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CN102686608A - 减少免疫原性的方法 - Google Patents

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CN102686608A
CN102686608A CN2010800585091A CN201080058509A CN102686608A CN 102686608 A CN102686608 A CN 102686608A CN 2010800585091 A CN2010800585091 A CN 2010800585091A CN 201080058509 A CN201080058509 A CN 201080058509A CN 102686608 A CN102686608 A CN 102686608A
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T·贡德
D·乌雷奇
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Esbatech An Alcon Biomedical Research Unit LLC
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Abstract

本发明公开了一种减少抗体可变结构域的免疫原性的方法。

Description

减少免疫原性的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119要求在2009年12月23日提交的美国临时专利申请号61/289,446的优先权，将其全部内容引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及改变抗体可变结构域，特别是scFv的免疫原性的方法。
技术背景
对需要的受试者施用的治疗抗体通常被受试者的免疫系统识别为异质。即使施用的抗体已被人源化，例如通过将鼠CDR嫁接进人免疫球蛋白框架中以最小化小鼠成分，所述抗体仍然可能引起降低治疗效力和/或安全性的免疫应答。
根据文献，患者中的抗体应答依赖于B细胞表位和T细胞表位二者的存在。当B细胞受体识别并结合抗原（例如施用的治疗抗体）时，抗体通过受体介导的胞吞作用内化进B细胞并经历蛋白水解加工。得到的肽随后通过MHC I I类分子呈递。在T细胞表位被T辅助细胞识别后，后者刺激相应的B细胞增殖并分化为产生抗体的浆细胞。
为了降低患者的免疫系统对施用的抗体的应答，现有技术已经提供了若干去免疫（de-immunization）技术。大多数现有方法集中在去除T细胞表位，而仅有少数降低B细胞免疫原性的方法的实例。
WO 93/18792描述了通过部分还原抗体修饰抗体的方法。这改变了其免疫原性，从而选择性减弱其诱发抗同种型应答的能力，但其仍然保留诱发抗独特型应答的能力。尽管所述方法对疫苗适用，抗独特型应答对其他治疗应用是不期望的。
Molineux G(2003)Pharmacotherapy 23:35-85描述了蛋白质与高分子量聚乙二醇的连接。然而，Onda,M.等人(2008),PNAS Vol 105(32):11311-11316已经报导了此方法在杂种蛋白质中效果不佳，所述杂种蛋白质由与细菌或植物毒素连接的可变片段组成。他们的杂种蛋白质是失活的；并且，他们发现免疫原性仅略微减少。
第二种方法包括在抗体施用前的化学疗法，其中用环磷酰胺或氟达拉滨治疗患者。此方法对患者不适用，因为治疗损害免疫系统(Kusher,BH等人(2007),Pediatr Blood Cancer 48:430-434;Leonard JP等人(2005),J Clin Oncol 23:5696-5704)。
Nataga,S.和Pastan,I.(2009),Adv Drug Deliv Rev,p.977-985和Onda,M.等人(2008),PNAS Vol 105(32):11311-11316建议在外源蛋白质表面上的“抗原热点”进行点突变，从而去除B细胞表位。他们用小氨基酸（丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸）取代具有大量暴露区域的大体积亲水残基。优选丙氨酸用于取代，因为其一般存在于所有二级结构的隐藏和暴露位置，并且不会促成新的氢键形成。丙氨酸缺乏在β-碳之后的可与抗体反应的侧链原子，并且维持抗原的构象。然而，Nataga和Pastan描述的所述“热点”是位于蛋白质表面上的离散的簇上的构象表位。需要大量实验工作确定无法在计算机模拟中重现的表位的位置，因此他们的方法不能作为可常规应用的减少抗体免疫原性的一般解决方案。此外，此方法的基本假设是在分子表面上主要是亲水残基参与和宿主抗体的接触。对大多数外源蛋白质事实上是如此，然而在仅使用天然存在的蛋白质的一部分（例如片段、结构域）的情况下，原本通过其他结构域的接触被遮蔽的疏水氨基酸也很可能变为暴露在溶剂中并作为呈递至免疫系统的表位。这正是Fv抗体片段的情况，其中可变结构域上的界面残基在Fab片段中被掩藏，但在分离的可变结构域中暴露。目前可用的预测B细胞表位的算法有效性很低，且一般具有低成功率。
因此，在本领域中需要提供有效减少抗体片段和特别是可变结构域的免疫原性的直截了当的方法。
发明概述
因此，本发明的主要目标是提供减少任意抗体可变结构域的免疫原性，而无需进行大量分子建模工作的方法。特别地，本发明的目标是提供从抗体可变结构域去除B细胞表位的方法。
