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CN102686727A - 基于c-型凝集素结构域的组合文库 - Google Patents

基于c-型凝集素结构域的组合文库 Download PDF

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CN102686727A CN2010800560215A CN201080056021A CN102686727A CN 102686727 A CN102686727 A CN 102686727A CN 2010800560215 A CN2010800560215 A CN 2010800560215A CN 201080056021 A CN201080056021 A CN 201080056021A CN 102686727 A CN102686727 A CN 102686727A
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Abstract

本发明涉及包含多肽(该多肽含有具有随机化环区域的C-型凝集素结构域(CTLD))的多肽文库以及含编码此类多肽的核酸分子的核酸文库。本发明还涉及用于产生所述随机化多肽和所述多肽文库的方法。本发明进一步涉及基于修饰CTLD与感兴趣靶分子的特异性结合来筛选所述多肽和核酸文库的方法。本发明还涉及源自此类文库且与感兴趣靶分子结合的多肽。

Description

基于C-型凝集素结构域的组合文库
相关申请的交叉参考
本申请是2009年10月9日提交的美国申请序列第12/577067号的部分继续申请以及是2009年10月9日提出的国际申请，PCTUS09/60271的部分继续申请，所有这些申请通过参考以其整体并入。序列表声明
序列表仅以电子格式在本申请中提出并通过参考并入本文。所述序列表文本文件“09-493 Subst SeqList.txt”创建于2010年3月21日，大小为385kb.
技术领域
本发明涉及包含具有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽的多肽文库以及含编码此类多肽的核酸分子的核酸文库，所述C-型凝集素结构域具有随机化环区域。本发明还涉及用于产生所述随机化多肽和所述多肽文库的方法。本发明进一步涉及基于修饰CTLD与感兴趣靶分子的特异性结合来筛选所述多肽和核酸文库的方法。本发明还涉及源自此类文库且与感兴趣靶分子结合的多肽。
背景技术
C-型凝集素样结构域(CTLD)是一种已经在许多分离自多种动物样品的蛋白质中得到鉴定的蛋白质基序(在Drickamer and Taylor(1993)以及Drickamer(1999)中予以评述)。最初，CTLD结构域被鉴定为与所谓的C-型凝集素(钙依赖性糖结合蛋白)相同的结构域并被命名为"糖识别域"(″CRD")。最近，已经明了的是，该结构域被很多真核生物蛋白质共享，在这些蛋白质中，有若干种不与糖部分结合，因此规范结构域已被命名为"CTLD"。
已有报告称CTLD与很多种化合物结合，这包括碳水化合物、脂质、蛋白质以及甚至冰(Aspberg等(1997),Bettler等(1992),Ewart等(1998),Graversen等(1998),Mizumo等(1997),Sano等(1998),and Tormo等(1999))。尽管一些蛋白质含有CTLD的单拷贝，但是其他蛋白质含有该结构域的两个或多个拷贝。在生理学机能单位中，通常通过将单拷贝蛋白质前粒子装配到较大结构中而获得大量CTLD数目。
CTLD含有约120个氨基酸残基，而且特有地含两个或三个链内二硫键。尽管来自不同蛋白质的CTLD的基本序列共享相对低的氨基酸序列同源性，但是许多CTLD的二级和三级结构是类似的，从而产生高度保守的三维结构，在该三维结构中结构可变性基本局限于CTLD环区域。该CTLD环区域通常含至多5个环，其在配体和钙结合中起作用。若干CTLD含一个或两个钙结合部位，而且与钙相互作用的大部分侧链位于该环区域中。
基于可用的三维结构信息，规范CTLD特征在于以下述次序顺序出现的7个主要的二级结构元件(五个β-链和两个螺旋)：β1；α1；α2；β2；β3；β4；和β5(图1)。在三维结构已经确定的CTLD中，所述β链以两个反平行β-折叠排列，一个由β1和β5构成，另一个由β2、β3和β4构成。其他β-链β0在序列中通常位于β1之前，而且，当存在时，其形成与β1,β5折叠结合的其他链。此外，两个二硫键，一个连接α1和β5(CI-CIV，图1)，一个连接β3和连接β4与β5的多肽区段(CII-CIII，图1)，迄今为止始终发现于所表征的所有CTLD中。
在CTLD三维结构中，保守的二级和三级结构元件为很多环形成从核心伸出的致密支架，其在本上下文中统称为“环区域”。CTLD的环区域的一级结构被组织成两个区段，环区段A(LSA)和环区段B(LSB)。LSA表示连接β2和β3的长多肽区段，其通常缺乏常规的二级结构并含有多达4个环。LSB表示连接β-链β3和β4的多肽区段。包括环区域在内的CTLD的示意图显示于图4-6中。LSA中的残基连同β4中的单残基已经显示出特定于若干CTLD(包括四联蛋白的CTLD)的Ca2+-和配体-结合部位。例如，诱变研究(包括单或数个残基的置换)已经显示结合特异性、Ca2+-敏感性和/或亲和力的变化可通过CTLD结构域来调节(Weisand Drickamer(1996),Chiba等(1999),Graversen等(2000))。
四联蛋白是一种三聚糖蛋白(Holtet等(1997),Nielsen等(1997))，其已经分离自人血浆并且发现其存在于某些组织中的细胞外基质中。已知四联蛋白结合钙、复合多糖、纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白原/纤维蛋白和脱脂载脂蛋白(a)。与纤维蛋白溶酶原和脱脂载脂蛋白(a)的相互作用是由其中的kringle 4-蛋白结构域介导的。该相互作用已知对钙和氨基酸赖氨酸的衍生物敏感(Graversen等(1998))。
人类四联蛋白基因已经被表征，而且已经分离出人和鼠四联蛋白cDNA克隆。人和鼠四联蛋白的成熟蛋白包含181个氨基酸残基。参见美国专利申请公开2007/0154901，该文献以其整体引入本文。全长人类四联蛋白的三维结构以及分离四联蛋白CTLD的三维结构已经在两个独立研究中独立地测定(Nielsen等(1997)和Kastrup等(1998))。四联蛋白是2-结构域或可能为3-结构域蛋白，即，多肽链的主要部分包含CTLD(氨基酸残基Gly53到Val181)，而区域Leu26至Lys52通过形成同源三聚平行卷曲螺旋编码蛋白质的α-螺旋控制三聚。多肽取代Glu1至Glu25含有复合多糖结合部位(Lys6至Lys15)(Lorentsen等(2000))并显示有助于三聚结构的稳定化(Holtet等(1997))，位于环4中的两个氨基酸残基Lys148和Glu150以及Asp165(位于β4中)已经显示对纤维蛋白溶酶原kringle 4结合非常重要，且残基Ile140(在环3中)和Lys166及Arg167(在β4中)也显示很重要(Graversen等(1998))。用芳香残基置换Thr149(在环4中)显示出显著增加四联蛋白与kringle 4的亲和力并增加对纤维蛋白溶酶原kringle 2的亲和力，其水平可比得上野生型四联蛋白对kringle 4的亲和力(Graversen等(2000))。已经描述了四联蛋白的三聚平截。参见与2009年4月8日提交的US 2010/0028995，该文献以其整体并入作为参考。
许多其他含有CTLD的蛋白是已知的，包括下述非限定性实例：胰石蛋白(lithostatin)、鼠巨噬细胞半乳糖凝集素、星形细胞受体(Kupffercell receptor)、鸡神经聚糖、perlucin、唾液酸糖蛋白受体、软骨蛋白多糖核心蛋白、IgE Fc受体、胰腺炎相关蛋白、鼠巨噬细胞受体、自然杀伤细胞组(Natural Killer group)、干细胞生长因子、因子IX/X结合蛋白、甘露糖结合蛋白、牛共凝集素、牛CL43、胶原凝集素肝1、表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、e-选择蛋白、被囊类c-型凝集素、CD94 NK受体结构域、LY49A NK受体结构域、鸡肝凝集素、鳟鱼c-型凝集素、结合HIV gp 120的c-型凝集素、树突细胞免疫受体和很多蛇毒蛋白。
在很多天然出现的CTLD中结合部位构型的变化显示，其共有的核结构可适应很多基本不同的配体结合部位构型(参见例如US2007/0275393，该专利通过参考引入本文)。CTLD因此特别适于用作构建对感兴趣靶分子具有所需结合性质的新型有用的蛋白质产物。
例如，CTLD(或CTLD-基蛋白质产物)相对于抗体衍生物具有优势，因为在CTLD基蛋白质产物中的每一结合部位隐匿于单一结构自主的蛋白质结构域中。此外，CTLD结构域抵抗蛋白水解，而且与配体结合部位的稳定性和接近机会由于其他蛋白质结构域与CTLD的N-端或C-端相连均不会受损。
关于治疗用途，所述CTLD-基蛋白质产物与已经存在于体内的响应的天然CTLD蛋白质相同，而且其因此有望在患者体内引发最小限度的免疫应答。单CTLD大约是抗体质量的一半，而且在一些应用中可能是有利的，因为其可提供更好的组织穿透力和分布以及更短的循环半衰期。CTLD蛋白的多价形式可以提供增加的结合能力和亲和力以及更长的循环半衰期。
本发明提供组合CTLD多肽文库以及鉴定和分离CTLD的方法，以用作构建对感兴趣靶分子具有所需结合性质的新的和有用的蛋白质产物的基础。
发明内容
一方面，本发明提供组合多肽文库，其包含下述多肽成员，该多肽成员含有具有随机化环区域的C-型凝集素结构域(CTLD)，其中所述随机化环区域已经从该CTLD的天然序列进行修饰。本发明提供组合多肽文库和编码所述多肽文库的核酸文库，其包含下述多肽成员，该多肽成员含有具有随机化环区域的C-型凝集素结构域(CTLD)，其中该CTLD的环区域按照下述方案之一而被随机化：
(a)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1中至少一个氨基酸的插入以及环1内至少五个氨基酸的随机置换；
(b)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括环1内至少五个氨基酸的随机置换以及环2内至少三个氨基酸的随机置换；
(c)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括环1内至少七个氨基酸的随机置换以及在环4中的至少一个氨基酸插入；
(d)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少一个氨基酸插入以及环3内至少三个氨基酸的随机置换；
(e)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括将两个环组合成单一环的修饰，其中两个被组合的环为环3和环4；
(f)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环4中的至少一个氨基酸插入以及环4内至少三个氨基酸的随机置换；
(g)在CTLD的环区段A(LSA)和环区段B(LSB)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括环3中至少五个氨基酸残基的随机置换以及环5内至少三个氨基酸的随机置换；
(h)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少一个氨基酸的随机置换以及至少六个氨基酸的插入；
(i)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括下述的混合：(1)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换，和(2)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换和至少一个氨基酸插入；和
(j)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中或者环区段B(LSB)的环5中进行是至少四个或更多个氨基酸插入。
一方面，所述文库的多肽的CTLD具有下述二级结构：
a.以β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5的次序顺序出现的五个β-链和两个α-螺旋，所述β-链以两个反平行β-折叠排列，一个由β1和β5组成，另一个由β2、β3和β4组成，
b.至少两个二硫键，一个连接α1和β5，而一个连接β3和连接β4与β5的多肽区段，和
c.含环区段A(LSA)和环区段B(LSB)的环区域，其中LSA连接β2和β3，而LSB连接β3和β4。
在各种其他方面，所述文库的多肽具有在C端方向位于环2的C末端邻近的随机氨基酸置换。此外，当CTLD来自人类四联蛋白时，该CTLD还可包括随机的精氨酸-130置换。此外，当CTLD来自鼠四联蛋白时，该CTLD还可包括亮氨酸-130的随机置换。在(a)–(j)的某些修饰中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，该CTLD还可包括脯氨酸144的随机置换。
在各种其他实施方式中，所述文库的多肽可具有参与钙配位和/或纤维蛋白溶酶原结合的一个或更多个氨基酸的随机置换。例如，当CTLD来自四联蛋白时，该CTLD还可包含赖氨酸-148置换为丙氨酸(在环4中)。
在某些实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD时，所述氨基酸置换包括在环1中的两个氨基酸插入和在环1内的至少五个氨基酸是随机置换。在其他实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD而且CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的至少一个氨基酸插入、在环1内的至少五个氨基酸的随机置换，并且包括精氨酸130的随机置换。在一个具体实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD而且CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的两个氨基酸插入、在环1内的五个氨基酸的随机置换和精氨酸130的随机置换。在一个具体实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD而且CTLD来自鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的两个氨基酸插入、在环1内的五个氨基酸的随机置换和亮氨酸130的随机置换。在方案(a)的任意实施方式中，所述氨基酸修饰还可包括赖氨酸-148置换为丙氨酸。
在某些实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD而且CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的至少五个氨基酸的随机置换、在环2中的至少三个氨基酸的随机置换，并且包括精氨酸130的随机置换。在一个实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD而且CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的五个氨基酸的随机置换、在环2中的三个氨基酸的随机置换和精氨酸130的随机置换。在某些其他实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD而且CTLD来自鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的至少五个氨基酸的随机置换、在环2中的至少三个氨基酸的随机置换，并且包括亮氨酸130的随机置换。在一个实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD而且CTLD来自鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的五个氨基酸的随机置换、在环2中的三个氨基酸的随机置换和亮氨酸130的随机置换。在方案(b)的任意实施方式中，所述氨基酸修饰还可包括赖氨酸-148置换为丙氨酸。在其他具体实施方式中，组合文库的个体成员包括环区域，该环区域包括由下面实施例表3提供的任意或全部多肽序列。
在某些实施方式中，当组合文库具有方案(c)的修饰时，所述氨基酸修饰任选还包括至少两个氨基酸的随机置换。在某些其他实施方式中，当组合文库具有方案(c)的修饰时，所述氨基酸修饰包括在环4内的三个氨基酸插入，以及任选还包括至少两个氨基酸的随机置换。在一个实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环1内的至少七个氨基酸的随机置换、在环4中的至少三个氨基酸插入以及在环4内的至少两个氨基酸的随机置换。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环1内的七个氨基酸的随机置换、在环4中的三个氨基酸插入以及在环4内的两个氨基酸的随机置换。在其他具体实施方式中，组合文库的个体成员包括环区域，该环区域包括由下面实施例表3提供的任意或全部多肽序列。
在其他实施方式中，当组合文库具有方案(d)的修饰CTLD时，所述氨基酸修饰还可包括在环4中的至少一个氨基酸插入，并且还可包括在环4内的至少三个氨基酸的随机置换。在任意所述的方案(d)的实施方式中，所述氨基酸修饰可包括在环3中的三个氨基酸插入。在任意所述的方案(d)的实施方式中，所述氨基酸修饰可包括在环4中的三个氨基酸插入。因此，在某些实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3内的至少三个氨基酸的随机置换、在环4内的至少三个氨基酸的随机置换、在环3中的至少一个氨基酸插入和在环4中的至少一个氨基酸插入。在某些实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3内的至少三个氨基酸的随机置换、在环4内的至少三个氨基酸的随机置换、在环3中的至少三个氨基酸插入和在环4中的至少三个氨基酸插入。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3内的三个氨基酸的随机置换、在环4内的三个氨基酸的随机置换、在环3中的三个氨基酸插入和在环4中的三个氨基酸插入。在其他具体实施方式中，组合文库的个体成员包括环区域，该环区域包括由下面实施例表3提供的任意或全部多肽序列。
在某些实施方式中，当组合文库的成员具有方案(e)的修饰CTLD时，所述氨基酸修饰包括环3内的至少六个氨基酸的随机置换和环4内的至少四个氨基酸的随机置换。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括环3内的六个氨基酸的随机置换和环4内的四个氨基酸的随机置换。在方案(e)的任意实施方式中，当CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰还可包括脯氨酸-144的随机置换。在一个具体实施方式中，当CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括环3内六个氨基酸的随机置换、环4内四个氨基酸的随机置换和脯氨酸-144的随机置换，产生组合的环3和环4氨基酸序列，其包括，例如，NWEXXXXXXXXGGXXXN(SEQ ID NO:578)，其中X是任意氨基酸，且其中SEQ IDNO:578的氨基酸序列形成单环区域。在其他具体实施方式中，组合文库的个体成员包括环区域，该环区域包括由下面实施例表3提供的任意或全部多肽序列。
在其他实施方式中，当组合文库具有方案(f)的修饰CTLD时，所述氨基酸修饰包括在环4中的四个氨基酸插入。在一个实施方式中，当组合文库具有方案(f)的修饰CTLD时，所述氨基酸修饰包括在环4中的至少四个氨基酸插入和在环4内的至少三个氨基酸的随机置换。在一个具体实施方式中，所述氨基酸置换包括在环4中的四个氨基酸插入和在环4内的三个氨基酸的随机置换。在其他具体实施方式中，组合文库的个体成员包括环区域，该环区域包括由下面实施例表3提供的任意或全部多肽序列。
在其他实施方式中，当组合文库具有方案(g)的修饰CTLD且CTLD来自四联蛋白时，所述氨基酸修饰还可包括在环4中的一个或更多个氨基酸修饰，其调节CTLD的纤维蛋白溶酶原结合亲和力，例如，赖氨酸148置换为丙氨酸。因此，在某些实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环3中的至少五个氨基酸残基的随机置换、在环5中的至少三个氨基酸残基的随机置换和在环4中的赖氨酸148置换为丙氨酸。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3中的五个氨基酸残基的随机置换和在环5中的三个氨基酸残基的随机置换，以及，在另一具体实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰还包括在环4中的赖氨酸148置换为丙氨酸。在其他具体实施方式中，组合文库的个体成员包括环区域，该环区域包括由下面实施例表3提供的任意或全部多肽序列。
在某些实施方式中，当组合文库具有方案(h)的修饰CTLD且CTLD来自四联蛋白时，所述氨基酸修饰还可包括在环4中的一个或更多个氨基酸修饰，其调节CTLD的纤维蛋白溶酶原结合亲和力，例如，赖氨酸148置换为丙氨酸。在某些实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，组合文库的成员具有在环3中的至少一个氨基酸的随机置换和至少六个氨基酸的插入和在环4中的赖氨酸148置换为丙氨酸。在一个具体实施方式中，当组合文库具有方案(h)的修饰CTLD时，所述氨基酸修饰包括在环3中的一个氨基酸的随机置换和六个氨基酸的插入。在一个具体实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，组合文库的成员具有在环3中的一个氨基酸的随机置换和六个氨基酸的插入。和在环4中的赖氨酸148置换为丙氨酸。在任意这些实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，置换之一是异亮氨酸140的置换。在其他具体实施方式中，组合文库的个体成员包括环区域，该环区域包括由下面实施例表3提供的任意或全部多肽序列。
在一个实施方式中，当组合文库具有方案(i)的修饰CTLD时，所述氨基酸修饰包括下述的混合：在环3中六个氨基酸的随机置换、在环3中六个氨基酸的随机置换和一个氨基酸插入以及在环3中六个氨基酸的随机置换和两个氨基酸插入。在方案(i)的任意实施方式中，当CTLD来自四联蛋白时，所述氨基酸修饰还包括环4中赖氨酸148置换为丙氨酸。
在本发明的其他方面，组合多肽文库的多肽成员在环区段A(LSA)和环区段B(LSB)中的任意2、3、4或5个组合环中具有一个或更多个氨基酸修饰。多肽成员还可包括CTLD区域，该区域在LSA和LSB外部的区域中具有氨基酸修饰。在其他具体实施方式中，组合文库的个体成员包括环区域，该环区域包括由下面实施例表17提供的任意或全部多肽序列。
在本发明的某些实施方式中，组合文库由这样的多肽成员组成，该多肽成员在来自人或鼠四联蛋白的CTLD中具有经修饰的环区域。在某些实施方式中，所述多肽成员还可具有CTLD的N-端延伸(extension)和/或C-端延伸。N-端延伸和/或C-端延伸可提供效应子功能、酶功能、进一步结合功能或多聚化功能。在一个实施方式中，N-端延伸和C-端延伸中至少一个包括天然C-型凝集素样蛋白质或C-型凝集素或缺乏功能跨膜结构域的C-型凝集素的非CTDL-部分。在一个实施方式中，所述蛋白质是包含CTLD的部分的多聚体。
在本发明的其他实施方式中，多肽成员在环区域中可具有其他由肽接枝引入或通过淘选鉴定的变更，其可提供效应子功能、酶功能、进一步结合功能或多聚化功能。
在其他实施方式中，组合文库由这样的多肽成员组成，该多肽成员在全长人或鼠四联蛋白的CTLD区域中具有修饰的环区域。在某些实施方式中，多肽成员可具有四联蛋白的三聚结构域的N-端延伸。所述N-端延伸可提供效应子功能、酶功能、进一步结合功能或多聚化功能。在一个实施方式中，N-端延伸是具有已知功能的肽或多肽或者是通过淘选鉴定的肽。
在另一方面，本发明涉及编码本文所述任意多肽的核酸分子文库。在一个实施方式中，本发明提供编码多肽的核酸分子的文库，该多肽具有含随机化环区域的CTLD，其中所述CTLD的环区域按照本文所述的方案(a)-(i)的任一种随机化。在其他实施方式中，本发明提供编码多肽的核酸分子的文库，所述多肽具有按照方案(a)-(i)任一种随机化的CTLD且具有本文所述的任意其他修饰或序列。
核酸分子的文库可以在具有可见表型的展示系统中表达，该可见表型表现所展示的表达产物和相应的基因型的至少一种性质。合适的展示系统的实例包括噬菌体展示系统；酵母展示系统；病毒展示系统；基于细胞的展示系统；核糖体连接展示系统；或质粒连接展示系统。
在另一方面，本发明涉及用于产生本文所述的任意多肽的组合文库的方法。因此，本发明提供用于产生多肽组合文库的方法，该多肽具有含随机化环区域的CTLD，其中所述CTLD的环区域按照本文所述的方案(a)–(i)的任一种随机化。在一个实施方式中，所述方法包括在CTLD的LSA区域中的四个环中的至少一个环中产生至少一种随机突变。在另一实施方式中，所述方法包括在CTLD的LSA区域中的四个环中的至少一个环中产生至少一种随机突变和在CTLD的LBA区域中环中产生至少一种随机突变。随机突变可通过寡核苷酸指导的随机化、随机断裂引起的DNA混编、环混编(loop shuffling)、环步移(loop walking)或易错聚合酶链反应诱变和本领域已知的其他方法来产生。在其他实施方式中，本发明提供用于产生多肽组合文库的方法，所述多肽具有按照方案(a)–(i)任一种随机化的CTLD且具有本文所述的任意其他修饰或序列。
在另一方面，本发明涉及鉴定和分离对靶分子具有特异性结合活性的多肽的方法。在一个实施方式中，所述方法包括提供具有CTLD的多肽的组合文库，其中所述CTLD的环区域按照方案(a)–(j)的任一种随机化；使该组合多肽文库与靶分子在允许多肽与靶分子结合的条件下接触；和分离与该靶分子结合的多肽。在另一实施方式中，所述方法包括提供多肽的组合文库(所述多肽具有按照方案(a)-(i)任一种随机化的CTLD和本文所述的任意其他修饰或序列)；使该组合多肽文库与靶分子在允许多肽与靶分子结合的条件下接触；和分离与该靶分子结合的多肽。所述方法还可包括编码本文所述的组合多肽文库的多肽的核酸分子的文库，其中核酸文库在展示系统中表达，其中所述展示系统包括表现所展示的表达产物和相应的基因型的至少一种性质的可见表型。
本发明还涉及利用核酸分子文库鉴定和分离特异性结合靶标的多肽的方法。在一个实施方式中，本发明提供鉴定和分离能够特异性结合靶标的多肽的方法，包括下述步骤：提供编码多肽的核酸文库，该多肽具有含随机化环区域的CTLD，其中所述CTLD的环区域按照方案(a)–(j)的任一种随机化；在展示系统中表达核酸文库以获得多肽集合(an ensemble of polypeptides)，其中，在一个或更多个序列位置上的氨基酸残基在所述多肽集合的不同成员之间是不同的；使该多肽集合与所述靶标接触；和分离能够与所述靶标特异性结合的多肽。在其他实施方式中，本发明提供编码多肽的核酸分子文库，所述多肽具有按照方案(a)–(i)任一种随机化的CTLD且具有本文所述的任意其他修饰或序列。
在另一方面，本发明提供具有C-型凝集素样结构域(CTLD)的支架结构的多肽，其中所述多肽与不同于该CTLD的天然靶标的靶标结合，而且其中该CTLD的CTLD支架结构按照方案(a)–(j)的任一种进行修饰。在一个实施方式中，所述CTLD支架结构按照方案(a)–(j)的任一种进行修饰而且还包括本文所述的任意其他修饰，例如，在CTLD环球区域外的修饰。在一个实施方式中，所述多肽具有来自人或鼠四联蛋白的CTLD的支架结构并与非纤维蛋白溶酶原的靶标结合。
多肽可利用具有CTLD的多肽的组合物文库产生，其中所述CTLD的环区域按照方案(a)–(j)的任一种随机化，使该组合多肽文库与靶分子在允许多肽与靶分子结合的条件下接触；和分离与该靶分子结合的多肽，其中所述靶分子不是该CTLD的它天然靶。在该方法的一个实施方式中，CTLD是人或鼠四联蛋白。在该方法的另一实施方式中，所述CTLD的环区域按照方案(a)-(j)的任一种随机化并且包括本文所述的任意其他修饰，例如，在CTLD环区域外的修饰。
附图简述
图1描绘了10个已知三维结构的CTLD的氨基酸序列的比对。在每一序列至少标示了主要二级结构元件的序列位置，而且以顺序数字次序进行标记，其中"αX"表示α-螺旋数X，而βY表示β-链数Y。标出了参与CTLD的两个保守二硫键形成的四个半胱氨酸残基并将其标号为CI、CII、CIII和CIV，其中所述二硫键通过CI-CIV和CII-CIII形成。人四联蛋白序列中的各环区域通过下划线标出。
各CTLD包括：
Figure BDA00001748334900121
(人四联蛋白，Nielsen等,(1997))；(甘露糖结合蛋白，Weis等,(1991)；Sheriff等,(1994))；
Figure BDA00001748334900131
(表面活性蛋白D，Hakansson等,(1999))；
Figure BDA00001748334900132
(NK受体LY49A，Tormo等,(1999))；(脱唾液酸糖蛋白受体的H1亚单位，Meier等,(2000))；
Figure BDA00001748334900134
(巨噬细胞甘露糖受体结构域4，Feinberg等,(2000))；
Figure BDA00001748334900135
和
Figure BDA00001748334900136
(分别为凝血因子IX/X-结合蛋白结构域A和B，Mizuno等,(1997)；
Figure BDA00001748334900137
(胰石蛋白(lithostatine)，Bertrand等,(1996))；和
Figure BDA00001748334900138
(被囊类C-型凝集素，Poget等,(1999)).
