CN102676518B - 一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种新型抗肿瘤amiRNA序列，其包含下列序列中的任意一条或一条以上：amiRNA-hTERT 1：正义链5’-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’；反义链5’-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’；amiRNA-hTERT 2：正义链5’-CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’；反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’；amiRNA-hTERT 3：正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。本发明能抑制肿瘤的生长、增殖和迁移，使肿瘤细胞进入衰老状态而促其凋亡。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用。
背景技术
端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段重复的DNA序列5’-GGTTAG-3’，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，维持着染色体和基因组的完整性与稳定性(Rlackburn，E.H.Nature，350，569-573；1991.)。在正常体细胞中，细胞每分裂一次，由于DNA复制时的“冈崎片段”效应，端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致凋亡或其它癌变。因此，端粒和细胞老化有明显的关系。其长度反映着细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”(Kim Sh，S.H.，et al.Oncogene 21，503-511；2002.)。当端粒缩短到一定程度时，某些细胞为了逃避短端粒带来的凋亡效应，只有突变产生相应的“端粒维持机制”。通过“端粒维持机制”，这些细胞进行疯狂的增殖和复制，慢慢走向癌化的道路。目前已经报道的“端粒维持机制”除少数是‘非端粒酶依赖型’的外，绝大部分都是‘端粒酶依赖型’的，简单的说就是通过表达端粒酶来实现端粒的延伸或维持((Shay and Roninson，2004)。
端粒酶(Telomerase)，在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。简单来说，端粒酶是RNA和蛋白质的复合体，如人的端粒酶分别由起模板作用的端粒酶RNA(hTR)、起组装作用的端粒酶结合蛋白(hTP1)和起催化作用的端粒酶逆转录酶(hTERT)组成(Olovnikov，1971)。越来越多的研究表明，在哺乳动物中，各细胞中hTR的表达是普遍的，特异性不强；而hTERT则呈现与端粒酶活性极强的正相关性，是端粒酶活性的限速成份(Meyerson et al.，1997)。
实验表明，约85％-90％的肿瘤细胞中呈现端粒酶活性显著升高，而正常的成体细胞则显示低活性，因而端粒酶作为肿瘤治疗的最理想靶点早已是一个不争的事实(Hahn et al.，1999)。近年来通过调节端粒酶活性来干预肿瘤的研究日益增多，同时也取得了很好的效果，但主要局限在寡核苷酸和疫苗的临床研究方面(Brunsvig et al.，2006；Gandellini et al.，2007)。杰隆(Geron)的GRN163L是此类药物开发中最前沿的一个候选药物，早在2005年，FDA同意GRN163L在患慢性淋巴细胞白血病患者的临床实验。2007年，Geron公司开始GRN163L单独治疗多发性骨髓瘤的I期临床试验。2008年开始了GRN163L治疗乳腺癌的I期临床实验。同年12月，Geron发布了有关GRN163L治疗再发的和难治的多发性骨髓瘤的暂时性临床试验数据。2009年，Greron又发布了Geron163L对肿瘤干细胞的实验进展，包括非小型细胞肺癌、乳癌、胰脏炎、前列腺癌、小儿科神经肿瘤。数据显示，在以Geron163L治疗后，人类乳癌细胞MCF7的假定干细胞数量与自我再生的能力大幅减弱。目前Geron163L正处于临床II期试验中同样令人振奋的是KAEL-GemVax公司的抗端粒酶疫苗GV1001业已进入临床III期。