因此，本发明提供了减少包含可变轻链和/或可变重链的抗体可变结构域的免疫原性的方法，其中所述方法包括取代可变轻链和/或可变重链的一个或多个氨基酸残基的步骤，所述残基存在于相应的全长抗体或Fab的可变链和恒定链之间的界面上。
在一个方面，抗体可变结构域是scFv，Fv片段或单结构域抗体，特别是scFv。
在一个方面，将要被取代的可变轻链和/或可变重链的一个或多个氨基酸残基是各自亚型的共有残基。
在另一个方面，将要被取代的一个或多个氨基酸是亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）、精氨酸（R）和/或谷氨酸（E）。
在某些方面，可变轻链的一个或多个氨基酸残基位于第99、101和/或148位（AHo编号）。在其他方面，可变重链的一个或多个氨基酸残基位于第12,97,98,99,103和/或144位中的一个或多个位置（AHo编号）。
在另一个方面，在可变重链中将要被取代的一个或多个氨基酸残基是（a）在重链第12位氨基酸上的亮氨酸（L）；（b）在重链第103位氨基酸上的缬氨酸（V）；和/或（c）在重链第144位氨基酸上的亮氨酸（L）。
在另一个方面，本发明提供了通过本文公开的方法可得到的抗体可变结构域，和包含所述抗体可变结构域的药物组合物。
附图简述
在考虑了以下本发明的详细描述后，将更好的理解本发明，且除了上面陈述的其他目标将是显而易见的。所述描述参考附图。
图1a显示了用于检测已存在的抗scFv抗体的桥连ELISA的示意图。1：板表面，2：scFv903；3：抗药物抗体（ADA）；4：生物素化scFv903；5：链霉抗生物素Poly-HRP（辣根过氧化物酶）。
图1b显示了确认评估的原理，其中用过量的scFv903,34max(791),scFv903_DHP(961)和scFv105(100mcg/ml)竞争ADA与药物和生物素化scFv903的结合。
图2显示了在检测抗scFv903抗体的色度测定（桥连ELISA）中，149种个体血清的信号强度。在测定截点（cut point）之上的信号指示在各个血清样品中抗scFv 903抗体的存在。在测定中约30%的检测血清样品为阳性。
图3显示了4种不同s cFv的溶剂暴露部分的可变轻链序列比对。上图：用粗体显示了在每种scFv中与scFv 903中的对应氨基酸类型不同的氨基酸。下图指示与每个单独位置相关的表位种类，和显示与各个表位种类结合的人血清的百分比。
图4显示了显示了4种不同scFv的溶剂暴露部分的可变重链序列比对。上图：用粗体显示了在每种scFv中与scFv 903中的对应氨基酸类型不同的氨基酸。下图指示与每个单独位置相关的表位种类，和显示与各个表位种类结合的人血清的百分比。
图5显示了scFv 903的模拟的分子结构。5a：前视图；5b：180°视图。灰色：可能参与表位种类β的残基；黑色：可能参与表位种类α的残基。
发明公开
为了更易于理解本发明，首先定义某些术语。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。尽管可使用与本文描述的类似或等同的方法和材料实施或检验本发明，下面描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考以其整体引入作为参考。在有冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并无意限制。
如本文使用的表达“免疫原性”表示在对受试者施用的蛋白质上存在的B细胞或抗体表位，然而这样的B细胞或抗体（又称抗药物抗体；ADA）可能在施用所述蛋白质以前就存在。
可通过ELISA测定确定这样的免疫原性的程度，并可用包含可测量的已存在（pre-existing）的ADA量的人血清的百分比表示。蛋白质和相应的以减少其免疫原性为目的的改造蛋白质之间的免疫原性的减少可通过比较包含针对改造蛋白质的ADA的血清样品的百分比和包含针对原始蛋白质的ADA的血清样品的百分比测量。针对改造蛋白质的阳性血清样品的减少的数量或百分比指示改造蛋白质的免疫原性的减少。可基于单个血清样品应用更灵敏的测量，其使用竞争ELISA设置。在这样的竞争ELISA中，改造蛋白质与原始蛋白质竞争结合检测血清中的ADA。改造蛋白质竞争原始蛋白质的能力越低，免疫原性减少得越成功。
优选地，免疫原性减少的程度指下述血清样品的百分比，其中改造蛋白质不再能与原始蛋白质有效竞争。用阈值（来自竞争ELISA的相对信号）定义有效竞争，其中-100指示完全竞争剂（免疫原性没有减少）和0指示完全无竞争（完全缺乏ADA表位）。一般用于有效竞争的这样的阈值可为-90,-80,-70,-60,-50,-40,-30,-20,-10或>-10。
如本文使用的“界面”或“界面-界面”指位于全长抗体的可变结构域和恒定区1（CL1或CH1）之间或Fab部分和Fc结构域（CH2和CH3）之间的区域。
如本文使用的，“ADA”是抗药物抗体的缩写，其指在患者血清中已存在的抗体。
术语“抗体可变结构域”（V结构域）指包含抗体的所有或部分抗原结合位点的分子，例如重和/或轻链可变结构域的全部或部分，使得抗体可变结构域特异性识别靶抗原。所述术语因此对应免疫球蛋白的V-J区或V-D-J区。将这些V结构域命名为：VL（Ig轻链的V结构域）或VH（Ig重链的V结构域）。抗体可变结构域的非限制性实例包括
（i）包含抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，
（ii）单链Fv片段（scFv），