图2描述了人与小鼠四联蛋白成熟形式的编码区的核苷酸和氨基酸序列的比对，其中标示了已知的二级结构元件。
图3描绘了分离自人(Swissprot P05452)、小鼠(Swissprot P43025)、鸡(Swissprot Q9DDD4)、牛(Swissprot Q2KIS7)、大西洋鲑鱼(SwissprotB5XCV4)、青蛙(Swissprot Q5I0R9)、斑马鱼(GenBank XP_701303)的四联蛋白的数种C-型凝集素结构域，和分离自牛软骨(Swissprot u22298)和礁鲨(Swissprot p26258)的相关CTLD同系物的比对。
图4描绘了人四联蛋白的三维结构(丝带形式)，其描述了该蛋白质的二级结构特征。该结构溶于Ca2+-结合形式。
图5A描绘了人四联蛋白(HTN)和数种四联蛋白同系物的CTLD的三维覆盖结构，所述四联蛋白同系物包括人甘露糖结合蛋白(MBP)、大鼠甘露糖结合蛋白-C(MBP-C)、人表面活性蛋白D、大鼠甘露糖结合蛋白-A(MBP-A)和大鼠表面活性蛋白A。该CTLD覆盖结构利用MacIntosh的Swiss PDB Viewer DeepView v.4.0.1、采用人四联蛋白的三维结构作为模板生成。图5B显示来自人四联蛋白和图5A所述四联蛋白同系物的CTLD的相应的氨基酸序列。在图B中，1HUP=人甘露糖结合蛋白，1BV4A=大鼠甘露糖结合蛋白，2GGUA=人表面活性蛋白D，1KXOA=大鼠甘露糖结合蛋白A，1R13=大鼠表面活性蛋白A。
图6A描述了人四联蛋白(HTN)和数种四联蛋白同系物的CTLD的三维覆盖结构，所述四联蛋白同系物包括人胰腺炎相关蛋白、人树突细胞特异性ICAM-3-捕获性非整联蛋白2(DC-SIGNR)、大鼠聚集蛋白聚糖、小鼠清道夫受体和人清道夫受体。该CTLD覆盖结构利用MacIntosh的Swiss PDB Viewer DeepView v.4.0.1、采用人四联蛋白的三维结构作为模板生成。图6B显示来自人四联蛋白和图6A所述四联蛋白同系物的CTLD的相应的氨基酸序列。在图6B中，1TDQB=大鼠聚集蛋白聚糖，1UV0A=人胰腺炎相关蛋白，2OX8A=人清道夫受体，2OX9A=小鼠清道夫受体，和1SL6A=人DC-SIGNR。
图7显示用于在CTLD中产生随机环的PCR策略。
图8显示经过修饰包含克隆用限制性位点的人四联蛋白CTLD的DNA和氨基酸序列，表明Ca2+结合位点。限制性位点用实线下划线标出。环用虚线下划线标出。钙配位残基用加粗斜体表示，并包括位点1：
Figure BDA00001748334900141
位点2:
Figure BDA00001748334900142
CTLD结构域在氨基酸A45处开始，加粗表示(即ALQTVCL...)。用小写字母表示对本体四联蛋白(TNCTLD)碱基序列的改变。使用不改变天然氨基酸序列的沉默突变产生限制性位点。
图9描绘在CTLD环区域中延长和引入随机化的非限定性策略。
图10显示在下述五种DR5 ATRIMERTM存在下策略细胞死亡的实验结果：4a8c、2a1a、1a7b、9b3d和8b6b。用DR5 ATRIMERTM(20μg/mL)或TRAIL(0.2μg/mL)以1x104细胞/孔温育H2122肺腺癌细胞和A2780卵巢癌细胞。数据以相当于各缓冲液对照的细胞死亡百分比表达。
图11显示本发明多肽及天然IL-23与人IL-23R结合比较的实验结果。
图12显示在本发明的ATRIMERTM复合物4G8、天然人IL-23和优特克单抗(Ustekinumab)存在下IL-23-诱导的IL-17产生比较的实验结果。
图13显示在本发明的ATRIMERTM复合物1A4和优特克单抗存在下IL-23-诱导的IL-17产生比较的实验结果。
图14显示在本发明的ATRIMERTM复合物4G8、天然人IL-23和优特克单抗(Ustekinumab)存在下IL-12-诱导的IFNγ产生比较的实验结果。
图15显示NKL细胞中响应IL-23和本发明多肽的Stat-3磷酸化比较的实验结果。
图16A和16B是显示与若干本发明的ATRIMERTM多肽复合物相关的实验结果表。
发明详述
定义
遍及本申请使用的所有科学和技术术语应当理解为具有其常见的科学/技术含义，除非另外具体说明。类似地，当使用单数形式的术语或冠词时，应当理解其还包括该术语或冠词的复数形式。
术语"C-型凝集素样蛋白质"和"C-型凝集素"用于指存在于任意真核物种的基因组中或在其中编码任何蛋白质或多肽，其中该蛋白质或多肽含一个或更多个C-型凝集素结构域(CTLD)或一个或更多个属于CTLD的任意亚组的一个或更多个结构域(例如，CRD，其能够结合碳水化合物配体)。该定义包括连接膜的C-型凝集素样蛋白质和C-型凝集素、缺乏功能跨膜结构域的"可溶性"C-型凝集素样蛋白质和C-型凝集素，及变体C-型凝集素样蛋白质和C-型凝集素(其中一个或更多个氨基酸残基通过糖基化或任何其他合成后修饰体内进行了变更)，以及通过C-型凝集素样蛋白质和C-型凝集素的化学和酶修饰而得到的任何产物。在权利要求书和整个说明书中，一些变更可参照CTLD或含CTLD蛋白质的特定氨基酸残基数目来确定。参见，Essentials of Glycobiology,second edition.Edited by A.Varki,R.D.Cummings,J.D.Esko,HH.Freeze,P.Stanley,C.R.Bertozzi,G.W.Hart,M.E.Etzler.CHS Press。
所述CTLD由约120个氨基酸残基组成，而且特有地含两个或三个链内二硫键。尽管来自不同蛋白质的CTLD之间在氨基酸序列水平上的相似度相对低，但是已经发现许多CTLD的三维结构是高度保守的，其中结构可变性基本局限于环区域，通常由至多五个环限定。若干CTLD含一个或两个钙结合部位，而且与钙相互作用的大部分侧链位于该环区域中。
基于其三维结构信息是可用的CTLD，已经推断出，规范CTLD的结构特征在于以下述次序顺序出现的7个主要的二级结构元件(即五个β-链和两个螺旋)：β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5。图1图解了十个C-型凝集素的已知三维结构的CTLD的比对。在三维结构已经确定的所有CTLD中，β链以两个反平行β-折叠排列，一个由β1和β5构成，另一个由β2、β3和β4构成。其他β-链β0在序列中通常位于β1之前，而且，当存在时，其形成与β1、β5折叠结合的其他链。此外，两个二硫键，一个连接α1和β5(CI-CIV)，一个连接β3和连接β4与β5的多肽区段(CII-CIII)，迄今为止始终发现于所有CTLD中。
保守的二级结构元件(α螺旋和β折叠)为很多环形成从核心向外伸出的致密支架，其在本上下文中统称为“环区域”。在CTLD的一级结构中，这些环被组织成两个区段，环区段A(LSA)和环区段B(LSB)。LSA表示连接β2和β3的长多肽区段，其通常缺乏常规的二级结构并含有多达4个环。LSB表示连接β-链的β3和β4的多肽区段。LSA中的残基连同β4中的单残基已经显示出特定于若干CTLD(包括四联蛋白的CTLD在内)的Ca2+-和配体-结合部位。例如，诱变研究(包括单或数个残基的置换)已经显示结合特异性、Ca2+-敏感性和/或亲和力的变化可通过CTLD结构域来调节。
如本文所讨论的，许多含有CTLD的蛋白是已知的，包括下述非限定性实例：四联蛋白、胰石蛋白(lithostatin)、小鼠巨噬细胞半乳糖凝集素、星形细胞受体(Kupffer cell receptor)、鸡神经聚糖、perlucin、唾液酸糖蛋白受体、软骨蛋白多糖核心蛋白、IgE Fc受体、胰腺炎相关蛋白、鼠巨噬细胞受体、自然杀伤细胞组、干细胞生长因子、因子IX/X结合蛋白、甘露糖结合蛋白、牛共凝集素、牛CL43、胶原凝集素肝1、表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、e-选择蛋白、被囊类c-型凝集素、CD94NK受体结构域、LY49A NK受体结构域、鸡肝凝集素、鳟鱼c-型凝集素、结合HIV gp 120的c-型凝集素和树突细胞免疫受体。参见美国2007/0275393，该文献以其整体通过参考并入本文。
术语"氨基酸(amino acid,amino acids)"和"氨基酸残基"是指所有天然存在的L-氨基酸以及非天然存在的氨基酸。该定义意图包括正亮氨酸、鸟氨酸和高半胱氨酸。天然存在的L-氨基酸可按照其侧链的化学组成和性质来分类。其被广泛分为两组，带电的不带电的。这些组的每一组被分为亚组，以便更精确地为氨基酸分类：A.带电氨基酸-(A.1.酸性残基):Asp,Glu;(A.2.碱性残基):Lys,Arg,His,Orn;B.不带电氨基酸-(B.1.亲水残基):Ser,Thr,Asn,Gln;(B.2.脂族残基):Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Nle;(B.3.非极性残基):Cys,Met,Pro,Hcy;(B.4.芳香残基):Phe,Tyr,Trp。
"非天然氨基酸"或“非天然存在的氨基酸”是指不属于20个普通氨基酸之一的氨基酸，其包括例如通过天然编码氨基酸(包括但不限于，20个普通氨基酸或焦赖氨酸(pyrolysine)和硒代半胱氨酸)的修饰(例如，翻译后修饰)而产生的氨基酸，但是所述氨基酸并非是通过翻译复合物(translation complex)自然引入生长多肽链中的其自身。此类非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰氨基葡糖-L-丝氨酸、N-乙酰氨基葡糖-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
很多适于用在本发明中的非天然氨基酸是商业可得的，例如来自Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,Wis.,USA)。非商业可得的那些非天然氨基酸任选通过如本文所提供的方法或如在各种出版物中所提供的方法或者利用本领域技术人员知晓的标准方法来合成。关于有机合成技术，参见例如Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon,(1982,Second Edition,Willard Grant Press,Boston Mass.)；Advanced OrganicChemistry by March(Third Edition,1985,Wiley and Sons,New York)；和Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg(Third Edition,PartsA and B,1990,Plenum Press,New York)。描述非天然氨基酸合成的其他出版物保留例如：WO 2002/085923，名称"In vivo incorporation ofUnnatural Amino Acids"；Matsoukas等,(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.& Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis ofGlutamine and of.gamma.-Dipeptides of Glutamic Acid from PhthylatedIntermediates.J.Chem.Soc.,3315-3319；Friedman,O.M.& Chatterrji，R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates forAnti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.等(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.&Frappier,F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials,Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.& Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally ConstrainedAmino Acid Analogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates fromL-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincaminethrough Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org.Chem.1989:1859-1866；Barton等,(1987)Synthesis of Novelα-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis ofL-and D-α-Amino-Adipic Acids,L-α-aminopimelic Acid and AppropriateUnsaturated Derivatives.Tetrahedron Lett.43:4297-4308；和Subasinghe等,(1992)Quisqualic acid analogues:synthesis of beta-heterocyclic2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novelquisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35:4602-7。还可参见US2004/0198637和US 2005/0170404，其每一篇以其整体并入本文作为参考。
术语“氨基酸修饰”和“修饰”是指氨基酸序列中相对于天然序列的氨基酸置换、缺失或插入或其任意组合。在此，置换的变体是那些在天然CTLD序列中去除至少一个氨基酸残基并在相同位置处插入不同的氨基酸的变体。置换可以是单一的，其中在分子中仅仅置换一个氨基酸，或者也可以是多重的，其中在同一分子中置换有两个或更多个氨基酸。具体提到CTLD中的一个以上氨基酸置换是指其中每个单个的氨基酸置换可以发生在CTLD中任意氨基酸位置(包括连续和不连续的氨基酸位置)处的多重置换。类似地，具体提到CTLD中的一个以上的氨基酸插入或缺失是指其中每个单个的氨基酸插入或缺失可以发生在CTLD中任意氨基酸位置(包括连续和不连续的氨基酸位置)处的多重插入或缺失。
术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指沿脱氧核酸链的脱氧核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核苷酸的顺序决定了沿着肽链的氨基酸的顺序。DNA序列由此编码氨基酸序列。
任何上下文中使用的识别随机化多肽或核酸序列的术语“随机化”、“加以随机化”和“随机化的”以及任何类似的术语是指多肽或核酸序列或区段的系综(ensembles)，其中在多肽或核酸系综的不同成员之间，一个或多个序列位置处的氨基酸残基或核苷酸可以不同，使得在每个这样的序列位置处出现的氨基酸残基或核苷酸可以属于一组氨基酸残基或核苷酸，其可包括所有可能的氨基酸残基或核苷酸或其任意严格亚型。该术语常用来指其中对于系综的每个成员可能的氨基酸残基或核苷酸的数目相同的系综，但是也可用来指其中系综的每个成员中可能的氨基酸残基或核苷酸的数目可以是适当整数范围内的任意整数的系综。
术语“调节(modulate或modulating)”当用于指CTLD与纤维蛋白溶酶原、金属(例如，Mg2+,Ca2+,Zn2+,Mn2+等)或任意其他靶分子的结合亲和力时，指的是修饰CTLD与纤维蛋白溶酶原或金属离子或靶分子的结合亲和力相对于天然(未经修饰的)CTLD多肽的结合亲和力的改变。因此，"调节"包括增加结合亲和力、降低结合亲和力和/或完全破坏或取消结合亲和力(尽管并非排除对术语。术语"完全破坏"或"取消(abrogating)"纤维蛋白溶酶原、金属离子或靶分子结合活性的具体描述)。
当涉及结合对时，诸如配体/受体、抗体/抗原或其他结合对，在结合反应中测量结合，所述结合反应用于测定结合对的一个成员在该结合对中另一成员的异源群体中的存在。在指定条件下，当结合对的一个成员与该结合对的另一成员在异源群体中结合而且不以显著量与样品中存在的其他蛋白质或多肽结合时，发生"特异性结合"。特异性结合可利用本文所述的方法测量，包括Biacore和ELISA。
术语“1X-2文库”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在该CTLD的环1中的至少两个氨基酸插入和在其环1内的至少五个氨基酸的随机置换。
术语“1-2文库”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1内的至少五个氨基酸的随机置换和在环2内的至少三个氨基酸的随机置换。
术语“1-4文库”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1内的至少七个氨基酸的随机置换、在环4中的至少三个氨基酸插入和至少两个氨基酸的随机置换。
术语“3X文库”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括下述的混合：至少六个氨基酸的随机置换；至少六个氨基酸的随机置换和至少一个氨基酸置换；以及在环3中的至少六个氨基酸的随机置换和至少两个氨基酸置换。
术语“3-4X文库”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少三个氨基酸插入和在环3内的至少三个氨基酸的随机置换，以及包括在环4中的至少三个氨基酸插入和在环4内的至少三个氨基酸的随机置换。
术语“3-4组合文库(combo library)”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括将两个环组合成单个环的修饰，其中两个经组合的环是环3和环4。
术语“4文库”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环4中的至少四个氨基酸插入和在环4内的至少三个氨基酸的随机置换.
术语“3-5文库”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3内的至少五个氨基酸的随机置换和在环5内的至少三个氨基酸的随机置换。
术语“环3X环文库”是指组合多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域包含在该CTLD的LSA中的四个环中至少一个环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括至少一个氨基酸的随机置换和至少六个氨基酸插入。
具有经修饰CTLD的组合多肽文库
本发明通常涉及组合多肽文库，其包含含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，所述C-型凝集素结构域具有随机化环区域，其中所述随机化环区域已经从该CTLD的天然序列进行修饰。该CTLD的随机化环区域可包含在该CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中至少一个环中的一个或更多个氨基酸修饰，而且还可包含在环区段B(LSB)的环中(也称为环5)的一个或更多个氨基酸修饰。本发明还涉及产生及利用所述随机化组合多肽文库的方法。通过应用化学重组蛋白质和抗体领域已知的标准组合物方法，本发明的所述文库和方法使得可产生、筛选及鉴定对感兴趣靶分子展示结合特异性的蛋白质产物。
在天然存在的CTLD中结合部位构型的变化显示其共同的核结构可容纳很多基本不同的配体结合部位构型(参见例如US2007/0275393)。因此，CTLD特别适于用作构建此类具有期望的结合特性的新型且有用的蛋白质产物。因此，尽管一方面本发明涉及包含对CTLD的环区域(LSA和LSB)进行修饰的组合多肽文库，但是可进行对普通CTLD核结构(即，β-链和α-螺旋)的其他修饰，而不会影响本文所述的文库的实用性。本领域技术人员可靶向CTLD核结构中将会保留CTLD功能性的的特定修饰。例如，基于包含CTLD的各种多肽的二级和三级结构，亲水性、电荷(离子)和氢键相互作用都可被考虑在内，可进行保留CTLD功能的适当置换。此类修饰包括保守氨基酸置换。在CTLD的环区域外部的区域中包含变体诸如、缺失、插入或置换变体的实施方式中，同一性百分比可低达50%。在包含位于CTLD区域内的此类变化的实施方式中，变体与任何特定CTLD序列或CTLD共有序列具有至少80%同一性。在某些实施方式中，此类变体与任何特定CTLD序列或CTLD共有序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
组合文库中所用的CTLD可得自任何CTLD。适当的CTLD实例是本文(即，图1-3)及US 2007/0275393(该专利以整体并入本文作为参考)中所述的CTLD(即，图1和表1)，以及本领域另外已知的CTLD。在某些实施方式中，CTLD具有下述二级结构：以次序β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5顺序出现的五个β-链和两个α-螺旋，所述β-链以两个反平行β-折叠排列，一个由β1和β5组成，另一个由β2,β3和β4组成；至少两个二硫键，一个连接α1和β5，而一个连接β3和连接β4与β5的多肽区段；和含环区段A(LSA)和环区段B(LSB)的环区域，其中LSA连接β2和β3，而LSB连接β3和β4。
在特定实施方式中，CTLD序列是按照本发明进行修饰的人或小鼠四联蛋白CTLD序列。图2显示了人和小鼠四联蛋白CTLD的核酸和堕胎序列的比对。在其他实施方式中，所述CTLD来自多种肽，例如，在图3中所示的那些，图3显示了分离自人(Swissprot P05452)、小鼠(Swissprot P43025)、鸡(Swissprot Q9DDD4)、牛(Swissprot Q2KIS7)、大西洋鲑鱼(Swissprot B5XCV4)、青蛙(Swissprot Q5I0R9)、斑马鱼(GenBank XP_701303)的四联蛋白的数种CTLD，和分离自牛软骨(Swissprot u22298)和礁鲨(Swissprot p26258)的相关CTLD同系物的比对。
因此，在广义方面，本发明提供多肽文库，其包括含C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的和/或在环区段B(LSB)的环(环5)中的一个或更多个氨基酸修饰。本文描述了多肽文库，其包括含有C-型凝集素结构域的多肽，所述C-型凝集素结构域包括在该CTLD的环区域(LSA和LSB)中的五个环中至少一个环中的一个或更多个氨基酸修饰。
在多肽文库的某些实施方式中，多肽成员含有CTLD，其中该CTLD环中的一个、两个、三个、四个或五个具有一个或更多个氨基酸修饰，其中所述一个或更多个氨基酸修饰包括使环区域延伸超出其原始长度的至少一个氨基酸插入。在这些实施方式的某一些中，所述一个或更多个氨基酸修饰包括在环区域(LSA和LSB)的任意单个环中的1至约30个氨基酸插入(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸插入)。在这些实施方式的某一些中，所述一个或更多个修饰包括在环区域的五个环中的至少两个环中的至少一个氨基酸插入(例如，LSA中的两个、三个或四个环，或者LSA中的一个、两个或三个环和LSB中的一个环)。
在某些实施方式中，多肽文库包括含C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述CTLD包括在环区域(LSA和LSB)中的五个环中的至少一个环中的一个或更多个氨基酸修饰，其中某些与环区域中的氨基酸配位的Ca2+得以保留。在其他实施方式中，多肽文库包括含C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述CTLD包括在环区域(LSA和LSB)中的五个环中的至少一个环中的一个或更多个氨基酸修饰，其中某些参与纤维蛋白溶酶原结合活性的氨基酸被消除。
在该方面的某些实施方式中，多肽文库包括含C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述CTLD包括落在LSA和LSB区域外的CTLD区域中的一个或更多个氨基酸修饰。因此，此类修饰可以在任意一个或多个β链和/或α螺旋区域中设计或随机产生。该实例显示在表17中。
任意CTLD的环区域，如果还未鉴定或表征，则可通过利用任意种类的基于结构或序列的分析、利用任意单个已结构表征的CTLD或已结构表征的CTLD的任意组合的基于现有序列的信息进行鉴定。通常，环区域是发现于CTLD氨基酸序列的更有序区域之间(例如，在α-螺旋或β-链之间)的氨基酸的一段序列，且其通常具有更柔韧的构象。CTLD中的环区段A(LSA)通常落在规范CTLD基序的β2与β3链之间。(LSA)含有较小的环区域(环1、2、3和4)，该区域通常位于小β折叠结构之间，该结构为(LSA)赋予有序程度(参见例如图4)。CTLD通常具有位于β3与β4之间的较小的环结构(环区段B，"LSB"或"环5")。
如上所述，可基于任意单个已结构表征的CTLD或已结构表征的CTLD的任意组合的现有序列信息，利用基于结构和/或序列的分析来鉴定任意CTLD的环区域。例如，任意未表征CTLD的环区域的位置可通过比对预期的CTLD序列与图1所呈现的结构已表征CTLD组来鉴定。图1所示的序列比对根据三维结构数据进行严格解释。倘若框架的相应结构元件的多肽区段也展示很强的氨基酸序列相似性，则图1提供一组直接的序列-结构标记，其可容易地根据序列比对来推断。入在图1中所示，环区域(LSA和LSB)位于对应于β2-链、β3-链和β4-链的区段侧面(LSA的环1-4通常落在规范CTLD的β2与β3链之间，而LSB的环5通常位于CTLD的β3与β4之间)。β2-链、β3-链和β4-链可通过鉴定其各自的共有序列来鉴定(公布于美国专利申请公开2007/0275393中)。通过将预期CTLD的序列与图1所示的序列进行比对，并如序列比对所指导来分配框架结构元件的位置(即，鉴定β2-链、β3-链和β4-链，调整比对，以确保参与迄今不变地发现于所有已表征CTLD中的两个保守二硫键(图1中的CI-CIV和CII-CIII)形成的四个规范半胱氨酸残基的精确比对)，可鉴定预期CTLD的环区域。此外，通过将预期CTLD的序列与图1中的任意CTLD序列进行比对，利用已知的蛋白质模拟程序鉴定诸如MacIntosh的Swiss PDB Viewer DeepView v.4.0.1，可以鉴定CTLD的环区域。可以相同习惯使用的其他蛋白质模拟程序是本领域已知的且由于公众应用而是可得的，例如，MODELLER and Selvita SPMP 2.0(见Sali A,Blundell TL.(1993)Comparative protein modelling by satisfactionof spatial restraints.J.Mol.Biol.234,779-815；Marti-Renom MA,StuartA,Fiser A,Sánchez R,Melo F,Sali A.(2000)Comparative proteinstructure modeling of genes and genomes.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29,291-325；Fiser A,Sali A.(2003)Modeller:generation andrefinement of homology-based protein structure models.Methods Enzymol.374:461-91)。
序列-结构分子也证实，CTLD可用作构建新CTLD文库种类的框架。基于精确三维结构还未测定的CTLD来制备用于构建新CTLD文库种类原材料所涉及的其他步骤包括下述：(1)将新CTLD的序列与图1中所示的序列进行比对；和(2)按照序列比对的指导分配框架结构元件的近似位置，观察是否需要对该比对进行微小调整，以确保参与两个保守二硫键(图1中的CI-CIV和CII-CIII)形成的四个规范半胱氨酸残基的精确比对。
用于本发明多肽文库中的含CTLD的多肽可以是具有CTLD的全长蛋白质或部分蛋白质，例如，本文所述及另外已知的任意蛋白质的全长氨基酸序列或部分氨基酸序列。可选地，用于本发明多肽文库中的含CTLD的多肽可以是仅含CTLD序列的多肽，例如，本文所述及另外已知的任意CTLD的氨基酸序列。含CTLD序列的多肽可以具有添加的侧翼C-端和/或N-端(非-CTLD)氨基酸序列。
一方面，本发明提供组合肽文库和编码该文库的多肽的核酸序列的文库，其中所述多肽的CTLD已经按照多种方案进行修饰，仅出于识别的目的，所述方案已经被标记为方案(a)-(j)。尽管每个方案在本文中进行了更具体的描述，但是所述修饰至少如下述：
在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1中的至少一个氨基酸插入在环1内的至少五个氨基酸的随机置换；
在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1内的至少五个氨基酸的随机置换和在环2内的至少三个氨基酸的随机置换；
在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1内的至少七个氨基酸的随机置换和在环4中的至少一个氨基酸插入；
在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少一个氨基酸插入和在环3内的至少三个氨基酸的随机置换；
在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括将两个环组合成单个环的修饰，其中两个经组合的环是环3和环4；
在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环4中的至少一个氨基酸插入和在环4内的至少三个氨基酸的随机置换；
在CTLD的环区段A(LSA)和环区段B(LSB)中的五个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少五个氨基酸残基的随机置换和在环5内的至少三个氨基酸的随机置换；
在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少一个氨基酸的随机置换和至少六个氨基酸的插入；
(i)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括下述的混合：(1)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换和，(2)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换和至少一个氨基酸插入；和
(j)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在CTLD的环区段A(LSA)的四个环中的至少一个中的或在环区段B(LSB)的环5中的至少四个或更多个氨基酸插入。