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默(C，NapoliC et al.，Plant Cell.2：279-289；1990)。RNAi现象是生物体中非常普遍的一种基因调节行为，按其引发源分可以划分为内源性的微RNA(microRNA，miRNA)干扰和外源性的小RNA(small RNA，siRNA)干扰现象(Jinek and Doudna，2009)。miRNA是一种内源性、20-25bp长的双链RNA，通过与目的基因的部分(极少是完全)互补配对来实现对基因的转录后基因调控作用，在生物体的生长发育各个阶段从未停止工作过。在人体中，高达30％的基因受到miRNA的调控作用(Bartel，2004)。如果单纯从片段长度上进行推算的话，理论上人体基因组应该存在420-25种符合miRNA长度的微RNA片段，但到目前为止在人类中却只发现1424种miRNA，且没有一种已知miRNA是直接靶向hTERT的(miRBase Release 17：April，27，2011)。因此，若能根据miRNA形成原理来设计更多靶向作用的人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)，我们将有可能实现对端粒酶依赖的肿瘤RNAi治疗的新突破。因为目前对端粒酶依赖的肿瘤RNAi治疗方面，由于没有找到一种直接靶向hTERT的miRNA及siRNA的脱靶效应及毒副作用使得miRNA和siRNA途径都黯然失色。这就迫使我们将注意力转向新的RNAi方向(即amiRNA)，实验表明，针对于相同的靶点，amiRNA融合了单纯miRNA和siRNA的优点。首先，由于amiRNA设计时采用了miRNA的原则，具有miRNA的内源性优势，具有比siRNA更高的表达、包装和基因沉默效率，并且能很好的规避siRNA带来的干扰素效应这一大难题；其次，同样由于amiRNA设计时兼顾了siRNA的完全配对原则，必然导致amiRNA比常规miRNA具有更强的靶向性和基因沉默作用，同时也降低了难以控制的多靶、脱靶效应(Zeng et al.，2002)。
尽管siRNA和miRNA技术都已经非常成熟，也取得了一定的成果，但其干扰效果、特异性和副作用(如脱靶、干扰素效应)却始终不容乐观(Gandellini et al.，2007)。然而，被寄予厚望的amiRNA却只刚刚开始，目前虽有少数有关利用amiRNA来调控靶基因表达的成功案例，但却尚未有利用amiRNA靶向hTERT来实现肿瘤细胞的高效、低毒治疗的报道(Dickins et al.，2005)。因此，寻找和筛选一些高效、专一的靶向人端粒酶hTERT基因的amiRNA序列将成为肿瘤RNAi疗法的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用，本发明的端粒酶hTERT本身是肿瘤细胞的特异性标记之一，本发明涉及的amiRNA-hTERT能高效抑制hTERT表达，从而抑制肿瘤的生长、增殖和迁移，同时使肿瘤细胞进入衰老状态而促进其凋亡。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
根据miRNA和siRNA形成和结构特点设计了多条可能靶向hTERT的amiRNA-hTERT序列，通过实验筛选出高效抑制hTERT的amiRNA-hTERT的3条序列，该序列为下述序列中的任意一条或一条以上：
amiRNA-hTERT 1(amiR1)：正义链5’-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’；
反义链5’-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’；
amiRNA-hTERT2(amiR2)：正义链5’-CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’；
反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’；
amiRNA-hTERT3(amiR3)：正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；
反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。
所述的序列中，优选对hTERT沉默效率最好的amiRNA为：
amiRNA-hTERT3(amiR3)：正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；