（iii）单结构域抗体如Dab片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)，其由VH或VL结构域组成，骆驼（Camelid）（见Hamers-Casterman,等人,Nature 363:446-448(1993),和Dumoulin,等人,Protein Science 11:500-515(2002)）或鲨鱼抗体（例如鲨鱼Ig-NARs
Figure BDA00001794846800061
）。
如本文使用的术语“抗体框架”或“框架”指可变结构域VL或VH的部分，其充当此可变结构域的抗原结合环的支架(Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)。
如本文使用的术语“抗体CDR”或“CDR”指抗体的互补决定区，其由如Kabat E.A.等人,(1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest.NIH Publication 91-3242定义的抗原结合环组成。抗体Fv片段的2个可变结构域中的每个包含例如3个CDR。
术语“单链抗体”或“scFv”指包含通过接头连接的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子。这样的scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。
术语“亚型”指在给定物种中属于相同组的V结构域组，且其共有高同一性百分比。术语“亚型”指由如Knappik(2000)中定义的各个共有序列定义的亚型。使用术语“亚家族”或“亚类”作为“亚型”的同义词。如本文使用的术语“亚型”指与代表其亚型的各个共有序列共有最高程度的同一性和相似性的序列。通过比对各个序列与所有已知的人种系区段或定义的各亚型的共有序列和随后基于最高同源性与特定亚型关联，确定特定可变结构域所属的“亚型”。通过使用检索矩阵例如BLOSUM(Henikoff1992)测定序列的同源性和分组的方法是本领域技术人员熟知的。
可通过产生给定亚型的氨基酸共有序列测定在给定位置上的“共有残基”。如本文使用的“氨基酸共有序列”指可如下产生的氨基酸序列，使用至少2个、优选多个比对的氨基酸序列矩阵，并允许比对中有缺口，使得可以测定在每个位置上最频繁出现的氨基酸残基。共有序列是包含在各位置上最频繁出现的氨基酸的序列。当在单个位置上等同地出现2个或多个氨基酸时，共有序列包括2种或所有这些氨基酸。可在多个水平上分析蛋白质的氨基酸序列。例如，可在单个残基水平、多个残基水平、具有缺口的多个残基等水平上展示保守性或可变性。残基可展示同一残基的保守性，或可在种类水平上是保守的。其他种类是本领域技术人员已知的，并可使用结构测定或评估取代性的其他数据定义种类。在该意义上，可取代的氨基酸可指可在该位置上可被取代并维持功能保守性的任意氨基酸。如本文使用的，当一个氨基酸序列（例如，第一个VH或VL序列）与一个或多个另外的氨基酸序列（例如，在数据库中的一个或多个VH或VL序列）比对时，在一个序列（例如，第一个VH或VL序列）中的氨基酸位置可与一个或多个另外的氨基酸序列中的“相应位置”比较。如本文使用的，“相应位置”代表当序列被最佳比对时，即当比对序列以获得最高百分比同一性或百分比相似性时，被比较的序列中的等价位置。
在A.Honegger和A.Pl ückthun(2001),J.Mol.Biol.309:657-670中描述了在说明书通篇使用的AHo编号方案。
术语“患者”指人或指非人动物。
术语“治疗”指为了预防、治愈、延缓疾病或复发疾病，降低疾病或复发疾病的严重程度或减轻疾病或复发疾病的一种或多种症状，或为了延长受试者的存活（超过缺乏这样的治疗时的预期存活）的治疗和/或预防措施。
“亲水”氨基酸是极性且带电荷的氨基酸，例如Asp,Glu,Lys,Arg和Hi s。
极性且不带电荷的氨基酸是Gly,Ser,Thr,Cys,Asp,Gln和Tyr。
“疏水”氨基酸一般是非极性氨基酸，例如Ala,Val,Leu,Ile,Met,Phe,Trp和Pro。
在第一个方面，公开了减少抗体可变结构域的免疫原性的方法。抗体可变结构域包含可变轻链和/或可变重链，且所述方法包含取代可变轻链和/或可变重链的一个或多个氨基酸残基的步骤，所述残基存在于相应的全长抗体（或Fab，即包含恒定结构域或其部分的任意抗体或抗体片段）的可变链和恒定链之间的界面上。
所述选定的待取代的一个或多个氨基酸残基优选地是存在于相应的全长抗体（或Fab，即包含恒定结构域或其部分的任意抗体或抗体片段）的可变链和恒定链之间的界面上，且在抗体可变结构域，例如scFv中暴露在溶剂中的残基。所述界面又称V/C结构域界面。
抗体可变结构域是例如scFv，Fv片段或单结构域抗体，优选scFv。
特别感兴趣的是在形成不连续的，即构象B细胞表位的位置上的氨基酸残基。这样的残基包括在以下位置上（AHo编号）的残基：
可变轻链第99,101和/或148位；和
可变重链第12,97,98,99,103和/或144位。
从Nieba等人(1997)Protein Eng.,Apr;10(4):435-44中得知（也在US 6,815,540中公开），轻链的残基位置99,101和148（AHo编号）以及重链的残基位置12,98,99,103和144（AHo编号）可用于通过蛋白质工程改进抗体的折叠性能。Nieba建议在指定位置上用亲水氨基酸取代疏水氨基酸；然而，该文献没有提及这些取代可能对分子的免疫原性有影响。此外，作者强调这些疏水残基不都是同样好的用于替换的候选残基。尽管疏水区块（patch）在所有抗体中保守存在，其确切位置和程度不同。