关于方案(a)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在该CTLD的LSA的四个环中的至少一个中的或在LSB的环中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1中的至少一个氨基酸插入和在环1内的至少五个氨基酸的随机置换。
在组合文库的该方面的某些实施方式中，当CTLD来自人类四联蛋白时，该CTLD还具有精氨酸-130的随机置换。对于非人类四联蛋白的CTLD的CTLD而言，该肽的位置紧邻C端方向的环2的C端肽。例如，在鼠四联蛋白中，该肽是Gly-130。在组合文库的该方面的某些实施方式中，当CTLD来自四联蛋白时，例如，人或鼠四联蛋白，该CTLD包括在环4中的赖氨酸-148置换为丙氨酸。
在某些实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD，所述氨基酸修饰包括在环1中的两个氨基酸插入和在环1内的至少五个氨基酸的随机置换。在其他实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD而且CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的至少一个氨基酸插入、在环1内的至少五个氨基酸的随机置换，并且包括精氨酸130的随机置换。在一个具体实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD而且CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的两个氨基酸插入、在环1内的五个氨基酸的随机置换和精氨酸130的随机置换。在一个具体实施方式中，当组合文库具有方案(a)的修饰CTLD而且CTLD来自鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的两个氨基酸插入、在环1内的五个氨基酸的随机置换和亮氨酸130的随机置换。在方案(a)的任意实施方式中，所述氨基酸修饰还可包括赖氨酸-148置换为丙氨酸。因此，在组合文库的该方面的一个具体实施方式中，所述CTLD包括在环1中的两个氨基酸插入、在环1内的至少五个氨基酸的随机置换、精氨酸-130或位于C端方向环2外部或邻近的其他氨基酸的随机置换以及在环4中赖氨酸-148置换为丙氨酸。
关于方案(b)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在该CTLD的LSA的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1内的至少五个氨基酸的随机置换和在环2内的至少三个氨基酸的随机置换。
在方案(b)的组合文库的该方面的某些实施方式中，当CTLD来自四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1内的至少五个氨基酸的随机置换、环2内至少三个氨基酸的随机置换以及精氨酸-130或位于C端方向环2外部或邻近的其他氨基酸的随机置换。在某些实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD而且CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的至少五个氨基酸的随机置换、在环2中的至少三个氨基酸的随机置换，并且包括精氨酸130的随机置换。在一个实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD而且CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的五个氨基酸的随机置换、在环2中的三个氨基酸的随机置换和精氨酸130的随机置换。在某些其他实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD而且CTLD来自鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的至少五个氨基酸的随机置换、在环2中的至少三个氨基酸的随机置换，并且包括亮氨酸130的随机置换。在一个实施方式中，当组合文库具有方案(b)的修饰CTLD而且CTLD来自鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环1中的五个氨基酸的随机置换、在环2中的三个氨基酸的随机置换和亮氨酸130的随机置换。在方案(b)的任意实施方式中，所述氨基酸修饰还可包括赖氨酸-148置换为丙氨酸。因此，在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环1内的至少五个氨基酸的随机置换、环2内至少三个氨基酸的随机置换，以及精氨酸-130或位于C端方向环2外部或邻近的其他氨基酸的随机置换，以及在环4中赖氨酸-148置换为丙氨酸。
关于方案(c)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在该CTLD的环区段A(LSA)的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1内的至少七个氨基酸的随机置换和在环4中的至少一个氨基酸插入。
在组合文库的该方面的某些实施方式中，所述组合文库的多肽成员还包括在环4内的至少两个氨基酸的随机置换。在该方面的某些其他实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环4内的三个氨基酸插入，以及任选还包括至少两个氨基酸的随机置换。在一个实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环1内的至少七个氨基酸的随机置换、在环4中的至少三个氨基酸插入以及在环4内的至少两个氨基酸的随机置换。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环1内的七个氨基酸的随机置换、在环4中的三个氨基酸插入以及在环4内的两个氨基酸的随机置换。
关于方案(d)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在该CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少一个氨基酸插入和在环3内的至少三个氨基酸的随机置换。
在某些实施方式中，当组合文库具有方案(d)的修饰CTLD时，所述氨基酸修饰还可包括在环4中的至少一个氨基酸插入，并且还可包括在环4内的至少三个氨基酸的随机置换。在任意所述的方案(d)的实施方式中，所述氨基酸修饰可包括在环3中的三个氨基酸插入。在任意所述的方案(d)的实施方式中，所述氨基酸修饰可包括在环4中的三个氨基酸插入。因此，在某些实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3内的至少三个氨基酸的随机置换、在环4内的至少三个氨基酸的随机置换、在环3中的至少一个氨基酸插入和在环4中的至少一个氨基酸插入。在某些实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3内的至少三个氨基酸的随机置换、在环4内的至少三个氨基酸的随机置换、在环3中的至少三个氨基酸插入和在环4中的至少三个氨基酸插入。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3内的三个氨基酸的随机置换、在环4内的三个氨基酸的随机置换、在环3中的三个氨基酸插入和在环4中的三个氨基酸插入。在任意上述实施方式中，当CTLD是四联蛋白时，氨基酸修饰还可包括环4中赖氨酸-148至精氨酸的随机置换。
关于方案(e)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括将两个环组合成单个环的修饰，其中两个经组合的环是环3和环4。在某些实施方式中，当组合文库的成员具有方案(e)的修饰CTLD时，所述氨基酸修饰包括环3内的至少六个氨基酸的随机置换和环4内的至少四个氨基酸的随机置换。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括环3内的六个氨基酸的随机置换和环4内的四个氨基酸的随机置换。在方案(e)的任意实施方式中，当CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰还可包括脯氨酸-144的随机置换。在一个具体实施方式中，当CTLD来自人类四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括环3内六个氨基酸的随机置换、环4内四个氨基酸的随机置换和脯氨酸-144的随机置换，产生组合的环3和环4氨基酸序列，其包括，例如，NWEXXXXXXX XGGXXXN(SEQ ID NO:578)，其中X是任意氨基酸，且SEQ ID NO:578的氨基酸序列形成单个环区域。因此，在一个具体实施方式中，组合文库的多肽成员包括序列NWEXXXXXXXXGGXXXN(SEQ ID NO:578)，其中X是任意氨基酸，且其中SEQ IDNO:578的氨基酸序列从经组合并经修饰的环3和环4形成单个环。
关于方案(f)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环4中的至少一个氨基酸插入和在环4内的至少三个氨基酸的随机置换。在某些实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环4中的四个氨基酸插入。在一个实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环4中的至少四个氨基酸插入和在环4内的至少三个氨基酸的随机置换。在一个具体实施方式中，所述氨基酸置换包括在环4中的四个氨基酸插入和在环4内的三个氨基酸的随机置换。
关于方案(g)，组合文库的多肽成员包括经修饰的环3和经修饰的环5，其中该经修饰的环3包括五个氨基酸残基随机化，而该经修饰环5包括三个氨基酸残基随机化。在一个实施方式中，组合文库的多肽成员包括经修饰的环3、经修饰的环5和经修饰的环4，其中对环4的修饰消除了纤维蛋白溶酶原结合。例如，当组合文库具有方案(g)的修饰CTLD且CTLD来自四联蛋白时，所述氨基酸修饰还可包括在环4中的一个或更多个氨基酸修饰，其调节CTLD的纤维蛋白溶酶原结合亲和力，例如，赖氨酸148置换为丙氨酸。因此，在某些实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰包括在环3中的至少五个氨基酸残基的随机置换、在环5中的至少三个氨基酸残基的随机置换和在环4中的赖氨酸148置换为丙氨酸。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3中的五个氨基酸残基的随机置换和在环5中的三个氨基酸残基的随机置换，以及，在另一具体实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，所述氨基酸修饰还包括环4中的赖氨酸148置换为丙氨酸。
关于方案(h)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括至少一个氨基酸的随机置换和至少六个氨基酸插入。在某些实施方式中，当CTLD来自四联蛋白时，所述氨基酸修饰还可包括在环4中的一个或更多个氨基酸修饰，其调节CTLD的纤维蛋白溶酶原结合亲和力，例如，赖氨酸148置换为丙氨酸。在某些实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，组合文库的成员具有在环3中的至少一个氨基酸的随机置换和至少六个氨基酸的插入和在环4中的赖氨酸148置换为丙氨酸。在一个具体实施方式中，所述氨基酸修饰包括在环3中的一个氨基酸的随机置换和六个氨基酸的插入。在一个具体实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，组合文库的成员具有在环3中的一个氨基酸的随机置换和六个氨基酸的插入。和在环4中的赖氨酸148置换为丙氨酸。在任意这些实施方式中，当CTLD来自人或鼠四联蛋白时，置换之一是异亮氨酸140的置换。
关于方案(i)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括下述的混合：在环3中的六个氨基酸的随机置换和在环3中六个氨基酸的随机置换和一个氨基酸插入。在一个实施方式中，所述混合还包括在环3中的六个氨基酸的随机置换和两个氨基酸插入。因此，在一个实施方式中，所述氨基酸修饰包括下述的混合：在环3中六个氨基酸的随机置换、在环3中六个氨基酸的随机置换和一个氨基酸插入以及在环3中六个氨基酸的随机置换和两个氨基酸插入。在方案(i)的任意实施方式中，当CTLD来自四联蛋白时，所述氨基酸修饰还包括环4中赖氨酸148置换为丙氨酸。
关于方案(i)，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中，其中所述氨基酸修饰包括在CTLD的环区段A(LSA)的四个环中的至少一个中的或在环区段B(LSB)的环5中的至少四个或更多个氨基酸插入。
在其中组合文库包括对环4区域的一个或更多个氨基酸修饰(单独修饰或与CTLD的其他区域的修饰相结合)的实施方式中，某些修饰被设计为维持、调节或消除CTLD的金属离子结合亲和性。此类修饰影响CTLD的纤维蛋白溶酶原结合亲和性(参见例如Nielbo等,Biochemistry,2004,43(27),pp 8636–8643；或Graversen 1998)。
文库的多肽成员可包括在CTLD的四个LSA环和LSB环(环5)中任意组合中的一个或更多个氨基酸修饰(例如，通过插入、置换、延伸或随机化)。因此，在本文所述的各种实施方式的任一种中，随机化CTLD可包括在LSB环区域的环(环5)中的一个或更多个氨基酸修饰，或者单独的修饰，或者与LSA环区域(环1-4)的任意一个环、两个环、三个环或四个环中的一个或更多个氨基酸修饰相结合。一方面，本发明提供组合多肽文库，其包括具有随机化C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述随机化CTLD包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的一个或更多个氨基酸修饰和环区段B(LSB)的环(环5)中的一个或更多个氨基酸修饰，其中所述一个或更多个氨基酸修饰包括LSB氨基酸残基的随机化。
根据本文所述的各种实施方式，所述组合文库的多肽成员可具有在CTLD的环区域(LSA和LSB)中的任意两个环、三个环、四个环或五个环中的一个或更多个氨基酸修饰(例如，对两个环、对三个环、对四个环或对所有五个环的随机氨基酸修饰的任意随机组合)。所述组合文库的多肽成员还可包括对环区域(LSA和LSB)外的CTLD区域的其他氨基酸修饰，诸如在α-螺旋或β-链中(参见例如图1)。
在本发明其他实施方式中，所述CTLD环区域可以被延伸超出在下面非限定性实例中详述的示例性构建物之外。
一方面，本发明还提供编码按照上述任一个方面和实施例所述的组合多肽文库的多肽的核酸分子的文库。在该方面的一个实施方式中，本发明提供编码所述文库的多肽的核酸序列，其中所述多肽的CTLD已经按照方案(a)-(j)进行修饰。
生成重组CTLD修饰环文库
一方面，本发明提供生成多肽文库的方法，该多肽文库包括含有C-型凝集素结构域(CTLD)的多肽成员，其中所述CTLD包含在该CTLD的环区段A(LSA)的四个环中至少一个环中和/或其环区段B(LSB)(环5)的环中的一个或更多个氨基酸修饰。
在该方面的实施方式中，该方法包括在CTLD的LSA区域中的四个环中的至少一个环中和/或其LSB区域中的环中产生至少一个随机突变，其中所述至少一个随机突变包括：(a)在至少一个环中一个或更多个氨基酸插入；或(b)在至少一个环内或其邻近的一个或更多个氨基酸的置换；或(c)在至少一个环内或其邻近的一个或更多个氨基酸的缺失；(d)组合两个相邻环的修饰，或(e)它们的任意组合。
在该方面的某些实施方式中，该方法包括按照任意方案(a)-(j)在CTLD的LSA区域中的四个环中的至少一个环中和/或其LSB区域中的环中产生随机突变。
在该方面的某些实施方式中，重组CTLD文库的多肽包含修饰CTLD，在该CTLD中，在环区域中的一些Ca2+配位氨基酸被保留和/或包括纤维蛋白溶酶原结合活性被消除的修饰CTLD。
此外，在该方面的某些实施方式中，重组CTLD文库可包括具有修饰CTLD区域的多肽，其中氨基酸修饰落在CTLD的环区域(LSA和LSB)外。因此，此类修饰可在任一种或多种β链和/或α螺旋区域中设计或随机产生。
产生随机化且最优化重组CTLD文库以获得可特异性结合感兴趣靶标的蛋白质产物可通过本领域已知的任意技术来实施，所述技术例如，寡核苷酸指导的随机化、易错聚合酶链反应诱变、随机断裂引起的DNA混编、环混编、环步移(loop walking)、体细胞高变(参见例如美国专利公开2009/0075378，其被引入作为参考)，以及本领域已知的可建立序列多样性以产生具有最佳结合活性的分子的其他方法。(参见例如Stemmer,W.P.,Proc Natl Acad Sci USA,(Oct.1994)91:10747-751；Patrick,W.M.& Firth,A.E.,Biomolecular Engineering,(2005)22:105-112；Firth,A.E.& Patrick,W.M.,Bioinformatics,(2005)21(15):3314-3315；和Lutz S.& Patrick,W.M.,Curr.Opin.Biotechnol.,(2004)15:291-297)。
在某些实施方式中，产生及优化方法包括用于诱变环的寡核苷酸定点随机化(NNK或NNS)策略。例如，示于图1和图4中的人四联蛋白(hTN)CTLD含五个环(LSA中的四个环和LSB中的一个环)，这些环可被更改，以使CTLD与任意感兴趣靶分子结合。随机的氨基酸序列(经由随机化、置换、插入等产生)可被引入这些环的一个或多个中，以建立可以从中选出具有期望结合性能的CTLD结构域的文库。可利用如本文所述的NNK或NNS完成这些文库的构建，这些文库含有限于人四联蛋白CTLD的五个环中任一种或全部中的随机肽。这些文库还可包括被引入位于LSA或LSB区域外部的CTLD区域中的氨基酸修饰(例如，α-螺旋和/或β-链)。下述步骤描述了一种可将七个随机肽插入hTN CTLD的环1中的方法的非限定性、说明性实例。
利用下述策略，PCR可用于产生第一片段(片段A，见图7)。正向Oligo 1Xfor(5’-GG CTG GGC CTG AAC GAC ATG NNK NNK NNKNNK NNK NNK NNK TGG GTG GAT ATG ACT GGC GCC-3’；SEQ IDNO:137)(其中N=A,T,G或C，且K=G或T)编码CTLD的环1周围的区域，但是用七个NNK密码子代替编码五个氨基酸(AAEGT；SEQ ID NO:579)的15个和核苷酸。这些编码七个随机氨基酸的NNK密码子置换编码五个天然四联蛋白氨基酸的野生型密码子。Oligo 1Xfor(SEQ ID NO:137)可用反向oligo 1Xrev2(5’-GGC GGT GAT CTC AGT TTC CCAGTT CTT GTA GGC GAT GCG GGC GCC AGT CAT ATC CACCCA-3’；SEQ ID NO:580)退火。该两个在其3'端的21个核苷酸内是互补的。参考图7，利用PCR从这两个重叠的寡核苷酸(oligos)产生片段A(101bp)。类似地，通过利用正向oligo BstX1 for(5’-ACT GGG AAACTG AGA TCA CCG CCC AAC CTG ATG GCG GCG CAA CCG AGAACT GCG CGG TCC TG-3’；SEQ ID NO:139)和反向引物PstBssRevC(5’-CCC TGC AGC GCT TGT CGA ACC ACT TGC CGT TGG CGGCGC CAG ACA GGA CCG CGC AGT TCT-3’；SEQ ID NO:140)进行PCR以产生105bp片段，可建立片段B(见图7)。可利用高保真聚合酶或taq混合和标准PCR热循环调节进行PCR。片段A的3'端与片段B的5'端互补。这些片段可进行凝胶分离并随后合并以利用外引物Bglfor12(SEQID NO:141)and PstRev(SEQ ID NO:142)实现重叠延伸PCR。所产生的195bp片段可凝胶分离，然后用限制酶Bgl II和Pst I消化，之后可凝胶分离最终的185bp片段并将其克隆到含有下面所示与基因III融合的限制修饰的CTLD的噬菌体展示载体(诸如CANTAB 5E)中，该片段类似地用Bgl II和Pst I消化以进行克隆。
用随机化氨基酸置换的其他环的修饰可如本文所述类似地进行。环内确定氨基酸被随机化氨基酸的置换并不局限于任意特定环，也不局限于环的原始大小。同样，环的总体置换不是必要的，可对任意环进行部分置换。在一些情况中，可能需要保留环内的一部分原始氨基酸诸如钙配位氨基酸。在这些情况中，利用随机化氨基酸进行的置换可对环内的任一方较少数氨基酸进行，以保留钙配位氨基酸，或者可将额外的随机化氨基酸加至环中，以增加环的总体大小但是仍然保留这些钙配位氨基酸。通过将环区域诸如环1和2或者环3和4组合成较大置换环，可容纳非常大的肽并对其进行测试。
利用核酸化学合成常规方法，通过进行分步合成，以便在核酸片段化学合成的每一步添加纯核苷酸单体的预定组合或核酸单体任意组合的混合物，可获得核酸分子。以这种方式，能够产生从一个单一氨基酸序列到最复杂混合物的任意水平的序列简并，其将表示最大数目4N的单一序列的完整或不完整表现，其中N是序列中的核苷酸数。
可选地，通过对高分子量核酸组合物(诸如从任意生物体提取的染色体组核酸)进行化学、物理或酶断裂而产生核酸片段的混合物，可以制备包含多个核酸片段的复杂组合物。为使此类核酸片段的混合物用于产生如本文所述的重组体文库，在初期分裂步骤中获得的粗制片段混合物通常将被按大小分离，以获得近似分子量范围的片段，然后，通常使所述片段与适宜的接头核酸对相连，该适宜的接头核酸对被设计来促进大小受限的寡核苷酸片段的接头嵌入式混合物插入接收核酸载体中。
通过核酸分子克隆的任何常规方法，诸如通过化学合成核酸被拷贝编辑到接收核酸中的适当设计的PCR处理，可将核酸片段在特定位置插入接收核酸(receiving nucleic acid)中，在这种情况下，对插入而言内切核酸酶限制位点不是必需的。可选地，通过将内切核酸酶限制位点的适当组合基因工程到靶核酸中，可促进核酸片段的插入/切除，利用核酸分子克隆的标准方法可将适当设计的寡核苷酸片段插入该靶核酸中。
在对特定靶标(例如，真核细胞、病毒、细菌、特定蛋白质、多糖、其他聚合物、有机化合物等)进行数轮选择之后，从特定噬菌体分离DNA，测定编码配体结合区域的区段的核苷酸序列，将其从噬菌粒DNA切除并转移到适当的衍生物表达载体，以便异源产生期望产物。在原核生物中的异源产生可用于分离期望产物。
为促进组合CTLD文库的构建，可将限制位点引入CTLD中。例如，设计位于编码人和小鼠四联蛋白中β2、β3和β4的核酸序列邻近的合适的限制位点，其对由所更改序列编码的多肽序列的干扰最小。已发现能够建立如下详述的设计策略，通过该设计策略相同的内切核酸酶限制位点可在该两个序列中的相应的位置引入这使得感兴趣的环区域变体可容易地从重组小鼠CTLD中切除并恰当地插入人四联蛋白的CTLD框架中，反之亦然。
对编码人四联蛋白成熟形式的核苷酸序列的分析显示(图2)，发现限制酶Bgl II的识别位点位于位置326至331(AGATCT)，其涉及β2的已编码残基Glu109、Ile110和Trp111，而且发现限制酶Kas I的识别位点位于位置382至387(GGCGCC)，其涉及已编码氨基酸残基Gly128和Ala129(在环2中位于C端)。通过利用四联蛋白序列中天然存在的氨基酸的交替密码子，将限制酶位点Pst I(CTGCAG)和Mfe I(CAATTG)在位置501到506(最初，CTGCCG)基因工程到四联蛋白编码序列中，所述位置涉及已编码的氨基酸残基Arg167、Cys168和Arg169，以及在位置511至516(最初，CAGCTG)基因工程到四联蛋白编码序列中，所述位置涉及已编码的氨基酸残基Gln171和Leu172，所有位置均位于β4与β5之间。
在本发明的其他某些方面中，提供了包含本文所述至少一种核酸的质粒、载体、转录或表达盒形式的核酸构建物。可选择或构建合适的载体，其含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。载体可以是质粒、病毒例如噬菌体或者合适的噬菌粒。关于其他详细情况，参见例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition,Sambrook等,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
本发明还提供包含一种或更多种如本文所述的构建物的重组宿主细胞。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中用于表达异源多肽的可用哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、海拉细胞、幼仑鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞和很多其他细胞。在一个实施方式中，所述宿主细胞是HEK293细胞。
展示系统
本文所述的所得重组CTLD文库可利用本文所述及本领域中已知的很多可选技术来展示。在展示系统中表达核酸分子文库的方法描述于美国专利申请公开2007/0275393中，该文献以其整体并入本文作为参考。在一个实施方式中，展示系统包括可观察的表型，其呈现所展示的表达产物以及相应基因型的至少一种性质。合适的展示系统的实例包括噬菌体展示系统；酵母展示系统；病毒展示系统；基于细胞的展示系统；核糖体连接展示系统；或质粒连接展示系统；它们的任意组合，或者本领域已知的任意其他合适的展示系统。
因此，一方面，本发明提供展示系统，其包含按照上述方面和实施方式中任一种所述的组合多肽文库。在该方面的一个实施方式中，本发明提供展示系统，其包含根据方案(a)-(i)所述的组合多肽文库。
在该方面的某些实施方式中，展示系统包括：噬菌体展示系统；酵母展示系统；病毒展示系统；基于细胞的展示系统；核糖体连接展示系统；或质粒连接展示系统；它们的任意组合，或者本领域已知的任意其他合适的展示系统。
就推定配体结合模数(putative ligand binding module)或具有推定酶活性的模数而言，已经描述了若干展示表型的系统。这些包括：噬菌体展示(例如丝状噬菌体fd[Dunn(1996)，Griffiths和Duncan(1998)，Marks等(1992))，λ噬菌体(Mikawa等(1996))，在真核病毒上展示(例如杆状病毒(Ernst等(2000))，细胞展示(例如在细菌细胞(Benhar等(2000)))，酵母细胞(Boder和Wittrup(1997))，和哺乳动物细胞(Whitehorn等(1995)))上展示，核糖体连接展示(Schaffitzel等(1999))，和质粒连接展示(Gates等(1996))。
一种表型展示并将其与基因型相连的常用方法是通过噬菌体展示。这通过将编码支架蛋白或感兴趣蛋白的读码框插入表明暴露的噬菌体蛋白来完成。丝状噬菌体fd(例如，M13)已经证实可用于该目的。
美国专利申请公开第2007/0275393号描述了一种用于完成展示系统以产生CTLD文库的方法。一般而言，用于产生上述CTLD文库的展示系统的方法包括：
(1)鉴定CTLD中环区域的位置；
(2)将编码所选CTLD的核酸片段亚克隆到蛋白质展示载体系统中，之前插入或未插入接近编码CTLD中β2、β3和β4的序列的核酸内切酶限制位点；和
(3)用由多个核酸片段组成的组的随机选择成员取代编码所选CTLD的部分或全部环区域的核酸片段，导致CTLD的原始环区域随机化和/或延伸。每个克隆的核酸片段，其编码具有已置换环区段或全部环区域的新多肽，将在其新序列背景中测定的阅读框内解码。
CTLD环区域的位置可利用本文前面所述的方法鉴定。简言之，该环区域可通过参考所选CTLD的三维结构来鉴定，如果此种信息可得的话，或者如果此种信息不可得，则通过与图1中所示序列的序列比对来鉴定β2-、β3-和β4-链的序列位置，来鉴定该环区域，所述序列比对通过鉴定对应于β2和β3共有序列元件和β4-链特征的序列元件以及也在本文图1中公开的保守半胱氨酸残基协助进行。
鉴定和分离与靶分子结合的CTLD多肽的策略
一方面，本发明提供一种鉴定与分离与靶分子具有特异性结合活性的多肽的方法，其中所述方法包括：(a)提供本发明的组合多肽文库；(b)使该组合多肽文库的多肽与靶分子在允许多肽与该靶分子之间进行结合的条件下接触；和(c)分离与该靶分子结合的多肽。在各种实施方式中，靶分子可包括：与细胞(诸如真核细胞；肿瘤细胞、免疫细胞、细菌细胞、原生动物、真菌以及感染病毒的细胞)表面结合的任意分子；蛋白质(诸如受体蛋白、可溶蛋白、酶或抗体)；多糖；聚合物；和小有机化合物。
在另一方面，本发明提供一种鉴定与分离与靶分子具有特异性结合活性的多肽的方法，其中所述方法包括：一种鉴定与分离与靶分子具有特异性结合活性的多肽的方法，其中所述方法还包括编码所述组合多肽文库的多肽的核酸分子文库，其中所述核酸文库在展示系统中表达。在一个实施方式中，展示系统包括可观察的表型，其呈现所展示的表达产物以及相应基因型的至少一种性质。
在另一方面，本发明提供一种鉴定与分离与靶分子具有特异性结合活性的多肽的方法，包括下述步骤：(a)提供编码权利要求1所述的多肽文库的核酸分子文库；(b)在展示系统中表达所述核酸分子文库，以获得多肽集合(an ensemble of polypeptides)，在该集合中，一个或多个序列位置上的氨基酸残基在所述多肽集合的不同成员之间是不同的；(c)使该多肽集合的多肽与所述靶分子在允许多肽与该靶分子之间进行结合的条件下接触；和(d)分离能够与所述靶分子结合的多肽。
在任意这些方面和实施方式中，本发明提供一种鉴定与分离与靶分子具有特异性结合活性的多肽的方法，其中所述多肽已经按照方案(a)-(i)中任一种进行修饰。
在一个方面，感兴趣靶分子的特异性结合成员可以通过选择特异性结合该靶分子的文库成员而由多肽随机文库获得。如本文所讨论的，已知很多用于展示具有推定配体结合位点的表型的系统。这些包括：噬菌体展示(例如丝状噬菌体fd[Dunn(1996),Griffiths和Duncan(1998),Marks等(1992)]，λ噬菌体[Mikawa等(1996)])，在真核病毒上展示(例如杆状病毒[Ernst等(2000)])，细胞展示(例如在细菌细胞[Benhar等(2000)]，酵母细胞[Boder和Wittrup(1997)]，和哺乳动物细胞[Whitehorn等(1995)])上展示，核糖体连接展示[Schaffitzel等(1999)]，和质粒连接展示[Gates等(1996)]。
为选择与靶分子具有结合活性的多肽，可构建文库，并首先或者以单一单体CTLD结构域或者以噬菌体表面上展示的单独肽，作为单体元件筛选与所述靶分子的结合。通过将展示于噬菌体表面上的CTLD支架内的五个不同环中的一个或多个环中(或者环外)的氨基酸随机化，可构建文库。通过噬菌体展示淘选可选出与靶分子的结合。
