术剪切开皮肤，顿性分离，逐层暴露气管，将5mgml的博莱霉素注射液像小鼠的气道灌注30μl，之后用缝合针缝合。将小鼠随机分成四组，每组30只，在博莱霉素造模3天后开始给药，给药方式为灌胃给药,20天的时候杀死小鼠，取样。分组如下A：博莱霉素造模组；B:给药200mg/只/天组；C：没有造模的正常小鼠对照组。

氯硝柳胺对肺纤维化小鼠治疗的评价如下：

1氯硝柳胺给药后小鼠的平均体重及死亡曲线的治疗评价

博莱霉素造模后，A：没有造模的正常小鼠对照组；B：博莱霉素造模组；C：给药200mg/只/天组；，三组小鼠每组分别都有30只小鼠，每天下午两点，对每组的每只小鼠进行称量，之后计算出每组小鼠的平均重量，作为治疗的指标之一。另外每天对每组小鼠的只数进行统计。因为肺纤维化是一种恶性疾病，在造模后，随着发病的进行，小鼠的病情会逐渐的变的严重，在没有任何干预治疗的情况下，小鼠的体重会出现持续的下降并出现一定的死亡比例，直到最后全部死亡，死亡曲线是反映小鼠肺纤维化发病情况以及药物治疗效果的一个重要的评价指标。如图2所示，博莱霉素模型组小鼠的体重随着时间的推移，小鼠平均体重一直在下降，在21天的时候下降到临界值以下，9.5克（10克是小鼠能够存活的极限体重，如果随着时间继续往后进行，模型组的小鼠会全部死亡）。氯硝柳胺治疗组的小鼠在造模0-4天，体重处于略微的下降从17.2克下降至16.3克，但是随着第三天氯硝柳胺给药的治疗，小鼠的体重逐渐恢复并呈现出和正常对照组一样的体重增加，随着时间的进行，小鼠的体重逐渐的增加，几乎和正常对照组没有差别。因此我们可以得出结论：氯硝柳胺对肺纤维化的治疗使得小鼠的体重增加，病情得到恢复，具有很好的治疗效果。图3的结果显示，随着时间的推移，博莱霉素造模组的小鼠逐渐出现死亡，从最开始的30只一直死到最后的10只，21天的存活率仅有33%；而氯硝柳胺治疗组的小鼠21天的存活率则达到83.3%，存活率显著高于模型组。因此我们可以得出结论，氯硝柳胺对肺纤维化的治疗使得小鼠的存活率升高，氯硝柳胺对肺纤维化的治疗具有显著的效果。

2氯硝柳胺给药后H&E染色肺部纤维化程度的组织学评价

20天的时候处死小鼠，将小鼠的肺组织取出，通过石蜡包埋的方法将小鼠的肺组织包埋于石蜡中，用石蜡切片机按照5μm的厚度切片。37℃烤片24小时，然后按照如下步骤脱蜡至水。二甲苯5min→二甲苯5min(这两步时间可延长一些,腊脱不清会导致非特异染色,10min)→无水乙醇∶二甲苯=1∶1,5min→无水乙醇3min×2→95%乙醇3min→90%乙醇3min→80%乙醇3min→75%乙醇3min→70%乙醇3min→60%乙醇3min→50%乙醇3min→30%乙醇3min→水3min，苏木精染色3min，水3min→70%乙醇3min→80%乙醇3min→90%乙醇3min→95%乙醇3min→伊红1min→95%乙醇3min→无水乙醇3min→二甲苯10min，封片。200放大拍片。如图4所示，A：博莱霉素造模组；B:给药200mg/只/天组；C：没有造模的正常小鼠对照组。博莱霉素模型组的小鼠整个肺组织已经没有完整的形态，被大量的细胞外基质阻塞，而氯硝柳胺治疗组和正常对照组，则有明显的肺泡形态，肺组织结构清晰。因此我们可以得出结论，氯硝柳胺对肺纤维化的治疗使得被细胞外基质阻塞的肺组织恢复了组织学形态，恢复了肺组织的功能，具有显著的治疗意义。

3氯硝柳胺给药后肺部成纤维细胞表达的α-SMA的表达状况及其评价

对小鼠肺部纤维原细胞表达α-SMA的评价采用免疫组化的方式进行，免疫组化的步骤按照常规的实验方法即可。α-SMA是纤维原细胞表达的特异性的marker，因此α-SMA的多少则直接显示了肺部纤维原细胞的多少，而纤维原细胞在肺部大量的增值正是纤维化发病的主要原因。如图5所示，A：博莱霉素造模组；B:给药200mg/只/天组；C：没有造模的正常小鼠对照组。博莱霉素造模组α-SMA的表达量显著的高于治疗组和正常对照组，而氯硝柳胺治疗组的α-SMA的表达量和正常对照组都比较少。因此我们可以得出结论，氯硝柳胺可以抑制肺部纤维原细胞的增值，从而达到治疗肺纤维化的目的。同时也证明了氯硝柳胺对肺纤维化的治疗，具有明显的治疗效果，可以作为治疗肺纤维化的有效治疗药物。

4氯硝柳胺给药后小鼠肺部胶原沉积状况的治疗评价

对小鼠肺部胶原的沉积状况采用马森氏染色的方法进行鉴定。切片脱蜡处理至水。滴加1滴（50-100μl）Masson复合染色液（试剂A）染色5分钟。蒸馏水冲掉染液。滴加1滴（50-100μl)磷钼酸（试剂C）染色5分钟，甩干（切记不要洗涤）。直接滴加1滴（50-100μl）苯胺蓝（试剂D）染色5分钟蒸馏水稍冲。滴加1滴（50-100μl）分化液（试剂B）分化30～60秒(2次)。95%酒精、无水酒精脱水，透明，封固。结果：在这个染色过程中，胶元纤维被染成蓝色，即蓝色越深的地方，胶原的含量就越高。在肺纤维化过程中，纤维原细胞大量表达胶原，使得肺组织被胶原等阻塞，使肺部丧失气体交换功能，胶原的含量是评价肺纤维化发病严重程度的指标之。如图6所示，A：博莱霉素造模组；B:给药200mg/只/天组；C：没有造模的正常小鼠对照组。博莱霉素模型组胶原大量分泌，整个片子都是颜色较深的蓝色，而氯硝柳胺治疗组和正常对照组只在气道周围有着一定颜色深度的蓝色，整个片子的蓝色比较浅（组织本底）。由此我们可以得出结论，氯硝柳胺对肺纤维化的治疗，可以显著的抑制肺部纤维原细胞分泌胶原蛋白，从而达到对肺纤维化的治疗作用。

Claims

1.一种氯硝柳胺或其盐的结构式为：

2.根据权利要求1所述氯硝柳胺盐的制备方法，其特征是以氯硝柳胺为母核，经过取代反应，从产物中得到。

3.权利要求1所述氯硝柳胺或其盐在制备预防和治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

4.根据权利要求3所述氯硝柳胺或其盐在制备预防和治疗肺纤维化疾病药物中的应用，其特征是氯硝柳胺或其盐的浓度为1×10^-8~10^-2M。