如本领域已知的，特别是
（i）在二级结构的转角区中存在的氨基酸，
（ii）具有大的、易弯曲侧链或大体积侧链的氨基酸，或
（iii）疏水氨基酸
易于成为B细胞表位的一部分并因此引起免疫原性反应。通过去除免疫原性氨基酸，B细胞表位被破坏，并且可增强患者对抗体可变结构域的耐受性。
优选地，用比选定的氨基酸免疫原性低的氨基酸，即不引起免疫应答或引起弱免疫应答的氨基酸取代选定的一个或多个氨基酸残基。这样的免疫原性较低的氨基酸是与针对包含原始（即未取代的）氨基酸的抗体可变结构域的ADA反应性相比，减少ADA反应性的氨基酸。
免疫原性，即在患者体内诱发抗体应答的性能可例如通过其抗原性，即与已存在抗体的反应性预测。抗原性可通过ADA反应性测定，通过桥连ELISA（见实施例1和图1），使用来自可能包含已存在抗体的供体的血清测定ADA反应性。因此，为了评估免疫原性较低的氨基酸，可在指示的位置突变抗体可变结构域。如本文描述的，可通过在桥连ELISA中用假定的免疫原性较低的其改造衍生物竞争起源抗体的信号，评估这些突变对免疫原性的影响。也可通过使用无标签的结合测定，例如表面等离子共振、荧光共振能量转移（FRET）、量热测定等评估ADA针对抗体的结合。
在一个实施方案中，选择用于取代的氨基酸位于选自可变轻链残基99,101和148和可变重链残基12,97,98,99,103和144的一个或多个位置上。
选择用于取代的优选氨基酸是暴露的，但在相应的全长抗体或Fab中被恒定结构域隐藏。
在一个实施方案中，将要被取代的可变轻链和/或可变重链的一个或多个氨基酸残基是各个亚型的共有残基。例如，选择用于取代的优选氨基酸是亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）、精氨酸（R）和/或谷氨酸（E）。
更优选地，选择用于取代的一个或多个氨基酸残基选自可变轻链残基D99,F101和L148和可变重链残基L12,R97,A98,E99,V103和L144。
甚至更优选地，用极性氨基酸，优选用丝氨酸（S）和/或苏氨酸（T）取代亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）和/或丙氨酸（A）。
特别地，出人意料地发现，如在PCT/CH2009/00022中描述的DHP基序减少抗体可变结构域的免疫原性，而对抗体可变结构域的热稳定性、重折叠、表达产量、聚集和/或结合活性没有副作用。所述DHP基序包含可变重链12,103和144（AHo编号）的氨基酸残基，在这些位置上存在以下氨基酸：
(a)丝氨酸(S)位于重链氨基酸位置12;
(b)丝氨酸(S)或苏氨酸(T)位于重链氨基酸位置103;和/或
(c)丝氨酸(S)或苏氨酸(T)位于重链氨基酸位置144。
PCT/CH2009/00022没有提供有关教导的修饰适于减少抗体可变结构域的免疫原性的任何暗示。
DHP基序位于Fab片段的V/C界面，并在去除恒定结构域后变为暴露在溶剂中。因此在本发明的优选实施方案中，选择用于取代的一个或多个氨基酸残基选自可变重链12,103和144(AHo编号)。优选地，
a)在重链氨基酸第12位存在的亮氨酸（L）；
b)在重链氨基酸第103位存在的缬氨酸（V）；和/或
c)在重链氨基酸第144位存在的亮氨酸（L）。
这些残基在人框架中高度保守。因此，取代一个或多个所述残基提供了去免疫抗体可变结构域但不影响分子的生物物理性能的一般解决方案，并且本文公开的方法适用于抗体可变结构域的任何框架。优选地，在指示位置存在的残基被以下氨基酸取代
a)在重链氨基酸第12位的丝氨酸（S）；
b)在重链氨基酸第103位的丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；和/或
c)在重链氨基酸第144位的丝氨酸（S）或苏氨酸（T）。
甚至更优选地，进行以下取代：L12S,V103T和/或L144T。
抗体可变结构域可针对任意靶，并特异性结合所述靶。靶的代表实例包括但不限于：跨膜分子、受体、配体、生长因子、生长激素、凝血因子、抗凝血因子、纤溶酶原激活物、血清白蛋白、激素或生长因子受体、神经营养因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子（TGF）、CD蛋白、干扰素、集落刺激因子（CSF）、白介素（IL）、T细胞受体、表面膜蛋白、病毒蛋白、肿瘤相关抗原、整合素或白介素、VEGF；肾素、人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子VIIIC；凝血因子IX；组织因子（TP）；von Willebrands因子；蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性剂；尿激酶；人尿；组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α或-β；脑啡肽酶；RANTES（受活化调节，由正常T细胞表达和分泌的因子）；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1)-α；人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)；CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子（VEGF）；蛋白质A或D；类风湿因子；骨源神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