在噬菌体展示文库构建中可以使用数种策略。一种策略是构建和/或使用随机肽噬菌体展示文库。可单独在噬菌体颗粒表面展示构建为二硫键约束环的随机线性肽和/或随机肽，并通过噬菌体展示“淘选”而筛选与期望靶分子结合的随机线性肽和/或随机肽。在获得具有期望结合活性的肽克隆后，可将这些肽移植到人四联蛋白的三聚结构域上或移植进入CTLD结构域的环中然后移植到三聚结构域上并筛选激动剂活性。
构建噬菌体展示文库和三聚结构域构建体的另一种策略包括获得CTLD来源的结合物(binder)。可以通过将噬菌体表面上展示的人四联蛋白CTLD骨架中五个不同环的一个或多个环中的氨基酸随机化而构建文库。可以通过噬菌体展示淘选而筛选与靶分子的结合。在获得包含证明具有期望结合活性的肽环的CTLD克隆后，这些CTLD克隆之后将移植到人四联蛋白的三聚结构域并筛选激动剂活性。
另一种策略包括使用具有已知的结合感兴趣靶能力的肽序列，并首先通过用肽两侧的随机氨基酸或/或肽中的随机选择内部氨基酸建立新文库而提高其结合能力，然后通过噬菌体展示筛选改进的结合。获得亲和力更好的结合物后，这些肽的结合物可与其他功能蛋白结构域诸如人四联蛋白的三聚结构域融合(在下文讨论并在PCT/US09/60271和US.2010/0028995中详细讨论，该篇文献以其整体并入本文作为参考)，并评价期望活性。在这种方法中，如下构建原始文库：其可作为在噬菌体颗粒表面展示的游离肽，如在第一种策略中，或者如上面讨论的第二种策略中，其可作为CTLD支架中的受约束环(constrainedloop)。这些展示策略详细地描述于PCT/US09/60271中，该文献以其整体并入本文作为参考。
下文更具体地描述了用于鉴定与分离与感兴趣靶分子具有特异性结合活性的多肽的示例性策略。尽管这些策略集中在噬菌体展示上，但是可以使用鉴别多肽的其它等同方法。
策略1
市场销售肽展示文库试剂盒如，但不限于，New England BiolabsPh.D.噬菌体展示肽文库试剂盒，并且可以购买用于筛选具有靶分子结合活性的新肽。有三种形式的New England Biolabs试剂盒可供使用：包含长7个氨基酸的线性随机肽的Ph.D.-7肽文库试剂盒，文库大小为2.8x109个单独克隆，包含以长7个氨基酸的随机肽的二硫限定环构建的肽的Ph.D.-C7C二硫限定肽文库试剂盒，文库大小为1.2x109个单独克隆，和包含长12个氨基酸的线性随机肽的Ph.D.-12肽文库试剂盒，文库大小为2.8x109个单独克隆。
可以用包含与这些试剂盒相似的随机氨基酸的肽从头构建可替换的相似文库。使用NNK或NNS策略可产生用于重新构建的随机核苷酸，其中N代表四种核苷酸碱基A、C、G和T的等量混合物。K代表G或T的等量混合物，而S代表G或C的等量混合物。这些随机位置可以克隆到噬菌体或噬菌粒展示载体系统中的GeneIII蛋白上。NNK和NNS策略均覆盖所有20种可能的氨基酸和一个终止密码子，编码氨基酸的效率略有不同。因为细菌转化效率的限制，噬菌体展示产生的文库大小的数量级如上文所述，因此可以产生包含多达7个随机氨基酸位置的肽，并包含全部理论组合(207=1.28x109)。可以使用NNK或NNS策略构建更长的肽文库，但是由于细菌转化的要求，实际噬菌体展示文库的大小可能不包含与这种长度有关的所有可能的理论氨基酸组合。
因此当需要更大/更长的随机肽时，核糖体展示文库是有益的。对于二硫限定文库，可使用相似的NNK或NNS随机核苷酸策略。然而，这些随机位置两侧为半胱氨酸残基，可以形成二硫桥。N端的半胱氨酸前面经常会加上另一个氨基酸如丙氨酸。此外，由(但不限于)几个甘氨酸残基组成的灵活接头可以作为肽和任何上述随机肽文库的gene III蛋白之间的间隔区。
策略2
图1和4中所示人四联蛋白CTLD包含五个环(LSA中的四个环和包含LSB的一个环)，其能改变，使CTLD结合不同的蛋白靶标。可以在这些环的一个或多个环中放置随机氨基酸序列，产生文库，从中可以筛选具有理想结合性质的CTLD结构域。例如，可使用本文所述的任意CTLD多肽文库，即CTLD已经按照任意方案(a)-(i)进行修饰的多肽。可以使用上面策略1中所述的NNK或NNS(但不限于此)完成在人四联蛋白CTLD五个环中任何或所有环中所含随机肽的文库的构建，而且这些文库的构建页在本文中其他地方详细描述。
策略3
在已经鉴定出对感兴趣靶分子具有结合活性的其他肽的情况中，可以利用一种策略，其中这些肽作为游离线性肽或作为使用半胱氨酸的二硫键限制环可被直接克隆到四联蛋白三聚结构域的N或C端末端上。也可以将能够结合感兴趣靶标的单链抗体或结构域抗体克隆到三聚结构域的任一端。此外，可以将具有已知结合性质的肽直接克隆到TN CTLD的任一个环区域中。被选择作为含二硫限制环或抗体的互补确定区域的肽可以非常容易地重新安置到人四联蛋白的CTLD的环区域中。可测试所有这些构建体以单体形式的结合，以及当CTLD与三聚结构域融合时，可测试三聚形式的结合和激动剂活化。
CTLD多肽
本发明的组合多肽文库可用于产生和鉴定包含与感兴趣靶分子具有所需结合特性的CTLD的多肽。
一方面，本发明提供具有C-型凝集素样结构域(CTLD)支架结构的多肽，其中所述多肽与不同于该CTLD的天然靶标的靶标结合，而且其中该CTLD的CTLD支架结构按照方案(a)–(j)的任一种进行修饰。在一个实施方式中，所述CTLD支架结构按照方案(a)-(j)的任一种进行修饰而且还包括本文所述的任意其他修饰，例如，在CTLD环球区域外的修饰。在一个实施方式中，所述多肽具有来自人或鼠四联蛋白的CTLD的支架结构并与非纤维蛋白溶酶原的靶标结合。
本发明的CTLD多肽可利用本文所述的任意方法和组合文库产生。例如，在一个实施方式中，多肽可利用具有CTLD的多肽的组合物文库产生，其中所述CTLD的环区域按照方案(a)-(j)的任一种随机化，使该组合多肽文库与靶分子在允许多肽与靶分子结合的条件下接触；和分离与该靶分子结合的多肽，其中所述靶分子不是该CTLD的天然靶。在该方法的一个实施方式中，CTLD是人或鼠四联蛋白。在该方法的另一实施方式中，所述CTLD的环区域按照方案(a)–(j)的任一种随机化并且包括本文所述的任意其他修饰，例如，在CTLD环球区域外的修饰。
按照本发明的修饰CTLD的非天然靶标可以是任何游离或缀合形式(conjugatd form)的化合物，其展示免疫半抗原、激素诸如类固醇激素或任意生物聚合物或其片段的特征，例如，蛋白质或蛋白质结构域；肽；寡聚脱氧核苷酸；核酸；花生四烯酸或其代谢物、脂质或其代谢物；脂肪酸或其代谢物；自由基；寡糖或多糖或其缀合物(conjugates)；或者滥用或治疗应用的化学合成或天然药物。一方面，所述靶标是蛋白质。该蛋白质可以是任意球形可溶性蛋白或受体蛋白，例如，参与细胞信号传导的跨膜蛋白，指示特定疾病的免疫系统的成分诸如MHC分子或细胞表面受体。蛋白质可以是翻译后修饰蛋白质，其添加了生化官能团，诸如乙酸根、磷酸根和/或各种脂质及糖类，包括但不限于，糖基化和十四烷酰化。本发明的修饰CTLD还可结合蛋白质片段。例如，所述CTLD可结合细胞表面受体的结构域，此时所述结构域是固定在细胞膜中的受体的一部分，或者如果该结构域还可作为可溶蛋白产生时，则CTLD可结合溶液中的同一结构域。该CTLD还可对低(较低)分子量配体诸如生物素、荧光素或洋地黄毒苷具有特异性结合亲和力。
在各种实施方式中，结合一个或多个靶分子的CTLD多肽序列可具有结合亲和力，该结合亲和力大约等于所述一个或多个靶分子的天然存在配体的结合亲和力。实施方式中，本发明的多肽对一个或多个靶分子的结合亲和力更强于天然配体对相同靶分子的结合亲和力。此种配体是有用的，例如，在一些情况下用于阻断结合成员的活性，或者在其他情况中实现更有效地激动(agonizing)，例如在修饰CTLD与受体结合并且还被选择来激动受体的情况中。在其他实施方式中，本发明的多肽对一个或多个靶分子的结合亲和力弱于天然配体对相同靶分子的结合亲和力。相比天然配体对靶分子具有较弱亲和力的CTLD多肽可具有改进的穿透肿瘤或组织的能力，和/或可用于期望目标是抑制靶活性而不是完全阻断该活性的情况中。相比天然配体具有较弱结合亲和力的CTLD在例如最佳选择活性是基于与靶结合后内部化到细胞中的情况中可能也是期望的。
修饰CTLD还可结合一个或多个受体并充当激动剂。在此类实施方式中，可通过ELISA、RIA和/或BIAcore试验以及本领域已知的其他试验，测定激动剂各自的结合亲和力并使其与天然配体或其部分的结合性能相比较。在某些实施方式中，本发明的受体选择性激动剂在至少一种哺乳动物细胞(例如，癌细胞)中抑制或诱导生物活性，而且此种活性可通过已知的本领域方法测定。利用本文提供的方法鉴定的充当激动剂的CTLD实例是与TRAIL-R1和TRAIL-R2结合的多肽。
在其他实施方式中，修饰CTLD可结合一种或多种受体或者一种或多种对受体具有亲和力的配体并充当拮抗剂(受体阻断剂(receptorblockers))。在此种实施方式中，可通过ELISA、RIA和/或BIAcore试验以及本领域已知的其他试验，测定激动剂各自的结合亲和力并使其与天然配体或其部分的结合性能相比较。在某些实施方式中，本发明的拮抗剂在至少一种哺乳动物细胞(例如，癌细胞)中抑制或诱导生物活性，而且此种活性可通过已知的本领域方法测定。利用本文提供的方法鉴定的充当拮抗剂的CTLD实例是与IL-23R结合的多肽。
包含特异性结合感兴趣靶分子的多肽可包括“结合成员”，其包括全部的或部分的CTLD。如本文所使用的，术语“结合成员”指彼此之间有结合特异性的分子对中的成员。结合对的成员可以天然产生或者全部或部分合成产生。分子对中的一个成员有表面区域或凹陷处，该区域或凹陷与分子对中另一个成员的特定空间和极性组织结合并因此与其互补。因此分子对成员具有彼此特异性结合的特性。
在CTLD基蛋白质产物源自哺乳动物四联蛋白的实施方式中，如本文中所示例的小鼠和人四联蛋白的情况，其结构与所有其他哺乳动物四联蛋白几乎相同。这种物种保守型结构(species-conserved structure)允许定义配体结合特异性的多肽区段在直向同源物之间直接交换(straightforward swapping)(例如，小鼠和人四联蛋白衍生物)。因此，在此种实施方式中，这种平台相比小鼠抗体衍生物的“人源化”提供了特别的优势，其可参与很多并发症。
一方面，本发明提供具有多聚结构域的多肽并包括结合至少一种靶分子的CTLD多肽-结合成员。如本文所用的，术语“多聚结构域”指包含下述官能度的氨基酸序列，该官能度能够与两种或更多种其他氨基酸序列结合而形成三聚体或其他多聚复合物。在本发明的各种实施方式中，多聚结构域是二聚结构域、三聚结构域、四聚结构域、五聚结构域等。这些结构域能够形成本发明的两个、三个、四个、五个或更多个多肽的多肽复合物。
在一个实例中，多肽包含氨基酸序列-“三聚结构域”-其与两个其它三聚结构域形成三聚复合物。三聚结构域能结合相同氨基酸序列的其它三聚结构域(形成同三聚体)，或结合不同氨基酸序列的三聚结构域(形成异三聚体)。这种相互作用属于可产生三聚蛋白质或多肽的类型。这种相互作用可能是由于三聚结构域组分之间的共价键以及氢键力、疏水力、范德华力和盐桥而引起。三聚结构域的三聚效应由卷曲螺旋结构引起，所述结构与其它两个三聚结构域的卷曲螺旋结构相互作用，形成三重α螺旋卷曲螺旋三聚体，其即使在相对较高的温度仍然稳定。在各种实施方式中，例如，基于四连蛋白结构元件的三聚结构域，所述复合物在至少60℃是稳定的，例如在一些实施方式中，在至少70℃是稳定的。
在一个实施方式中，多聚多肽是三聚体，例如，四联蛋白三聚模块(见US 2007/0154901)。包括CTLD的三聚复合物在本文被称为“atrimer”。“ATRIMERTM”多肽复合物是指也包含CTLD的三个三聚结构域的三聚复合物(Anaphore,Inc.,San Diego,California)。
根据本发明，结合成员可以连接至多聚结构域的N-或C-端氨基酸残基。此外，在某些实施方案中，可以有利地将结合成员连接至单体的多聚结构域的N-端和C-端，由此提供多聚多肽复合物。例如，当多聚肽与相似分子形成三聚体时，六个能结合感兴趣靶分子的结合成员可与单一三聚复合物结合。
在本发明的另一方面，CTLD的环区域中的一个或多个环中包含特异性结合感兴趣靶分子的多肽。在这个方面，CTLD可在三聚结构域的C-端连接至任何已知的三聚结构域。此外，本发明的融合蛋白可以包括在三聚结构域的N-端融合的第二CLTD结构域。在本方面的变化中，该融合蛋白包括在三聚结构域的一端结合第一靶分子和在另一端结合CLTD的多肽。一个、两个或三个此类蛋白质可以是三聚复合物的一部分，所述复合物最多包含一个或多个靶分子的六个特异性CTLD结合成员。
在另一个方面，本发明提供三个蛋白质的多聚复合物，每个蛋白质包含多聚结构域和至少一个结合至少一个感兴趣靶分子的CTLD多肽。在一个实施方案中，多聚复合物包含具有多聚结构域的融合蛋白，所述结构域选自四联蛋白三聚结构元件(四联蛋白三聚模块)、甘露糖结合蛋白(MBP)三聚结构域的其它人三聚多肽，胶原凝集素颈区和其它相似部分。多聚复合物可以包含能彼此关联而形成多聚体的多聚结构域。因此，在一些实施方案中，多聚复合物是由具有相同氨基酸序列的蛋白质组成的均多聚复合物。在其它实施方案中，多聚复合物是由具有不同氨基酸序列的蛋白质组成的异多聚复合物，比如，不同的多聚结构域，和/或不同的可结合不同靶分子的CTLD多肽。在这种实施方案中，CTLD多肽都可特异性结合一种靶分子。在其它实施方案中，CTLD多肽特异性结合不同靶分子。因此，在某些实施方案中，多聚复合物包含本发明的融合蛋白，其中每个融合蛋白包含至少一种结合一种靶分子的CTLD多肽(其中所述多肽可以相同或不同)，和/或至少一种结合第二靶分子的CTLD多肽(其中所述第二靶分子结合多肽可以相同或不同)。
本发明的多肽的三聚结构域可以来自美国专利申请公开No.2007/0154901(‘901申请)中所述的四联蛋白，其通过引用全部并入本文。本文中以SEQ ID NO:100提供成熟人四联蛋白单链多肽序列(参见，例如，表1)。四联蛋白三聚结构域的实例包括SEQ ID NO:1的氨基酸17至49、17至50、17至51和17-52，其代表由人四联蛋白基因的外显子2编码的氨基酸，和可选地由所述基因的外显子3编码的前一个、两个或三个氨基酸。其它实例包括氨基酸1至49、1至50、1至51和1至52，其代表所有外显子1和2，和可选地由所述基因的外显子3编码的前一个、两个或三个氨基酸。可替换地，在三聚结构域中仅包括外显子1编码的部分氨基酸序列。具体地，三聚结构域的N-端可以在SEQ ID NO:1的残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17的任何位置开始。在具体的实施方案中，N端是I10或V17，并且C-端是Q47、T48、V49、C(S)50、L51或K52(根据SEQ ID NO:1编号)。此外，图3A-3D提供多种人四联蛋白三聚结构域的可能的截短型变体。
在本发明的一个方面，三聚结构域是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的四联蛋白三聚结构元件(“TTSE”)，其为四联蛋白家族三聚结构元件的保守序列，US 2007/00154901中有更完整的描述，其通过引用全部并入本文。如图2所示，TTSE环抱着四联蛋白的蛋白家族天然产生成员的变体，和具体地，氨基酸序列经过修正不会对TTSE形成α螺旋卷曲螺旋三聚体的能力产生任何实质的负面影响的变体。在本发明的各个方面，根据本发明的三聚多肽包括作为三聚结构域的TTSE，其与SEQ ID NO:10的保守序列具有至少66%的氨基酸序列同一性；例如与SEQ ID NO:1的保守序列具有至少73%，至少80%，至少86%或至少92%的序列同一性(仅计算确定(不包括X)残基)。即，SEQ ID NO:1中确定的氨基酸中至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，或至少五个可以被取代。
在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:63在位置50(C50)处的半胱氨酸可以有利地突变为丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或任何其它氨基酸残基，以避免形成不理想的链间二硫桥，其会产生不理想的多聚。其它已知的变体包括选自第6、21、22、24、25、27、28、31、32、35、39、41和42个(根据SEQ ID NO:63编号)的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基，其可以由任何非螺旋阻断的氨基酸残基取代。这些残基已经表现出不会直接参与分子间的相互作用，所述相互作用可以稳定本体四联蛋白单体的三个TTSE之间的三聚复合物。在图2所示的一个方面，TTSE具有分子式为a-b-c-d-e-f-g(N至C)的重复的七肽重复序列，其中残基a和d(即，位置26、33、37、40、44、47和51)可以是任何疏水氨基酸(根据SEQ ID NO:1编号)。
在进一步的实施方案中，TTSE三聚结构域可以通过掺入聚组氨酸序列和/或蛋白酶裂解位点，例如，血凝因子Xa或颗粒酶B(参见US2005/0199251，其通过引用并入本文)，并通过包括C-端KG或KGS序列而修正。此外，为了帮助纯化，位置2的脯氨酸可以用甘氨酸取代。
TTSE截短型和变体的具体的非限定性实例如图3A-3D所示。此外，已知多个与人四联蛋白的三聚结构域具有实质相似性(大于66%)的三聚结构域。
表1-三聚结构域
已知可三聚的其他人多肽包括在表2中所示的那些。
表2-三聚多肽
Figure BDA00001748334900472
Figure BDA00001748334900481
US 6,190,886中公开了三聚结构域的另一个实例(通过引用以其整体并入本文)，其描述了包含胶原凝集素颈区的多肽。然后在合适的条件下可以用三个包含胶原凝集素颈区氨基酸序列的多肽形成三聚体。鉴定了多个胶原凝集素，包括：
人SP-D的胶原凝集素颈区：
VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK[SEQ ID NO:101]
牛SP-D的胶原凝集素颈区：
VNALRQRVGILEGQLQRLQNAFSQYKK[SEQ ID NO:102]
大鼠SP-D的胶原凝集素颈区：
SAALRQQMEALNGKLQRLEAAFSRYKK[SEQ ID NO:103]
牛胶固素的胶原凝集素颈区：
VNALKQRVTILDGHLRRFQNAFSQYKK[SEQ ID NO:104]
牛胶原凝集素的胶原凝集素颈区：
VDTLRQRMRNLEGEVQRLQNIVTQYRK[SEQ ID NO:105]
人SP-D的颈区：
GSPGLKGDKGIPGDKGAKGESGLPDVASLRQQVEALQGQVQHLQA
AFSQYKKVELFPGGIPHRD[SEQ ID NO:106]
MBP三聚结构域的其它实例在PCT申请序列号US08/76266，公开号为WO 2009/036349中描述，其通过引用全部并入本文。该三聚结构域甚至可以进一步低聚，并产生更高级的多聚复合物。
本发明还提供一种将初始选择的蛋白质衍生物可靠转化为最终蛋白质产物的概述且简单的步骤，其无需进一步重新设计即可在细菌中(例如，大肠杆菌)中以小及大规模进行生产(国际专利申请公开WO94/18227 A2)。在某些实施方式中，若干相同或不相同的结合部位可通过简单且普通的方法被引入同一功能蛋白质单元中，使得甚至能够通过相互作用中的亲和力来开发弱亲和性，或者构建双功能或异功能分子装配(国际专利申请公开WO 98/56906，其通过引用以其整体并入)。在某些实施方式中，通过在CTLD中具有一个或多个保留金属结合部位的组合文库中添加或去除二价金属离子(例如，钙离子)，可调节结合。
可选地，通过改变pH可调节结合。
CTLD多肽的应用
本发明的组合多肽文库可用于产生和鉴定可用于多种应用且对感兴趣靶分子具有期望结合性能的CTLD，所述应用包括例如，诊断或治疗应用(其中抗体产物通常被用作反应物)、生物化学测定系统、体外或体内医学诊断测定系统，或者作为活性成分用在治疗组合物中。所述组合多肽文库包含改变的环区域，该环区域使得能够产生针对选定靶部分的高亲和力结合分子。
关于体外测定系统应用，所述CTLD(或CTLD-基蛋白质产物)相对于抗体衍生物具有优势，因为CTLD-基蛋白质产物中的每个结合部位包含在单个结构自主性蛋白质结构域中。CTLD结构域抵抗蛋白质水解，而且稳定性以及对配体-结合部位的接触不会由于其他蛋白质结构域与该CTLD的N-或C-端相连而受损。因此，CTLD结合模块可易于被用作构建模块式分子装配的结构单元(例如，N-和/或C-端延伸)，例如，包含多个相同或不相同特异性的CTLD、报道分子、酶分子(过氧化物酶、磷酸酶)、效应分子、放射性同位素或者本领域已知的任何其他信号分子。
在作为被用于体内诊断或治疗目的的组合物的基本组分的体内应用方法，所述CTLD-基蛋白质产物实际上与体内已经存在的相应的天然CTLD蛋白质相同，因此其在患者中有望引起最低程度的免疫应答。单CTLD的最小的功能性抗体衍生物即单链Fv衍生物质量的一半，该中小尺寸在一些应用中可能是有利的，因为其可提供更佳的组织穿透和分布以及较短的循环半衰期。多价形式的CTLD蛋白质，诸如基于完整四联蛋白三聚体或其他多聚胶原凝集素的那些(例如，甘露糖结合蛋白)，提供了增加的结合能力和亲和力以及更长的循环半衰期。、
应当注意到，本文所使用的小节标题仅仅出于组织目的，绝不应当理解为以任意方式对所述内容进行限制。在此出于所有目的将本文引用的所有参考资料均全文并入作为引证。
以下实施例仅仅是对本发明某些实施方式的说明，不应理解为对本发明加以限制，本发明由所附权利要求限定。
实施例
以下实施例中讨论的载体(pANA)源自之前所述的载体[参见US2007/0275393]。一些载体序列在序列表中提供，本领域技术人员将能够根据本文提供的描述得出载体。pPhCPAB噬菌体展示载体(SEQ IDNO:50)具有gIII信号肽编码区，其已用连接基与编码ALQT(等)的hTN序列融合。CTLD区的C-端经由连接基与其余的gIII编码区融合。在CTLD区内，产生核苷酸突变，该突变不改变编码序列，但产生适合于克隆含有改变的环区域的PCR片段的限制位点。这些限制位点之间的环区域部分被除去，使得所有的文库噬菌体将只表达重组体而不表达野生型四联蛋白。类似地设计小鼠TN CTLD噬菌体展示载体。这些载体的另一实施方式是pANA27(SEQ ID NO:64)，其中基因III C-端区已经被平截，并且hTN编码序列末端处的可抑制终止密码子已经被改变成编码谷氨酰胺。以类似的方式构建小鼠载体pANA28(SEQ ID NO:65)。
实施例1
文库构建：环1的突变和延伸
人四联蛋白和小鼠四联蛋白的序列和环1、2、3、4(LSA)和5(LSB)的位置如图1、2和4所示。对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的1-2个延伸文库(分别为“人1-2X”和“小鼠1-2X”)，修饰环1的编码序列，使其编码表3中所示序列，其中五个氨基酸AAEGT(SEQ ID NO:579；人)或AAEGA(SEQ ID NO:581；小鼠)由核苷酸NNKNNK NNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:582)编码的七个随机氨基酸取代；N表示A、C、G或T；K表示G或T。紧跟在环2之后的氨基酸精氨酸也通过使用编码链中的核苷酸NNK完全随机化。随机化这个氨基酸是因为精氨酸接触环1中的氨基酸，并且可能限制由于环1随机化而可获得的构型。此外，改变环4的编码序列，使其编码丙氨酸(A)，而不是赖氨酸148(K)，从而消除纤维蛋白溶酶原结合，其已经表现为依赖环4赖氨酸(Graversen等，1998)。人四联蛋白和小鼠四联蛋白的序列和环1、2、3、4和5(LSB)的位置示于图2中。
表3
来自人和小鼠四联蛋白(TN)的环区域的氨基酸。
括号表示未作为环的一部分考虑的邻近氨基酸。
X=任何氨基酸。
Figure BDA00001748334900521
以下述方式使用重叠PCR产生人环1延伸文库(引物序列如表4所示)。混合引物1Xfor(SEQ ID NO:137)和1Xrev(SEQ ID NO:138)并通过PCR延伸，并且混合引物BstX1for(SEQ ID NO:139)和PstBssRevC(SEQ ID NO:140)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段，混合并在存在外部引物Bglfor12(SEQ ID NO:141和PstRev(SEQID NO:142)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化，并用BglII和PstI剪切，并克隆进噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中。噬菌体展示载体pPhCPAB来自pCANTAB(Pharmacia)，并且包含与M13基因III蛋白融合的部分人四联蛋白CTLD。修饰CTLD区域使其在环1-4的侧翼包括BglII和PstI限制性酶位点，并且改变1-4区域使其包括终止密码子，从而在不连接框内插入时，不会由载体产生功能性基因III蛋白。通过用SEQ ID NO:64(pANA27)的BamHI至ClaI序列替代BamHI至ClaI区域而由pPhCPAB产生pANA27。这样用谷氨酰胺密码子替换了琥珀抑制终止密码子，并且将基因III氨基末端区域截短。
将连接的材料转化进电感受态XL—Blue大肠杆菌(Stratagene)，四至八升细胞过夜生长，并分离DNA产生用于淘选的主文库DNA储液。获得的文库大小为1.5×108，检查的克隆在靶标区域表现出多样化的序列。
以下述方式使用重叠PCR产生小鼠环1延伸文库(引物序列如表4所示)。混合引物Mu1Xfor(SEQ ID NO:143)和Mu1Xrev(SEQ ID NO:144)并通过PCR延伸，并且混合引物Mu1XSal1for(SEQ ID NO:145)和Mu1XPstRev(SEQ ID NO:146)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段，混合并在存在外部引物BstBBssH(SEQ ID NO:147)和Mu Pst(SEQ ID NO:148)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化，并用BssH II和Pst I剪切，并连接到经类似消化的噬菌体展示载体pANA16或pANA28中。通过用小鼠四联蛋白CTLD代替人四联蛋白CTLD，噬菌体展示载体pANA16(SEQ ID NO:63)来自pPhCPAB。小鼠四联蛋白CTLD包括位于环1-4区域内的BstBI、BssHII和SalI位点以及在环4区域后的PstI位点，类似于pPhCPAB，以便促进克隆。另外，该区域被改变为包括如上所述的终止密码子。通过用SEQ IDNO:65中给出的BamHI至ClaI序列代替BamHI至ClaI区域，噬菌体展示载体pANA28(SEQ ID NO:65)得自pANA16(SEQ ID NO:63)。将连接的材料转化进电感受态XL-Blue大肠杆菌(Stratagene)，四至八升细胞过夜生长，并分离DNA产生用于淘选的主文库DNA储液。获得的文库大小为2.65×1010，检查的克隆在靶标区域表现出多样化的序列。
表4
产生噬菌体展示C型凝集素结构域文库中使用的序列。
M=A或C；N=A，C，G或T；K=G或T；S=G或C；W=A或T。
Figure BDA00001748334900531
Figure BDA00001748334900541
Figure BDA00001748334900571
实施例2
文库构建：环1和2的突变
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环1-2文库(分别为，“人1-2”和“小鼠1-2”)，修饰环1的编码序列，使其编码表1中所示序列，其中用由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNK((SEQ ID NO:583；N表示A、C、G或T；K表示G或T))编码的五个随机氨基酸替代五个氨基酸AAEGT(SEQ ID NO:579；人)或AAEGA(SEQ ID NO:581；小鼠)。在环2中(包括邻近精氨酸)，用由核苷酸NNK NNK NNKNNK(SEQ ID NO:586)编码的四个随机氨基酸替代人的四个氨基酸TGAR(SEQ ID NO:584)或小鼠的TGGR(SEQ ID NO:585)。此外，改变环4的编码序列，使其编码丙氨酸(A)，而不是环中的赖氨酸(K)，从而消除纤维蛋白溶酶原结合，其表现为依赖环4赖氨酸(Graversen等，1998)。
以下列方式使用重叠PCR生成人1-2文库(引物序列示于表4中)。将引物1-2 for(SEQ ID NO:149)和1-2 rev(SEQ ID NO:150)混合并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在外部引物Bglfor12(SEQ ID NO:141)和PstRev12(SEQ ID NO:151)的存在下通过PCR延长。将产生的片段凝胶提纯，用Bgl II和Pst I切割，并克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中，如上文所述。获得大小为4.86x108的文库，并且检查的克隆在靶标区域中显示出多样化的序列。
以下列方式使用重叠PCR生成小鼠1-2文库。将引物Mu1Xfor(SEQ ID NO:143)和Mu12rev(SEQ ID NO:152)混合并通过PCR延长，以及将引物Mu1234for(SEQ ID NO:153)和Mu1XPstRev(SEQ ID NO:146)混合并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在外部引物BstBBssH(SEQ ID NO:147)和Mu Pst(SEQ ID NO:148)的存在下通过PCR延长。将产生的片段凝胶提纯，用BssH II和Pst I切割，并克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pANA16或pANA28中，如上文所述。获得大小为1.63x109的文库，并且检查的克隆在靶标区域中显示出多样化的序列。
实施例3
文库构建：环1和4的突变和延伸
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环1-4文库(分别为，“人1-4”和“小鼠1-4”)，修饰环1的编码序列，使其编码表3中所示序列，其中用由核苷酸NNS NNS NNS NNS NNS NNS((SEQ IDNO:582；N表示A、C、G或T；S表示G或C；K表示G或T))编码的七个随机氨基酸替代七个氨基酸DMAAEGT(SEQ ID NO:587;人)或DMAAEGA(见SEQ ID NO:588;小鼠)。用核苷酸NNS NNS NNSNNS NNS(SEQ ID NO:583)编码的五个随机氨基酸，替代环4中人的两个氨基酸KT或小鼠的两个氨基酸KA。
以下列方式使用重叠PCR生成人1-4文库(引物序列示于表4中)。将引物BglBssfor(SEQ ID NO:154)和BssBglrev(SEQ ID NO:155)混合并通过PCR延长，将引物BssPstfor(SEQ ID NO:156)和PstBssRev(SEQID NO:157)混合并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在外部引物Bglfor(SEQ ID NO:158)和PstRev(SEQ ID NO:142)的存在下通过PCR延长。将产生的片段凝胶提纯，用Bgl II和Pst I限制酶切割，并克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中，如上文所述。获得大小为2x109的文库，并且在淘选之前考察的12个克隆在目标区域中显示出多样化的序列。