反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。
本发明所提供的amiRNA由正义链和反义链组成，amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT2的正义链模拟了常规siRNA，长度为19个核苷酸；它的反义链则模拟了常规miRNA，长度为21个核苷酸；amiRNA-hTERT3则是将amiRNA-hTERT2的正义链改造成完全跟其反义链互补配对。
本发明所提供的3对amiRNA经Realtime PCR验证可以显著降低hTERT的mRNA表达，经Western blot方法证明可以明显降低hTERT的蛋白表达水平，在酶活性方面，Telo-TRAP和ElISA方法同时验证了3对amiRNA都能明显抑制hTERT的活性，从而实现对hTERT在转录本、蛋白和酶活多个层面抑制作用。并在体外细胞系列实验中验证了设计并合成的3对amiRNA对肿瘤细胞生长、增殖、迁移的特异性抑制作用和促进凋亡效果，而对正常细胞没有显著作用。并且能抑制内皮细胞的小管形成，为将来肿瘤治疗中抑制肿瘤周边血管形成提供了可能。动物水平的裸鼠移植瘤实验同样证实了合成的3对amiRNA能抑制移植瘤的形成和生长。整体效果来说，设计并合成的3对amiRNA中，其中以amiRNA-hTERT 3效果最佳。
一种新型抗肿瘤amiRNA序列在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所提供的amiRNA序列可用于制备与hTERT基因相关疾病的治疗药物，如抗肿瘤药物。该amiRNA序列可以通过化学合成以化学药物用于肿瘤的预防和治疗，也可以经过包装(如质粒或病毒类载体)最后以基因药物形式用于肿瘤的预防和治疗中。
本发明的有益效果是：本发明的端粒酶hTERT本身是肿瘤细胞的特异性标记之一，本发明涉及的amiRNA-hTERT能高效抑制hTERT表达，从而抑制肿瘤的生长、增殖和迁移，同时使肿瘤细胞进入衰老状态而促进其凋亡；在有效浓度方面，本发明中的amiRNA-hTERT 3只需1.56nM的浓度就可以实现对宫颈癌细胞Hela的81％的生长抑制作用，比以往报道的靶向hTERT的siRNA(约50-100nM)等效作用浓度降低近2个数量级；在RNAi治疗的副作用方面，本发明中的3对amiRNA都没有检测到明显的干扰素效应和脱靶效应。
附图说明
图1是本发明amiRNA对NCI-H446，Hela，U2-OS，Huvec转染效率的测定。1-1为Cy3标记的amiRNA转染实验细胞后荧光、白光及拟合图片；1-2为根据荧光细胞所占比例计算所得的转染效率结果；
图2是本发明amiRNA对NCI-H446hTERT mRNA表达水平的抑制效果；
图3是本发明amiRNA对NCI-H446hTERT蛋白表达水平的抑制效果；其中3-1是hTERT蛋白的Western blot图谱；3-2为根据蛋白条带显色亮度计算所得的蛋白表达效率；
图4是本发明amiRNA对NCI-H446细胞hTERT酶活的抑制效果；其中4-1为TRAP法检测hTERT酶活的电泳图谱；4-2为3-2为以NC为参照，根据条带显色亮度计算所得的相对总体酶活；
图5是本发明amiRNA对Hela，NCI-H446，U2-OS，Huvec的增殖影响及amiRNA-hTERT 3对Hela细胞增殖影响的量效曲线；其中5-1为MTT法测定amiRNA对Hela，NCI-H446，U2-OS，Huvec的增殖影响的结果；5-2为amiRNA-hTERT 3对Hela细胞增殖影响的量效曲线；
图6是本发明amiRNA对NCI-H446，Hela，U2-OS，Huvec细胞迁移能力的影响；其中6-1为划痕法测定细胞迁移能力的细胞图谱；6-2为根据划痕愈合率计算得到的细胞迁移能力结果；
图7是本发明amiRNA对NCI-H446，Huvec细胞侵袭能力的影响；其中7-1为transwell法测定细胞侵袭能力的细胞图谱；7-2为根据通过小室的细胞量计算得到的细胞侵袭能力结果；
图8是本发明amiRNA对NCI-H446单细胞软琼脂克隆形成能力的影响；其中8-1为细胞在软琼脂上形成的细胞克隆图谱；8-2为根据有效克隆的总体积计算得到的细胞克隆形成能力结果；
图9是本发明amiRNA对Huvec小管形成能力的影响；其中9-1为细胞在ECM胶上形成的小管的细胞图谱；9-2为根据有效小管结点量计算得到的细胞小管形成能力结果；