白-3,-4,-5或-6(NT-3,NT-4,NT-5,或NT-6)；NGF-β；血小板源生长因子(PDGF);aFGF;bFGF；表皮生长因子（EGF）；TGF-α;TGF-β,包括TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,TGF-β14,或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I或-II(IGF-I或IGF-II);des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白、红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素-α,-β或-γ；M-CSF,GM-CSF或G-CSF;IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；衰变加速因子；AIDS囊膜蛋白；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；CD3,CD4,CD8,CD11a,CD11b,CD11c,CD18,CD19,CD20,CD34,CD40,或CD46,ICAM,VLA-4或VCAM;或HER2,HER3或HER4受体；ErbB受体家族成员；EGF受体；HER2,HER3或HER4受体；细胞粘附分子；LFA-1,Mac1,p150.95,VLA-4,ICAM-1,VCAM,α4/β7整合素或αv/β3整合素；细胞粘附分子的α或β亚基；抗体；生长因子、VEGF；组织因子（TF）；TGF-β;α干扰素(α-IFN);IL-8;IgE；血型抗原Apo2、死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖（OB）受体；mpl受体;CTLA4或蛋白质C。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过本文公开的方法可得到的抗原结合片段。所述抗原结合片段可例如用于治疗或诊断应用。
在本文的实施例中使用的序列包括：
>903或578minmax(SEQ ID NO:1)EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS
>791或34max(SEQ ID NO:2)MEIVMTQSPSTLSASLGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKSGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGAEFSLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVACIYGDNDITPLYANWAKGRFPVSTDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYADYAYDLWGQGTLVTVSS
>scFv105(SEQ ID NO:3)DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
>961或578minmaxDHP(SEQ ID NO:4)EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTTVTVSS
实施例1
抗药物抗体桥连ELISA(ADA-ELISA)
1.1背景
针对单克隆抗体的已存在抗体可能针对恒定区，针对可变结构域框架位置或针对抗原结合环，CDR。与Fv片段特异性结合但不与IgG特异性结合的已存在抗体可能识别原先在IgG中隐蔽的区域。这样的区域主要是位于可变结构域和恒定区1(CL1或CH1)之间、或Fab部分和Fc结构域(CH2和CH3)之间的结构域界面。识别这样的界面的抗体很可能是形式（format）特异的。由于scFv903的框架序列在人中高度保守，在人血清中针对scFv903的已存在抗体很可能结合CDR或V/C界面残基。通过评估多种scFv竞争抗药物抗体（ADA）与ESBA903结合的潜能，在夹心ELISA中表征这些针对已存在的抗scFv903抗体的表位。检测的scFv是：
-包含与scFv903相同框架但不同CDR的scFv(34_max(791))，
-具有与scFv903不同框架和不同CDR的scFv(scFv105)，和
-在原先的V/C界面中包含取代的scFv903变体(scFv903DHP(961))。
用于筛选抗scFv903抗体而进行的ELISA是半定量测定并以桥连形式进行（见图1），这允许检测来自不同物种的所有抗体同种型的应答。
简单地说，参考图1，用scFv 9031，2包被微滴定板，使包含抗scFv903抗体3,6的样品与其结合。使用生物素化scFv 9034作为第一检测试剂，检测任何结合的scFv 903/抗scFv 903复合物，其进而通过第二检测试剂4，链霉抗生物素Poly-HRP 5检测。使用过氧化物酶(POD)底物(3,3’-5,5’四甲基联苯胺(TMB))测定在质量对照和样品中存在的抗scFv 903抗体的量。
使用名为AB903-3的阳性对照抗体建立ADA ELISA。通过用scFv 903免疫兔子和随后亲和纯化血清(Squarix Biotechnology)产生抗scFv 903抗体储液（兔多克隆抗scFv 903IgG，称为AB903-3）。如在图1b中所示，通过用如上所述的scFv竞争ADA与scFv 903的结合表征已存在抗体在scFv 903上的表位。