以下列方式使用重叠PCR生成小鼠1-4文库(引物序列示于表4中)。将引物Mu 1-4 AF(SEQ ID NO:201)和Mu 1-4 AR(SEQ ID NO:202)混合并通过PCR延长，以及将引物Mu 1-4 BF(SEQ ID NO:203)和Mu 1-4 BR(SEQ ID NO:204)混合并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在外部引物Mu 1-4 OF(SEQ ID NO:205)和Mu1-4 OR(SEQ ID NO:206)的存在下通过PCR延长。将产生的片段凝胶提纯，用BstB I和Pst I限制酶切割，并克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pANA28中，如上文所述。获得大小为4.7x109的文库，并且对>20个克隆在淘选之间进行检查，其在靶标区域中显示出多样化的序列。
实施例4
文库构建：环3和4的突变和延伸
对于人和小鼠鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环3-4文库(分别为，“人3-4”和“小鼠3-4”)，修饰环3的编码序列，使其编码表4中所示序列，其中在编码链中用由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNKNNK(SEQ ID NO:589)编码的六个随机氨基酸替代人或小鼠四联蛋白的三个氨基酸EIT(N表示A、C、G或T；K表示G或T)。此外，在环4中，用由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:589)编码的六个随机氨基酸替代人的三个氨基酸KTE或小鼠的三个氨基酸KAE。
以下述方式使用重叠PCR产生人3-4延伸文库(引物序列如表4所示)。混合引物H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:163)和H Loop 3-4 Ext-R(SEQID NO:164)并通过PCR延伸，并且混合引物H Loop 3-4 Ext-F(SEQ IDNO:165)和H Loop 5-R(SEQ ID NO:166)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段，混合并在存在额外的H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:163)和H Loop 5-R(SEQ ID NO:166)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化，并用Bgl II和Pst I限制酶剪切，并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中，如上所述。获得的文库大小为7.9×108，并且检查的克隆在靶标区域中表现出具有多样化的序列。
以下述方式使用重叠PCR产生小鼠3-4延伸文库。混合引物MSacII-F(SEQ ID NO:167)和M Loop 3-4 Ext-R(SEQ ID NO:168)并通过PCR延伸，并且混合引物M Loop 3-4 Ext-F(SEQ ID NO:169)和M Loop5-R(SEQ ID NO:170)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段，混合并在存在额外的M SacII-F(SEQ ID NO:167)和M Loop 5-R(SEQ IDNO:170)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化，并用Sac II和Pst I限制酶剪切，并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pANA16或pANA28中，如上所述。获得的文库大小为4.95×109，并且检查的克隆在靶标区域中表现出具有多样化的序列。
实施例5
文库构建：环3和4的突变和环之间的PRO
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环3-4组合文库(分别为，“人3-4合并”和“小鼠3-4合并”)，环3和4的编码序列以及这两个环之间的脯氨酸被改变成编码表3中所示的序列，其中人的序列TEITAQPDGGKTE(SEQ ID NO:590)或相应的小鼠序列TEITTQPDGGKAE(SEQ ID NO:591)被13氨基酸的序列XXXXXXXXGGXXX(SEQ ID NO:592)取代，其中X表示由序列NNK(N表示A、C、G或T；K表示G或T)编码的随机氨基酸。
以下列方式使用重叠PCR生成人3-4组合文库(引物序列示于表4中)。将引物H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:163)和H Loop 3-4 Combo-R(SEQ ID NO:171)混合并通过PCR延长，将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在额外的H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:163)和H Loop 5-R(SEQ IDNO:166)的存在下通过PCR延长。将产生的片段凝胶提纯，用Bgl II和PstI限制酶切割，并克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中，如上文所述。获得大小为4.95x109的文库，并且考察的克隆在目标区域中显示出多样化的序列。
以下列方式使用重叠PCR生成小鼠3-4组合文库。将引物MSacII-F(SEQ ID NO:167)和M Loop 3-4Combo-R(SEQ ID NO:172)混合并通过PCR延长，将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在外部引物M SacII-F(SEQ ID NO:167)和M Loop 5-R(SEQ ID NO:170)的存在下通过PCR延长。将产生的片段凝胶提纯，用Sac II和Pst I限制酶切割，并克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pANA16或pANA28中，如上文所述。获得大小为7.29x108的文库，并且考察的克隆在目标区域中显示出多样化的序列。
实施例6
文库构建：环4的突变和延伸
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环4延伸文库(分别为，“人4”和“小鼠4”)，修饰环4的编码序列，使其编码表3中所示序列，其中用由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK((SEQ ID NO:582；N表示A、C、G或T；K表示G或T)编码的七个随机氨基酸替代人四联蛋白的三个氨基酸KTE或小鼠四联蛋白的三个氨基酸KAE。
以下述方式使用重叠PCR产生人4延伸文库(引物序列如表4所示)。混合引物H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:163)和H Loop 3-R(SEQ IDNO:173)并通过PCR延伸，并且混合引物H Loop 4 Ext-F(SEQ ID NO:174)和H Loop 5-R(SEQ ID NO:166)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段，混合并在存在额外的H Loop 1-2-F(SEQ ID NO:163)和HLoop 5-R(SEQ ID NO:166)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化，并用Bgl II和Pst I限制性酶剪切，并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中，如上所述。获得的文库大小为2.7×109，并且检查的克隆在靶标区域中表现出多样化的序列。
以下述方式使用重叠PCR产生小鼠4延伸文库。混合引物M SacII-F(SEQ ID NO:167)和M Loop 3-R(SEQ ID NO:175)并通过PCR延伸，并且混合引物M Loop 4 Ext-F(SEQ ID NO:176)和M Loop 5-R(SEQ IDNO:170)并通过PCR延伸。由凝胶纯化得到的片段，混合并在存在额外的M SacII-F(SEQ ID NO:167)和M Loop 5-R(SEQ ID NO:170)的情况下通过PCR延伸。将得到的片段凝胶纯化，并用SacII和PstI限制性酶剪切，并克隆进相似消化的噬菌体展示载体pANA16或pANA28中，如上所述。
实施例7
文库构建：有以及没有环3的延长的突变
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环3改变的文库，环3的编码序列被修饰成编码表3中所示的序列，其中六个人氨基酸ETEITA(SEQ ID NO:593)或六个小鼠四联蛋白氨基酸ETEITT(SEQ ID NO:594)被六个、七个或八个由核苷酸NNK NNK NNK NNKNNK NNK(SEQ ID NO:583)、NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:582)和NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK(SEQID NO:595)编码的随机氨基酸取代；N表示A、C、G或T；K表示G或T。此外，在环4中，三个人中的氨基酸KTE或三个小鼠中的氨基酸KAE被六个由核苷酸NNK NNK NNK NNK NNK NNK(SEQ ID NO:589)编码的随机氨基酸取代。此外，环4的编码序列改变成编码丙氨酸(A)而不是环中的赖氨酸(K)，以取消纤维蛋白溶酶原结合，其已经显示依赖于环4的赖氨酸(Graversen等人,1998)。
以下列方式使用重叠PCR生成人环3改变的文库。将引物HLoop3F 6、HLoop3F 7和HLoop3F 8(各为SEQ ID NOS:177-179)分别与HLoop4R(SEQ ID NO:180)混合并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在oligos H Loop 1-2F(SEQ ID NO:163)、HuBglfor(SEQ ID NO:193)和PstRev(SEQ ID NO:142)的存在下通过PCR延长。将产生的片段凝胶提纯，用Bgl II和Pst I限制酶消化，并克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中，如上文所述。文库生成之后，集合三个文库用于淘选。
以下列方式使用重叠PCR生成小鼠环3改变的文库。将引物MLoop3F 6、MLoop3F 7和MLoop3F 8(各为SEQ ID NOS:181-183)分别与M SacII-F(SEQ ID NO:167)混合并通过PCR延长。另外，混合引物MLoop4F(SEQ ID NO:207)和M MfeR(SEQ ID NO:208)并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在引物M 3X OF(SEQ ID NO:184)和M 3X OR(SEQ ID NO:192)的存在下进行PCR。将产物用Sal I(或Sac II)和PstI限制酶消化，并将提纯的片段克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pANA16或pANA28中，如上文所述。
环3的交替环延长
以下列方式使用重叠PCR产生人环3环文库。将引物Loop3AF2(SEQ ID NO:187)和Loop3AR2(SEQ ID NO:188)混合并通过PCR延长，将引物Loop3BF(SEQ ID NO:189)和Loop3BR(SEQ ID NO:190)混合并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在引物Bgl for(SEQ ID NO:158)和Loop3OR(SEQ ID NO:191)的存在下进行PCR。将产物用Bgl II和Pst I限制酶消化，将提纯的片段克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中，如上文所述。此外，环4的编码序列被改变成编码丙氨酸(A)而不是环中的赖氨酸(K)，以取消纤维蛋白溶酶原结合，其已经显示依赖于环4的赖氨酸(Graversen等人,1998)。
实施例8
环3和5的突变
对于人和小鼠四联蛋白C-型凝集素结合结构域的环3和5改变的文库，将环3和5的编码序列修饰成编码表3中所示的序列，其中五个人氨基酸TEITA(SEQ ID NO:596)或五个小鼠四联蛋白氨基酸TEITT(SEQ ID NO:597)被五个由核苷酸NNK NNK NNK NNKNNK(SEQ ID NO:583)编码的氨基酸取代，并且三个人或小鼠氨基酸AAN被三个由核苷酸NNK NNK NNK编码的氨基酸取代。此外，将环4的编码序列改变成编码丙氨酸(A)而不是环中的赖氨酸(K)，以取消血纤维蛋白溶酶原结合，其已经显示依赖于环4的赖氨酸(Graversen等人,1998)。
以下列方式使用重叠PCR生成人环3和5改变的文库。将引物h3-5AF(SEQ ID NO:213)和h3-5AR(SEQ ID NO:214)混合并通过PCR延长，将引物h3-5BF(SEQ ID NO:215)和h3-5BR(SEQ ID NO:216)混合并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，混合，并在h3-5 OF(SEQ ID NO:217)和PstRev(SEQ ID NO:142)的存在下通过PCR延长。将产生的片段凝胶提纯，用Bgl II和Pst I限制酶消化，并克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pPhCPAB或pANA27中，如上文所述。
以下列方式使用重叠PCR生成小鼠环3和5改变的文库。将引物m3-5 for(SEQ ID NO:209)和m3-5 rev(SEQ ID NO:210)混合并通过PCR延长。将产生的片段用凝胶提纯，利用引物m3-5 OF(SEQ ID NO:211)和m3-5 OR(SEQ ID NO:212)再扩增。将产物用Sal I和Pst I限制酶消化，将提纯的片段克隆到类似地消化的噬菌体展示载体pANA16或pANA28中，如上文所述。
实施例9-22提供了利用本发明的组合多肽文库分离对TRAIL死亡受体具有特异性的多肽序列的示例性方法。TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，除此之外，文献中也称为Apo2L和TNFSF10)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族，并且已经鉴定为肿瘤细胞中程序化细胞死亡或凋亡的激活剂。TRAIL在免疫系统细胞中表达，包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞和树突细胞，并且位于细胞膜中。TRAIL可以由半胱氨酸蛋白酶加工，产生蛋白质的可溶形式。TRAIL的膜结合和可溶形式均可作为三聚体并且能通过与靶细胞上的TRAIL受体相互作用而触发凋亡。在人类中，已经鉴定了五个受体具有结合TRAIL的活性。这五个受体中的两个，TRAIL-R1(DR4，TNFSF10a)和TRAIL-R2(DR5，TNFRSF10b)，包含称为死亡结构域(DD)的细胞质区域。这两个受体分子上的死亡结构域是TRAIL结合受体后外在凋亡途径TRAIL-活化所需要的。其余三个TRAIL受体(称作TRAIL-R3(DcR1，TNFRSF10c)、TRAIL-R4(DcR2，TNFRSF10d)和循环骨保护素(OPG，TNFRSF11b))被认为是作为诱饵受体。这三个受体缺乏功能性DD，被认为主要通过隔绝TRAIL或刺激促存活信号而参与负调节凋亡。
一旦TRAIL与TRAIL-R1(DR4)或-R2(DR5)结合，三聚受体就会募集几种胞质蛋白，形成死亡诱导信号复合物(DISC)，之后由其活化半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-10。这将触发两种不同的引起不可逆细胞死亡途径之一，一条途径中，半胱天冬酶-8直接激活效应物半胱天冬酶(半胱天冬酶-3、-6、-7)，导致细胞分解，而另一条途径包括依赖促死亡Bcl-2家族蛋白Bid的半胱天冬酶-8的裂解，并参加线粒体或内在死亡途径。
根据这种细胞死亡活性，与TRAIL-R1和TRAIL-R2结合的分子在很多种癌症的治疗中可具有治疗性作用。因此，筛选出本发明的CTLD多肽文库，以试图鉴定和分离对TRAILR1和TRAIL R2具有特异性结合活性的CTLD-基多肽。
实施例9
人文库1-4的淘选与筛选
在重组TRAIL R1(DR4)/Fc嵌合体和TRAIL R2(DR5)/Fc嵌合体上对由人文库1-4产生的噬菌体进行淘选。在三、四和/或五轮淘选后，使用ELISA平板测试方法进行筛选，鉴别受体特异性结合肽。
实施例10
用于选择和筛选TRAIL受体DR4和DR5的文库和克隆的构建
可以从制造商如New England Biolabs(NEB)购买表达各种长度线性或环形随机肽的噬菌体文库。或者，可以产生在人四联蛋白的C-型凝集素结构域(CTLD)的环(SEQ ID NO:)中包含随机肽的噬菌体展示文库。CTDL的LSA的环1、2、3和4如图4所示。可以使用NNS或NNK重叠PCR突变策略将这些环中的氨基酸随机化。可以用突变的NNS或NNK密码子替代任一个环中的一至七个密码子，产生用于筛选的文库；或者，突变氨基酸的数量可以超过被替换的氨基酸的数量(可以用五个替代两个氨基酸，得到更大的随机环)。此外，可以同时改变多个环。重叠PCR策略能在环2和3之间的最终DNA构建体中产生KpnI位点，其改变环之间的一个氨基酸，将苏氨酸交换为原始的丙氨酸。或者，可以在环2和3之间掺入BssH II位点，其不改变原始氨基酸序列。
实施例11
TRAIL受体DR4和DR5的激动剂的选择和筛选
通过分别使用噬菌体文库的噬菌体甘油管或文库DNA感染或转染细菌如大肠杆菌TG-1或XL-1 Blue，产生表达噬菌体的细菌菌落。O.D.600为1.0的五十毫升感染/转染细菌在室温(RT)生长15分钟，之后向培养基中加入40%终浓度的选择药物标记，并在37°C温育1h。温育后加入其余用于筛选的药物，并在37°C再温育一小时。加入辅助噬菌体VCS M13并温育2h。向培养基中加入卡那霉素(70μg/mL)，然后在37°C震荡过夜温育。通过离心富集噬菌体，然后用三分之一体积的20%聚乙二醇(PEG)8000/2.5M NaCl将噬菌体从上清冷沉淀。将噬菌体重悬于包含蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche Complete Mini EDTA-free)的缓冲液中，然后无菌过滤。在大肠杆菌TG-1，XL1-Blue，或其它合适的细菌宿主中测试噬菌体文库的滴度。
在针对人DR4和/或DR5的几轮阳性筛选中淘选噬菌体。人DR4和DR5(aka人TRAIL死亡受体1和2)可以购得可溶解形式(AntigenixAmerica,Cell Sciences,或者以Fc(Genway Biotech,R&D Systems)或GST融合形式(Novus Biologicals)的。在PBS中的可溶DR4或DR5直接与固相支持体结合，比如微孔板的孔底部(Immulon 2B板)，或者与磁珠如Dynabead结合。通过在4°C或RT在PBS中过夜温育，将约250ng至500ng的可溶DR4或DR5与固体基质结合。然后用PBS/0.05%Tween 20将板(或珠)洗三次，然后加入阻滞剂如1%BSA，0.05%叠氮化钠的PBS溶液，并在RT温育至少0.5h，以防止在将来的步骤中产生材料与非特异性表面的结合。还可以使用阻滞剂如包含3%脱脂乳粉或煮沸酪蛋白的PBS。
在可替换的方案中，为了结合DR4或DR5 Fc融合蛋白，首先用商业购买的0.5-1μg抗-Fc抗体在PBS温育板或珠。洗涤板(或珠)并用如上所述的1%BSA，0.05%叠氮化钠的PBS溶液阻断，然后与5μg/ml死亡受体融合蛋白温育，并在RT温育2h。然后用PBS/0.05% Tween 20洗涤板三次。
向包含直接或间接结合的死亡受体的孔(或珠)加入浓度约1011或1012pfu/mL的噬菌体文库。尽管要筛选不同结合性质时需要的温育时间和温度不同，但是在RT温育噬菌体至少2h。用PBS/0.05% Tween 20至少洗涤孔八次，然后用PBS洗涤(8x)。在后面的筛选轮次中可以用更酸的酸性缓冲液洗涤孔，比如100mM Tris pH 5.0，Tris pH 4.0和TrispH 3.0。通过胰蛋白酶消化洗脱结合的噬菌体(用100μL 1mg/mL胰蛋白酶的PBS溶液洗脱30分钟)。还可以使用0.1M甘氨酸，pH 2.2洗脱结合的噬菌体。或者，可以使用TRAIL(可从AbD Serotec购得)洗脱结合的噬菌体，筛选与TRAIL竞争结合死亡受体的CTLD或肽。进一步地，可以用已知与TRAIL竞争结合死亡受体的化合物洗脱结合的噬菌体。
洗脱的噬菌体用10mL新鲜生长至OD600为0.8的细菌温育15分钟，并且如上处理感染的细菌，产生第二轮淘选的噬菌体。再进行另外两轮或三轮阳性淘选。
作为使用直接或间接结合支持体的DR4和/或DR5的可替换方案，可以在阳性筛选各轮中使用由癌细胞系外源表达或由转染细胞如293细胞表达的DR4和/或DR5。对于转染细胞，在淘选前两天使用例如Qiagen AttracteneTM方案和合适的表达质粒如携带DR4或DR5的pcDNA3.1，pCEP4或pCEP5进行转染。细胞在非胰蛋白酶解离缓冲液中解离，并将6×106个细胞重悬于2mL IMDM缓冲液中。在加入细胞之前透析待淘选的噬菌体，并在RT温育2h。通过在IMDM中多次吸取重悬而洗涤细胞，并用甘氨酸缓冲液洗脱噬菌体。
为了选择对DR4和/或DR5有亲和力但对诱饵受体没有亲和力的那些肽，伴随阳性筛选进行阴性筛选轮次或阴性筛选。使用诱饵受体DcR1、DcR2、可溶的DcR3，和/或骨原壳蛋白(OPG，R&D系统)进行阴性筛选。OPG和可溶的DcR3可以从市场购得(GeneTex,R&D系统)，DcR1和DcR2与Fcor GST(R&D Systems,Novus Biologicals)共轭结合。对于阴性筛选轮次，将诱饵受体与板或珠结合，并如上对于阳性筛选轮次所述进行阻断。对于较大的表面积，珠更理想，分子可以接触淘选的文库。初级文库或来自其它阳性筛选轮次的噬菌体与诱饵受体在室温温育2h，或者在4°C过夜温育。然后去除未结合的噬菌体并进行一轮阳性筛选。
阳性筛选也可以与阴性筛选同时进行。阻断用可溶DR4或DR5涂布的孔或珠，并使其接触初级文库或来自上述筛选轮次的噬菌体，但是包括浓度为10μg/mL的诱饵受体如DcR1。本策略中洗脱之前的4°C温育时间可以从2h延伸至几天，从而获得对于DR4或DR5的特异性和亲和力更强的噬菌体。使用DR4以获得DR5-特异性，或使用DR5以获得DR4-特异性结合肽的阴性筛选，也可以使用上述方法进行。
还可以在癌细胞或表达一个或多个诱饵受体的转染细胞上进行阴性筛选。与上述阳性筛选相似地进行阴性筛选，但是在温育后淘选细胞，然后从上清回收噬菌体，然后用于阳性筛选轮次。
实施例12
三聚TRAIL受体激动剂和三聚CTLD-衍生TRAIL受体激动剂的质粒构建
将来自噬菌体展示或肽-移植、肽-三聚结构域(TD)融合体，肽-TD-CTLD融合体或其各种组合的各种三聚TRAIL受体激动剂和三聚CTLD-衍生TRAIL受体激动剂亚克隆到细菌表达载体(pT7 in house载体，或pET，NovaGen)和哺乳动物表达载体(pCEP4,pcDNA3,Invitrogen)中进行小规模或大规模生产。
设计引物从来自实施例1的各种功能展示载体PCR扩增连接肽/激动剂。5’端引物侧有BamH I限制性位点，并且在载体pT7CIIH6框内，具有前导序列。5’引物还可以掺入蛋白酶Granzyme B或因子Xa的分解位点。3’引物侧有EcoRI限制性位点。用BamHI/EcoRI消化PCR产物，然后连接进用相同酶消化的pT7CIIH6中，产生细菌表达载体pT7CIIH6-TRAILa。
可以将TRAIL受体激动剂DNA亚克隆进载体pT7CIIH6或pET28a(NovoGen)，没有任何前导序列和6XHis。5’引物侧有NdeI限制性位点，并且3’引物侧有EcoRI限制性位点。用NdeI/EcoRI消化PCR产物，并连接进用相同酶消化的载体中，产生表达载体pT7-TRAILa和pET-TRAILa。
可以将TRAIL受体激动剂DNA亚克隆进载体pT7CIIH6或pET28a(NovoGen)，具有分泌信号肽。将表达的蛋白质导出至细菌周质中，并在转移过程中去除分泌信号肽。5’引物侧有NdeI限制性位点，并且将引物掺入细菌分泌信号肽，PelB，OmpA或OmpT。3’引物侧有EcoRI限制性位点。可选地可将6xHis标签编码序列掺入3’引物中。用NdeI/EcoRI消化PCR产物，并连接进用相同酶消化的载体中，产生表达载体pT7-sTRAILa，pET-sTRAILa，pT7-sTRAILaHis，和pET-sTRAILHis。
可以将TRAIL受体激动剂DNA和分泌信号肽一起亚克隆进哺乳动物表达载体pCEP4或pcDNA3.1。将表达的蛋白质分泌进培养基，并在分泌过程中去除分泌信号肽。5’引物侧有NheI限制性位点，并且将引物掺入四联蛋白分泌信号肽，或另一个信号肽(例如，Ig肽)。3’引物侧有XhoI限制性位点。可选地可将6xHis标签编码序列掺入3’引物中。用NheI/XhoI消化PCR产物，并连接进用相同酶消化的载体中，产生表达载体pCEP4-TRAILa，pcDNA-TRAILa，pCEP4-TRAILaHis，和pcDNA-TRAILaHis。
实施例13
来自细菌的TRAIL受体激动剂的表达和纯化
将细菌表达构建体转化进细菌菌株BL21(DE3)(Invitrogen)。将新鲜平板上的单菌落接种进摇瓶中的100mL 2xYT培养基。摇瓶在旋转摇床上在37°C以250rpm温育12h或过夜。使用过夜培养物(50mL)接种4L摇瓶中的1L 2xYT。在摇瓶中培养细菌OD600至约0.7，此时向培养基加入IPTG至终浓度1mM。4h温育后，通过离心收集细菌团，并保存以进行后续的蛋白纯化。
在10升发酵罐中在补料批式条件下进行细菌发酵。一升复合发酵培养基包含5g酵母提取物，20g蛋白胨，0.5g NaCl，4.25g KH2PO4，4.25g K2HPO4·3H2O，8g葡萄糖，2g MgSO4·7H2O，和3mL痕量金属溶液(2.7% FeCl3·6H2O/0.2% ZnCl2·4H2O/0.2% CoCl2·6H2O/0.15%Na2MoO4·2H2O/0.1% CaCl2·2H2O/0.1% CuCl2/0.05% H3BO3/3.7% HCl)。用过夜培养物(5%体积比)接种发酵罐，并在pH 6.9(用氢氧化铵和磷酸控制)和30°C，在恒定操作条件下生长。变化空气流量和搅拌速度以保持40%的最低溶氧水平。当培养基中的葡萄糖水平低于1g/L时开始补料(40%葡萄糖)，并且在发酵的其余时间将葡萄糖水平维持在0.5g/L。当OD600到达约60时，向培养基中加入IPTG至终浓度0.05mM。诱导后四小时，富集细胞。通过离心获得细菌团，并在-80°C保存以进行后续的蛋白纯化。
可溶的、分泌到细菌细胞的周质中，并包括亲和标签(例如，6xHis标签蛋白)的表达蛋白可使用标准色谱方法纯化，比如金属螯合色谱(例如，Ni亲和柱)，阴离子/阳离子亲和色谱，尺度排阻色谱，或其任意组合，所述技术为本领域技术人员所公知。
表达的蛋白能在细菌细胞中形成不溶的包涵体。在起初的纯化步骤中在变形条件下纯化这些蛋白，并进行之后的再折叠过程。将细菌团悬浮于裂解缓冲液(0.5M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8，和1mM EDTA)中并超声破碎。通过离心回收包涵体，然后溶解于包含6M氯化胍，50mM Tri-HCl,pH8和0.1M DTT的结合缓冲液中。将溶解的部分过Ni亲和柱。由柱洗下未结合材料后，用洗脱缓冲液(6M氯化胍，50mMTri-HCl pH8.0，10mM 2-巯基乙醇，250mM咪唑)洗脱蛋白。分离的蛋白通过缓冲液交换进结合缓冲液，并重新过Ni+柱，去除变性剂。一旦载入柱上，使用不含变性剂(50mM Tri-HCl pH8.0，10mM 2-巯基乙醇，加2mM CaCl2)的5 C.V.(柱体积)缓冲液，通过线性梯度(0-0.5MNaCl)将蛋白质再折叠。用包含0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0，和250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。用因子Xa或Granzyme B分解融合标签(6xHis,CII6His)，并过Ni+-NTA亲和柱从蛋白样品去除标签。通过在Q-琼脂糖(GE)上进行离子交换色谱，使用10 C.V.缓冲液(50mMTris-HCl,pH8.0和2mM CaCl2)的线性梯度(0-0.5M NaCl)进一步纯化蛋白。将蛋白透析如1XPBS缓冲液。可选地，通过Mustang E过滤器(PALL)去除内毒素。
为了从细菌细胞制备周质中表达蛋白的可溶提取物，将细菌团悬浮于上样缓冲液(10mM磷酸缓冲液pH 6.0)中，并使用超声裂解(或者用French按压)。在旋转分离不容部分后，将可溶提取物过SP F柱(GE)。也通过渗透压休克或“软”超声制备周质提取物。通过Ni+-NTA柱，如上所述纯化分泌的可溶6xHis标签蛋白。将粗提物通过缓冲液交换进入亲和柱上样缓冲液，然后过SP FF柱。用4C.V.上样缓冲液洗涤后，使用100%梯度，用8C.V.高盐缓冲液(10mM磷酸缓冲液，0.5M NaCl,pH 6.0)洗脱蛋白质。将洗脱液通过Mustang E过滤器去除内毒素，过滤洗脱液。将部分纯化的蛋白质经过缓冲液交换进入10mM磷酸缓冲液,pH 7.4，然后载入至Q FF柱。在用7C.V.10mM磷酸缓冲液pH 6.0洗涤后，使用100%梯度，用8C.V.高盐缓冲液(10mM磷酸缓冲液，pH 6.0，0.5M NaCl)洗脱蛋白质。通过Mustang E过滤器再次去除内毒素。
实施例14
来自哺乳动物细胞的TRAIL受体激动剂的表达和纯化
使用Qiagen Endofree Maxi Prep Kit制备每个表达构建体的质粒。使用质粒瞬时转染HEK293-EBNA细胞。收集组织培养上清液，在转染后2-4天进行蛋白质纯化。
对于大规模生产，在CHO或PER.C6细胞中的稳定细胞系过表达TRAIL受体激动剂。将细胞(5x108)接种在20L生物反应器(Wave)中的2.5L培养基中。细胞倍增后，即加入新鲜培养基(1x初始体积)，并在细胞倍增时继续加入，直至终体积达到10L。细胞培养约10提案，直至细胞存活率下降至20%。然后收集细胞培养物上清进行纯化。