图10是本发明amiRNA对NCI-H446，Hela，Huvec，U2-OS细胞凋亡的影响；其中10-1为用PI单染细胞后做的流式图谱；10-2为根据细胞流式仪显示的凋亡率得到的细胞凋亡统计结果；
图11是本发明amiRNA对NCI-H446细胞干扰素通路相关基因IFN-beta，OAS1，STAT1的影响；
图12是本发明pAM-CAG-EGFP载体图谱及amiRNA对靶点基因的沉默效果；其中12-1为靶点沉默实验中所用的pAM-CAG-EGFP载体图谱；12-2为细胞转染含靶点质粒的amiRNA后的荧光表达变化；12-3为根据荧光表达效率所得的沉默效果统计结果；
图13是本发明amiRNA对NCI-H446细胞裸鼠移植瘤成瘤性及凋亡的影响；其中13-1为裸鼠移植瘤实验中裸鼠及其移植瘤的图谱；13-2为根据肿瘤体积计算所得的肿瘤生长曲线；13-3为肿瘤的免疫组化图谱。
具体实施方式
实施例1
amiRNA-hTERT的设计与合成。
从GenBank中查得人端粒酶逆转录酶基因hTERT的cDNA序列号(NM_198253)，结合目前常用的siRNA，miRNA mimics设计原理及天然miRNA结构特点综合进行amiRNA设计：①先用siRNA法则进行定位，再将预选的作用位点演变成miRNA mimics形式，最后根据天然miRNA结构特点进行结构优化，得到待选amiRNA；②分别选择靶基因hTERT序列的翻译区(ORF)和3’非翻译区(3’-UTR)为靶区域进行设计；③GC的百分比含量控制在35％-55％；④评估等级设为最高级的5星；⑤BLAST验证序列的特异性。结果得到2条amiRNA(amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2)，同时对amiRNA-hTERT 2进行结构改造得到amiRNA-hTERT 3，见表1(只列举最后验证有效的3条)。如表1所示，表1为设计的amiRNA-hTERT的三条有效引物序列
设计所得3条amiRNA由上海吉玛制药技术有限公司代为合成，合成时采用以下原则：①进行G，C碱基的2’Ome修饰；②在各链的3’末端人为添加2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸dTdT；③产品经PAGE纯化验证。阴性对照(NC)同时也购自上海吉玛制药技术有限公司。
实施例2
体外细胞实验评价amiRNA-hTERT的抗肿瘤效果。
1.细胞培养及amiRNA-hTERT转染效率的测定
本实施例根据实验目的针对性的选择了4株细胞(均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，分别为端粒酶低表达的正常细胞(HUVEC)、端粒酶阴性的肿瘤细胞(U2-OS)和端粒酶高表达的肿瘤细胞(Hela和NCI-H446)。所有细胞均在含有10％胎牛血清(Gibico公司)、100U/ml氨苄青霉素和100ug/ml硫酸链霉素(Sigma公司)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)中，37℃、5％CO2、饱和湿度的环境条件下进行连续培养。转染前一天，细胞以4000个/孔的量接种于96孔板中。amiRNA-hTERT的转染完全按照Invitrogen的Lipo2000(Invitrogen公司)方案进行，amiRNA的转染浓度为50nM，使用siRNALabeling Kit转染检测试剂盒(Ambion公司)。即先将待转染的amiRNA进行荧光染料Cy3标记，amiRNA的转染浓度为50nM，转染后6h用PBS洗去残余标记物，接着进行荧光观察(Nikon Ti-U，Japan)及软件分析(NIS-Elements software，Nikon)。具体操作完全按照Lipo2000和
siRNA Labeling Kit厂家提供的使用说明进行，并且全部操作均在避光条件下进行。结果表明amiRNA-hTERT能对所选细胞实现高效转染，分别为NCI-H446(93.4％)、Hela(95.1％)、U2-OS(95.2％)、HUVEC(96.5％)，结果见图1所示。
2.分析amiRNA-hTERT对hTERT的沉默效果
为了充分评价amiRNA-hTERT对hTERT的沉默效果，我们将从hTERT发挥作用的不同层面(转录本、蛋白和酶活)进行测定。