1.2测定程序
用在PBS(Dulbecco,Sigma)中的0.1mcl/ml scFv 903包被微滴定板(Nunc Maxisorp)。在4℃过夜孵育密封的板。
用300mcl/孔洗涤缓冲液(在Atlantis微量板洗涤器(ASYS)中的TBST0.005%Tween(20)）洗3次板。用280mcl/孔封闭缓冲液(PBS,10mg/mlBSA 1%(w/v),0.1ml/50ml Tween 20(0.2%,v/v)封闭非特异性位点。在室温(25℃)下孵育密封的板1.5小时，同时摇晃。随后，如上所示再洗3次板。
加入3种不同浓度的分析物对照（名为AB903-3的亲和纯化的兔多克隆抗scFv 903IgG或人血清）：
HiQC:2500ng/ml AB903
MeQC:500ng/ml AB903
LoQC:250ng/ml AB903
在各个NSB血清合并物（用于确定测定截点（>30）的所有血清的合并物）中掺加QC。以1:10稀释应用待测量样品。每孔应用50mcl样品；在室温(25℃)下孵育密封的板2.0小时。
如上所示，用洗涤缓冲液洗3次板。加入生物素化scFv 903（使用Lightning-Link试剂盒(方案:Lightning-LinkTM生物素缀合试剂盒,A型,#704-0015,Innova Biosciences)生物素化500mcg蛋白质）作为第一检测试剂。为了所述目的，在稀释缓冲液中将生物素化scFv 903稀释为250ng/ml的浓度(PBS,10mg/mL BSA 1%(w/v),0.1ml/50ml Tween 20(0.2%v/v))。加入50mcl/孔。在室温(25℃标称)下孵育密封的板1.0小时，同时摇晃。
如上所示再洗3次板。在稀释缓冲液中以1:5，000稀释第二检测试剂，链霉抗生物素-Poly-HRP(Stereospecific Detection Technologies,1mg/ml)，并每孔加入50mcl。在室温(25℃标称)下孵育密封的板1.0小时，同时摇晃。
为了检测，如上所示用300mcl/孔洗涤缓冲液洗3次板。随后，用300mcl/孔ddH2O洗2次板。然后，在室温加入50mcl/孔POD(TMB)底物。在孵育3-6分钟后（不应超过最长孵育时间30分钟），通过加入50mcl/孔1M HCL终止反应。如果显色反应太强，用50mcl/孔1M HCL更早地终止反应。
使用Tecan Sunrise的微滴定板阅读器，在450nm处读板。一般，对每种质量对照、NSB和各个血清样品进行一式三份的反应。平均化读数。
1.3测定截点（ACP）的确定
为了确定阳性结果，在测定进行时确定测定截点。测定截点是测定的应答水平，在此水平或此水平以上的样品被定义为阳性，在此水平以下的样品被定义为阴性。使用基于风险的方法，使用5%的假阳性而不是任何假阴性是合适的。为此使用参数法，使用平均吸光度加上1.645标准偏差，其中1.645是正态分布的第95百分位。排除所有OD≥3*标准偏差的个体并计算新的测定截点。如果最多5%个体的OD在ACP以上，可使用计算的值作为ACP。反之，则对剩余个体再次应用排除标准并重复此过程直到最多5%的个体具有ACP以上的OD。
在排除了149个个体血清中的34个之后，将测定截点修正为0.110。40个血清(26.8%)显示了高于测定截点的OD（见图2）。为了监控测定性能，将LoQC,MeQC和Hi QC样品包括在内。为了制备NSB，将由于测定截点的统计学评估而去除的34个血清从血清合并物中排除。平均NSB结果为0.073，导致1.50的标准化因子。
1.4标准化因子和板特异性截点的测定
一旦用NSB测定了ACP，应用标准化因子计算板特异性截点，用于随后使用相同NSB的测量。为了测定标准化因子，评估NSB的OD值。在每块板上分析NSB的3次重复（一式三份）。将标准化因子定义为测定截点除以NSB的平均吸光度。如下计算每块板的板特异性截点：
板特异性截点=NSB吸光度*标准化因子。
1.5确认测定
在血清中检测到ADA的情况下，用确认测定证明在ADA桥连ELISA中发现为阳性的抗体是特异性针对scFv 903的。确认测定与筛选测定类似，除了阳性样品是与包含scFv 903的测定缓冲液或仅测定缓冲液混合、且在分析前与之预孵育以外。为此，在稀释缓冲液或人血清中掺加参考材料至LoQC,MeQC和HiQC的浓度水平。然后用缓冲液或包含10mcg/ml,100mcg/ml或1mcg/ml（用于人血清）scFv 903的缓冲液以1:2稀释这些样品。在RT孵育样品约60分钟，以允许scFv 903与样品中存在的ADA结合。在加到板上以前，在缓冲液中进一步稀释样品，以使总体基质稀释最低。scFv 903阻止ADA与板上包被的scFv 903结合（又见图1）。因此，将在用缓冲液以1:2稀释的血清和用包含scFv 903的缓冲液以1:2稀释的血清之间的>30%的OD值变化定义为确认存在特异性抗scFv 903抗体的最低抑制。与10mcg/ml,100mcg/ml以及1mcg/ml scFv 903的预孵育在检测的所有3个QC水平上导致60%和95%之间的OD变化。选择100mcg/ml的浓度用于确认测定。
1.6竞争测定的结果
