CN102676573B - 光合作用相关的蛋白ppd1的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光合作用相关的蛋白PPD1的应用。PPD1蛋白的编码基因在保护植物光系统I光合功能中的应用也属于本发明的保护范围之内。进一步讲，上述保护光系统I的光合功能为恢复突变体黄化苗为绿色苗。具体地讲，上述应用是将所述PPD1蛋白的编码基因导入PPD1降低的拟南芥突变体中。实验证明：转基因后，可以得到基因T-DNA插入纯合突变体的转基因互补株系，黄化苗的表型恢复成绿色，并且能够在土里自养，表明PPD1蛋白能够保护光系统I的正常光合功能。

Description

光合作用相关的蛋白PPD1的应用

技术领域

本发明涉及光合作用相关的蛋白PPD1的应用。

背景技术

绿色植物(包括藻类)的光合作用是指它们在光照下利用CO₂和H₂O合成有机物质，并释放出氧气的过程。植物的光合作用不仅是一个规模巨大的能量转换过程，它合成的有机物质也是人类生命活动的物质基础，是农业、林业和其他一切种植业、畜牧业以及水产养殖业的物质基础。人们研究光合作用的目的，不仅在于揭示自然界这一特异的生命活动规律，而且企图模拟这一过程，提高光能转换效率，使人类获取更大的经济效益(匡廷云，2003，光合作用原初光能转化过程的原理与调控，江苏科学技术出版社)。

光合膜是光合作用原初光能转化过程的场所。植物吸收的光能通过光合膜上电子传递和光合磷酸化转变为化学能。高等植物类囊体膜上的超分子蛋白复合物主要包括：PSII，PSI，Ctyb6f以及ATP合成酶。植物吸收的光能经常超过光合作用所能利用的能量，此时叶绿体中会产生大量的活性氧分子，活性氧会对类囊体膜上的蛋白复合物产生伤害，尤其对光系统I和光系统II的伤害最为严重(Asada K.1999，Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol，50：601-639)。植物在长期的进化过程中产生了许多光保护机制，其中就有许多蛋白参与蛋白复合体的修复以及组装过程(Apel K.and Hirt H.2004，Annu Rev Plant Biol，55：373-399)。

发明内容

本发明的目的在于提供PPD1蛋白的编码基因在保护植物光系统I光合功能中的应用。

进一步讲，上述保护光系统I光合功能可以是恢复突变体黄化苗为绿色苗。

具体地讲，上述应用是将所述PPD1蛋白的编码基因导入PPD1降低的拟南芥突变体中的。

上述PPD1蛋白是如下1)或2)蛋白：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与1)活性相同的由1)衍生的蛋白质。

在实施例中，上述PPD1蛋白的编码基因的编码序列是序列表中序列1。

更进一步讲，上述PPD1蛋白的编码基因是通过重组表达载体导入所述PPD1降低的拟南芥突变体中的；所述重组表达载体是将所述PPD1蛋白的编码基因插入pCAMBIA1301的多克隆位点间构成的重组载体。

上述PPD1降低的拟南芥突变体是来自SALK_143493C的纯合株系。

我们为了研究光保护和调控的机理，以模式生物拟南芥为材料，从美国ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购买定位于叶绿体的核编码基因的突变体，筛选到了一个参与光系统I合成和保护的突变体，该突变体的AT4g15510位点的内含子中由于插入了T-DNA，导致成熟RNA和蛋白含量的降低，致使光系统I的合成受到影响，光敏感性增加，植物不能自养。该基因序列中推测含有PsbP结构域，被命名为PPD1(PsbP domain containing)，其功能目前未知。PsbP蛋白是光系统II放氧复合物的外周蛋白，对于维护放氧复合物的稳定具有重要作用。实验证明：转基因后，可以得到基因T-DNA插入纯合突变体的转基因互补株系，黄化苗的表型恢复成绿色(图4)，并且能够在土里自养，表明PPD1蛋白能够保护光系统I的正常光合功能。

附图说明

图1为突变体的生长表型。

图2为77K荧光激发光谱。

图3Western-Blot检测不同光强下光合膜蛋白含量变化，光强：正常光，100μmol m^-2s^-1；低光，60μmol m^-2s^-1；高光，250μmol m^-2s^-1。

图4为互补株系的表型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、基因功能的发现过程

1、突变体材料的鉴定

购买回来的突变体种子(ABRC，SALK_143493C)在MS培养基上生长，发现其中有黄苗(图1)，4周后移至营养土中继续培养，发现黄苗致死，从DNA水平上通过PCR方法鉴定外源T-DNA插入情况，发现纯合体的PPD1基因的第二个内含子中有外源T-DNA插入，杂合体的后代分离出黄苗，而且绿苗和黄苗的比例接近3∶1，说明是单基因决定的表型。

我们进一步对黄苗从基因表达水平上进行鉴定，半定量RT-PCR和Q-PCR结果发现成熟的转录本RNA降低到野生型的1/3水平，Western-blot结果表明突变体中PPD1蛋白含量也降低到野生型的1/3。以上结果表明外源T-DNA的插入造成基因表达的下降，从而造成了黄化表型。

2、叶绿素荧光参数测定

对在培养基中生长3周的幼苗进行叶绿素荧光参数测定，几乎检测不到突变体在810nm激发的P700吸收，表明光系统I功能的缺失是导致黄化表型的主要原因。77K低温荧光可以检测激发能在捕光色素复合物和光系统I反应中心的传递过程，突变体中发生蓝移的结果表明PPD1影响了光系统I的功能(图2)。