(1)qPCR分析hTERT mRNA的变化。NCI-H446和Hela细胞在各自转染amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2，amiRNA-hTERT 3和NC后24h，用Trizol Reagent(Invitrogen公司)按其说明书进行总RNA提取(由此开始在冰上进行操作)，接着用Bio Mate仪器(Thermo，USA)测定RNA纯度和浓度，立刻进行反转录(相关试剂购自Zoman公司)：加入5xRT缓冲液10ul，dNTP(2.5mM)4ul，Rnasin(40U/ul)1ul，RTase(200u/ul)1ul，Oligo18(50uM)0.1ul，RNA 2ug，补充ddH2O到50ul，充分混匀后42℃孵育60min。完成反转录之后用RealtimePCR(ABI，USA)对hTERT表达水平进行定量，内参为GAPDH。操作按Zoman的“2x SYBR Green qPCR kit”方案进行，即模板2ul，上、下游引物(10uM)1ul，2xMix 10ul，补充ddH2O到20ul。扩增条件为：95℃4min→(94℃45s，60℃45s，72℃45s)40cycle→meltcurve。
qPCR实验结果表明，3对amiRNA能明显下调端粒酶阳性的两种细胞(NCI-H446和Hela)hTERT的表达。以NCI-H446为例(如图2所示)，相对于NC来说，amiRNA-hTERT 1降低了72％的hTERT表达，amiRNA-hTERT 2为89％，而amiRNA-hTERT 3达到99％，初步认定amiRNA-hTERT 3在抑制hTERT表达时最为有效。
(2)SDS-PAGE和Western Blot分析hTERT蛋白的变化。在转染amiRNA后用CHAPS裂解液(Beyotime公司)裂解NCI-H446细胞，裂解液经12000rpm x 20min离心后取上清。经BCA蛋白浓度检测试剂盒(Beyotime公司)测定蛋白浓度，取30ug蛋白上清进行8％SDS-PAGE跑胶，之后进行转膜，剪下目的蛋白条带，用1％脱脂奶粉(Beyotime公司)封闭过夜，按1∶500加入对应性一抗(兔抗人hTERT一抗、兔抗人Actin一抗，Santa公司)，37℃孵育2h，用TBST洗3次，用1∶1000的二抗(山羊抗兔IgG-HRP，Santa公司)孵育2h，再用TBST洗3次，用ECL检测试剂盒(Beyotime公司)显色。结果显示，在端粒酶阳性的NCI-H446细胞中，相对于NC来说，amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2和amiRNA-hTERT 3分别下调其hTERT的蛋白表达约58％，87％和98％，抑制效果明显，尤其是amiRNA-hTERT 3(如图3所示)。相类似的结果也在另一株端粒酶阳性的Hela细胞中得到。
(3)端粒酶活性的测定。分别在NCI-H446，Hela细胞中转染amiRNA，转后3d收集细胞，接着用TeloChaser试剂盒(TOYOBO公司)进行端粒酶活性检测。具体操作为用TeloChaser试剂盒(TOYOBO公司)自带的裂解液配制细胞提取液并裂解细胞，离心后取上清液进行BCA蛋白浓度定量，用三蒸水将相同蛋白量的上清液统一配成20ul反应液，配好Extension mix后加入20ul提取液上清进行端粒酶延伸反应，之后用异丙醇和乙醇纯化反应产物，以所得产物为模板，加入TeloChaser试剂盒(TOYOBO公司)自带引物进行PCR反应，结束后用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶经过夜固定后进行银染显色。结果表明所设计的3种amiRNA都能很有效的抑制端粒酶活性，以Hela细胞为例(如图4所示)，3对amiRNA的抑制率分别16％，77％和99％。同时用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS kit(Roche公司)对处理细胞进行端粒酶活性检测，也得到相似的结果，具体操作同其说明书。
3.分析各amiRNA对细胞增殖的影响
转染前一天，将正常细胞Huvec，端粒酶阴性细胞U2-OS，端粒酶阳性细胞NCI-H446和Hela分别按3E+3个细胞/孔接种于96孔板中，接板后20h进行amiRNA转染，转染浓度统一为50nM，除阴性对照组(NC)外，同时增设一组只加lipo 2000的lipo对照组，用于评价整体实验操作可靠性。转染后每2天更换一次培养基，第四天加入MTT标记物(Roche公司)，吸去培养液，加入溶解液后孵育过夜，用分光光度计(Eppendorf，Germany)检测580nm吸光度，具体操作同cell proliferation kit I(Roche公司)。结果显示，相对于NC来说，3种amiRNA对端粒酶阴性(或低表达)的细胞(U2-OS，Huvec)没有显著作用，而对端粒酶阳性的细胞(NCI-H446，Hela)却有明显的增殖抑制作用，尤其是amiRNA-hTERT 3效果更为显著，对Hela细胞的抑制率达到85％。