如上所述使用His-标签蛋白纯化(通过Ni+-NTA柱)和非标签蛋白纯化(通过离子交换色谱)。
实施例15
模拟辅助的TRAIL受体激动剂的亲和力成熟
使用模拟对从CTLD噬菌体展示文库筛选中鉴别的TRAIL受体激动剂进行亲和力成熟。根据已知的四联蛋白3D结构建立激动剂相似性模型。使用LOOPER(DS2.1,Accelrys)及其相关算法限定并优化激动剂相似性模型的环构象。这个过程包括三个基本步骤：1.构建一组可能的环构象异构体，其中环骨架与蛋白质其余部分的相互作用经过优化；2.环侧链的建立和结构优化，并且所有环原子的能量最小化；3.对保留的环构象的变体进行最后的评分和分级。使用手动和基于分子动力学的停靠(docking)的组合，鉴别位于DR4/DR5胞外结构域上的可能的结合区域或表位为激动剂。通过使用DR4/DR5胞外结构域的缺失或点突变和激动剂进行结合实验，进一步确认结合结构域。在DR4/DR5和TRAIL CTLD激动剂上确定参与决定结合特异性的氨基酸残基(或序列)。使用基于结构的计算筛选各个靶标位置的随机突变组合，确定与结构模板的相容性。根据表观包装缺陷分析，选择进行突变的残基，构建噬菌体展示文库。
可以使用TRAIL受体拮抗肽和DR4/DR5的3D模型作为参照，限定肽移植CTLD和DR4/DR5模型模拟。在将TRAIL受体拮抗肽移植进入CTLD环时，优化环构象并通过使用模拟改变侧翼和周围氨基酸残基而重新使其表面与拮抗肽/DR4/DR5结合相匹配。根据已知的四联蛋白3D结构建立肽移植CTLD激动剂相似性模型。使用如上所述的LOOPER(DS2.1,Accelrys)及其相关算法限定并优化激动剂相似性模型的环构象。使用基于结构的计算筛选各个靶标位置的随机突变组合，确定与结构模板的相容性。根据表观包装缺陷分析，选择肽侧翼和周围要突变的氨基酸残基，构建噬菌体展示文库。
实施例16
癌细胞增殖的抑制
将表达DR4和/或DR5的人癌细胞系如COLO205(结肠直肠癌)，NCI-H2122(非小细胞肺癌)，MIA PaCa-2(胰腺癌)，ACHN(肾细胞癌)，WM793B(黑素瘤)和U266B1(淋巴瘤)(全部购自American Type TissueCollection(Manassas,VA))在合适的条件下培养并以5000-20000细胞/孔的细胞密度接种(根据每种癌细胞系的生长曲线确定合适的值)。以0.0001-100μg/mL的浓度加入DR4/5拮抗细胞。可选地，将DR4/DR5激动剂与治疗方法组合，包括化学疗法(例如硼替佐米)或通过辐射预先敏化的细胞，产生协同效应，上调DR4或DR5或改变半胱天冬酶活性。24和48h后使用“CellTiterAQueous One Solution Cell ProliferationAssay”(Promega)，根据生产商的说明，评价活细胞数量，并确定DR4/DR4激动剂的IC50浓度。
实施例17
癌细胞系中通过DR5和DR4拮抗分子激活半胱天冬酶
将表达DR4和/或DR5的人癌细胞系如COLO205(结肠直肠癌)，NCI-H2122(非小细胞肺癌)，MIA PaCa-2(胰腺癌)，ACHN(肾细胞癌)，WM793B(黑素瘤)和U266B1(淋巴瘤)(全部购自American Type TissueCollection(Manassas,VA))在合适的条件下培养并以5000-20000细胞/孔的细胞密度接种(根据每种癌细胞系的生长曲线确定合适的值)。以0.0001-100μg/mL的浓度加入DR4/5拮抗细胞。可选地，将DR4/DR5激动剂与治疗方法组合，包括化学疗法(例如硼替佐米)或通过辐射预先敏化的细胞，产生协同效应，上调DR4或DR5或改变半胱天冬酶活性。在不同的时间点使用“APO-ONE半胱天冬酶试验”(Promega)，根据生产商的说明确定半胱天冬酶活性。
通过如上所述温育2×106个肿瘤细胞，由蛋白印迹法进行进一步分析。制备后续的细胞裂解液进行蛋白印迹分析。通过SDS-PAGE分离蛋白，并转移至硝酸纤维素膜。用抗体温育滤膜，所述抗体可识别凋亡蛋白PARP、半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、bid和肌动蛋白的前蛋白和裂解形式。通过HRP-耦合二级抗体和增强化学发光检测对应于具体蛋白质的条带。
实施例18
肿瘤异种移植模型中的拮抗分子评价
将癌细胞系(例如HCT-116，SW620，COLO205)皮下注射进Balb/cnude或SCID小鼠。使用卡尺一周测量两次肿瘤长度和宽度。一旦肿瘤的大小达到250mm3，将小鼠随机分组并肌肉注射或皮下注射10-100mg/kg DR4或DR5激动剂。将治疗与其它疗法如化学疗法(例如伊立替康，硼替佐米或5FU)或放射性治疗组合。观察肿瘤大小30天，除非肿瘤大小达到1500mm3，此时要处死小鼠。
实施例19
人文库1-4对人DR4和DR5的淘选
1.对DR4受体的淘选
使用人CTLD的人环1-4文库进行淘选，淘选在DR4/Fc抗原涂布(R&D Systems)孔上进行，所述孔在用以100μL PBS每孔稀释的250ng至1μg载体自由靶标抗原结合前一晚新鲜制备。抗原板在4°C过夜温育，然后在37°C温育1h，用PBS/0.05% Tween 20洗涤两次，并用PBS洗涤两次，然后用1% BSA/PBS在37°C阻断1h，之后进行淘选。每轮使用六孔，使用未稀释、1∶10和1∶100稀释度平行的纯化噬菌体上清储液，在37°C将噬菌体与孔结合两小时。因为靶标抗原表达为Fc融合蛋白，所以噬菌体上清储液包含1μg/mL可溶IgG1 Fc作为可溶竞争剂。此外，在靶标抗原结合前，将噬菌体上清预结合至包含人IgG1Fc的抗原孔，去除Fc接头(预结合过程中不存在可溶的IgG1 Fc竞争剂)。
为了产生用于第一轮淘选的噬菌体，将10μg文库DNA转移进电感受态TG-1细菌并在包含40μg/mL羧苄青霉素和2%葡萄糖的SB的100mL培养基中在37°C生长1小时。然后将羧苄青霉素的浓度增加至50μg/mL，并且使培养基再生长一小时。然后将培养体积增至500mL，并用辅助噬菌体以5x109pfu/mL的感染量(MOI)感染培养物，并在37°C再生长一小时。离心细菌并重悬于包含50μg/mL羧苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的500mL SB中，并在室温于250rpm震荡，生长过夜。第二天将细菌离心，并用终浓度4% PEG/0.5M NaCl在冰上沉淀噬菌体1小时。然后在4°C以10,500rpm离心沉淀的噬菌体。将噬菌体团重悬于包含Roche不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂的1%BSA/PBS中。然后在微量离心机中以13,200rpm中将重悬的噬菌体离心10分钟，并通过0.2μM滤膜，去除残余细菌。
50μL纯化的噬菌体上清储液每孔与IgG Fc涂布的孔在37°C预结合1小时，然后以合适的稀释度转移至用靶标抗原涂布的孔，如上所述在37°C预结合2小时。然后用PBS/0.05% Tween 20上下吸取而洗涤5分钟(第一轮洗涤1次，第二轮洗涤5次，并且在第三轮和第四轮洗涤10次)。用60μL每孔酸洗脱缓冲液(甘氨酸pH 2)将结合靶标抗原的噬菌体洗脱，然后用2M Tris 3.6μL/孔中和。然后使用洗脱的噬菌体在室温感染TG-1细菌(2mL，OD600为0.8-1.0)15分钟。将培养物用包含40μg/mL羧苄青霉素和2%葡萄糖的SB补充至10mL，并在37°C以250rpm震荡，生长1小时。然后将羧苄青霉素浓度增至50μg/mL，并使培养物再生长一小时。然后将培养体积增至100mL，并用MOI为5x109pfu/mL的辅助噬菌体感染细菌，在37°C再生长一小时。离心细菌，并重悬于包含50μg/mL羧苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的100mL SB中，在室温以250rpm震荡，过夜生长。类似地进行后面轮次的淘选，由于培养体积更小而作相应调整，并且在后面的轮次中增加洗涤次数。克隆在DR4/Fc上进行四轮淘选，从第三和第四轮筛选中获得克隆。
2.噬菌体ELISA
使用细菌的TG-1菌株进行至少四轮淘选。在每轮淘选中，取样本并涂布在包含50μg/mL羧苄青霉素和2%葡萄糖的LB平板上。为了筛选噬菌粒克隆对受体靶标的特异性结合，在后面的淘选轮次中从这些平板挑取单个菌落，并在室温以250rpm震荡，在包含2%葡萄糖和50μg/mL羧苄青霉素的250μL 2xYT培养基中过夜生长，所述培养基在聚丙烯96-孔中，顶部覆盖透气膜。第二天通过用30μL前面的过夜培养物接种包含2%葡萄糖和50μg/mL羧苄青霉素的500μL 2xYT，在96孔深孔板中建立复制板。使用其余过夜培养物，通过向每个孔加入100μL 50%甘油而获得主储液板，并在-80°C储存。复制培养板在37°C以250rpm生长约2小时，直到OD600为0.5-0.7。然后用混合至5x109pfu/mL的K07辅助噬菌体感染孔，并在37°C不震荡温育30分钟，然后在37°C以250rpm震荡，再温育30分钟。然后以2500rpm和4°C离心培养物20分钟。从孔去除上清，并将细菌细胞团重悬于包含50μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的500μL 2xYT中。将透气膜放在培养模块上，并且细胞在室温以250rpm震荡过夜生长。
在第3天，离心培养物，并用3%牛奶/PBS将包含噬菌体的上清在室温阻断1小时。使用75-100ng结合抗原每孔进行初始噬菌体ELISA。在前一晚通过加入用100μL PBS每孔稀释的上述量的抗原结合，新鲜制备DR4/Fc抗原(R&D Systems)-包被孔和IgG Fc包被孔。在4°C过夜温育抗原板，然后再37°C温育1小时，用PBS/0.05% Tween 20洗涤两次，并用PBS洗涤两次，然后在ELISA之前用3%牛奶/PBS在37°C阻断1小时。将阻断的噬菌体与阻断的抗原-结合板结合1小时，然后用0.05% Tween 20/PBS洗涤两次，再用PBS洗涤两次。然后使用用3%牛奶/PBS稀释的结合HRP的抗-M13二级抗体，结合1小时，并如上所述洗涤。使用90μL TMB底物混合物显示ELISA信号，然后用90μL 0.2M硫酸终止，然后在450nm读取ELISA板。在鉴别的阳性结合克隆上进行二级ELISA筛选，针对其他TRAIL受体和诱饵受体筛选，测试特异性(DR4，DR5，DcR1和DcR2)。同上述方案相似地进行二级ELISA筛选。
DR4特异结合克隆。从人TN1-4文库中选择的与DR4受体特异性结合的环1和4的氨基酸序列详细列于下面的表4中。
表5
与人DR4连接的环1和环4序列
Figure BDA00001748334900751
3.对DR5受体的淘选
除了进行五轮淘选和在包被BSA而不是IgG1 Fc的孔上进行预结合之外，与上述对DR4受体的淘选相似地进行对DR5受体的淘选。然而噬菌体上清储液包含在每轮中用作Fc结合的可溶性竞争剂的可溶性IgG1 Fc。从第5轮筛选获得DR5特异性结合克隆。获得自用于DR5特异性结合的克隆的环1和4的氨基酸序列如表6所示。
表6
来自可连接人DR5的接头的环1和4的序列
Figure BDA00001748334900771
如上所述，环1在筛选文库中包含七个随机化氨基酸，而环4具有5个随机化氨基酸的插入，替代2个天然氨基酸(表6中的下划线区域)。在一些改变的环中包含谷氨酰胺(Q)的克隆中，琥珀-抑制终止密码子(TAG)编码谷氨酰胺，并用小写“q”表示。在淘选过程中，鉴别了包含几个在这些区域之外的改变的克隆，例如，在环4中，羰基侧翼氨基酸在几个实例中由E变为K。
实施例20
可与人DR4和DR5受体结合的ATRIMERTM接头的亚克隆和产生
通过用BglII和MfeI限制性酶双消化，从DR4/DR5接头DNA释放环区域DNA片段，并连接至细菌表达载体pANA4(SEQ ID:54)、pANA10(SEQ ID:60)或pANA19，在大肠杆菌中产生分泌的ATRIMERTM。
将表达构建体转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，并且将细菌涂布在包含氨苄青霉素的LB琼脂上。将新鲜平板上的单菌落接种到包含氨苄青霉素的2xYT培养基中。将培养物在37C，200rpm震荡的摇床上温育，直至OD600达到0.5，然后冷却至室温。加入阿拉伯糖中毒(arabinosis)至终浓度0.002-0.02%。在室温以120-150rpm震荡，过夜进行诱导，之后通过离心收集细菌。通过等渗休克或轻柔地超声提取周质蛋白。
通过Ni+-NTA亲和色谱纯化6xHis-标签ATRIMERTM。简而言之，在His-结合缓冲液(100mM HEPES，pH 8.0，500mM NaCl，10mM咪唑)中重构周质蛋白并载入用His-结合缓冲液预平衡的Ni+-NTA柱上。用10倍体积的结合缓冲液洗涤柱。用洗脱缓冲液(100mM HEPES，pH8.0，500mM NaCl，500mM咪唑)洗脱蛋白。将纯化的蛋白透析进入PBS缓冲液中，并通过离子交换去除细菌内毒素。
通过Strep-Tactin亲和色谱纯化strep II-标签ATRIMERTM。简而言之，在1X结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.5，150mM NaCl，2mMCaCl2，0.1% Triton X-100)中重构周质蛋白并载入用结合缓冲液预平衡的Strep-Tactin柱上。用10倍体积的结合缓冲液洗涤柱。用洗脱缓冲液(包含2.5mM脱硫生物素的结合缓冲液)洗脱蛋白。将纯化的蛋白透析进入结合缓冲液并通过阳离子交换去除细菌内毒素。
将环区域的DNA片段亚克隆进入哺乳动物表达载体pANA2(SEQID NO:52)和pANA11(SEQ ID NO:61)中，在HEK293瞬时表达系统中产生ATRIMERTM。通过用BglII和MfeI限制性酶双消化，从IL-23R接头DNA释放环区域的DNA片段，并连接至表达载体pANA2和pANA11，所述载体已用BglII和MfeI预消化。通过Qiagen HiSpeedPlasmid Maxi Kit(Qiagene)从细菌纯化表达质粒。对于HEK293粘附细胞，根据生产商的方案通过Qiagen SuperFect Reagent(Qiagene)进行瞬时转染。转染后一天，去除培养基并转移至293 Isopro无血清培养基(Iryine Scientific)。两天后，向培养基加入0.5M HEPES中的20%葡萄糖至终浓度1%。转染后4-7天收集组织培养物上清用于纯化。对于HEK293F悬浮细胞，通过Invitrogen的293Fectin及其方案进行瞬时转染。第二天，向培养基中加入1倍体积的新鲜培养基。转染后4-7天收集组织培养物上清用于纯化。如上所述从哺乳动物组织培养物上清纯化His-或Strep II-标签ATRIMERTM。
将环区域的DNA片段亚克隆进哺乳动物表达载体pANA5(SEQID NO:55)、pANA6(SEQ ID NO:56)、pANA7(SEQ ID NO:57)、pANA8(SEQ ID NO:58)和pANA9(SEQ ID NO:59)，在HEK293瞬时表达系统中产生具有不同CTLD-呈现方向的ATRIMERTM复合物。pANA5是在人TN中包含C-端His-标签和V49缺失的修饰pCEP4载体。相似地，pANA6具有T48缺失，并且pANA7具有T48和V49缺失。pANA8具有C50，C60——S50，S60双突变，提供比野生型TN更灵活的CTLD。pANA9具有E1-V17缺失，去除糖基化位点。通过用BglII和MfeI限制性酶双消化，从IL-23R接头DNA释放环区域的DNA片段，并连接至表达载体pANA5、pANA6、pANA7、pANA8和pANA9，所述载体已用BglII和MfeI预消化。
实施例21
使用Biacore鉴别人DR4和DR5受体接头的亲和力
表7和8分别提供了三聚DR4和DR5接头的表观亲和力。使用标准的胺耦合化学进行抗-人IgG Fc抗体(Biacore)与CM5芯片(Biacore)的固定化，并且使用这个表面捕获重组的人DR4或DR5受体Fc融合蛋白(R&D Systems)。以30ul/分向IL-23受体表面注射ATRIMERTM复合物稀释液(1-500nM)，并使用Biaevaluation软件(3.1版，Biacore)由感应图数据产生动力学常数。数据收集为3分钟关联和5分钟解离。用3M氯化镁的30s脉冲再生抗-人IgG表面。所有感应图均为针对活化和阻断流通池以及缓冲液注射的双重参照。
表7
H环1-4文库的DR4受体接头的表观亲和力。
  分析物   Ka(1/M·s)   Kd(1/s)   KA(1/M)   KD(nM)
  014-42.3D10   1.22E+04   1.85E-03   6.58E+06   152
  014-42.3B8   1.12E+05   1.01E-03   1.11E+08   9.01
  014-42.3D11   1.33E+04   5.26E-04   2.53E+07   39.5
表8
H环1-4文库的DR5受体接头的表观亲和力
  分析物   Ka(1/M·s)   Kd(1/s)   KA(1/M)   KD(nM)
  1a7b(=A8G)   4.05E+04   6.29E-04   6.43E+07   15.6
  8b6b(=A1H)   1.29E+04   5.06E-04   2.56E+07   39.1
  9b3d(=B3D)   116   1.04E-04   1.11E+06   899
  2a1a(=B9F)   4.38E+04   1.84E-03   2.38E+07   42.8
  4a8c(=A3C)   6.30E+04   3.62E-04   1.74E+08   5.74
细胞检测说明。
在96孔白色透明板(Costar)中，在10% FBS/RMPI培养基中以1×104细胞/孔将H2122肺腺癌细胞(ATCC#CRL-5985)和A2780卵巢癌细胞(欧洲细胞培养物中心，#93112519)与DR5 ATRIMERTM(20ug/mL)或TRAIL(0.2ug/mL,R&D Systems)温育。对照孔装培养基和各种缓冲液：DR5 ATRIMERTM为TBS，TRAIL为PBS。20小时后，通过ViaLightPlus(Lonza)确定细胞活力，并在Glomax luminometer(Promega)上检测。用相对于各自缓冲液对照的细胞死亡百分比表示数据(见图10)。使用Excel绘制三次重复的平均值和标准偏差。测试了五个DR5ATRIMERTM复合物：4a8c、2a1a、1a7b、9b3d和8b6b。三个DR5ATRIMERTM(4a8c、1a7b和8b6b)在两种细胞系中均表现出超过50%的杀死细胞率。在各次单独实验中获得了相似的数据。
实施例22
针对人DR5的NEB肽文库淘选和DR5特异性肽的鉴别
使用New England Biolabs(NEB)Ph.D.噬菌体展示文库进行肽文库的淘选。在DR5/Fc抗原-包被(R&D Systems)孔上进行淘选，所述孔在与用150uL 0.1M NaHCO3 pH 8.6每孔稀释的3ug无载体靶标抗原结合前一晚新鲜制备。每轮使用两个重复孔。在4°C过夜温育抗原板，然后在37C温育1小时。去除抗原，然后在淘选前用PBS pH 7.4中的0.5%煮沸酪蛋白在37C阻断1小时。然后去除酪蛋白，然后用300uLTBST(0.1%Tween)洗涤孔六次，然后加入噬菌体。因为靶标抗原表达为Fc融合蛋白，所以在靶标抗原结合前，将噬菌体上清与包含人IgG1Fc的抗原孔预结合1小时，去除Fc接头(在第2轮到第4轮的过程中)。如上所述，与DR5/Fc抗原结合孔相似地进行Fc抗原结合孔的制备。
对于第一轮淘选，向每个孔加入100uL TBST(0.1%Tween)，并向每个孔加入3个NEB肽文库(Ph.D.-7，Ph.D.-12和Ph.D.-C7C)各5uL。在室温轻轻震荡板，然后用TBST(0.1%Tween)洗涤十次。用100uL包含浓度为100ug/mL的可溶性DR5/Fc靶标抗原的PBS洗脱结合的噬菌体。在室温震荡洗脱噬菌体1小时。然后从孔去除洗脱的噬菌体，并用于感染OD600nm为0.05至0.1的20ml ER2738细菌，并在37°C在250rpm震荡生长4.5小时。然后以12K X G在4°C将培养物中的细菌离心分离20分钟。将细菌转移至新鲜管中并再次离心。再次将上清转移至新鲜管中，并通过加1/6体积的20%PEG/2.5M NaCl而沉淀噬菌体。在4°C过夜沉淀噬菌体。第二天，以12K X G在4°C将沉淀的噬菌体离心20分钟。弃去上清并将噬菌体团重悬于1ml TBST(0.1%Tween)中。通过在4°C在微量离心机中以13.2K离心10分钟而去除其余细菌。然后将噬菌体上清转移至新管中，并通过加入1/6体积的20%PEG/2.5M NaCl而再次沉淀，并在冰上以4°C温育1小时。在微量离心机中以13.2K在4°C将沉淀的噬菌体离心10分钟。弃去上清并将噬菌体团重悬于200uL TBS中。除了噬菌体与Fc包被孔预结合1小时以及从前一轮得到的4uL扩增的噬菌体储液每孔用于结合之外，后面的淘选轮次与第一轮相似。除此之外，10次洗涤中使用的tween在TBST中的浓度增加至0.5%。
噬菌体ELISA
使用ER2738细菌菌株进行至少四轮淘选。在每轮淘选中，取样并使用LB/Xgal平板上的顶层琼脂涂布获得噬菌斑。为了筛选噬菌体克隆与受体靶标的特异性结合，从来自后面淘选轮次的这些平板挑取各个噬菌斑，并用于感染OD600nm为0.05至0.1的ER2738细菌，并在37°C以250rpm震荡生长4.5小时。然后在4°C过夜保存。
在第2天，在4°C以12K X G将培养物离心20分钟，并用3%牛奶/PBS在室温将包含噬菌体的上清阻断1小时。使用75-100ng DR5/Fc抗原结合每孔进行最初的噬菌体ELISA。使用包含75-100ng人IgG1 Fc每孔的孔测量非特异性结合。通过结合用100uL PBS每孔稀释的上述量的抗原，在前一晚新鲜制备用DR5/Fc抗原(R&D Systems)-包被的孔和IgG1 Fc包被的孔。在4°C过夜温育抗原板，然后在37°C温育1小时，用PBS/0.05% Tween 20洗涤两次，并用PBS洗涤两次，然后在ELISA之前用3%牛奶/PBS在37C阻断1小时。将阻断的噬菌体与阻断的抗原结合平板结合1小时，然后用0.05% Tween 20/PBS洗涤两次，然后用PBS再洗涤两次。然后使用用3%牛奶/PBS稀释的HRP-耦合抗-M13二级抗体，结合1小时，并如上所述洗涤。使用90uL TMB底物混合显示ELISA信号，然后用90uL 0.2M硫酸终止，然后在450nM读取ELISA板。在鉴别的阳性结合克隆上进行二次ELISA筛选，针对其它TRAIL受体和诱饵受体筛选，测试特异性(DR4、DR5、DcR1和DcR2)。与上述方案相似地进行二次ELISA筛选。
DR5特异性结合克隆。表XX中详细显示了由NEB Ph.D.-C7C噬菌体文库筛选与DR受体特异性结合的肽的氨基酸序列实例。
表9
  克隆   肽序列  肽SEQ ID NO
  088-13.1H3   ACFPIMTLHCGGG  369
表10:TRAIL-相关序列
Figure BDA00001748334900831
Figure BDA00001748334900841
实施例23-32提供了利用本发明的组合多肽文库来鉴定和分离特异性结合IL-23受体的CTLD多肽的示例性方法。
IL-23是Th17细胞产生和存活所必需的细胞因子。大量来自临床前模型和临床实践的证据表明，Th17细胞在包括类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化的许多自体免疫疾病的病理学中发挥着至关重要的作用。IL-23R是Th17细胞上的关键靶标。类似地，IL-23细胞因子由两个亚单位p19和p40组成，p19亚单位为IL-23独有，p40与IL-12共享。IL-23是与IL-23受体结合并介导某些T细胞亚型、NK细胞和骨髓细胞的活化的杂二聚受体。IL-23杂二聚受体由两个亚单位IL-23R和IL-12Rβ1组成，IL-23R是IL-23途径独有的亚单位。IL-12Rβ1与IL-12受体共享，因此属IL-12途径。
重要地，IL-23R中的遗传变异与银屑病和克罗恩病(Crohn’s disease)有关，并且还与强直性脊柱炎,沃格特-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)、系统性硬化症、贝赫茨病(disease，BD)、原发性
Figure BDA00001748334900843
综合征(Primary
Figure BDA00001748334900844
Syndrome)、古德帕斯彻病(Goodpasture disease)的易感性有牵连。另外，已经表明了IL-23在移植物抗宿主病(Graft Versus Host disease)和慢性溃疡中的重要性，并且IL-23与肿瘤发生有牵连。
IL-23途径的阻断在自体免疫疾病的许多临床前模型中是有效的。但是，共享配体以及IL-23和IL-12途径之间的受体亚单位的性质导致了比之前认识的更加复杂的生物学过程，而且IL-23阻断与IL-12阻断的分离似乎在效果和安全性方面具有重要的治疗意义。之一或另一个或者二者的阻断可以在细胞因子亚单位或受体亚单位的水平上进行。
实施例23
人文库1-4的淘选和筛选
将由人文库1-4产生的噬菌体在重组人IL-23R/Fc嵌合体(R&DSystems)和重组小鼠IL-23R/Fc嵌合体(R&D Systems)上淘选。在所有情形中，在三、四和/或五轮淘选之后使用ELISA平板测定对这些结合实验对象进行筛选，鉴别出受体特异性结合物。
为了产生用于淘选的噬菌体，将主文库DNA通过电穿孔转化到细菌菌株TG1(Stratagene)中。在37℃下在SOC(具有代谢产物抑制作用的超级优化肉汤(Super-Optimal broth))培养基中振荡，使细胞恢复1小时，之后，通过加入超级肉汤(SB)至20%葡萄糖、20μg/mL羧苄青霉素的最终浓度，使体积增加10倍。在37℃下摇动1小时之后，将羧苄青霉素浓度增加至50μg/mL再振荡1小时，之后加入400mL具有2%葡萄糖和50μg/mL羧苄青霉素的SB，并一起加入辅助噬菌体M13K07至最终浓度为5x109pfu/mL。在37℃下不加振荡地温育30分钟，然后在100-150rpm下再振荡温育30分钟。在4℃下将细胞在3200g下离心20分钟，然后重新悬浮在500mL含有50μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的SB培养基中。在以150rpm振荡的条件下使细胞在室温(RT)下生长过夜。通过在15,000g和4℃下离心20分钟使细菌细胞成粒状沉淀，分离噬菌体。将上清液用1/4体积(通常为250mL上清液/瓶+62.5mL PEG溶液)的20%PEG/2.5M NaCl在冰上温育30分钟。通过在15,000g和4℃下离心20分钟，使噬菌体成粒状沉淀。将噬菌体粒状沉淀重新悬浮在根据制造商说明书制备的含有0.1%叠氮化钠(BSA/PBS/叠氮化物)和完整的小型不含EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)的1%牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐缓冲盐水(PBS)。另外可选地，将噬菌体重新悬浮在含有0.05%煮沸酪蛋白(cassein)、0.025% Tween-20和蛋白酶抑制剂的缓冲液D中。将材料用Whatman Puradisc的直径25mm、孔径0.2μm的滤器过滤灭菌。
将由人文库1-4产生的噬菌体在重组人IL-23R/Fc嵌合体(R&DSystems cat #1686-MR)上淘选。文库淘选使用平板或珠的形式进行。对于平板形式，将96-孔Immulon HB2 ELISA板的六至八孔涂以250-1000ng/孔Dulbecco’s PBS中的不含载体的人IL-23R/Fc。将材料在平板上温育过夜，之后将孔用PBS洗涤三次，加入封闭缓冲液(1% BSA/PBS/叠氮化物或缓冲液C，含有0.05%煮沸酪蛋白和1% Tween-20)，然后将孔在37℃下温育至少1小时。同时将另外的孔也用封闭缓冲液处理，以便随后与封闭缓冲液结合的噬菌体的吸收。
使用噬菌体制剂的三种稀释液：未稀释，1:10和1∶100稀释于封闭缓冲液加蛋白酶抑制剂中。在一些轮的淘选中，向每个稀释液中加入重组人IgG1 Fc，至10μg/mL的最终浓度。将封闭缓冲液从“仅封闭(Block Only)”(预吸收以封闭)的孔中取出，将不同的噬菌体混合物在37℃下在这些孔中再温育1小时。将等份(50μL)的每种噬菌体混合物转移至洗涤并封闭的目标孔中，使其在37℃下温育2小时。对于第一轮淘选，将结合的噬菌体用1X PBS/0.05% Tween或缓冲液D洗涤一次，并使用含有1mg/mL BSA的pH 2.2的甘氨酸缓冲液洗脱。在用2MTris碱(pH 11.5)中和之后，将洗脱的噬菌体在酵母萃取-胰蛋白胨(YT)培养基中在600nm(OD600)下测得为大约0.9的光学密度下与2至4微升的TG1(Stratagene)、XL1-Blue(Stratagene)、ER2738(Lucigen或NEB)或SS320(Lucigen)细胞一起在室温下温育15分钟。使用上述方案由该感染物制备噬菌体，但规模减少大约20%(体积)。对由洗脱的噬菌体制备的噬菌体进行另外数轮淘选。在每一轮，通过用适当的抗生素在琼脂上铺板测定输入和输出噬菌体的滴度，随后使用来自这些平板的克隆用于通过ELISA筛选结合物。
如上所述进行额外数轮淘选，不同之处在于，在第二轮淘选中，洗涤增加到5次，在随后几轮中，洗涤增加到10次。进行三至六轮淘选。对于最后一轮淘选，在感染之后不产生噬菌体；相反，感染的细菌生长过夜，并且由DNA进行大规模制备(Qiagen试剂盒)。从每一轮冷冻储存(-80℃下)输入噬菌体的甘油原液(15%)。
对于珠淘选形式，使用Sulfo-NHS微型生物素化试剂盒(Thermo-Scientific)对人IL-23R进行生物素化并提纯。根据以上方案从主文库产生用于淘选的噬菌体，不同之处在于将噬菌体粒状沉淀重新悬浮在含有0.5%煮沸酪蛋白、加有不含EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)的0.025% Tween 20的PBS溶液的酪蛋白缓冲液中。使用磁体，将链霉抗生物素磁珠(2管，Myone T1 Dynabeads中每一个具有50μL或0.5mg(Invitrogen))在0.5%煮沸酪蛋白、1% Tween 20中洗涤数次，除去防腐剂。将150μL等份的噬菌体制剂与一管珠一起在37℃下预温育30分钟，以除去链霉抗生物素结合物。然后将噬菌体制剂从珠上去除，连同10μL人Fc一起以100μg/mL加入1μg生物素化的IL-23R，并在37℃下搅拌温育2小时。然后将该材料加入到其余的洗涤过的珠的管中，在37℃下温育30分钟。使用磁性架，将珠用PBS/0.05% Tween洗涤五次。将噬菌体用pH 2.0的甘氨酸洗脱，中和，并用于感染如上所述的细菌。在随后几轮淘选中，在洗脱之前将结合于珠的噬菌体洗涤10次。如上所述测定输入和输出噬菌体的滴度。