为了定位抗scFv 903抗体的结合位点，使用一组具有已知氨基酸序列的不同scFv以及scFv903的IgG形式替代在如上所述的确认测定设置中过量的scFv 903。在此实验设置中，如果ADA识别也在检测scFv上的相似表位，则给定的检测抗体仅可竞争scFv 903与抗scFv 903抗体（ADA）的结合。因此，在测定中的信号减少将指示scFv 903和检测scFv共有的至少一个表位的存在。在此实验中使用以下检测抗体：scFv105，人源化TNF抑制性scFv抗体片段，其包含嫁接在Vk1-VH1b型人scFv支架上的小鼠CDR；scFv 791，人源化TNF抑制性抗体片段，其包含嫁接在与用于scFv 903的scFv支架(Vk1-VH3)相同的scFv支架上的兔CDR；scFv 961，为scFv 903的衍生物，其在参与可变和恒定结构域之间的界面的区域中包含3个点突变（DHP基序），和scFv903-IgG，scFv 903的IgG形式。
使用4种检测分子之间的序列变化和在ADA结合特征中的差异的相关性鉴定在整个scFv支架、更具体地是在V-C界面中的ADA表位。另外，使用scFv903的全长版本（IgG）的竞争进一步确认已存在的ADA的形式特异性。
表1中显示了来自竞争实验的数据总结。过量的scFv903竞争了除了2个血清以外的所有个体人血清的结合，证明这些ADA特异性针对ESBA903。在32个特异性针对scFv 903的人血清中，只有2个不被scFv791竞争，指示在这些人血清(H53和H76)中存在的抗体与scFv903CDR结合，而所有其他血清明显不是CDR特异性的。约48%的ADA也识别scFv105上的表位，尽管这些反应略微较低。这说明大多数抗体并非框架特异性的，而是与不同scFv支架中保守的氨基酸结合。有趣地是，scFv 903的IgG形式不与scFv 903显著竞争结合任意检测的血清。这强烈指示大多数血清与可变和恒定区之间的界面结合，此界面在scFv 903中是ADA可接近的，但在其IgG形式中ADA无法接近。此外，与scFv903仅相差3个氨基酸的scFv 961竞争仅64%的ADA的结合。这些反应比scFv903普遍较低，这暗示绝大部分已存在的ADA结合包含这3个氨基酸的表位，此表位在scFv 903的V-C界面中构成疏水表面区块。scFV105相比scFV903得到的结果差异可通过在这2个分子中存在的疏水表面区块的不同模式来解释。总之，这些结果显示在人血清中多达50%的已存在ADA显示为scFv种类特异性抗体。
表1:
在人血清中已存在抗体的表位表征。显示了对34种具有已存在的抗scFv903抗体的不同人血清，在用100mcg/ml scFv903,791(34_max),scFv105和961(scFv903_DHP)以及scFv903的IgG形式竞争后的OD的%减少。
Figure BDA00001794846800171
Figure BDA00001794846800181
Figure BDA00001794846800191
为了鉴定ADA和scFv 903之间的相互作用位点，将s cFv 903和其他scFv(791,105和961)之间的序列变化与ADA在不同人血清中的特异性相关联。首先，比对不同s cFv的序列，并根据scFv 903和其他scFv之间的序列差异对暴露在溶剂中的位置进行分组（图3和4）。在这里，“α”代表scFv 961和所有其他scFv之间有差异的位置组，“β”代表仅scFv105与其他分子在序列中有差异的位置，和“γ”指示scFv 791与所有其他分子有差异的位置。此外，αβ和αγ分别描述在除了scFv 961和scFv105或scFv961和scFv791以外的所有scFv中保守的位置。类似地，通过在竞争测定中测定的包含抗scFv903抗体的人血清对其他scFv的特异性对其分类，使用如上使用的用于氨基酸位置的相同分类代码（见表2）。为了将血清判定与给定检测scFv结合，将在竞争测定中50%的最小信号减少设置为阈值。在此研究中，“α”代表不显示针对scFv 961的结合活性的人抗scFv 903血清。“β”血清不结合scFv105，“γ”血清不结合scFv 791。从序列分析和体外结合研究的相关性中可以得出如下结论，例如在“α”型人血清中的抗scFv 903抗体与氨基酸组“α”中的至少一个氨基酸相互作用。类似地，任意其他类型的血清与对应的氨基酸组中的至少一个氨基酸相互作用。
使用Discover Studio版本2.5.5进行scFv 903的结构分析和同源性模型。分析了建模的结构以确定哪些氨基酸残基暴露于溶剂，哪些氨基酸残基被掩蔽。通过测定每个残基相对其最大可能溶剂可及表面积的相对溶剂可及表面（Solvent Accessible Surface，SAS）进行计算。将截止值定义为25%，因此将具有等于或大于25%的相对SAS的残基视为暴露在溶剂中的。
表2：
ELISA结果，其中scFv 903,791,scFv105和961与scFv903竞争结合在34个血清样品中的抗体。
Figure BDA00001794846800211
94%的血清具有特异性结合scFv 903或scFv 791的抗体，显示大多数已存在抗体不结合CDR区。一半（50%）的人血清不显示与scFv 961的结合或具有较少的结合scFv 961的抗体。序列分析显示，scFv 961和scFv 903仅在可变重链中的第12、103和144位上有差异。因此，在scFv 903的可变重链中的L12,V103和L144参与ADA结合（表2和图4和5）。此发现被scFv 903的IgG形式不竞争抗scFv 903血清与scFv 903结合的事实进一步证实，其中scFv 903的I gG形式对应的界面残基由于和相邻恒定区的接触使溶剂无法接近。
12%的检测的人血清具有针对所有抗原区的抗体(α，β，γ)。