选择最为有效的amiRNA-hTERT 3进一步做量效曲线，以确定其最低有效浓度。同样转染前一天，将Hela分别按3E+3个细胞/孔接种于96孔板中，接板后20h进行amiRNA-hTERT 3转染，转染浓度从100nM开始逐渐进行半量递减(100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0nM)，同时设一个完全的空白组(Blank)来评价实验的操作可靠性。实验组中各浓度的lipo 2000用量统一为lipo2000操作方案的推荐用量，其余操作完全按lipo2000说明书进行。转让后第四天用cell proliferation kit I(Roche公司)进行细胞增殖测定，操作按其说明进行。结果表明，对应Hela来说，amiRNA-hTERT 3在0.78nM时开始呈现强劲的细胞增殖抑制效果，在1.56nM时基本达到其最大的抑制率(82％)，这个浓度是目前报道的靶向hTERT的最低有效浓度。结果见图5所示。
4.分析各amiRNA对细胞迁移和侵袭的影响
NCI-H446，Hela，U2-OS，Huvec细胞按8000个细胞/孔接种于96孔板中，20h后进行amiRNA转染，转后48h用200ul黄枪头在培养孔的中间位置划“十”字，再用PBS洗去悬浮细胞，换上新鲜培养液继续培养24h并拍照。此划痕实验结果显示，NCI-H446，Hela，Huvec三种细胞的迁移能力明显收到amiRNA的影响，尤其是amiRNA-hTERT3的作用更为显著，如图6所示，图6为Huvec，NCI-H446的实验结果。
另外，选NCI-H446，Huvec细胞进行Transwell侵袭实验来检验所设计的amiRNA是否会影响细胞的侵袭性能。实验细胞在转染amiRNA 48h后，分别将NCI-H446，Huvec细胞用无血清培养基(Invitrogen公司)稀释，并按3E+5、5E+4个细胞/孔的量接种于Transwell(Costar公司)上层小室中，放入含有正常血清浓度培养基(Invitrogen公司)的小室中继续培养4-8h，取出小室用含1％乙醇的结晶紫溶液(Sigma公司)固定、染色，再用棉球檫去小室上层细胞，显微镜(Nikon，Japan)下统计已经侵袭到小室下层的细胞。结果表明3对amiRNA都能不同程度的显著抑制细胞的侵袭，如图7所示。
5.软琼脂实验分析各amiRNA对细胞克隆形成能力的影响
将1.2％低熔点琼脂糖(Sigma公司)与2×细胞培养基(Invitrogen公司)以1∶1的体积比混合制备0.6％的混合琼脂铺着24孔培养板(Corning公司)(0.25ml/孔)，凝固形成底层琼脂。NCI-H446，Hela细胞在转染amiRNA或NC后24h消化并进行计数，取适量细胞(300个细胞/孔)与预先制备好的0.3％的混合琼脂混匀后铺在培养板底层琼脂的上面，凝胶后形成顶层琼脂，培养箱培养14d后用结晶紫染色，随即选择5个视野统计有效克隆(细胞量大于50个)的数量和大小，最后以各自有效克隆的总体积为克隆能力形成评价指标。结果显示，相对于对照组NC来说，所选amiRNA都能显著减少处理细胞的克隆数目，尤其是amiRNA-hTERT 3处理过的细胞基本不能形成有效克隆，如图8所示，图8为NCI-H446的实验结果。
6.小管形成实验分析各amiRNA对细胞小管形成能力的影响
Huvec细胞按5E+4个细胞/孔接到24孔板后20h分别进行amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2，amiRNA-hTERT 3及NC转染，转染试剂使用lipo2000，转染浓度统一为50nM，具体操作按照lipo2000说明书进行。第二天将matrigel胶(BD公司)放入4℃解冻，解冻完成后在冰上用含10％FBS的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)将matrigel胶配成1x的工作液，50ul/孔平铺到96孔板中，之后转染培养箱中凝固待用。Huvec细胞转染后48h后进行消化并计数，调整细胞密度至1.5E+4个细胞/ml取100ul细胞细胞悬液加入昨天预制好的matrigel胶上，每组设3个复孔，放入培养箱中继续培养6h后进行显微观察并拍照。统计完整小管和有效接点数作为评价小管形成指标。结果表明，阴性对照NC组能形成完整的小管，而amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2除少数有效接点并不能形成完整小管，尤其是amiRNA-hTERT 3连有效接点都不能形成，细胞基本呈散点状或简单的短线状。说明所选3对amiRNA都能显著的抑制小管形成，尤其是amiRNA-hTERT 3效果最为显著。如图9所示。