对于ELISA筛选，将来自后几轮淘选的克隆在YT培养基中用2%葡萄糖和抗生素生长过夜，将每一等份用于开始新的培养，其生长至OD600为0.5。将辅助噬菌体加入至5x109pfu/mL，并使其在37℃下感染30分钟，然后在37℃下搅动生长。将细菌离心，并重新悬浮在具有羧苄青霉素和卡那霉素的YT培养基中生长过夜，用以产生噬菌体。然后使细菌成粒状沉淀，除去培养基，并与1/5体积(1:5牛奶混合物：上清液)的6X PBS、18%牛奶混合。通过在4℃下与50-100μL含有75-100ng/孔重组人IL-23R/Fc的PBS一起温育过夜，制备ELISA平板。使用涂有人IgG Fc(R&D Systems)的复制平板作为对照。将平板用PBS洗涤3次，用1X PBS中3%的牛奶在37℃下封闭1小时，并与100uL/孔各个牛奶处理的噬菌体混合物一起温育1小时。将平板用PBS/0.05%Tween 20洗涤一次，用PBS洗涤两次，与缀合HRP的抗-M13抗体(GEHealthcare)一起温育1小时，各用PBS/Tween和PBS洗涤三次，与TMB底物(VWR)一起温育。加入硫酸，以使显色反应停止，读取450nm处吸光度，以识别阳性结合物。
从第三和第四轮淘选中识别人IL-23R的结合物。来自噬菌体展示的CTLD与人IL-23R/Fc嵌合体的结合物的随机化环1和4区域的序列例子在表11中给出。考察这些序列表明，对于31/36的结合物，随机化环4区域中的基序是很明显的：第二个和第五个氨基酸总是甘氨酸，第四个氨基酸总是环状氨基酸色氨酸或苯丙氨酸中的一个，第一个氨基酸是疏水的，通常是环状氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸，第三个氨基酸是疏水的，通常是缬氨酸。环1区域的共有区较少，但甘氨酸和丝氨酸主要出现在第一位和第二位，缬氨酸常常在第七位上。五个另外的结合物似乎不具有该共有区，但其中的两个可能与环4区域中的MFGMG(SEQ ID NO:598)或LFGRG(SEQ ID NO:599)一起形成另一小组。许多结合物各自由多个克隆呈递。
表11
人环1和4与人IL-23R/Fc嵌合体的结合物的序列
Figure BDA00001748334900881
Figure BDA00001748334900891
ELISA测定表明，这些结合物并不会与人IgG1 Fc或者与重组小鼠IL-23R交叉反应。ELISA和Biacore结合测定表明，来自候选物克隆001-69.4G8和其他的经提纯的单体CTLD或全长三聚物与IL-23竞争结合人IL-23R。已经识别出具有纳摩尔亲和力的竞争候选物。
表12中给出了来自小鼠IL-23R/Fc的噬菌体展示CTLD结合物的环1和4单独随机化区域的序列实例。该序列与人IL-23R结合物(例如，比较环1与B12C，或者比较环4与C12C)中所观察到的原基序具有相似性。令人感兴趣的是，环4中的位置4的不变的环色氨酸/苯丙氨酸被小鼠IL-23R结合物中的甘氨酸替换。
表12
人环1和4与小鼠IL-23R的结合物的序列
  克隆   环1[SEQ ID NO]   环4[SEQ ID NO]
  H1-4P141D   GSSQMDV[432]   WGLGG[433]
实施例24
人IL-23R结合物的亲和力成熟
由于人IL-23R的环4区域似乎是相关的基序，开发以下改组(shuffling)方法，其保留已经通过淘选获得的环4区域的多样性，但从初始的天然文库中以所有可能的环1区域将其再分类。为此，将人IL-23R的第四轮淘选的DNA用EcoRI和BssHII限制酶消化，上述限制酶在环1和环4区域之间切割，分离大约1.4kb的含有环4区域的片段。单独地，将初始的人1-4文库DNA用同样的酶消化，分离出大约3.5kb的含有环1区域的片段。将这些片段连接在一起，如上所述，产生新的h1-4改组文库。使用珠方案(如上)对文库进行淘选，不同之处在于，每一轮淘选时，生物素化的重组人IL-23R/Fc的量降低约10倍，从200ng，(降至20ng，降至2ng)，降至0.1ng。将来自克隆的噬菌体上清液如上所述通过ELISA进行筛选，鉴定结合物并进行测序。亲和力成熟的结合物的环1和4序列出现于表13中。
表13
亲和力成熟的人环1-4的与人IL-23R的结合物的环1和4序列
生成单独的亲和力成熟文库，其中在初始的第4轮淘选中得到的环1区域的多样性得以保持，利用环4选项的有限选择，并且环3在六个位置中进行随机化。这通过以下方法实现：产生引物，以便使用来自人环1-4文库的初始的第4轮淘选的DNA作为模板，连同引物Bglfor(SEQ ID NO:158)和H1-3-4R(SEQ ID NO:185)对环1区域进行扩增。该引物编码以下的环3和4的氨基酸序列：
RIAYKNWEXXXXXQPXGG(F/L)G(F/Y/V/D)(F/W/L/C)GENCAVLS(SEQ ID NO:600)。
该序列并入了环4的主要可选性，以及CTLD环3区域的变化。另外生成其他的与之类似但对环4更具特异性的引物，并用于产生另一在环3区域中随机化的文库。通过使用引物PstLoop4rev(SEQ ID NO:186)和Pst Rev(SEQ ID NO:142)的重叠PCR产生其余的感兴趣区域。
从这些文库中得到的亲和力成熟的IL-23R结合序列提供于表14中。通过以更有利的环4或环1序列交换其他来改变得到的一些结合物，得到额外的亲和力成熟的结合物，这些均包括在表14中。
表14
Figure BDA00001748334900911
*克隆101-80-5H3在改变的区域的正上游从计划的环4有一氨基酸缺失，在环4区域中有其他两个氨基酸变化(GlyGly变化成AlaAla)。
表15显示了一些额外的克隆，其由类似于H1-3-4R(SEQ ID NO:185)的引物产生，但具有以下环修饰的编码序列。
表15
Figure BDA00001748334900921
通过将环4限于五个氨基酸序列：FGVFG(SEQ ID NO:381)、WGVFG(SEQ ID NO:404)、FGYFG(SEQ ID NO:389)、WGYFG(SEQID NO:413)和WGVWG(SEQ ID NO:409)，同时保持在IL-23R结合物中环1的起始处发现的GlySer，并使用NNK策略改变环1中随后的五个氨基酸，生成另一个亲和力成熟文库。将引物GSXX(SEQ ID NO:194)和090827 BssBglrev(SEQ ID NO:195)混合，并使用PCR延长，将引物FGVFGfor、FGYFGfor、WGVFGfor、WGYFGfor和WGVWGfor(SEQID NOS:196至200)分别与引物Pst Loop 4 rev(SEQ ID NO:186)混合并使用PCR延长。将产生的片段凝胶提纯并混合，并在引物Bgl for(SEQID NO:158)和Pst rev(SEQ ID NO:142)的存在下通过PCR延长。将产生的片段用Bgl II and Pst I消化，并插入到用于噬菌体展示的载体pANA27中。使用具有连续目标稀释的珠淘选，从文库中选择亲和力成熟的候选物。从该文库得到的候选物的序列提供于表16中。
表16
  候选物   环1   SEQ ID NO:   环4   SEQ ID NO:
  105-20-1H7   GSAGTNT   464   FGYFG   389
  105-57-2E8   GSAHTDT   465   WGYFG   413
  105-08-2G2   GSAITDT   466   WGYFG   413
  105-08-2B3   GSAITNT   467   WGYFG   413
  105-20-2C4a   GSAKTDT   468   WGYFG   413
  105-20-1A6   GSAKTGT   469   WGYFG   413
  105-59-3E5   GSAKTNT   470   WGYFG   413
  105-08-1C6   GSALTDT   471   FGYFG   389
  105-08-1D1   GSALTDT   471   WGYFG   413
  105-20-1B3   GSALTNT   396   FGYFG   389
  105-59-3H6   GSALTRT   472   WGVFG   404
  105-59-3C8   GSALTSL   473   WGVWG   409
  105-57-2D11   GSARGRV   474   WGVWG   409
  105-20-2F10   GSARTDT   475   FGYFG   389
  105-08-2D2   GSARTGT   476   FGYFG   389
  105-08-1D10   GSARTGT   476   WGYFG   413
  105-08-1A4   GSAVTNT   477   FGYFG   389
  105-08-2F6   GSAYTNT   478   FGYFG   389
  105-08-2E12   GSGLTDT   479   WGYFG   413
  105-55-1A10   GSGWTGL   480   WGVWG   409
  105-20-2F12   GSKLTDT   481   FGYFG   389
  105-82-4A3   GSKVSGL   482   WGVFG   404
  105-08-1D3   GSKVTET   483   FGYFG   389
  105-61-4D8   GSLKTDT   484   FGVFG   381
  105-08-2C11   GSLKTQT   485   WGYFG   413
  105-08-2C10   GSLLTDT   486   FGVFG   381
  105-08-2G6   GSLLTDT   486   WGYFG   413
  105-59-3A5   GSLLTNT   487   FGVFG   381
  105-08-2C4   GSLLTNT   487   FGYFG   389
  105-61-4B2   GSLRSDL   488   FGVFG   381
  105-61-4G3   GSLRTDT   489   FGVFG   381
  105-08-1G12   GSLRTGT   490   WGYFG   413
  105-78-2D1   GSLRTHT   491   FGVFG   381
  105-78-2E6   GSLRTNT   492   FGVFG   381
  105-59-3B9   GSMLTDT   493   FGVFG   381
  105-08-2A1   GSMRTDT   494   WGYFG   413
  105-08-2H10   GSNHTDT   495   FGYFG   389
  105-59-3B5   GSPITDT   496   FGVFG   381
  105-20-2A3   GSPITNT   497   FGYFG   389
  105-08-1G9   GSPKTDT   498   FGYFG   389
  105-08-2G7   GSPKTGT   499   FGYFG   389
  105-08-2G1   GSPKTHT   500   FGYFG   389
  105-08-2G10   GSPLTDT   501   FGYFG   389
  105-61-4G5   GSPLTNT   502   FGVFG   381
  105-20-1H1   GSPLTNT   502   WGYFG   413
  105-08-1B7   GSPRTDT   503   FGYFG   389
  105-08-1A3   GSPRTDT   503   WGVFG   404
  104-101-1A3F   GSPRTDT   503   FGVFG   381
  105-08-2H11   GSPRTDT   503   WGYFG   413
  105-08-2H12   GSPRTET   504   FGYFG   389
  105-08-2G4   GSPRTGT   505   FGYFG   389
  105-59-3D6   GSPRTHT   506   FGYFG   389
  105-08-1A8   GSPRTNT   507   FGVFG   381
  105-20-2G12   GSPRTNT   507   FGYFG   389
  105-08-1B1   GSPRTQT   508   FGYFG   389
  105-57-2E11   GSPRTSV   509   FGYFG   389
  105-08-2H2   GSPTTDT   510   WGYFG   413
  105-59-3C11   GSPVNDV   511   FGYFG   389
  105-08-1D2   GSPVTDT   512   FGYFG   389
  105-55-1F3   GSPVTDT   512   WGYFG   413
  105-08-2H6   GSPVTGT   513   FGYFG   389
  105-59-3F1   GSPVTNT   514   FGYFG   389
  105-59-3H4   GSQLTDT   515   FGYFG   389
  105-08-1C3   GSQLTDT   515   WGYFG   413
  105-57-2E2   GSQLTNT   516   FGYFG   389
  105-08-2C12   GSQRTDT   517   FGYFG   389
  105-08-2C6   GSQRTDT   517   WGYFG   413
  105-08-1C2   GSRATDT   518   FGYFG   389
  105-08-1B10   GSRHTDT   519   FGYFG   389
  105-76-1D11   GSRLTDT   520   WGVFG   404
  105-59-3E3   GSRLTNT   521   FGYFG   389
  105-55-1E3   GSRRTDT   522   FGYFG   389
  105-20-2G5   GSRRTDT   522   WGYFG   413
  105-08-1A10   GSSITDT   523   WGYFG   413
  105-08-1G2   GSSKTNT   524   WGYFG   413
  105-59-3F9   GSSLTDT   525   FGYFG   389
  105-08-2C1   GSSLTDT   525   WGYFG   413
  105-61-4H2   GSSLTNT   526   FGYFG   389
  105-08-2H3   GSSLTNT   526   WGYFG   413
  105-08-1C11   GSSRTDT   527   FGYFG   389
  105-20-1B4   GSSRTNT   528   WGYFG   413
  105-08-1C10   GSSVTNT   529   WGYFG   413
  105-82-4A11   GSSVTST   530   WGVFG   404
  105-08-1C9   GSTLTDT   531   FGYFG   389
  105-08-1C4   GSTLTDT   531   WGYFG   413
  105-59-3G12   GSTLTNT   532   FGYFG   389
  105-08-2C9   GSTLTNT   532   WGYFG   413
  105-55-1A11   GSTMTQT   533   FGYFG   389
  105-59-3G9   GSTRTDT   534   FGYFG   389
  105-59-3B11   GSTRTNT   535   FGYFG   389
  105-61-4B12   GSVITGT   536   FGYFG   389
  105-61-4E5   GSVITNT   537   FGYFG   389
  105-20-2C4b   GSVKTDT   538   WGYFG   413
  105-08-1D12   GSVLTDT   539   FGYFG   389
  105-59-3A6   GSVLTGT   540   FGYFG   389
  105-55-1B9   GSVLTNT   541   FGYFG   389
  105-08-2H4   GSVRTDT   542   FGYFG   389
  105-80-3G12   GSVRTDT   542   WGVFG   404
  105-20-2C11   GSVRTDT   542   WGYFG   413
  105-80-3D4   GSVRTES   543   FGVFG   381
  105-59-3F11   GSVRTGT   544   FGYFG   389
  105-08-1A7   GSVRTNT   545   FGYFG   389
  105-20-2C7   GSVTTDT   546   FGYFG   389
  105-57-2H2   GSWGSGI   547   WGVWG   409
  105-08-2C8   GSWLTDT   548   WGYFG   413
  105-55-1D12   GSYLTNT   549   FGYFG   389
通过丙氨酸扫描，即通过本领域技术人员已知的基因位点特异性诱变将特定的氨基酸用氨基酸丙氨酸取代，产生环的氨基酸序列和周围序列的额外的变化。表17描述了在候选物056-53.H4E中进行的丙氨酸取代。这种取代并不限于所示的残基，可以在任何候选物骨架中进行。表17显示了许多的这些取代对于亲和力和/或蛋白质产生是有利的。
表17结合IL-23R的丙氨酸扫描候选物
Figure BDA00001748334900951
*注意，由于在环4中引入了三个额外的氨基酸，056-53.H4E氨基酸的编号不同于所列最后四个候选物的TN序列编号。因此，例如，056-53.H4E中的E153对应于原始TN序列中的E150(例如，图2)。
表18
通过丙氨酸扫描产生的056-53.H4E ATRIMERTM多肽复合物的大肠杆
菌周质中的亲和力和产生水平
  Atrimer   KD(nM)   mg/L
  056-53.H4E   0.772   1.430
  H4E N115A   7.560   0.923
  H4E G116A   10.700   1.680
  H4E S117A   2.230   1.314
  H4E L119A   1.330   1.600
  H4E T120A   1.210   1.500
  H4E N121A   0.989   1.100
  H4E T122A   6.690   1.000
  H4E W123A   11.500   1.100
  H4E R130A   1.570   1.940
  H4E K134A   1.580   0.764
  H4E N135A   1.170   0.546
  H4E W136A   14.400   0.484
  H4E E137A   0.597   1.850
  H4E T138A   0.743   2.218
  H4E E139A   0.640   1.194
  H4E I140A   1.280   1.706
  H4E T141A   0.651   1.378
  H4E Q143A   0.689   0.444
  H4E D145A   0.714   0.876
  H4E G146A   0.960   1.092
  H4E G147A   1.030   0.512
  H4E E153A*   0.948   0.750
  H4E N154A*   0.843   1.570
  H4E R170A*   0.777   1.984
  H4E R172A*   1.080   0.836
实施例25
与人IL-23R的CTLD和ATRIMERTM多肽复合物结合物的亚克隆和产生
通过用BglII和PstI(或MfeI)限制酶消化，并与用BglII和PstI预消化过的细菌CTLD表达载体pANA1(SEQ ID NO:51)、pANA3(SEQID NO:53)或pANA12(SEQ ID NO:62)连接，得到编码环区的DNA片段。pANA1是设计成表达C-端6xHis-标记的人单体CTLD的基于T7的表达载体。pelB信号肽将蛋白质导向周质或生长培养基。pANA3是pANA1的C-端HA-His-标记的形式。pANA12是pANA1的C-端HA-StrepII-标记的形式。对于三聚蛋白质的表达，可以将环区亚克隆到ATRIMERTM多肽复合物表达载体pANA4(SEQ ID NO:54)或pANA10(SEQ ID NO:60)中，以在大肠杆菌中产生分泌的ATRIMERTM多肽复合物。pANA4是含有C-端His/Myc-标记的全长人TN的基于pBAD的表达载体，其具有将蛋白质导向周质或生长培养基的ompA信号肽。pANA10是pANA4的C-端HA-StrepII-标记的形式。
将表达构建物转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。将Star(对于pANA1、pANA3和pANA12；单体CTLD的产生)或BL21(DE3)(对于pANA4 and pANA10；ATRIMERTM多肽复合物的产生)与适当的抗生素一起在LB/琼脂平板上铺开。将新鲜平板上的单个群落接种到1L的具有1%葡萄糖和卡那霉素的SB(对于pANA1和pANA12载体)或者具有氨苄青霉素的2xYT(两倍浓缩的酵母胰蛋白胨)培养基(对于pANA4和pANA10载体)中。将培养物在摇床上以200rpm在37℃下温育，直至OD600为0.5，然后冷却至室温。对于pANA1和pANA12，加入IPTG至最终浓度为0.05mM，而对于pANA4和pANA10，加入阿拉伯糖中毒(arabinosis)至最终浓度为0.002-0.02%。在以120-150rpm振荡的条件下诱导进行过夜，之后通过离心收集细菌。将周质蛋白质通过渗透性冲击或温和超声提取。
使用Ni+-NTA亲和力色谱提纯6xHis-标记的蛋白质。简言之，将周质蛋白质在His-结合缓冲液(100mM HEPES,pH 8.0,500mM NaCl,10mM咪唑)中重构，并装到用His-结合缓冲液预平衡的Ni+-NTA柱上。将柱子用10x体积的结合缓冲液洗涤。将结合的蛋白质用洗脱缓冲液(100mM HEPES,pH 8.0,500mM NaCl,500mM咪唑)洗脱。将提纯的蛋白质透析到1X PBS缓冲液中，通过阴离子交换除去细菌内毒素。
将strep II-标记的单体CTLD和ATRIMERTM多肽复合物通过Strep-Tactin亲和力色谱提纯。简言之，将周质蛋白质在1X PBS缓冲液中重构，并装到用1X PBS缓冲液预平衡的Strep-Tactin柱上。将柱子用10x体积的PBS缓冲液洗涤。将蛋白质用洗脱缓冲液(具有2.5mM脱硫生物素的1X PBS)洗脱。将提纯的蛋白质透析到1X PBS缓冲液中，通过阴离子交换除去细菌内毒素。
对于一些细胞测定，通过哺乳动物细胞产生ATRIMERTM多肽复合物。将编码环区的DNA片段亚克隆到哺乳动物表达载体pANA2或pANA11中，以在HEK293短暂表达系统中产生ATRIMERTM多肽复合物。pANA2是含有C-端His标记的修饰的pCEP4载体。pANA11是pANA2的C-端HA-StrepII-标记的形式。通过用BglII和MfeI双重消化，得到表达环区的DNA片段，将其连接到用BglII和MfeI预消化的表达载体pANA2和pANA11中。使用Qiagen HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒(Qiagene)从细菌中提纯表达质粒。对于HEK293粘附细胞，使用Qiagen SuperFect试剂根据制造商的方案进行瞬时转染。转染第二天，除去培养基，并换成293 Isopro无血清培养基(Irvine Scientific)。两天后，向培养基中加入0.5M HEPES缓冲液中的葡萄糖，至最终浓度为1%。转染后的4-7天收集组织培养上清液用以提纯。对于HEK293F悬浮细胞，通过Invitrogen的293Fectin根据制造商的方案进行瞬时转染。第二天，向培养物中加入1X体积的新鲜培养基。转染后的4-7天收集组织培养上清液用以提纯。
由哺乳动物组织培养上清液中提纯His或Strep II-标记的ATRIMERTM多肽复合物如对于大肠杆菌产生的ATRIMERTM多肽复合物所述那样进行。
实施例26
通过ELISA和竞争ELISA对结合物进行表征
如实施例23中所述那样进行ELISA测定，表明噬菌体展示的结合物无一与人IgG1 Fc或者与重组小鼠IL-23R/Fc(R&D Systems)交叉反应。
使用如上所述由阳性人IL-23R(IL-23R)结合物产生的提纯的单体CTLD或ATRIMERTM多肽复合物阻断人IL-23与人IL-23R的结合，进行竞争ELISA测定。测定通常进行如下。将Immulon HB2平板中的各个孔与100μL含有100ng抗-人IgG Fc(R&D MAB 110 clone 97924)的PBS一起在4℃下温育过夜。将平板用PBS/0.05%Tween 20洗涤五次，将孔与100μL各自含有50ng重组人IL-23R/Fc的PBS一起在RT下温育1.5小时。将平板如上述洗涤，并用150μL PBS中3%牛血清白蛋白(Sigma)在RT下封闭1小时，之后将平板如所述洗涤，将孔在RT下与100μL各个有或没有竞争剂(ATRIMERTM多肽复合物或CTLD)的含有IL-23的PBS一起温育1-2小时。如下所述制备含有IL-23的溶液。将人IL-23(eBioscience)以100ng/mL的浓度加入。包括有最终浓度在1μg/mL的竞争剂。温育之后，将板如所述洗涤，将孔在RT下与100μL各个含有链霉抗生物素-HRP缀合物(Pierce catalog no.21130)的1:5000稀释液的PBS中一起温育40分钟。洗涤之后，将孔在RT下与100μL各个TMB(BioFX Lab，编号TMBH-1000-0)一起温育至多30分钟。加入等体积的0.2M硫酸使反应停止。
使用ATRIMERTM多肽复合物从初始的淘选进行的竞争测定(抑制IL-23/IL-23R相互作用)的结果的例子呈现于图11中。野生型人四联蛋白对照左侧的ATRIMERTM多肽复合物(TN)是利用人环1-4文库从对人IL-23R的第三轮淘选获得的(P1D1除外)。该四联蛋白对照右侧的ATRIMERTM多肽复合物是在数量降低的IL-23R上进行3-4轮淘选后从人1-4混编文库(shuffle library)获得。来自亲和力成熟淘选过程的候选分子与IL-23竞争结合IL-23R的能力相比来自初始淘选过程的候选物得到改进。
将若干ATRIMERTM多肽复合物在竞争ELISA中更广泛地测试，以测定IC50值。如表11所示，ATRIMERTM多肽复合物显示出低至亚纳摩尔的IC50。
表19
ATRIMERTM多肽复合物与IL-23竞争结合IL-23R的能力
  hIL-23R结合物   SEQ ID NO:   平均IC50(nM)
  H7H   378,389   0.53
  H7B   440,404   0.9
  4G8   382,381   1.4
  F7F   435,389   1.45
  B5C   396,389   1.65
  A3C   434,389   1.8
  056-53.H4E   396,381   2.5
  A9E   396,395   2.6
  H1G   436,381   3.75
选择ATRIMERTM多肽复合物056-53.H4E作为比较标准，用亲和力成熟的ATRIMERTM多肽复合物进行另外的竞争测定。表20提供了所测ATRIMERTM多肽复合物与在同一测试中进行的056-53.H4E的IC50的比值，以更好地比较测试当中的竞争结果。
表20
ATRIMERTM多肽复合物与IL-23竞争结合IL-23R的能力的比较
Figure BDA00001748334901011
实施例27
通过Biacore对人IL-23R结合物的亲和力进行表征
来自原始文库淘选和亲和力成熟的文库淘选的单体和三聚结合物的表观亲和力提供于表21、表22和表23中。使用Biacore 3000生物传感器(GE Healthcare)来评价人IL-23R和受体结合物的相互作用。使用标准胺偶联化学将抗-人IgG Fc抗体(GE Healthcare)固定化在CM5芯片(Biacore)上，并使用该修饰的表面捕获重组人IL-23R/Fc融合蛋白(R&D Systems)。对于所有分析均使用小于200RU的低密度受体表面。将ATRIMERTM多肽复合物稀释液(1-500nM)以30μl/min注射在IL-23R表面之上，使用Biaevaluation软件(version 3.1,GE Healthcare)由传感曲线(sensorgram)数据得出动力学常数。对于缔合，数据收集为3分钟，对于解离，数据收集5分钟。用30s脉冲的3M氯化镁使抗-人IgG表面再生。所有传感曲线都是针对活化的和阻断的流动细胞以及缓冲注射剂双参照的。
表21
来自H环1-4文库的单体CTLD IL-23R结合物的亲和力
  分析物   Ka(1/M·s)   Kd(1/s)   KA(1/M)   KD(nM)
  A5F   1.70E+05   4.15E-03   4.11E+07   24.3
  4G8   1.43E+05   7.83E-03   1.83E+07   54
  B1B   1.15E+05   6.46E-03   1.77E+07   56.4
  A9E   3.81E+04   4.10E-03   9.29E+06   108
  A8E   5.37E+04   7.57E-03   7.09E+06   141
  4D4   2.83E+04   4.19E-03   6.76E+06   148
  C7F   3.58E+04   5.31E-03   6.75E+06   148
  分析物   Ka(1/M·s)   Kd(1/s)   KA(1/M)   KD(nM)
  C12E   4.16E+04   7.40E-03   5.62E+06   178
  3C2   3.99E+04   7.41E-03   5.39E+06   186
  C3C   8.45E+04   1.58E-02   5.34E+06   187
  A4A   1.18E+05   2.29E-02   5.18E+06   193
  4F5   2.35E+04   5.71E-03   4.12E+06   243
  B1A   2.18E+04   7.04E-03   3.09E+06   324
  4E5   4.54E+04   1.61E-02   2.82E+06   355
  B12C   1.26E+05   5.72E-02   2.20E+06   455
  B7C   3.03E+04   1.99E-02   1.52E+06   656
表22
来自原始和第一亲和力成熟的文库的全长ATRIMERTM多肽复合物IL-23R结合物的亲和力。“4G8 TN m”是指哺乳动物细胞产生的材料。
所有其他材料均在大肠杆菌中产生。
  分析物   Ka(1/M·s)   Kd(1/s)   KA(1/M)   KD(nM)