64%的血清不含或具有显著少的结合scFv 961(α)的抗体。如上所述，此scFv与scFv 903仅在位于原先的可变-恒定结构域界面上的3个残基位置上(L12S,V103T,L103T)有差异。由于这些在V/C界面上的残基位置高度保守，突变这些位置已显示了去免疫scFv而不影响生物物理性能的一般解决方案。
51%的血清不含或具有较少的针对scFv105(β)（Vk1-VH1b亚型（不同框架）的scFv）的抗体。通过序列比对鉴定了可能的抗原区（图3、4和5）。
23%的血清特异性针对scFv 903，然而不结合scFv105，也不结合scFv961(αβ)。当与scFv903相比时，在2种scFv中均仅相差一个残基位置。因此，在scFv903的可变重链结构域中的对应氨基酸（L12）在ADA和scFv903之间的相互作用中起关键作用。
总之，可得到以下结论：a）约50%的ADA与可变区和恒定区之间的界面中的表位(α)结合，所述表位包含在可变重链结构域中的第12、103和144位的残基，和b）突变这3个高度保守的残基普遍显著降低了已存在抗体对scFv的结合强度和频率。在人来源的可变重链中的第12位亮氨酸、第103位缬氨酸和第144位亮氨酸出现的高频率（图6）进一步支持了DHP基序减少scFv的免疫原性的此一般适用性。由于当与scFv 903比较时，抗scFv 903血清与scFv105的结合一般较弱，将在scFv 903中的任意暴露在溶剂中的残基取代为在scFv105中的对应氨基酸可能消除或减弱B细胞表位。特别感兴趣的是在可变轻链中的第101和148位残基，因为这些大体积残基参与原先的恒定-可变结构域界面（表4）。
表3：
检测的具有针对不同抗原区的抗体的人血清的总结表
  种类(抗原区)   占血清的%
  所有   12%
  α   35%
  β   51%
  αβ   23%
  Nd   12%
  无   4%
  αγ   4%
表4：
在人可变结构域的选定位置上的氨基酸频率
尽管显示和描述了目前优选的本发明的实施方案，应当明确理解，本发明不受限于这些实施方案，且可在以下权利要求的范围内被另外不同地实施和实践。
Figure IDA00001794847400011
Figure IDA00001794847400021
Figure IDA00001794847400031
Figure IDA00001794847400041
Figure IDA00001794847400051
Figure IDA00001794847400061
Figure IDA00001794847400071

Claims (16)

1.一种减少包含可变轻链和/或可变重链的抗体可变结构域的免疫原性的方法，所述方法包括取代可变轻链和/或可变重链的一个或多个氨基酸残基的步骤，所述残基存在于相应的全长抗体的可变链和恒定链之间的界面上。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体可变结构域是scFv、Fv片段或单结构域抗体，特别是scFv。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述一个或多个将要被取代的氨基酸残基是亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）、精氨酸（R）和/或谷氨酸（E）。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸残基被免疫反应性更低的氨基酸取代。
5.权利要求4的任一项的方法，其中亮氨酸（L）、缬氨酸（V）和/或苯丙氨酸（F）被极性更强的氨基酸取代。
6.权利要求5的方法，其中所述极性更强的氨基酸是丝氨酸（S）和/或苏氨酸（T）。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述可变轻链的一个或多个氨基酸残基位于第99、101和/或148位（AHo编号）。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述可变重链的一个或多个氨基酸残基位于一个或多个以下位置：第12,97,98,99,103和/或144位（AHo编号）。
9.权利要求8的方法，其中所述可变重链的一个或多个氨基酸残基选自12、103和144（AHo编号）。
10.权利要求9的方法，其中所述一个或多个氨基酸残基是
（a）在重链第12位氨基酸上的亮氨酸（L）；
（b）在重链第103位氨基酸上的缬氨酸（V）；和/或
（c）在重链第144位氨基酸上的亮氨酸（L）。
11.权利要求9和10中任一项的方法，其中所述可变重链的一个或多个氨基酸残基被以下氨基酸取代
（a）在重链第12位氨基酸上的丝氨酸（S）；
（b）在重链第103位氨基酸上的丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；和/或
（c）在重链第144位氨基酸上的丝氨酸（S）或苏氨酸（T）。
12.通过权利要求1-11的方法可得到的抗原结合片段。
13.权利要求12的抗原结合片段，用于治疗或诊断应用。
14.权利要求13的抗原结合片段，其通过局部性（locally）和/或局部（topically）应用。
15.权利要求13或14的抗原结合片段，其通过缓释制剂和/或设备应用。
16.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述将要被取代的一个或多个氨基酸残基是在各个亚型中的共有残基。
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