7.流式细胞术分析各amiRNA对细胞凋亡的影响
NCI-H446，Hela，Huvec，U2-OS细胞按2E+5个细胞/well接种到6孔板中，接板后20h用Lipo2000进行amiRNA转染，转染浓度为50nM，具体操作按照lipo2000说明书进行，每组设3个复孔。转染后每2天更换一次培养基，第四天消化收集细胞，将相同3个复孔的细胞混合成一管，用PBS重悬后，1000rpm X 5min离心收集细胞。用300ul预冷的PBS重悬细胞，加入700ul冰冻的无水乙醇后混匀，放入4度冰箱过夜。细胞固定24h后弃固定液，用1ml预冷的PBS重悬细胞，1000rpm X 10min收集细胞，再用1ml PBS重悬细胞和离心收集，重复3次。用750ul预冷的PBS重悬细胞，加入50μL 1mg/mLRNase A(Beyotime公司)，37℃水浴处理30min。取出EP管，在冰上放置2min后加200μL 100g/mL PI(Sigma公司)，4℃避光染色30min，过400目筛网(Zoman公司)后立刻上流式细胞仪(Beckman，USA)进行检测，激发波长488nm，收集波长630nm，每组样品检测3E+4个细胞。用Beckman流式细胞仪自带的软件生成图谱并进行凋亡分析。结果表明，对于正常细胞Huvec和端粒酶阴性的U2-OS来说，3对amiRNA都没有明显的促凋亡效果，而对端粒酶阳性的NCI-H446和Hela来说，3对amiRNA都能明显的促进细胞的凋亡，尤其是amiRNA-hTERT 2最为明显。如图10所示。
8.amiRNA专一性的验证
(1)对干扰素信号通路的影响测定
NCI-H446以5E+4个细胞/well接种到24孔板中，接板后20h用lipo2000进行amiRNA转染，转染浓度为50nM，转染操作按lipo2000方案进行。转染后24h用Trizol Reagent(Invitrogen公司)按其说明书进行总RNA提取(由此开始在冰上进行操作)，接着用Bio Mate仪器(Thermo，USA)测定RNA纯度和浓度，立刻进行反转录(相关试剂购自Zoman)：加入5xRT缓冲液10ul，dNTP(2.5mM)4ul，Rnasin(40U/ul)1ul，RTase(200u/ul)1ul，Oligo18(50uM)0.1ul，RNA 2ug，补充ddH2O到50ul，充分混匀后42℃孵育60min。完成反转录之后用Realtime PCR仪器(ABI，USA)对干扰素信号通路中的标志性基因(IFN-beta，OAS-1，STAT1)的表达水平进行定量，内参为GAPDH。操作按Zoman的“2x SYBR Green qPCR kit”方案进行，即模板2ul，上、下游引物(10uM)1ul，2xMix 10ul，补充ddH2O到20ul。扩增条件为：95℃4min→(94℃45s，60℃45s，72℃45s)40cycle→meltcurve。
qPCR结果表明，3对amiRNA虽然都能不同程度的影响到3个干扰素基因的表达变化，但只是轻微的发生改变，跟常规的siRNA引起的干扰素效应(通常为10倍以上变化)有本质差异，说明所选amiRNA不会引起明显的干扰素效应，副作用小。如图11所示。
(2)靶点沉默实验验证amiRNA的专一性
根据amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2，amiRNA-hTERT 3在人端粒酶逆转录酶基因hTERT(NM_198253)上的靶点位置，以各自靶点为中心在hTERT基因序列上分别向上下游延伸100bp作为各自的待验证片段(amiRNA-hTERT 1：3890-4010；amiRNA-hTERT 2：2820-3040；amiRNA-hTERT 3：2820-3040)，由上海生工合成上述片段，并通过ClaI，SalI两个酶切位点克隆到pAM-CAG-EGFP载体中的EGFP表达框下游，得到2个靶点沉默载体(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 1，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2)。