  H7B   4.31E+05   2.40E-04   1.80E+09   0.557
  B5C   3.07E+05   3.14E-04   9.78E+08   1.02
  056-53.H4E   2.66E+05   3.14E-04   8.47E+08   1.18
  F7F   2.98E+05   3.76E-04   7.92E+08   1.26
  H7H   2.56E+05   3.85E-04   6.65E+08   1.5
  A3C   2.13E+05   3.73E-04   5.70E+08   1.75
  A9E   1.72E+05   3.30E-04   5.21E+08   1.92
  B12F   2.44E+05   5.45E-04   4.47E+08   2.24
  A5F   1.53E+05   7.00E-04   2.19E+08   4.57
  4G8m   1.58E+05   7.51E-04   2.10E+08   4.76
  H1G   9.52E+04   4.89E-04   1.95E+08   5.13
  B9B   9.28E+04   4.78E-04   1.94E+08   5.15
  C7F   7.22E+04   4.65E-04   1.55E+08   6.44
  4G8   1.09E+05   8.05E-04   1.35E+08   7.42
  A4A   5.06E+04   4.09E-04   1.24E+08   8.08
  C3C   5.79E+04   4.83E-04   1.20E+08   8.34
  分析物   Ka(1/M·s)   Kd(1/s)   KA(1/M)   KD(nM)
  C6H   4.95E+04   8.45E-04   5.85E+07   17.1
表23
来自额外的亲和力成熟的文库和丙氨酸扫描候选物的ATRIMERTM多肽复合物IL-23R结合物的亲和力。所有材料均在大肠杆菌中产生。
  分析物   Ka(1/M·s)   Kd(1/s)   KA(1/M)   KD(nM)
  101-113-6C102   2.71E+05   2.83E-04   9.62E+08   1.04
  101-113-6C108   6.23E+05   3.82E-04   1.63E+09   0.613
  101-51-1A10   1.67E+05   3.45E-04   4.85E+08   2.06
  101-51-1A3   4.63E+05   2.62E-04   1.77E+09   0.565
  101-51-1A4   1.02E+06   3.95E-04   2.58E+09   0.388
  101-51-1A5   4.95E+05   2.89E-04   1.71E+09   0.584
  101-51-1A6   5.57E+05   4.15E-04   1.34E+09   0.746
  101-51-1A7   4.19E+05   1.87E-04   2.24E+09   0.447
  101-51-1A8   2.62E+05   3.96E-04   6.62E+08   1.51
  101-51-1A9   3.45E+05   3.29E-04   1.05E+09   0.955
  101-54-4A12   1.24E+06   5.73E-04   2.16E+09   0.463
  101-54-4B10   4.79E+05   4.29E-04   1.11E+09   0.897
  101-54-4B3   1.13E+06   3.64E-04   3.12E+09   0.321
  101-54-4B6   6.87E+05   3.90E-04   1.76E+09   0.569
  101-80-5E8   1.13E+06   3.91E-04   2.89E+09   0.346
  101-80-5H3   5.05E+04   3.27E-04   1.55E+08   6.46
  105-08 1A3   7.35E+05   3.48E-04   2.11E+09   0.473
  105-08 1A4   2.50E+05   3.12E-04   8.00E+08   1.250
  105-08 1A8   7.37E+05   3.44E-04   2.14E+09   0.467
  105-08 1D3   2.28E+05   3.01E-04   7.58E+08   1.320
  105-08 2C10   6.06E+05   3.71E-04   1.63E+09   0.612
  105-08 2F6   5.50E+05   3.59E-04   1.53E+09   0.653
  105-08 2G10   3.02E+05   3.97E-04   7.58E+08   1.320
  105-08 2G7   2.51E+05   3.58E-04   6.99E+08   1.430
  105-20 1B3   4.05E+05   3.10E-04   1.31E+09   0.764
  105-20 1H1   3.74E+05   3.20E-04   1.17E+09   0.857
  105-20 1H7   5.00E+05   3.72E-04   1.34E+09   0.744
  105-20 2A3   4.12E+05   3.12E-04   1.32E+09   0.759
  105-20 2F12   2.54E+05   4.71E-04   5.41E+08   1.850
  105-20 2G12   3.98E+05   2.62E-04   1.52E+09   0.658
  H4E D145A   4.01E+05   2.86E-04   1.40E+09   0.714
  H4E E137A   4.37E+05   2.61E-04   1.68E+09   0.597
  H4E E139A   4.19E+05   2.68E-04   1.56E+09   0.64
  H4E N154A   1.68E+05   1.42E-04   1.19E+09   0.843
  H4E Q143A   3.42E+05   2.36E-04   1.45E+09   0.689
  H4E R170A   3.23E+05   2.51E-04   1.29E+09   0.777
  H4E T138A   3.52E+05   2.61E-04   1.35E+09   0.743
  H4E T141A   4.05E+05   2.64E-04   1.54E+09   0.651
  H4EW   6.51E+05   3.64E-04   1.79E+09   0.560
实施例28
结合IL-23R的ATRIMERTM复合物不识别IL-12Rβ1或IL-12Rβ2
使用Biacore 3000生物传感器(GE Healthcare)评价人IL-12Rβ1/Fc或IL-12Rβ2/Fc与IL-23R结合ATRIMERTM复合物的相互作用。使用标准胺偶联化学将抗-人IgG Fc抗体(GE Healthcare)固定化在CM5芯片(GE Healthcare)上，并使用该修饰的表面捕获重组人IL-12Rβ1/Fc或IL-12Rβ2/Fc融合蛋白(R&D Systems)。对于所有分析均使用小于200RU的低密度受体表面。将ATRIMERTM多肽复合物稀释液(100nM)以30μl/min注射在IL-23R表面之上。对于缔合，数据收集为3分钟，对于解离，数据收集5分钟。用30s脉冲的3M氯化镁使抗-人IgG表面再生。所有传感曲线都是针对抗-人IgG Fc抗体表面以及缓冲注射剂双参照的。如表24所示，ATRIMERTM复合物没有表现出任何可测量的与人IL-12Rβ1/Fc或IL-12Rβ2/Fc的结合。
表24
  ATRIMERTM(100nM)   Il12Rb1   Il12Rb2
  105-08-1A8   阴性   阴性
  H4E-E137A   阴性   阴性
  101-54-4B6   阴性   阴性
  101-113-6C108   阴性   阴性
  101-51-1A4   阴性   阴性
  101-51-1A7   阴性   阴性
  101-51-1A7F   阴性   阴性
  105-08-1A8   阴性   阴性
实施例29
在IL-23R结合物的存在下使用Biacore进行人IL-23结合IL-23R的竞争测定
将IL-23R结合性ATRIMERTM多肽复合物胺-偶联在CM5芯片(GEHealthcare)上，然后将IL-23R(IL-23R)注射在芯片表面之上。在结合稳定化之后，监测人IL-23(eBioscience)IL-23R相互作用的能力。通过在室温下用30分钟预形成IL-23R和IL-23或者IL-23R和ATRIMERTM多肽复合物之间的复合物，进行额外的竞争测定。然后将复合物注射在具有胺-偶联的ATRIMERTM复合物的表面之上。如表25所示，在不存在竞争剂(IL-23或不同Atrimer)的条件下测定剩余IL-23R Atrimer对于Atrimer A5F的结合，并表示成结合百分比。
表25
A5F与IL-23竞争结合IL-23R
  分析物  结合A5F的百分比
  rhIL23RFc   100
  rhIL23RFc+rhIL23   19
  rhIL23RFc+A9E   25
实施例30
在基于细胞的测定中测试选择的ATRIMERTM多肽复合物的活性
在10%FBS/高级RPMI培养基(Invitrogen)中的IL-23RATRIMERTM多肽复合物或优特克单抗的存在下，将来自健康供者的人外周血单核细胞(PBMC)(全细胞)用人重组IL-23(1ng/mL,eBioscience)和PHA(1μg/mL,Sigma)以1x106细胞/mL加以刺激。培养4天后，收集细胞上清液，并使用IL-17 Quantikine试剂盒(R&D Systems)通过ELISA进行测定。在平行培养中，在IL-23R ATRIMERTM多肽复合物或优特克单抗的存在下，将PBMC用人重组IL-12(1ng/mL,R&D Systems)处理4天。将细胞上清液通过Luminex(Procarta,Panomics)进行IFNγ和IL-17测定，并在Bioplex系统(BioRad)上分析。所有处理均进行三份，使用GraphPad Prism软件绘制平均值和标准误差。如图12、13和4所示，IL-23ATRIMERTM多肽复合物阻断IL-23-诱导的IL-17产生，但是不抑制IL-12-诱导的IFNγ产生。如所预计，优特克单抗抑制IL-23和IL-12二者的响应。
表26显示了在PBMC测定中测试的亲和力成熟的ATRIMERTM多肽复合物的结果。对于所示出的ATRIMERTM多肽复合物，测量ATRIMERTM多肽复合物阻断IL-23-诱导的IL-17、IL-17F和IL-22产生的能力。结果表示成ATRIMERTM多肽复合物的IC50相比较于优特克单抗的IC50的分数比。对于一些ATRIMERTM多肽复合物，显示一项以上测定的结果。
表26
同一实验中在ATRIMERTM多肽复合物相比较于优特克单抗的存在下所示细胞因子的产生水平
Atrimer/优特克单抗
Figure BDA00001748334901061
Figure BDA00001748334901071
实施例31
NKL激动剂测定
为了表明IL-23R ATRIMERTM多肽复合物缺乏对IL-23R的激动剂活性，测定所选择的IL-23R ATRIMERTM复合物在结合表达杂二聚IL-23受体的天然杀灭细胞线NKL时的STAT-3磷酸化。将浓度为150μg/mL的ATRIMERTM复合物或者浓度为50ng/mL的IL-23作为阳性对照在96-孔板中在37℃下与140,000NKL细胞/孔一起温育。10分钟之后，将细胞在1200下离心5分钟，用PBS洗涤两次。然后，将细胞溶解，并根据Stat3磷酸化试剂盒中提供的方案处理，上述试剂盒获自CellSignaling Technology(PATH
Figure BDA00001748334901072
Phospho Stat3 Sandwich ELISA试剂盒,Cat #7300,Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA)。使用Molecular Devices ELISA板读取仪通过450nM处的吸光度测量Stat-3磷酸化。如示例性的H4E和H4EP1E9复合物在图15中所示，没有观察到IL-23R受体被ATRIMERTM复合物活化，而IL-23如所预计那样导致STAT-3磷酸化。对于所有其他所测试的atrimer，例如101-51-1A4、101-51-1A7、105-08-1A8、101-54-4B6、H4E E137A、101-113-6C108和101-54-4B10，均得到类似的结果，如图16A和16B中所总结。
实施例32
在小鼠IL-23R上淘选小鼠1-4文库并鉴定小鼠IL-23R-特异性CTLD结合物
小鼠文库1-4的淘选和筛选
将由小鼠文库1-4产生的噬菌体在重组小鼠IL-23R/Fc嵌合体(R&D Systems)上淘选。在三轮淘选之后使用ELISA平板测定对这些结合实验对象进行筛选，鉴别出受体特异性结合物。
为了产生用于淘选的噬菌体，将主文库DNA通过电穿孔转化到细菌菌株ER2738(Lucigen或NEB)中。在37℃下在SOC(具有代谢产物抑制作用的超级优化肉汤(Super-Optimal broth))培养基中振荡，使细胞恢复1小时，之后，通过加入超级肉汤(SB)至20%葡萄糖、20μg/mL羧苄青霉素的最终浓度，使体积增加10倍。在37℃下摇动1小时之后，将羧苄青霉素浓度增加至50μg/mL再振荡1小时，之后加入400mL具有2%葡萄糖和50μg/mL羧苄青霉素的SB，并一起加入辅助噬菌体M13K07至最终浓度为5x109pfu/mL。在37℃下不加振荡地温育30分钟，然后在100-150rpm下再振荡温育30分钟。在4℃下将细胞在3200g下离心20分钟，然后重新悬浮在500mL含有50μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的SB培养基中。在以150rpm振荡的条件下使细胞在室温(RT)下生长过夜。通过在15,000g和4℃下离心20分钟使细菌细胞成粒状沉淀，分离噬菌体。将上清液用1/4体积(通常为250mL上清液/瓶+62.5mL PEG溶液)的20%PEG/2.5M NaCl在冰上温育30分钟。通过在15,000g和4℃下离心20分钟，使噬菌体成粒状沉淀。将噬菌体重新悬浮在含有0.05%煮沸酪蛋白(cassein)、0.025% Tween-20和蛋白酶抑制剂的缓冲液D中。将材料用Whatman Puradisc的直径25mm、孔径0.2μm的滤器过滤灭菌。
使用平板形式，将由小鼠文库1-4产生的噬菌体在重组人IL-23R/Fc嵌合体(R&D Systems cat #1686-MR)上淘选。将96-孔Immulon HB2 ELISA板的六个孔涂以250-1000ng/孔Dulbecco’s PBS中的不含载体的小鼠IL-23R/Fc。将材料在平板上温育过夜，之后将孔用PBS洗涤三次，加入封闭缓冲液(缓冲液C，含有0.05%煮沸酪蛋白和1% Tween-20)。将孔在37℃下温育至少1小时。同时将另外的孔也用封闭缓冲液处理，以便随后与封闭缓冲液结合的噬菌体的吸收。
使用噬菌体制剂的三种稀释液：未稀释，1:10和1:100稀释于缓冲液D加蛋白酶抑制剂中。在3轮淘选中，向每个稀释液中加入重组人IgG1 Fc，至10μg/mL的终浓度。将封闭缓冲液从“仅封闭(BlockOnly)”(预吸收以封闭)的孔中取出，将不同的噬菌体混合物在37℃下在这些孔中再温育1小时。将等份(50μL)的每种噬菌体混合物转移至洗涤并封闭的目标孔中，使其在37℃下温育2小时。对于第一轮淘选，将结合的噬菌体用缓冲液D洗涤一次，并使用含有1mg/mL BSA的pH 2.2的甘氨酸缓冲液洗脱。在用2M Tris碱(pH 11.5)中和之后，将洗脱的噬菌体在酵母萃取-胰蛋白胨(YT)培养基中在600nm(OD600)下测得为大约0.9的光学密度下与2至4微升的ER2738细胞(Lucigen或NEB)一起在室温下温育15分钟。使用上述方案由该感染物制备噬菌体，但规模减少大约20%(体积)。对由洗脱的噬菌体制备的噬菌体进行另外数轮淘选。在每一轮，通过用适当的抗生素在琼脂上铺板测定输入和输出噬菌体的滴度，随后使用来自这些平板的克隆用于通过ELISA筛选结合物。
如上所述进行额外数轮淘选，不同之处在于，在第二轮淘选中，洗涤增加到5次，在随后几轮中，洗涤增加到10次。进行三至六轮淘选。对于最后一轮淘选，在感染之后不产生噬菌体；相反，感染的细菌生长过夜，并且由DNA进行大规模制备(Qiagen试剂盒)。从每一轮冷冻储存(-80℃下)输入噬菌体的甘油原液(15%)。
对于ELISA筛选，将来自后几轮淘选的克隆在YT培养基中用2%葡萄糖和抗生素生长过夜，将每一等份用于开始新的培养，其生长至OD600为0.5。将辅助噬菌体加入至5x109pfu/mL，并使其在37℃下感染30分钟，然后在37℃下搅动生长。将细菌离心，并重新悬浮在具有羧苄青霉素和卡那霉素的YT培养基中生长过夜，用以产生噬菌体。然后使细菌成粒状沉淀，除去培养基，并与1/5体积(1:5牛奶混合物：上清液)的6X PBS、18%牛奶混合。通过在4℃下与50-100μL含有75-100ng/孔重组小鼠IL-23R/Fc的PBS一起温育过夜，制备ELISA平板。使用涂有人IgG Fc(R&D Systems)的复制平板作为对照。将平板用PBS洗涤3次，用1X PBS中3%的牛奶在37℃下封闭1小时，并与100uL/孔各个牛奶处理的噬菌体混合物一起温育1小时。将平板用PBS/0.05% Tween 20洗涤一次，用PBS洗涤两次，与缀合HRP的抗-M13抗体(GE Healthcare)一起温育1小时，各用PBS/Tween和PBS洗涤三次，与TMB底物(VWR)一起温育。加入硫酸，以使显色反应停止，读取450nm处吸光度，以识别阳性结合物。
从第三轮淘选中鉴定出与小鼠IL-23R充分结合的噬菌体展示小鼠TN CTLD。表27给出了来自该结合物的环1和4中的随环境区域的序列。
表27
  克隆名称   环1   SEQ ID NO   环4   SEQ ID NO
  105-106-6F1   PGPGTRW   576   RSKSG   577
上述实例不限制这些文库产生的各种变化的范围。可以产生其它文库，其中各种数量的随机或更多的靶向氨基酸用于替代现有氨基酸，并且可以使用环的各种组合。此外，可以使用其它突变和产生突变的方法，比如随机PCR突变，提供可进行淘选的多种文库。
尽管已在本文描述了本发明的各种具体实施方式，但是应当理解，本发明并不受限于这些精确实施方式，本领域技术人员可在其中实施各种变化或修改，而不会背离本发明的范围和精神。
上文给出的实例仅为阐释性，不意味着对本发明的所有可能的实施方案、应用或修正的穷尽式列举。因此，在不背离本发明范畴和精神的情况下，对于本领域的技术人员而言，本发明的所述方法和系统的各种修正和变化是显而易见的。尽管本发明通过具体实施方案进行描述，但是应理解的是，要求权利要求的本发明不限于这些具体的实施方案。事实上，进行本发明的所述节点的各种修正，其对于分子生物学、免疫学、化学、生物化学或相关领域的技术人员是显而易见的，这些修正意欲包含于所附权利要求的范围中。
应理解的是，本发明不受本文所述特定方法学、方案和试剂等的限制，因为如同技术人员可识别的，这些可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，不意欲限定本发明的范围。
本发明的实施方案和其各种特点和优势将参照非限定性实施方案更完整地解释和/或在附图和下述描述中阐释。应注意的是，图中阐释的特点不需要按比例绘制，并且一个实施方案的特点可以与其它实施方案使用，如同技术人员将识别的，即使本文未阐明。
本文引用的任何数值包括从较低值到较高值的所有数值，以一个单位递增，只要任何较低值和较高值之间有至少两个单位的分隔。作为一个实例，如果提到组分的浓度或过程变量的数值如，例如，大小、角度、压力、时间等，为，例如，从1至90，具体为从20至80，更具体为从30至70，则在这种说明中意欲表示数值如15至85，22至68，43至51，30至32等。对于小于一的数值，在适当的情况下，一个单位认为是0.0001，0.001，0.01或0.1。这些仅是具体的实例，最低值和最高值之间数值的所有可能组合在本申请中以相似的方式表示。
文引用的所有文献和出版物的公开通过引用全部并入本文，其程度与通过引用单独并入相同。
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Claims (41)

1.一种组合多肽文库，其包括下述多肽成员，所述多肽成员含有具有随机化环区域的C-型凝集素结构域(CTLD)，其中所述CTLD的环区域包括含有环1-4的环区段A(LSA)和含有环5的环区段B(LSB)，并且所述CTLD的环区域按照下述方案之一而被随机化：
(a)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环1中至少一个氨基酸的插入以及环1内至少五个氨基酸的随机置换；
(b)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括环1内至少五个氨基酸的随机置换以及环2内至少三个氨基酸的随机置换；
(c)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括环1内至少七个氨基酸的随机置换以及在环4中的至少一个氨基酸插入；
(d)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少一个氨基酸插入以及环3内至少三个氨基酸的随机置换；
(e)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括将两个环组合成单一环的修饰，其中两个被组合的环为环3和环4；
(f)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环4中的至少一个氨基酸插入以及环4内至少三个氨基酸的随机置换；
(g)在CTLD的环区段A(LSA)和环区段B(LSB)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括环3中至少五个氨基酸残基的随机置换以及环5内至少三个氨基酸的随机置换；
(h)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少一个氨基酸的随机置换以及至少六个氨基酸的插入；
(i)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括下述的混合：(1)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换，和(2)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换和至少一个氨基酸插入；和
(j)在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中进行氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中或者环区段B(LSB)的环5中进行是至少四个或更多个氨基酸插入。
2.如权利要求1所述的文库，其中所述CTLD包括下述二级结构：
(a)以β1、α1、α2、β2、β3、β4和β5的次序顺序出现的五个β-链和两个α-螺旋，所述β-链以两个反平行β-折叠排列，一个由β1和β5组成，另一个由β2、β3和β4组成；
(b)至少两个二硫键，一个连接α1和β5，而一个连接β3和连接β4与β5的多肽区段；和
(c)环区段A(LSA)和环区段B(LSB)，其中LSA连接β2和β3，而LSB连接β3和β4。
3.如权利要求1所述的文库，还包括在C-端方向位于环2的C-末端邻近的氨基酸的随机置换。
4.如权利要求1所述的组合文库，其中所述CTLD来自人四联蛋白而且还包括精氨酸-130的随机置换。
5.如权利要求1所述的组合文库，其中所述CTLD来自人或小鼠四联蛋白而且还包括赖氨酸-148置换为丙氨酸。
6.如权利要求4所述的组合文库，其具有方案(a)的随机化CTLD，其中所述氨基酸修饰包括在环1中的两个氨基酸插入、在环1内的至少五个氨基酸的随机置换和赖氨酸-148置换为丙氨酸。
7.如权利要求1所述的组合文库，其具有方案(c)的随机化CTLD，其中所述氨基酸修饰还包括在环4内的至少两个氨基酸的随机置换。
8.如权利要求7所述的组合文库，其中所述氨基酸修饰包括在环1内的至少七个氨基酸的随机置换、在环4中的至少三个氨基酸插入以及在环4内的至少两个氨基酸的随机置换。
9.如权利要求1所述的组合文库，其具有方案(d)的随机化CTLD，其中所述氨基酸修饰还包括在环4中的至少一个氨基酸插入。
10.如权利要求9所述的组合文库，其中所述氨基酸修饰还包括在环4内的至少三个氨基酸的随机置换。
11.如权利要求10所述的组合文库，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的三个氨基酸插入。
12.如权利要求11所述的组合文库，其中所述氨基酸修饰包括在环4中的三个氨基酸插入。
13.如权利要求1所述的组合文库，其具有方案(e)的随机化CTLD，其中所述氨基酸修饰包括在环3中的至少六个氨基酸的随机置换和在环4中的至少四个氨基酸的随机置换。
14.如权利要求13所述的组合文库，其中所述CTLD是人或小鼠四联蛋白且其中所述氨基酸修饰还包括脯氨酸-144的随机置换。
15.如权利要求14所述的组合文库，其中所述组合的环3和环4氨基酸序列包括NWEXXXXXXX XGGXXXN(SEQ ID NO:578)，其中X是任意氨基酸，且其中SEQ ID NO:578的氨基酸序列形成单一环区域。
16.如权利要求1所述的组合文库，其具有方案(f)的随机化CTLD，其中所述氨基酸修饰包括在环4中的四个氨基酸插入和在环4内的至少三个氨基酸的随机置换.
17.如权利要求1所述的组合文库，其具有方案(g)的随机化CTLD，其还包括在环4中的、调节所述CTLD的纤维蛋白溶酶原-结合亲和力的一个或更多个氨基酸修饰。
18.如权利要求17所述的组合文库，其中所述CTLD来自人或小鼠四联蛋白而且环4的修饰包括赖氨酸148置换为丙氨酸。
19.如权利要求1所述的组合文库，其具有方案(h)的随机化CTLD，其中所述CTLD来自人或小鼠四联蛋白且其中所述氨基酸修饰包括异亮氨酸140的随机置换。
20.如权利要求19所述的组合文库，其还包括在环4区域中的、调节所述CTLD的纤维蛋白溶酶原-结合亲和力的一种或更多种氨基酸修饰。
21.如权利要求20所述的组合文库，其中所述对环4的修饰包括赖氨酸148置换为丙氨酸。
22.如权利要求1所述的组合文库，其具有方案(i)的随机化CTLD，其中所述氨基酸修饰包括在CTLD的环区段A(LSA)中的四个环中的至少一个中的氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰包括下述的混合：(1)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换；(2)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换和至少一个氨基酸插入；和(3)在环3中的至少六个氨基酸的随机置换和至少两个氨基酸插入。
23.如权利要求2所述的组合多肽文库，其中所述CTLD包括环区段A(LSA)和环区段B(LSB)中的两个、三个、四个或五个环的任意组合的一个或更多个氨基酸修饰。
24.如权利要求1所述的组合文库，其中所述氨基酸修饰包括对LSA和LSB之外的CTLD氨基酸的修饰。
25.如权利要求1所述的组合文库，其中所述CTLD是人四联蛋白的CTLD。
26.如权利要求1所述的组合文库，其中所述CTLD是小鼠四联蛋白的CTLD。
27.如权利要求1所述的组合文库，其中所述多肽成员还包含CTLD的N-端延伸和C-端延伸中至少一种。
28.如权利要求27所述的组合文库，其中至少一种N-端延伸和C-端延伸包括提供效应子功能、酶功能、进一步结合功能或多聚化功能的多肽。
29.如权利要求27所述的组合文库，其中至少一种N-端延伸和C-端延伸包括天然C-型凝集素样蛋白质或C-型凝集素或缺乏功能跨膜结构域的C-型凝集素的非CTLD-部分。
30.如权利要求29所述的组合文库，其中所述蛋白质是包含CTLD的部分的多聚体。
31.一种核酸分子文库，其编码权利要求1所述的组合多肽文库的多肽。
32.如权利要求31所述的核酸分子的文库，其中所述文库的核酸分子在展示系统中表达，其中所述展示系统包括表现所展示的表达产物和相应的基因型的至少一种性质的可见表型。
33.包含权利要求31所述的核酸分子文库的展示系统，其中所示展示系统选自噬菌体展示系统；酵母展示系统；病毒展示系统；细胞基展示系统；核糖体连接展示系统和质粒连接展示系统。
34.一种生成权利要求1所述的组合文库的方法，包括通过在所述CTLD的LSA区域中的四个环中至少一个环中生成至少一个随机突变来建立方案(a)-(j)任一种。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述至少一个随机突变通过下述产生：寡核苷酸指导的随机化；随机断裂引起的DNA混编；环混编；环步移；或易错聚合酶链反应诱变。
36.一种鉴定与分离与靶分子具有特异性结合活性的多肽的方法，其中所述方法包括：
(a)提供权利要求1所述组合多肽文库；
(b)使所述组合多肽文库与所述靶分子在允许多肽与所述靶分子之间进行结合的条件下接触；和
(c)分离与所述靶分子结合的多肽。
37.如权利要求36所述的方法，其中所示方法还包括编码所述组合多肽文库的核酸分子文库，其中所示核酸文库在展示系统中表达，且其中所述展示系统包括表现所展示的表达产物和相应的基因型的至少一种性质的可见表型。
38.一种用于鉴定和分离能特异性结合靶分子的多肽的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供编码权利要求1所述的多肽文库的核酸分子文库；
(b)在展示系统中表达所述核酸分子文库，以获得多肽集合，在该集合中，一个或多个序列位置上的氨基酸残基在所述多肽集合的不同成员之间是不同的；
(c)使所述多肽集合的多肽与所述靶分子在允许多肽与所述靶分子之间进行结合的条件下接触；和
(d)分离能够与所述靶分子结合的多肽。
39.一种多肽，其具有C-型凝集素样结构域(CTLD)的支架结构，其中所述多肽与不同于所述CTLD的天然靶标的靶标结合，且其中所述CTLD的CTLD支架结构按照权利要求1所述的任意方案进行修饰。
40.如权利要求39所述多肽，其中所述多肽具有人四联蛋白的C-型凝集素样结构域(CTLD)的支架结构，且其中所述多肽与人四联蛋白的天然靶标之外的靶标结合。
41.一种产生权利要求39所述的多肽的方法，其包括使权利要求1所述的组合多肽文库与所述靶分子在允许所述多肽与所述靶分子之间结合的条件下接触，以及分离与所述靶分子结合的多肽，其中所示靶分子不是CTLD的天然靶标。
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