3、生理生化检测

为了进一步分析PPD1蛋白对光合作用的影响，我们检测了三种不同光照强度下幼苗的光合膜蛋白的积累情况，结果如图3所示，不同光照强度下生长的幼苗中几乎检测不到光系统I的核心蛋白，但是光系统I捕光色素有不同程度的积累，弱光下有所恢复。光系统II的核心蛋白都有不同程度的降低，弱光下都有所恢复，光系统II捕光天线含量没有变化。突变体的其他膜蛋白复合物与野生型相比没有明显变化，这一结果表明突变体具有一定的光敏感性，可能的解释是PPD1蛋白含量的降低导致光系统I蛋白的积累以及功能丧失，多余的功能更容易对光系统II造成伤害。

不同光照强度下突变体的叶绿素积累情况也表明突变体更具有光敏感性，表1表明，无论是叶绿素含量还是Fv/Fm，都是高光下降低，低光下有所恢复。

表1不同光强下色素含量以及Fv/Fm变化

野生型正常光

野生型低光

野生型高光

突变体正常光

突变体低光

突变体高光

叶绿素(a+b)

1.26±0.013

1.32±0.021

1.29±0.015

0.35±0.004

0.38±0.005

0.32±0.009

叶绿素a/b

2.58±0.062

2.56±0.064

2.69±0.070

2.45±0.051

3.33±0.056

2.20±0.074

Fv/Fm

0.81±0.008

0.82±0.009

0.80±0.010

0.52±0.021

0.55±0.015

0.43±0.023

4、结论

我们通过对拟南芥突变体的生理生化功能研究研究，发现核基因编码的PPD1蛋白是参与植物光合作用的重要分子，该蛋白可能参与了光系统I的合成或组装过程，突变体表现的光敏感性也说明PPD1基因(AT4g15510)还具有光保护功能，因此该基因具有重要的应用价值。

实施例2、转基因实验

一、基因的获得

以F-at4g15510-0X-NcoI：TACCATGGATGGCTTCATCTGCATT和R-at4g15510-0X-BstEII：TAGGTNACCCTAAATCTTCTCGACC为引物，从拟南芥(Col-0生态型，购自拟南芥生物资源中心)基因组中扩出基因，扩增产物经切胶纯化后连接到T-easy载体上，转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，进行PCR、酶切、测序鉴定。测序结果表明其核苷酸序列如序列表中序列1所示，命名为PPD1，可编码序列2所示的蛋白。

二、重组载体、重组农杆菌的构建

含有PPD1的T-easy质粒经NcoI和BstEII酶切后克隆到相应酶切过的pCAMBIA1301(CAMBIA)中，PCR和酶切验证正确后用于转化侵染拟南芥的菌株GV3101。阳性农杆菌克隆用于转化拟南芥。

三、转基因互补实验

突变体纯合体不能自养，我们采用浸蘸法转化鉴定到的T-DNA插入杂合体植株(SALK_143493C)，具体步骤如下：

上述菌体活化以后，用转化缓冲液(1/2×MS盐，5％蔗糖，调节pH 5.7后加入0.02％的Silwet L-77)充分悬浮菌体后，将准备好的拟南芥杂合体植株剪去已经开放的花，浸入转化缓冲液中短时，取出保湿侧放，暗培养24h后，按正常条件培养至种子成熟，收集种子进行纯合系的筛选。

将转基因植物当代的种子(T₀)经表面灭菌后均匀地播洒于含50μg/mL潮霉素的1/2MS固体培养板上(可以同时含有50μg/mL羧苄青霉素以防止农杆菌污染)。大约一周后即可观察到阳性幼苗明显较大，较绿；而未转入基因的则在种子萌发后因不能抗潮霉素而变黄，不能正常生长。生长2-3周的阳性苗移入土中生长，在DNA水平上鉴定T-DNA插入的纯合株系，至种子成熟分单株收集种子。将T-DNA插入纯和株系的种子按同样的方法播种于含50μg/mL潮霉素的1/2MS培养基(不需羧苄青霉素)上。理论上单拷贝插入的转基因植物自交后代(T2)应该出现3∶1的分离比，选择具有这样分离比的株系按同样方法移栽阳性转基因苗，种子成熟时分单株收集。T₂种子按单株播种于含50μg/mL潮霉素的1/2MS培养基上，无分离的株系所对应的T2植株即为纯合系，可用于后续研究。

目前，我们已经得到了该基因T-DNA插入纯合突变体的转基因互补株系，黄化苗的表型恢复成绿色(图4)，并且能够在土里自养，表明PPD1蛋白能够保护光系统I的正常光合功能。

Claims (6)

1.PPD1蛋白的编码基因在保护植物光系统I光合功能中的应用；所述PPD1蛋白是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述保护光系统I光合功能为恢复突变体黄化苗为绿色苗。 

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用是将所述PPD1蛋白的编码基因导入PPD1降低的拟南芥突变体中。 

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述PPD1蛋白的编码基因的编码序列是序列表中序列1。 

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PPD1蛋白的编码基因通过重组表达载体导入所述PPD1降低的拟南芥突变体中；所述重组表达载体是将所述PPD1蛋白的编码基因插入pCAMBIA1301的多克隆位点间构建的重组载体。 

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述PPD1降低的拟南芥突变体是来自SALK_143493C的纯合株系。 

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