HEK293细胞以5000个细胞/孔接种于96孔板中，20h后进行质粒和amiRNA的共转，转染按lipo2000操作方案进行。实验设2组阴性对照组(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 1+NC，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+NC)、3组实验组(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 1+amiRNA-hTERT 1，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+amiRNA-hTERT 2，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+amiRNA-hTERT 3)。转染后48h进行荧光检测，以确定amiRNA对靶点质粒表达的沉默效果。荧光照片显示，相对于阴性对照组，3组实验组虽然也有微量的绿色荧光表达，但表达量非常低，而阴性对照组则呈现正常转染后的高荧光表达，表明amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2，amiRNA-hTERT 3能够高效的沉默含各自靶点的基因片段，作用位点专一。如图12所示。
实施例3
动物实验评价amiRNA-hTERT的抗肿瘤效果。
NCI-H446细胞按1.5E+7个细胞/皿接种到直径15cm的培养皿中(Corning公司)，接板后20h用Lipo2000分别进行amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2和NC转染，转染浓度为50nM，转染方案按lipo2000说明书进行。转染后24h消化细胞并计数，800rpm x 5min离心收集细胞，用预冷PBS重悬细胞并离心收集，用PBS重悬细胞并调整细胞密度为0.5E+8个细胞/ml，按100ul/只细胞量接种到4周龄的BABL/c裸鼠左前肢腋下(国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心(NLARSH)上海斯莱克实验动物有限责任公司)，每组设6只裸鼠。接瘤后第5天开始每3天测一次肿瘤的长a和宽b，按1/2*a*b*b公式计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。接瘤后29天腹腔注射2％的无巴比妥钠(Sigma公司)100ul/只，等裸鼠完全麻醉后拍照，接着脱颈处死裸鼠并剥离移植瘤，将取下的瘤体排列好拍照后制作冰冻切片。肿瘤生长曲线表明，amiRNA处理组先有一个肿瘤变小的过程，紧接着是平缓生长期，再进入对数生长期，而NC只经过一个平缓生长期就很快进入对数生长期，说明amiRNA处理后能抑制肿瘤的成瘤能力。切片经TUNEL凋亡检测试剂盒(Beyotime公司)染色表明，amiRNA-hTERT2能促进肿瘤细胞的凋亡。见图13所示。
表1
Claims (3)
1.一种抗肿瘤amiRNA，其特征在于，所述的amiRNA的序列为
amiRNA-hTERT 1:正义链5’-UGACCAAAUGUGCCCUGUA-3’；
反义链5’-UACAGGGCACACCUUUGGUCA-3’；
amiRNA-hTERT 2:正义链5’-CAGAGCCACUCACCUUCAA-3’；
反义链5’-UUGAAGGUGAGACUGGCUCUG-3’；
amiRNA-hTERT 3:正义链5’- CAGAGCCAGUCUCACCUUCAA -3’；
反义链5’-UUGAAGGUGAGACUGGCUCUG-3’。
2.如权利要求1所述的一种抗肿瘤amiRNA，其特征在于，所述amiRNA的序列为：
amiRNA-hTERT 3: 正义链5’- CAGAGCCAGUCUCACCUUCAA -3’；
反义链5’-UUGAAGGUGAGACUGGCUCUG-3’。
3.如权利要求1或2所述的一种抗肿瘤amiRNA在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于：所述的amiRNA用于制备与hTERT基因相关肿瘤的治疗药物，该amiRNA通过化学合成以化学药物的形式用于肿瘤的预防和治疗，也能经过质粒或病毒类载体包装后以基因药物形式用于肿瘤的预防和治疗中。
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